CN1934275A - 用嵌入染料标记的探针检测dna扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及采用嵌入染料标记的探针检测核酸扩增的方法。更具体地说，本发明涉及核酸扩增的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93－96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50－57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70－74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93－96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50－57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；和viii)重复步骤iv)－vii)一次以上。

Description

用嵌入染料标记的探针检测DNA扩增的方法
技术领域
本发明涉及采用嵌入染料标记的探针检测核酸扩增的方法。更具体地说，本发明涉及核酸扩增的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；和viii)重复步骤iv)-vii)一次以上。
背景技术
常规的聚合酶链式反应(PCR)通过分析分离自琼脂糖凝胶的PCR产物可提供一些仅与扩增部分的大小有关的信息。扩增部分的碱基序列信息仅能推测。
当怀疑琼脂糖凝胶中分离的PCR产物条带的特异性时，需要分析对应条带的碱基序列或者用同位素标记的探针进行southern印迹分析。
然而，证实可疑条带特异性的实验需要花费2或3天以上。
此外，在不同条件下需要控制探针退火所需的严谨性。
因此，为克服常规终点检测的缺点开发了实时PCR技术，其中，通过分析由每轮PCR循环获得的信号可精确计算样品中存在的核酸的浓度。现在，通过采用特定探针的实时PCR技术可获得精确、即时、灵敏的结果。
在常规PCR方法中加入定量分析功能的实时PCR是一种新的方法，它能够自动完成一些常规程序，并且能够通过降低可能误差提供精确结果。
在这种实时PCR技术中，采用荧光报告染料来监测整个反应的所有过程。
扩增样品发出的荧光强度与每轮PCR积累的扩增产物的量成比例增加。即便检测器无法检测PCR早期阶段的荧光，但随着扩增产物的累积，则可检测累积的荧光。
循环阈值(threshold cycle)(C(T))是当荧光强度可检测时该时间点上的扩增频率。
建立了核酸初始量的对数值和循环阈值之间的比例关系。
因此，通过测量已知核酸初始量的样品的循环阈值可建立标准校正曲线。通过参照所述标准校正曲线可正确计算未知核酸初始量的样品中的核酸初始量。
同时，可通过分析获自每轮实时PCR的样品计算样品中核酸正确浓度的方法是例如以下方法：采用Taqman探针的方法(Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7276-7280；Lee等，1993，Nucleid Acids Res.21：3761-3776)，采用Molecular Beacon探针的方法(Tyagi & Kramer 1996，Nature Biotech.14：303-309，US 5,119,801，USP5,312,728)，采用SYBR Green I等嵌入剂的方法和采用相邻杂交探针的方法(USP5,210,015)。
TaqMan探针是一种5’末端连接有报告染料(6-FAM、JOE、VIC、HEX、TET、荧光素、Cy-染料)同时3’末端连接有猝灭剂(TAMRA)的探针。
由于该探针的3’末端被封闭因此它不能起引物作用，所以DNA合成不能从探针的3’末端开始。天然Taq酶具有5’核酸酶活性，它具有除去与模板DNA杂交的下游DNA的功能。
当下游DNA的5’末端是双链DNA同时Taq酶结合在上游DNA的3-OH上时可激活Taq酶的5’核酸酶功能(Livak，K.J.，J.Marmaro和S.Flood.1995.Guidelines fordesigning Taqman fluorescent probes for 5’nuclease assays(5’核酸酶试验的Taqman荧光探针设计指南)，Research news.PE Applied Biosystems，Foster city，CA)。
当DNA复制开始时，Taq酶的5’核酸酶活性将探针的5’末端除去。
TaqMan探针的荧光强度(FI)与报告染料和猝灭剂之间距离(R)与6的乘积成反比。在探针的5’末端被Taq酶除去之前，报告染料的信号受到荧光共振能量转移(FRET)的中断。然而，该探针的5’末端被除去后猝灭剂染料从探针的5’末端释放出来，报告染料即可发射光。
当合成了一个靶DNA分子时，一个探针分子的5’末端被除去，使报告染料与猝灭剂染料分离(USP 5,763,181，USP 5,691,146等)。因此，报告染料的信号与扩增的DNA的量成比例增加。
即便采用TaqMan法无法获得扩增的DNA的大小信息，采用具有非常高特异性的TaqMan探针也能知道有关碱基序列和扩增的DNA的量的信息。
然而，由于探针由至少20个碱基构成，TaqMan探针法无法很好地猝灭报告染料。此外，TaqMan探针的制造困难且昂贵。
采用Molecular Beacon探针的方法被用于分析特定DNA和检测活细胞中的RNA。Molecular Beacon探针具有发夹形结构。Molecular Beacon探针的根部是与至少部分靶核酸互补的单链核酸。Molecular Beacon探针的茎部通过退火探针两端的互补臂序列形成(Tyagi，S.和F，R，Kramer.1996，Molecular beacons that fluoresce uponhybridization(杂交时发出荧光的Molecular beacon)，Nat.，Biotechnol.，16：49)。
Molecular Beacon探针5’末端的报告染料选自得克萨斯红(Texas Red)、若丹明红(Rodamin Red)、FAM、HEX、TET、ROX、TAMRA、荧光素或俄勒冈绿(Oregon green)等，Molecular Beacon探针3’末端的猝灭剂是DABSYL[4-(4′-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸]。
当Molecular Beacon探针未与靶核酸杂交时不能发出荧光。因此可简化探针的检测过程。
当茎部的报告染料和猝灭剂染料相互接近时，报告染料的荧光被猝灭。然而，当接触靶核酸时，与靶核酸形成了更加长久且稳定的杂交而不是与其自身的臂序列杂交。因此，报告染料不接近猝灭剂，可检测出荧光。
然而，由于要将探针与靶核酸分离，采用Molecular Beacon探针的方法不方便(Matsuo，T.1998.In situ visualization of messenger RNA for basic fibroblast growth factorin livingcells(在活细胞中原位显示碱性成纤维细胞生长因子的信使RNA).Biochim.Biophys.Acta 1379：178-184)。此外，由于Molecular Beacon探针由至少30-40个碱基构成，其制造困难且昂贵。
另一种分析方法是使用相邻杂交探针的方法。该方法采用了设计与靶核酸杂交的头-尾排列的两个探针。
在该方法中，探针的3’末端结合荧光供体，另一探针的5’末端结合荧光受体。因此，当荧光供体和荧光受体靠近时发生荧光能量转移，同时供体的发射光作为受体的激发光。
来自受光源激发的供体的能量被转移到受体，同时受体发出荧光。荧光强度与和扩增的核酸杂交的探针的量成比例。该方法被用来检测DNA和核酸的单碱基修饰。
然而，由于该方法需要4种引物因此该方法的过程复杂。此外，这种方法的特异性水平低(Heller，M.J.和L.E.Morrison.1985.Chemiluminescent and fluorescence probesfor DNA hybridization(DNA杂交的化学发光和荧光探针)，刊于D.T.Kinsbury和S.Flakow编的Rapid Detection and Identification of Infectious Agents(感染剂的快速检测和鉴定)一书第245-256页，Academic Press，纽约)。
再其它的分析方法是采用SYBR Green I、Foerst 33228、溴化乙锭(EtBr)等嵌入染料的方法。
该方法可用于多种样品，只要该方法的嵌入染料能够结合无特定靶序列的双链DNA。
在采用嵌入染料的方法中，由于易于制造探针以及将探针与核酸分离，因此其过程简单。同时，由于过程易于控制，因此容易获得特定步骤的信号。
然而，该方法的缺点在于，容易产生引物的扩增产物、非特异性扩增产物等。由于所述背景噪音，需要测量扩增产物的解链温度并通过分析解链曲线证实PCR获得的产物(Higuchi，R.，Dollinger，G.，Walsh，P.S.和Griffith，R.1992.Simultaneousamplication and detection of specific DNA sequences(同时扩增和检测特定DNA序列)，Biotechnology 10：413，Higuchi，R.，Fockler，C，Dollinger，G.和Watson，R.1993，kinetic PCR：Real monitoring of DNA amplication reactions(实时监控DNA扩增反应的动态PCR).Biotechnology 11：1026)。
为克服上述问题，本发明的发明人者试图开发一种新型探针和检测扩增核酸的方法，该方法能迅速分析扩增的核酸，同时探针制造和分析过程简单易行。
发明内容
技术解决方案
本发明的主要目的是提供用于实时检测扩增核酸的荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化。
本发明的另一个目的是提供一种核酸扩增的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；和viii)重复步骤iv)-vii)一次以上。
本发明的其它目的是提供一种样品中核酸初始量的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；viii)重复步骤iv)-vii)一次以上；ix)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和x)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
本发明的再一个目的是提供一种扩增核酸的组合物，该组合物包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iii)DNA聚合酶，和iv)4种核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种核酸扩增的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；和ix)重复步骤v)-viii)一次以上。
本发明的另一个目的是提供一种样品中核酸初始量的实时检测方法，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；ix)重复步骤v)-viii)一次以上；x)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和xi)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
本发明的另一个目的是提供一种扩增核酸的组合物，该组合物包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)反转录引物iii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iv)DNA聚合酶；v)反转录酶，和iv)4种核苷酸。
本发明的上述目的可通过提供用于实时检测扩增核酸的荧光探针实现，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化。
该荧光探针由10-40个碱基构成，其3’末端被封闭从而不能从3’末端开始复制。
优选地，所述探针包含选自Seq.ID Nos.1-22的碱基序列。
同时，探针的嵌入染料起荧光染料作用，所述嵌入染料宜选自吖啶同型二聚体及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放线菌素D及其衍生物、放线菌素D及其衍生物、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氢乙锭(Dihydroethidium)及其衍生物、溴化乙锭及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、单叠氮乙锭(Ethidium monoazide)及其衍生物、碘化己锭(Hexidium iodide)及其衍生物、双苯酰亚胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羟蔗脒(hydroxystilbamidine)及其衍生物、LDS 751及其衍生物、碘化丙锭(PI)及其衍生物或Cy-染料(Cy-dyes)衍生物。
荧光染料可与探针寡核苷酸5’末端区域、3’末端区域和中间区域至少之一相连，并通过通过使所述荧光染料结合或取代所述寡核苷酸中的碱基而标记所述寡核苷酸。
本发明的另一个目的可通过提供一种核酸扩增的实时检测方法实现，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；viii)重复步骤iv)-vii)一次以上.
在所述扩增核酸的检测方法中，步骤vii)可与步骤vi)同时进行。同时，所述荧光探针可与至少部分区域杂交，所述区域距离结合有所述引物3’末端的碱基1-15个碱基
本发明的另一个目的可通过提供一种样品中核酸初始量的检测方法实现，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70℃-74℃从而复制所述单链核酸；v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；viii)重复步骤iv)-vii)一次以上；ix)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和x)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
循环阈值(C(T))是当荧光强度可检测时该时间点上的扩增频率。
建立了核酸初始量的对数值和循环阈值之间的比例关系。
线性(R_2)表示靶核酸初始量的对数值与获自实时PCR的循环阈值之间有比例关系。
当标准校正曲线的线性(R_2)接近1.0时便可正确计算未知样品中的核酸初始量。参考标准校正曲线可知未知样品中的核酸初始量。
通过测量已知样品中核酸初始量的对数值和通过上述步骤i)-ix)的表现显示的循环阈值可获得标准校正曲线。
本发明的另一个目的通过提供一种扩增核酸的组合物实现，所述组合物包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iii)DNA聚合酶；和iv)4种核苷酸。
上述扩增核酸的组合物可在真空中干燥。
本发明的另一个目的可通过提供一种核酸扩增的实时检测方法实现，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；和ix)重复步骤v)-viii)一次以上。
本发明的另一个目的可通过提供一种样品中核酸初始量的检测方法实现，该方法包括以下步骤：i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；ix)重复步骤v)-viii)一次以上；x)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和xi)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
本发明的再一个目的可通过提供一种扩增核酸的组合物实现，该组合物包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)反转录引物；iii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iv)DNA聚合酶；v)反转录酶，和iv)4种核苷酸。
本发明的反转录酶指依赖于RNA的DNA聚合酶。该酶从RNA模板合成cDNA(互补DNA)。
反转录酶通常在造成肿瘤的RNA病毒内或在被RNA病毒感染的细胞内发现。这种酶通常用于合成与mRNA相对应的DNA的基因实验。
本发明的反转录酶宜选自MMLV(Moloney鼠白血病病毒)反转录酶、AMV(禽成髓细胞瘤病毒)反转录酶、RAV-2(2型Rous相关病毒)反转录酶或TTH(嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus))反转录酶。
当本发明的靶核酸是RNA时应首先从RNA合成cDNA。可使引物与所述cDNA杂交并开始复制。
在核酸解离成单链之后，可通过嵌入荧光染料检测荧光强度。
因此，当靶核酸是RNA时，可定量检测核酸扩增。
本发明是一种新的方法，它可检测并定量分析通过实时PCR扩增的核酸。当本发明探针的嵌入染料被嵌入双链核酸时，可检测染料的荧光。荧光强度与扩增的DNA的量成比例，因此可定量分析扩增的核酸。
本发明的方法可用于在体外或体内监测各种形式的核酸。例如，该方法可用于PCR、杂交、连接、剪切、重组、合成、测序、突变检测、以及评估铅(lead)、DNA、RNA和蛋白质浓度的生物传感器。
有益效果
如上所述，与SYBR Green I、Foerst 33228、溴化乙锭(EtBr)等实时检测扩增核酸的方法不同，通过采用本发明可更加准确地检测PCR扩增的核酸，同时，由于该方法不需要测量各种产物的解链温度，因此节约了实验时间。
下文将参照以下实施例更加详细地描述本发明。给出这些实施例只是为了阐述本发明而不是限制本发明。
附图简述
通过详细描述本发明的优选实施方案和参照附图将更容易明白本发明的上述目的和其它优点，附图中：
图1-2是本发明较佳实施方案过程的示意图。
图3显示了通过质谱仪测得的5’末端用DNA绿亚磷酰胺(DAN GREENphosphoramidite)标记的寡核苷酸的分子量。
图4显示了通过质谱仪测得的中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的分子量。
图5显示了5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸与互补寡核苷酸杂交之后，通过荧光分光光度计在500-650nm下测得的荧光强度。
图6显示了5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸与互补寡核苷酸杂交之后，通过实时PCR测得的解链曲线的荧光值。
图7显示了对5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图8显示了对阳性对照实验组进行PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图9显示了对中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图10显示了对5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行定量PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和标准校正曲线。
图11显示了对5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行定量PCR之后，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图12显示了对中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行定量PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和标准校正曲线。
图13显示了对中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行定量PCR之后，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图14显示了对5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行λDNA交叉污染PCR(lambda DNA cross-contamination PCR)之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图15显示了对中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行λDNA交叉污染PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图16显示了对3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行λDNA交叉污染PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
图17显示了对两个末端(5’末端和3’末端)都用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸进行λDNA交叉污染PCR之后，扩增产物的荧光强度变化和琼脂糖凝胶电泳结果。
最佳实施方式
实施例1.提取基因组DNA
采用AccuPrep基因组DNA提取试剂盒提取结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的基因组DNA，如下所述。
在Ogawa培养基(谷氨酸钠1g，KH2PO4 3g，蒸馏水100ml，鸡蛋200ml，甘油6ml，2％孔雀绿溶液6ml)中培养结核杆菌(tubercle bacillus)，将5ml痰液加入含1ml TE(8.0)和300μl蛋白酶K(20μg/μl)的混合物中。
然后在混合物中加入4ml裂解缓冲液(4M尿素)。65℃搅拌所得混合物20分钟。在混合物中加入结合缓冲液(7M盐酸胍)。65℃再搅拌混合物20分钟。在溶液中加入2.75ml异丙醇，2500rpm离心混合物5分钟。
将上面获得的750μl上层溶液倒入各个装有玻璃滤器的结合柱试管，12,000rpm离心柱中所含的溶液1分钟以除去流出液。然后在结合柱中倒入750μl洗涤缓冲液I(5M盐酸胍)并将如此制得的混合物在13,000rpm再离心1分钟以除去流出液。
在上面获得的结合柱中所含的混合物中加入750μl洗涤缓冲液II(20mM NaCl)，然后12,000rpm离心1分钟除去流出液。再将该柱12,000rpm离心2分钟除去留在结合柱试管中的洗涤缓冲液。
将装有玻璃滤器的结合柱放入1.5ml试管中。在装有结合柱和玻璃滤器的所述1.5ml试管中倒入100μl洗脱缓冲液(10mM TrisHCl)。将试管在室温静置5分钟。然后再将如此制得的混合物在12,000rpm离心2分钟以除去流出液。实施例1中收集的DNA被用于实施例4-9。
实施例2.合成DNA绿亚磷酰胺
按照美国专利No.6348596和No.6080868描述的方法制备含有具有化学式1的荧光物质的亚磷酰胺。在本说明书中，用于本发明的含有荧光物质的亚磷酰胺是DNA绿亚磷酰胺。用于本发明的探针在所需位置用DNA绿亚磷酰胺标记制成。
化学式1
Figure A20058000939300181
式中，n是2、3、4或5。R1是-CH3、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CO2H和-CH2CH2Br之一。R2是H、OH或NO2。CEP表示氰基乙氧基亚磷酰胺，DMT表示二甲氧基三苯甲基。
实施例3.设计引物和探针
该实施例采用结核分枝杆菌的RpoB基因来制造本发明的引物和探针。
采用设计引物和探针的程序Beacon Designer 2.1(PREMIER Biosoft Internationalco.)来设计可与上述RpoB基因杂交的寡核苷酸(Seq.ID Nos.1-5，Seq.ID Nos.8-17，Seq.ID Nos.19-22)。制备的寡核苷酸示于表1和表2。
表1和表2的Seq.ID Nos.8-12是5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的荧光探针，“内容”一栏中的数字表示碱基数。例如，29表示该寡核苷酸总共由29个碱基构成，并在距离3’末端第28个碱基的5’末端通过在第29位碱基上的化学取代或加成用DNA绿亚磷酰胺标记。
Seq.ID Nos.13-17包括在碱基序列的中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸，表1“内容”一栏中的数字表示碱基数。例如，28表示该寡核苷酸总共由28个碱基构成，并在距离探针3’末端的第10个碱基上通过化学取代或加成用DNA绿亚磷酰胺标记。
Seq.ID No.21是3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸，表2“内容”一栏中的数字表示碱基数。例如，23表示该寡核苷酸总共由23个碱基构成，并在距离5’末端第22个碱基的3’末端通过化学取代或加成用DNA绿亚磷酰胺标记。
Seq.ID No.22是5’末端和3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸，“内容”一栏中的数字表示碱基数。例如，24表示该寡核苷酸总共由24个碱基构成，其中，在22个碱基的5’末端和3’末端通过结合或取代第1个和第24个碱基而用DNA绿亚磷酰胺标记。
同时，核酸扩增需要两个寡核苷酸作为引物。该寡核苷酸被成为正向引物和反向引物。在表1和表2中，F表示正向引物，R表示反向引物。在表1和表2中，Seq.ID Nos.1-2、Seq.ID Nos.3-4、Seq.ID Nos.6-7和Seq.ID Nos.19-20被用作引物。
Seq.ID Nos.8-17、Seq.ID No.20、Seq.ID No.21和Seq.ID No.22中的至少一个被用作荧光探针。所述探针包含其碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸。所述探针可与至少部分区域杂交，所述区域距离结合有所述引物3’末端的碱基1-15个碱基。其示意图见图1。
在Seq.ID Nos.13-17中，从寡核苷酸的3’末端开始的第10个碱基被DNA绿亚磷酰胺取代，且该寡核苷酸可与扩增DNA中的互补碱基序列杂交。求示意图见图2。
在Seq.ID No.21和Seq.ID No.22中，Seq.No.21的3’末端以及Seq.No.22的3’末端和5’末端被DNA绿亚磷酰胺标记，所述碱基序列被设计成与扩增的DNA杂交。
同时，通过分析得自每轮实时PCR的样品来检测样品中核酸精确量的常规方法例如有Taqman法(Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276-7280；Lee等，1993，Nucleid Acids Res.21：3761-3776)、Molecular Beacon法(Tyagi & Kramer1996，Nature Biotech.14：303-309，US 5,119,801，USP 5,312,728)等。表1和表2中的Seq.ID No.5被用于MolecularBeacon法。
表3是按照波长分类的荧光染料表。每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长。表3中的值表示最佳激发波长。
寡核苷酸序列
[表1]
  Seq.IDNo.   内容  序列  注释
  1   引物F1  5’agt gca aag aca agg aca tga-3’  用于核酸扩增的寡核苷酸
  2   引物R1  5’ttc tcg gtc atc atc ggg aa-3’  用于核酸扩增的寡核苷酸
  3   引物F2  5’gat gtc gtt gtc gtt ctc-3’  用于检测对照组探针的寡核苷酸
  4   引物R2  5’acc gtc tga ctc ttg atc-3’  用于检测对照组探针的寡核苷酸
  5   探针1  5’cgc gat gtc acc gcc gag ttc atc aac aaatcg cg-3’  对照组的探针，5’末端用荧光素标记，3’末端用Dabcyl标记
  6   引物F3  5’acc tca ttt tca tgt ccg gtc agc-3’  用于扩增λ100bp的寡核苷酸
  7   引物R3  5’ggc aga gct gaa aga gga gct tga-3’  用于扩增λ100bp的寡核苷酸
  8   29  5’*cc atg aac acc gtc tga ctc ttg atc tc-3’  5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  9   27  5’*cc atg aac acc gtc tga ctc ttg atc-3’  5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  10   25  5’*cc atg aac acc gtc tga ctc ttg a-3’  5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  11   23  5’*cc atg aac acc gtc tga ctc tt-3’  5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  12   21  5’*cc atg aac acc gtc tga ctc-3’  5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  13   28  5’cca tga aca ccg tct gac *ct tga tct c-3’  中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记
  14   26  5’cca tga aca ccg tct g*c tct tga tc-3’  中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记
  15   24  5’cca tga aca ccg tc* gac tct tga-3’  中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记
  16   22  5’cca tga aca ccg *ct gac tct t-3’  中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记
  17   20  5’cca tga aca c*g tct gac tc-3’  中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记
寡核苷酸序列
[表2]
  18   D.G-ph-com   5’cc ttc agt ggg tac ttg tgg cag actgag aac tag agt ggc c-3’   与Seq.ID No.8-17互补的碱基序列
  19   21   5’caa gag tca gac ggt gtt ca-3’   用于核酸扩增的寡核苷酸
  20   22   5’ttg tcg gtg gac ttg tca at-3’   用于核酸扩增的寡核苷酸
  21   23   5’tga ctt ccc gat gat gac cga g*-3’   3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
  22   24   5’*tg act tcc cga tga tga ccg ag*-3’   在3’末和5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记
按照波长分类的荧光染料列表
[表3]
  激发波长(nm)   发射波长(nm)   推荐的荧光团
  490±10   520±10   FAM、SYBR Green I，荧光素
  510±5   530±5   DNA绿亚磷酰胺
  525±10   550±10   HEX、TET、VIC、JOE
  530   620   EtBr
  560±10   570±10   TAMRA、Cy3、若丹明红
  585±10   610±10   得克萨斯红、ROX
  625   640   LC640
  640±10   660±10   Cy5
  675±10   700±10   Cy5.5、LC705
实施例4.研究用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸
通过核酸合成系统EXPEDITE(Perseptive Biosystems Co.)制备表1和表2的寡核苷酸序列。通过该系统制得的寡核苷酸的分子量用聚合物质谱仪Axima-LNR(Maldi-Tof，SHIMADZU Co.)测量。
Maldi-Tof(衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间)是一种通过分析实测分子量和从寡核苷酸重量得到的预测分子量来测量脱嘌呤寡核苷酸修饰率、N-1失效的(failed)寡核苷酸以及各种修饰多核苷酸的装置。
表1和表2中Seq.ID Nos.8-12所示寡核苷酸中的至少一种被用于本实施例。
如图3所示，通过聚合物质谱仪测得的Seq.ID No.8的分子量显示，预测分子量(8941.2克/摩尔)和测量分子量(8914.6克/摩尔)类似。X轴表示测量分子量除以寡核苷酸电荷的结果。Y轴表示以百分数为单位测得的寡核苷酸强度。
峰1指出了靶寡核苷酸的分子量。峰2指出了测量分子量除以电荷值2的结果。
表1和表2中Seq.ID Nos.13-17所示寡核苷酸中的至少一种被用于本实施例。如图4所示，通过聚合物质谱仪测得的Seq.ID No.16的分子量显示预测分子量(6868.0克/摩尔)和测量分子量(6861.8克/摩尔)类似。X轴表示测量分子量除以寡核苷酸电荷的结果。Y轴表示以百分数为单位测得的寡核苷酸强度。
峰1指出了靶寡核苷酸的分子量。峰2指出了测量分子量除以电荷值2的结果。
用荧光分光光度计(RF-5301PC，SHIMADZU Co.)再次测量用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的激发波长和发射波长，已通过聚合物质谱仪测量该寡核苷酸的质量和纯度。
同时，用OpticonTM实时PCR(MJ Reasearch)测量当将DNA绿亚磷酰胺嵌入双链核酸时寡核苷酸荧光强度的变化。所述寡核苷酸的质量和纯度通过聚合物质谱仪测量。
表1和表2中Seq.ID Nos.8-17所示寡核苷酸中的至少一种被用于本实施例。与靶核酸互补的Seq.ID No.18被用来测量当将DNA绿亚磷酰胺嵌入双链核酸时荧光强度的变化。
准备两个15ml的试管以用荧光分光光度计来测量用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的激发波长和发射波长。
在试管1内混合2.9ml TEM缓冲液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)和100ml Seq.ID No.10(10皮摩尔/微升)。在试管2内混合2.8ml TEM缓冲液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)、100μl Seq.ID No.10(10皮摩尔/微升)和100μl Seq.ID No.18(10皮摩尔/微升)。所述试管中溶液的最终体积应为3ml，试管中的核酸分别在94℃变性5分钟。之后将试管1置于冰上。
将试管2中的核酸缓慢冷却至室温以使其杂交。用荧光分光光度计在以下条件下扫描用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的激发波长和发射波长：475nm/450nm-800nm至475nm/500nm-600nm、480nm/450nm-800nm至480nm/500nm-600nm、485nm/450nm-800nm至485nm/500nm-600nm、490nm/450nm-800nm至490nm/500nm-600nm、495nm/450nm-800nm至495nm/500nm-600nm、500nm/450nm-800nm至500nm/500nm-600nm、505nm/450nm-800nm至505nm/500nm-600nm、510nm/450nm-800nm至510nm/500nm-600nm、515nm/450nm-800nm至515nm/500nm-600nm、520nm/450nm-800nm至520nm/500nm-600nm和525nm/450nm-800nm至525nm/500nm-600nm。
这些测量中，激发荧光强度随发射波长增加而增加，与加入互补物无关。当加入互补寡核苷酸时，激发荧光强度大于未加入互补寡核苷酸时的强度。
当将DNA绿亚磷酰胺嵌入双链核酸时检测到荧光强度的变化和激发荧光波长的位移效应。还在505-515nm的发射波长范围内检测到较佳激发荧光强度。优选的激发波长为530-540nm。
图5显示了当发射波长为505nm、激发波长范围为500-650nm时Seq.ID No.10或Seq.ID No.10与18杂交的荧光强度。激发荧光强度在530nm-500nm之间升高，之后直到650nm之间下降。
图5的X轴表示测量激发荧光强度的扫描波长，Y轴表示每个扫描波长下测得的荧光强度。峰1表示当发射波长为505nm时Seq.ID No.10的激发荧光强度。峰2是当发射波长为505nm时Seq.ID No.10与18杂交的激发荧光强度图。
准备两个试管进行实时DNA扩增。测量当将DNA绿亚磷酰胺嵌入双链核酸时探针的荧光强度。
在试管1内混合49μl TEM缓冲液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mMMgCl2)和1μl Seq.ID No.10(10皮摩尔/微升)。在试管2内混合48μl TEM缓冲液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0，最后3.5mM MgCl2)以及1μl Seq.ID No.10(10皮摩尔/微升)和Seq.ID No.18(10皮摩尔/微升)。这些试管中溶液的最终体积分别为50μl，操作实时DNA扩增设备。
实时PCR条件为：94℃预变性5分钟，25℃预冷5分钟，25-95℃ PCR期间以1℃为增量随时扫描荧光强度。
测量中，在加入或不加入互补寡核苷酸两种条件下，荧光强度随反应温度升高而降低。
同时，当加入互补寡核苷酸时测得的荧光强度大于未加入互补寡核苷酸时测得的强度。它们之间的差异代表了嵌入造成的荧光强度变化效应。
图6显示了通过实时PCR得到的25-94℃时Seq.ID No.10或Seq.ID Nos.10与18杂交的解链曲线。X轴表示反应温度，Y轴表示每个温度下测得的荧光强度。峰1为反应温度下测得的Seq.ID No.10的荧光强度。峰2为反应温度下Seq.ID Nos.10与18杂交的荧光强度。
实施例5.采用5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR反应
引物是实时PCR中用来扩增靶核酸的特殊碱基序列。探针由与靶核酸互补并与引物附近的靶核酸杂交的碱基构成。探针在碱基序列的5’末端、3’末端或中间区域至少之一用荧光染料标记(表1和表2)。
在阳性对照组中，Molecular Beacon法(这是一种通过分析获自每轮实时PCR的样品而计算样品中核酸正确浓度的常规方法)的探针被用于实时PCR。因此，阳性对照组的数据被用作建立使用DNA绿亚磷酰胺标记的探针的可用性的标准。
Clen Taq聚合酶一种删除了Taq聚合酶的5’编码基因而失去5’外切核酸酶活性从而活性和热稳定性显著提高的聚合酶。在实时PCR中，Clen Taq聚合酶可除去由于Taq聚合酶对5’末端用荧光染料标记的探针的5’外切核酸酶活性而产生的非特异性。
在该实施例中，表1和表2的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.8-12至少之一被用作探针。在阳性对照组中，Seq.ID No.3和4被用作引物，Seq.ID No.5被用作探针。
用所述引物和引物在各个试管中制备20μl反应缓冲液以进行实时PCR。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2。10x反应缓冲液、dNTP和MgCl2的最终浓度分别为2mM、2.5mM和3mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2。引物的最终浓度为0.5μM。
然后在试管中加入中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.8-12。探针的最终浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM。在每个试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.2U(单位)。在各试管中加入2ml实施例1的精制的结核菌DNA，并在这些试管中加入蒸馏水至终体积为20μl。搅拌试管中的溶液，用微量离心机甩下。
对于阳性对照组，在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2。10x反应缓冲液、dNTP和MgCl2的最终浓度分别为2.5mM。然后加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.3和4，使最终浓度为0.5μM。用荧光染料标记的探针Seq.ID No.5的最终浓度为0.25μM。
在每个试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.2U(单位)。在各试管中加入2μl实施例1的精制的结核菌DNA。然后在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl并通过微量离心机甩下。
用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行三步骤实时PCR。在上述PCR中，95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，50℃退火60秒，72℃延伸40秒，共进行45轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
图7显示了当核苷酸浓度为0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM时Seq.ID No.8的实时PCR结果。反应结果显示，随着反应循环的重复荧光强度增加。
图7的X轴表示PCR反应循环，Y轴是测得的荧光强度。峰1-峰4是当5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的浓度为0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM时各反应循环的荧光强度图。
如图8所示，阳性对照的荧光强度随反应循环重复而增加。X轴是PCR反应循环，Y轴是测得的荧光强度。峰1-2是当探针浓度为0.25μM时各反应循环的荧光强度图。
上述反应获得的PCR产物通过凝胶电泳鉴定。在烧杯中加入2克琼脂糖(BIONEER Co.)和0.5X TBE。混合物的终体积为100ml。加热并搅拌混合物直到完全熔解。
当混合物冷却至60℃时加入4μl EtBr(10mg/ml)。将混合物倒入具有梳子的模具中并在室温放置30分钟以使混合物硬化。将硬化的胶放入AgaroPowerTM(BIONEERCo.)电泳槽中。在电泳槽中加入0.5X TBE电泳缓冲液，使凝胶没入其中。
将5μl PCR产物混合物和1ml加样缓冲液混合并用移液管加入琼脂糖凝胶的孔中。电泳后将凝胶放在UV透照灯上并用数码照相机Imager IIITM拍照。在本发明中，扩增产物的大小为127个碱基对(bp)，阳性对照扩增产物的大小为150个碱基对(bp)。
凝胶电泳的结果示于图7和图8。在图7中，泳道5是0.5μM 5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的凝胶电泳结果，泳道6是1.0μM 5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的凝胶电泳结果，泳道7是2.5μM 5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的凝胶电泳结果，泳道8是5.0μM 5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸的凝胶电泳结果。
泳道9表示100bp大小的标记。在图8中，泳道3-4是阳性对照的凝胶电泳结果，其中探针的浓度为0.25μM。泳道5表示100bp大小的标记。
实施例6.采用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR反应
在该实施例中，表1和表2的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.13-17所示的寡核苷酸至少之一被用作探针。
用所述引物和引物在各个试管中制备20μl反应缓冲液以进行实时PCR。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最终浓度分别为1.5mM、2mM和2.5mM。加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2使其浓度为0.5μM。
然后在试管中加入中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.13-17，使其浓度为0.5μM、1.0μM、2.5μM和5.0μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.17U(单位)。在各试管中加入1.5ml实施例1的精制的结核菌DNA。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，50℃退火50秒，72℃延伸40秒，共进行46轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
图9显示了当寡核苷酸浓度为0.5μM和1.0μM、MgCl2浓度为1.5mM时Seq.ID No.16的实时PCR结果。随着反应循环的重复荧光强度增加。
在图9中，X轴表示PCR反应循环，Y轴是测得的荧光强度。峰1是当中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸浓度为0.5μM时各反应循环的荧光强度图。峰2是当中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的寡核苷酸浓度为1.0μM时各反应循环的荧光强度图。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用中间区域用DNA亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为127bp。
在图8中，泳道3是0.5μM中间区域用DNA亚磷酰胺标记的寡核苷酸实时PCR产物的凝胶电泳结果，泳道4是1.0μM中间区域用DNA亚磷酰胺标记的寡核苷酸实时PCR产物的凝胶电泳结果。泳道5表示100bp大小的标记物。
实施例7.采用碱基序列5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的定量PCR
在阴性对照中，在PCR中使用蒸馏水代替靶核酸。阴性对照显示了一定水平的污染，这是由于PCR期间的外部原因间接造成的。
按照实施例4中反应条件的浓度对结核菌DNA进行定量实时PCR。实施例2中制造的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.8-12所示的寡核苷酸至少之一被用作探针。
用所述各引物和引物在各个试管中制备20μ1用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最终浓度为2mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，其最终浓度为0.5μM。
在试管中加入5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.10，使其浓度为5.0μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.2U(单位)。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。蒸馏水用作阴性对照。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸40秒，共进行45轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
之后对扩增曲线进行对数变化并确定循环阈值[C(T)]。建立标准校正曲线并确定定量PCR的线性。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为127bp。
如图10所示，左图为确定循环阈值(C(T))的所述对数扩增曲线。右图为根据循环阈值[C(T)]曲线得到的连续稀释的结核菌DNA的标准校正曲线。
与阴性对照相比，左图显示荧光强度随PCR反应重复而增加。右图显示线性(R_2)为0.997。
图12的X轴表示PCR反应循环，Y轴表示测得的荧光强度。峰1是PCR反应中每管6ng结核菌DNA的荧光强度，峰2是PCR反应中每管2ng结核菌DNA的荧光强度，峰3是PCR反应中每管500pg结核菌DNA的荧光强度，峰4是PCR反应中每管125pg结核菌DNA的荧光强度，峰5是PCR反应中每管31.3pg结核菌DNA的荧光强度，峰6是PCR反应中每管7.8pg结核菌DNA的荧光强度，峰7是PCR反应中每管1.95pg结核菌DNA的荧光强度。
图11显示了连续稀释的结核菌DNA的凝胶电泳结果。泳道1是PCR反应中每管6ng结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道2是PCR反应中每管2ng结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道3是PCR反应中每管500pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道4是PCR反应中每管125pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道5是PCR反应中每管31.3pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道6是PCR反应中每管7.8pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道7是PCR反应中每管1.95pg结核菌DNA的凝胶电泳结果。泳道8是阴性对照的凝胶电泳结果，泳道9表示100bp大小的标记物。
实施例8.采用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的定量PCR
按照实施例5中反应条件的浓度对结核菌DNA进行定量实时PCR。实施例2中制造的Seq.ID No.1和2被用作引物，Seq.ID No.13-17所示的寡核苷酸至少之一被用作探针。
用所述各引物和引物在各个试管中制备20μl用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mMMgCl2，混合物的最终浓度为1.4mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，其最终浓度为0.5μM。
在试管中加入中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.16，使其浓度为1.0μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.12U(单位)。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。蒸馏水用作阴性对照。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，56℃退火50秒，72℃延伸40秒，共进行46轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
之后对扩增曲线进行对数变化并确定循环阈值[C(T)]。建立标准校正曲线并确定定量PCR的线性。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为127bp。
如图12所示，左图为确定循环阈值(C(T))的所述对数扩增曲线。右图为根据循环阈值[C(T)]曲线得到的连续稀释的结核菌DNA的标准校正曲线。
与阴性对照相比，左图显示荧光强度随PCR反应重复而增加。右图显示线性(R_2)为0.993。
图12的X轴表示PCR反应循环，Y轴表示测得的荧光强度。峰1是PCR反应中每管6ng结核菌DNA的荧光强度，峰2是PCR反应中每管2ng结核菌DNA的荧光强度，峰3是PCR反应中每管500pg结核菌DNA的荧光强度，峰4是PCR反应中每管125pg结核菌DNA的荧光强度，峰5是PCR反应中每管31.3pg结核菌DNA的荧光强度。
图13显示了连续稀释的结核菌DNA的凝胶电泳结果。泳道1是PCR反应中每管6ng结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道2是PCR反应中每管2ng结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道3是PCR反应中每管500pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道4是PCR反应中每管125pg结核菌DNA的凝胶电泳结果，泳道5是PCR反应中每管31.3pg结核菌DNA的凝胶电泳结果。泳道6是阴性对照的凝胶电泳结果，泳道7表示100bp大小的标记物。
实施例9.采用5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR交叉污染实验
从被λ噬菌体(Ci857 Sam7)感染的热诱导型溶源性大肠杆菌菌株(dam-，dcm-)分离并精制λDNA。
按照实施例4的反应条件，采用5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行交叉污染反应。
Seq.ID No.8-12所示寡核苷酸至少之一在该实施例中被用作探针。Seq.ID No.1和2被用作结核菌DNA的PCR引物，Seq.ID No.6和7被用作λDNA的PCR引物。
用所述各引物和引物在各个试管中制备20μl用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
为对结核菌DNA进行PCR，在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mMdCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最终浓度分别为2mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，使其浓度分别为0.5μM。
之后在试管中加入5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.10，使其浓度为2.5μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.2U(单位)。在各试管中加入2μl实施例1的精制的结核菌DNA。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
为对λDNA进行PCR，在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最终浓度为2mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.6和7，使其最终浓度分别为0.5μM。
在试管中加入5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.10，使其浓度为2.5μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.2U(单位)。在各试管中加入10pg λDNA。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
然后进行实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸40秒，共进行44轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。
图14显示了当在两个试管中加入Seq.ID No.10时结核菌DNA和λDNA的实时PCR结果。结核菌DNA的荧光强度随反应循环重复而增加，而λDNA的荧光强度在反应循环重复时不改变。图14的X轴表示PCR循环，Y轴表示测得的荧光强度。
泳道1是结核菌DNA各反应循环的荧光强度图，泳道2是λDNA各反应循环的荧光强度图。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为127bp。λDNA的扩增产物的大小为100bp。
在图14，泳道3是结核菌DNA实时PCR产物的凝胶电泳结果，泳道4是λDNA实时PCR产物的凝胶电泳结果。泳道5表示100bp大小的标记物。
实施例10.采用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR交叉污染实验
按照实施例5的反应条件，采用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行交叉污染反应。
在本发明实施例2中制备的Seq.ID No.13-17至少之一被用作探针。Seq.ID No.1和2被用作结核菌DNA的PCR引物，Seq.ID No.6和7被用作λDNA的PCR引物。
用所述各引物和引物在各个试管中制备20μl用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
为对结核菌DNA进行PCR，在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mMdCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最终浓度分别为1.5mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.1和2，使其浓度分别为0.5μM。
在试管中加入中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.16，使其浓度为1.0μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.15U(单位)。在各试管中加入1.5μl实施例1的精制的结核菌DNA。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
为对λDNA进行PCR，在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(200mM Tris-HCl，100mMKCl，pH9.0)、2μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgCl2，混合物的最终浓度为1.5mM。在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.6和7，使其最终浓度分别为0.5μM。
之后在试管中加入中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID Nos.16，使其浓度为1.0μM。在每个反应试管中加入Clen Taq聚合酶(BIONEER Co.)使其浓度为0.15U(单位)。在各试管中加入10pg λDNA。在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，56℃退火50秒，72℃延伸40秒，共进行46轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
图15显示了当在两个试管中加入Seq.ID No.16时结核菌DNA和λDNA的实时PCR结果。结核菌DNA的荧光强度随反应循环重复而增加，而λDNA的荧光强度在反应循环重复时不改变。图15的X轴表示PCR循环，Y轴表示测得的荧光强度。
泳道1是结核菌DNA各反应循环的荧光强度图，泳道2是λDNA各反应循环的荧光强度图。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用中间区域用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为127bp。λDNA的扩增产物的大小为100bp。
在图15，泳道3是结核菌DNA实时PCR产物的凝胶电泳结果，泳道4是λDNA实时PCR产物的凝胶电泳结果。泳道5表示100bp大小的标记物。
实施例11.采用在碱基序列3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR
VentR(exo-)DNA聚合酶是一种无VentR DNA聚合酶的3′5’校正外切核酸酶活性的聚合酶。通过采用所述聚合物，3’末端用荧光染料标记的探针可发射出具有其特异性的光。
在该实施例中，表1和表2中的Seq.ID No.19和20被用作引物，Seq.ID No.21被用作探针。
用所述各引物和引物在试管中制备20μl用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(100mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，2mM MgSO4、0.1％Trition X-100，NEB Co.)、3μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgSO4，使各自的最终浓度分别为2mM、3mM和4mM。
之后在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.19和20，使其浓度分别为0.6μM。
然后在试管中加入3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID No.21，使其最终浓度分别为1.0μM和2.5μM。然后在各反应试管中加入VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB Co.)，使其最终为0.25U。
在各试管中加入0.5ml实施例1的精制的结核菌DNA。然后在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行三步骤实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性6分钟，95℃变性30秒，53℃退火60秒，72℃延伸50秒，共进行50轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
图16显示了1.0μM Seq.ID No.21和2mM MgCl2条件下的实时PCR结果。该结果显示，荧光强度随反应循环重复而增加。图16的X轴表示PCR循环，Y轴表示测得的荧光强度。
泳道1是在采用结核菌DNA和1.0μM3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR各循环中测得的荧光强度图。泳道2是是在采用蒸馏水和1.0μM3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR各循环中测得的荧光强度图。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用3’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为118bp。
如图16所示，泳道3是泳道1的PCR产物的凝胶电泳结果，泳道4是泳道2的PCR产物的凝胶电泳结果。
实施例12.采用在两个末端(5’末端和3’末端)用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR
VentR(exo-)DNA聚合酶是一种无VentR DNA聚合酶的3′5’校正外切核酸酶活性的聚合酶。通过采用所述聚合物，3’末端用荧光染料标记的探针可发射出具有其特异性的光。
在该实施例中，表1和表2中的Seq.ID No.19和20被用作引物，Seq.ID No.22被用作探针。
用所述各引物和引物在试管中制备20μl用于进行PCR的反应缓冲液。
缓冲液按以下过程制备。
在试管中加入2μl 10x反应缓冲液(100mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，2mM MgSO4、0.1％Trition X-100，NEB Co.)、3μl 10mM dNTP(分别为2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP)和20mM MgSO4，使各自的最终浓度分别为2mM、3mM和4mM。
之后在试管中加入扩增靶核酸的引物Seq.ID Nos.19和20，使其浓度分别为0.6μM。
然后在试管中加入在3’和5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针Seq.ID No.22，使其最终浓度分别为1.0μM和2.5μM。然后在各反应试管中加入VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB Co.)，使其最终为0.25U。
在各试管中加入0.5ml实施例1的精制的结核菌DNA。然后在试管中加入蒸馏水至终体积为20μl，并用微量离心机甩下。
然后用PCR仪(OpticonTM，MJ Co.)进行三步骤实时PCR。在上述PCR中，94℃预变性6分钟，95℃变性30秒，53℃退火60秒，72℃延伸50秒，共进行50轮。
测量每个退火步骤的荧光强度并用测得的数据建立实时PCR产物的扩增曲线。
图17显示了1.0μM Seq.ID No.22和2mM MgCl2条件下的实时PCR结果。该结果显示，荧光强度随反应循环重复而增加。图17的X轴表示PCR循环，Y轴表示测得的荧光强度。
泳道1是在采用结核菌DNA和1.0μM在3’和5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR各循环中测得的荧光强度图。泳道2是是在采用蒸馏水和1.0μM在3’和5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的探针进行的PCR各循环中测得的荧光强度图。
PCR产物按实施例4的方法通过凝胶电泳鉴定。用在3’和5’末端用DNA绿亚磷酰胺标记的引物获得的扩增产物的大小为118bp。
如图17所示，泳道3是泳道1的PCR产物的凝胶电泳结果，泳道4是泳道2的PCR产物的凝胶电泳结果。

Claims (34)

1.一种实时检测扩增核酸的荧光探针，其特征在于，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化。
2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光染料与寡核苷酸5’末端区域、3’末端区域和中间区域至少之一相连。
3.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的3’末端被封闭从而不能从所述3’末端开始复制。
4.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光染料选自吖啶同型二聚体及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放线菌素D及其衍生物、放线菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氢乙锭及其衍生物、溴化乙锭及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、单叠氮乙锭及其衍生物、碘化己锭及其衍生物、双苯酰亚胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羟蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙锭(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
5.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，通过使所述荧光染料结合或取代所述寡核苷酸中的碱基而标记所述寡核苷酸。
6.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针与至少一部分区域杂交，所述区域位于距离结合有所述引物3’末端的碱基1-15个碱基的范围内。
7.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40个碱基构成。
8.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述寡核苷酸含有选自Seq.IDNos.1-22的碱基序列。
9.一种核酸扩增的实时检测方法，该方法包括以下步骤：
i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；
ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；
iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；
iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；
v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；
vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；
vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；和
viii)重复步骤iv)-vii)一次以上。
10.如权利要求9所述的实时检测方法，其特征在于，所述步骤vii)与步骤vi)同时进行。
11.一种检测样品中核酸初始量的方法，所述方法包括以下步骤：
i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、荧光探针、4种核苷酸和DNA聚合酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；
ii)加热步骤i)中制备的水性缓冲液至93-96℃使所述双链核酸变性成为单链；
iii)将步骤ii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链与所述引物对退火；
iv)将步骤iii)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；
v)加热步骤iv)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；
vi)将步骤v)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；
vii)测量步骤vi)所得溶液发射的荧光强度；
viii)重复步骤iv)-vii)一次以上；
ix)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和
x)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述步骤vii)与步骤vi)同时进行。
13.一种扩增核酸的组合物，所述组合物包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iii)DNA聚合酶；和iv)4种核苷酸。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述荧光染料与寡核苷酸5’末端区域、3’末端区域和中间区域至少之一相连。
15.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针的3’末端被封闭从而不能从所述3’末端开始复制。
16.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述荧光染料选自吖啶同型二聚体及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放线菌素D及其衍生物、放线菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氢乙锭及其衍生物、溴化乙锭及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、单叠氮乙锭及其衍生物、碘化己锭及其衍生物、双苯酰亚胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羟蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙锭(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
17.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，通过使所述荧光染料结合或取代所述寡核苷酸中的碱基而标记所述寡核苷酸。
18.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针与至少部分区域杂交，所述区域位于距离结合有所述引物3’末端的碱基1-15个碱基的范围内。
19.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40个碱基构成。
20.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸含有选自Seq.IDNos.1-22的碱基序列。
21.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，真空干燥所述组合物。
22.一种核酸扩增的实时检测方法，所述方法包括以下步骤：
i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；
ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；
iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；
iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；
v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；
vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；
vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；
viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；和
ix)重复步骤v)-viii)一次以上。
23.如权利要求22所述的检测方法，其特征在于，所述步骤viii)与步骤vii)同时进行。
24.一种检测样品中核酸初始量的方法，所述方法包括以下步骤：
i)制备含有核酸、扩增所述核酸的一对引物、反转录引物、荧光探针、4种核苷酸、DNA聚合酶和反转录酶的水性缓冲液，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；
ii)将步骤i)中制备的水性缓冲液加热至42-50℃从而复制单链cDNA；
iii)将所述步骤ii)中获得的溶液加热至93-96℃从而使所述单链cDNA的反转录引物和反转录酶变性；
iv)将所述步骤iii)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述引物对退火；
v)将所述步骤iv)中获得的溶液加热至70-74℃从而复制所述单链核酸；
vi)加热所述步骤v)中获得的溶液至93-96℃使所述复制的核酸变性成为单链；
vii)将所述步骤vi)中获得的溶液冷却至50-57℃使所述单链核酸与所述荧光探针退火；
viii)测量步骤vii)所得溶液发射的荧光强度；
ix)重复步骤v)-viii)一次以上；
x)利用已知核酸初始量的样品建立表明核酸初始量的对数值和实施上述步骤i)-ix)所显示的循环阈值之间相关性的标准校正曲线；和
xi)参照步骤ix)中获得的标准校正曲线，根据与实施步骤i)-ix)所获得的循环阈值相对应的对数值检测核酸的初始量。
25.如权利要求24所述的检测方法，其特征在于，所述步骤viii)与步骤vii)同时进行。
26.一种扩增核酸的组合物，其包含：i)扩增所述核酸的一对引物；ii)反转录引物iii)荧光探针，其中，荧光探针中的荧光染料和碱基序列与所述核酸的至少一部分互补的寡核苷酸连接，当荧光染料嵌入双链核酸时其荧光强度发生变化；iv)DNA聚合酶；v)反转录酶，和iv)4种核苷酸。
27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述荧光染料与寡核苷酸5’末端区域、3’末端区域和中间区域至少之一相连。
28.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针的3’末端被封闭从而不能从所述3’末端开始复制。
29.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述荧光染料选自吖啶同型二聚体及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放线菌素D及其衍生物、放线菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氢乙锭及其衍生物、溴化乙锭及其衍生物、EthD-1及其衍生物、EthD-2及其衍生物、单叠氮乙锭及其衍生物、碘化己锭及其衍生物、双苯酰亚胺(Hoechst 33258)及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羟蔗脒及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙锭(PI)及其衍生物和Cy-染料衍生物。
30.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，通过使所述荧光染料结合或取代所述寡核苷酸中的碱基而标记所述寡核苷酸。
31.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针与至少部分区域杂交，所述区域距离结合有所述引物3’末端的碱基1-15个碱基。
32.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸由10-40个碱基构成。
33.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸含有选自Seq.IDNos.1-22的碱基序列。
34.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，真空干燥所述组合物。
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