CN101245387A

CN101245387A - 一种用于dna检测的纳米金信号探针及其制备方法和dna检测的方法

Info

Publication number: CN101245387A
Application number: CNA2008100328701A
Authority: CN
Inventors: 樊春海; 刘兴奋; 王丽华; 宋世平
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明公开了一种用于DNA检测的纳米金信号探针及其制备方法和DNA检测的方法，该纳米金信号探针为表面同时组装了可以产生显色或荧光信号的蛋白质以及巯基修饰的信号探针DNA的纳米金颗粒溶液。在DNA的检测中利用固相载体，通过DNA的杂交形成固相载体－靶DNA－纳米金信号探针的三明治复合物。由于一个纳米金颗粒表面可以连接多个可以产生显色或荧光信号的蛋白质，一个可以产生显色或荧光信号的蛋白质特别是酶催化剂又可以催化多个底物发生化学反应，从而可以放大反应信号，因此可以显著提高检测的灵敏度。故本发明在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

Description

一种用于DNA检测的纳米金信号探针及其制备方法和DNA检测的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于DNA检测的纳米金信号探针及其制备方法和应用该纳米金信号探针的DNA检测的方法。

背景技术

DNA检测在临床诊断、单核苷酸多态性分析、DNA测序、法医学鉴定、器官移植、环境分析、反恐等领域具有重要的意义。随着人们对自身健康的日益关注，迫切需要能对各种重大疾病进行早期诊断和治疗，这就需要对致病基因进行高灵敏度的检测。然而，由于发病早期体内致病基因的含量非常低，无法对其进行直接检测，常常需要对待检基因或信号进行放大。目前，常用的放大方法包括聚合酶链反应(M.C.Estes，J.S.Sevall，Mol.Cell Probes2003，17，59)、bio-bar-code放大(J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science 2003，301，1884；J.M.Nam，S.I.Stoeva，C.A.Mirkin，J.Am.Chem.Soc.2004，126，5932)和共轭高分子放大(L Chen，D.W.McBranch，H.Wang，R.Helgeson，F.Wudl，D.G.Whitten，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，12287)等。然而，这些方法有的比较繁琐，费时、昂贵，有的又存在选择性和灵敏度较低的不足。因此，迫切需要发展新的简便、经济、无需标记并且选择性和灵敏度较高的方法来满足对微量样品的检测。

纳米技术的发展为生物分子的高灵敏度检测提供了新的思路。以纳米金、荧光量子点和磁性颗粒为典型代表的纳米颗粒，已被广泛应用于生物分子的固定，信号的放大以及待测物质的富集和浓缩。纳米金颗粒因具有优异的光学性能，巨大的比表面积以及形状与性能的可调控性，目前已陆续开发出了多种基于纳米金的新型DNA检测技术。

美国西北大学的Mirkin研究组(R.Elghanian，J.J.Storhoff，R.C.Mucic，R.L. Letsinger，C.A.Mirkin，Science 1997，277，1078)最先发展了一种纳米金表面组装DNA的方法。通常所用的纳米金是通过柠檬酸钠还原法制备的，表面包覆了一层负电荷的柠檬酸根离子。巯基修饰的DNA(SH-DNA)可与纳米金形成强的Au-S共价键，使包覆在纳米金表面的柠檬酸根离子被SH-DNA取代，从而将DNA牢固的组装在纳米金表面。由于纳米金颗粒具有光学性质随聚集状态(颗粒间距)的不同而变化的特点，因此通过DNA之间的杂交，可以使纳米金颗粒之间的距离发生改变，从而产生颜色的变化。基于此原理，他们实现了对单核苷酸多态性的检测。目前，DNA修饰的纳米金(DNA-AuNP)已经被广泛研究和使用，如作为分子尺、基因和蛋白质检测、DNA三螺旋的组装、金属离子检测以及DNA连接分子的检测等。

由于每个纳米金颗粒表面可以同时组装多个DNA分子，这为信号放大提供了一个很好的思路。Mirkin等(J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science 2003，301，1884)就发展了一种称为“bio-bar-code”的放大方法。这种方法采用磁性颗粒来连接捕获探针，可以从混合介质中特异性的捕获到靶序列；采用DNA-AuNP纳米颗粒作为信号探针，通过DNA之间的杂交形成三明治夹心结构，最后将纳米金颗粒表面的DNA分离下来进行检测，靶分子的量与分离下来的DNA的量直接相关，因此可以实现基因的检测。这种方法非常灵敏，但是需要将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，增加了反应的步骤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于DNA检测的纳米金信号探针，应用其进行DNA检测无需将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，步骤简便，而且具有较好的灵敏度和选择性。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种所述的纳米金信号探针的制备方法。

酶催化底物反应具有专一性强、速度快、效率高的特点，常被用于DNA的放大检测。在含有受检物质和酶的标本中加入酶反应的底物后，底物被酶催化生成具有颜色或荧光的产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，所以可根据颜色深浅或荧光强弱进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使检测方法达到很高的灵敏度。本发明人发现，酶或其它一些能自身反应生成具有颜色或光学性质的蛋白质可与纳米金吸附结合，故本发明人将纳米金的放大功能与酶促反应的放大功能有机结合起来，用以检测DNA。结果本发明人惊奇地发现不仅无需将DNA从纳米金表面分离下来再进行检测，简便了步骤，而且保持了较好的灵敏度和选择性。

因此，本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是：一种用于DNA检测的纳米金信号探针，其为表面组装有信号探针DNA的纳米金颗粒，其中该纳米金颗粒表面还同时组装了可以产生显色或荧光信号的蛋白质，所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质为能催化底物生成具有颜色或荧光信号的产物的酶，或具有自发光性能的荧光蛋白。

由于一个金颗粒表面可以同时组装多个DNA和蛋白质分子，因此本发明纳米金信号探针可以作为一种放大试剂，通过催化剂催化的底物反应或自身反应起到信号放大的作用。

根据本发明，优选的，所述的能催化底物生成具有颜色或光学性质的产物的酶，优选的可为辣根过氧化酶(HRP酶)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或荧光素酶；所述的自身具有颜色或光学性质的蛋白质，优选的可为绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋或藻红荧光蛋白。这些可以产生显色或荧光信号的蛋白质已为现有技术所公开(如文献：范春蕾、温珍昌.药物分析中常用的化学发光试剂及其应用进展.海南大学学报自然科学版，2006，24(1)：66-73；Shagin D.A.，Barsova E.V.，Yanushevich Y.G.，Fradkov A.F.，Lukyanov K.A.，Labas Y.A.，Ugalde J.A.，Meyer A.，Nunes J.M.，Widder E.A.，Lukyanov S.A.and Matz M.Z.GFP-like proteins as ubiquitous Metazoansuperfamily：evolution of functional features and structural complexity.Mol.Biol.Evol.2004，21(5)：841-850.)。所述纳米金信号探针上组装的蛋白质所产生的显色或荧光信号可以用常规的检测方法，如采用显色法或电化学方法等检测方法进行定量检测，从而对待检测的靶物质含量进行测定。

根据本发明，所述的纳米金颗粒可以按照现有技术，如上述Mirkin等公开的方法制备。优选的，所述的纳米金颗粒的粒径可以是10～20nm。

当本发明所述的纳米金颗粒表面组装的是能催化底物生成具有颜色或光学性质的产物的酶时，本发明纳米信号探针可简称为纳米酶。本发明优选辣根过氧化酶为例来说明。

本发明采用下列技术方案来解决上述第二个技术问题：一种如上所述的纳米金信号探针的制备方法，可以包括下列步骤：

1)将所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质加入到纳米金溶液中，调节pH，振荡温育，然后离心浓缩；

2)加入巯基修饰的信号探针DNA溶液，室温温育组装；

3)加入封闭液封闭金颗粒表面的空余的结合位点，然后将此混合物离心、用洗涤液洗涤。

优选的，步骤1)所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质可以是酶，如辣根过氧化酶，加入的摩尔量可以是纳米金的1250～2500倍。酶的加入是过量的，但过量太多了不仅造成试剂的浪费，也会降低组装的效率，故通常不超过2500倍，而更优选1250倍。优选的，步骤1)所述的pH可为7～9，pH9最佳。温育时较佳的可在37℃振荡(350rpm)30分钟。

纳米金具有很好的生物相容性，可以吸附蛋白质，辣根过氧化酶是一种蛋白质。辣根过氧化酶与纳米金的连接是通过吸附作用实现的。

同常规，步骤1)所述的纳米金溶液的制备可以采用柠檬酸三钠还原法制备。

根据本发明，步骤2)中作为信号探针的DNA序列与纳米金的连接同现有的方法。其中的信号探针DNA序列修饰有巯基，与纳米金通过金硫键连接。通常将信号探针DNA加入纳米金溶液，室温反应16小时左右，然后逐次加入1MPBS至NaCl终浓度为0.1M，静置过夜。优选的，步骤2)所述的加入的巯基修饰的信号探针摩尔数可为纳米金的100～500倍，300倍最佳。

优选的，步骤3)中所述的封闭液可为10mM PB，100mM NaCl，1.5w/v％PEG，1w/v％BSA，pH7.4的PBS缓冲溶液，所述的洗涤液为10mM PB，0.1M NaCl，pH7.4的PBS缓冲溶液。其中，封闭液还可以含有其它常规使用的封闭剂如酪蛋白等，封闭的反应时间0.5-1小时，优选30分钟。

优选的，步骤1)或步骤3)中所述的离心条件可为13,000rpm，30min，4℃。

如果纳米金信号探针不马上使用，则可用等体积的储备液重新悬浮，4℃储存备用。所说的储备液优选含有10mM PB，0.1M NaCl，1w/v％BSA，0.01w/v％硫柳汞，pH7.4的PBS。

本发明还在上述基础上设计了一种固相载体辅助的纳米金信号探针信号放大的方法，实现对DNA高灵敏度和高选择性的检测。

因此，本发明还提供一种DNA的检测方法，可包括以下步骤：

1)通过固定于磁性颗粒上的捕获探针将靶向DNA连接在固相载体表面；

2)加入上述本发明的纳米金信号探针，通过DNA之间的杂交形成固相载体-靶向DNA-纳米金信号探针的三明治复合物；

3)然后使该纳米金信号探针上的可以产生显色或荧光信号的蛋白质催化底物生成具有一定颜色或荧光的产物并进行显色或荧光测定，或直接测定荧光蛋白自身的荧光信号。

根据本发明，步骤1)可以采用现有技术，如背景技术中的文献以及本申请人公开号为CN1808101A的申请文件所公开的方法来实现。通常采用商业化的修饰有链亲和素的磁珠(MMPs)和修饰有生物素的捕获探针，通过生物素与链亲和素之间的特异性反应，将生物素修饰的捕获探针连接在固相载体表面；然后通过捕获探针与靶向DNA的杂交反应将靶向DNA捕获于固相载体上；当固相载体为磁性颗粒时，易于靶向DNA的快速富集和分离。

而步骤2)中为使纳米金颗粒表面的巯基修饰的信号探针尽量保持竖立起来的状态，而不是倒伏在金颗粒表面，以利于与靶向DNA的结合，同常规，选用间隔DNA分子(spacer DNA)来占据纳米金颗粒表面的空余位点。因为封闭剂如BSA和酶如HRP分子较大，而巯基DNA之间又可能会产生空间位阻，所以用另一条较短的巯基修饰的DNA作为Spacer，其序列同现有技术，通常为10个T或A，相应地在信号探针巯基端也设计连续的相同碱基以产生空间位阻而使信号探针竖立，同时提高与靶的杂交效率。本发明以SH-T10为例来说明。较佳地，步骤2)中通常选用含有信号探针和SpacerDNA的工作液，其中信号探针和Spacer DNA的摩尔比例较好的可为1∶2。该工作液的最佳配方是：750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，pH7.4，0.5％(w/v)BSA，1μM spacer DNA，1.5nM纳米金信号探针(以纳米金的浓度来计，为1.5nM)。

较佳地，捕获探针与靶向DNA，以及靶向DNA与信号探针之间的杂交温度控制在25～42℃之间，更佳的是37℃左右。

优选的，步骤3)所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质可以是辣根过氧化酶，可以加入HPPA[3-(4-羟基苯丙酸)]和H₂O₂的荧光底物进行反应，相应地采用荧光法进行检测。根据本发明，可以通过底物的选择采用不同的检测方法，例如，采用TMB或ABTS时可以采用显色法；采用TMB时，也可以采用电化学方法。显然，所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质可以是能催化底物生成具有颜色或荧光信号的产物的其它酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或荧光素酶；也可以是自身具有颜色或光学性质的蛋白质，如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或藻红荧光蛋白等。反应生成的具有颜色或荧光信号的物质的量与标本中受检DNA的量直接相关，所以可根据颜色深浅或荧光强弱进行定性或定量分析，除荧光方法外，还可以用比色法、紫外-可见光谱法等。

相对于现有技术，本发明设计的纳米金信号探针信号放大的DNA检测方法，实现了对DNA的高灵敏度检测。与PCR放大方法相比，这种基于纳米金信号探针的方法无需对靶进行PCR扩增，即可实现信号的倍增；与Mirkin的bio-bar-code方法相比，这种方法又具有无需对DNA进行分离即可实现更灵敏检测的优点。本发明中所提供的纳米金信号探针制备简单，成本低廉，而且可以通过底物的选择采用不同的检测方法，使用很方便。本发明可以显著提高DNA及DNA突变检测，特别是基因如乳腺癌易感基因BRCA1及其突变基因检测的选择性和灵敏度，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

附图说明：

下面结合附图对本发明做进一步说明。

图1为本发明基于磁性颗粒和纳米酶的DNA检测方法的工作原理图。

图2为反应温度分别为25℃、37℃和42℃时本发明对不同浓度的靶基因进行检测的结果。

图3为对本发明检测方法的特异性进行研究的结果；其中a为靶浓度为0；b为非同源靶(浓度为250nM)，c为靶基因(浓度为250pM)。

图4为对本发明检测方法的灵敏度进行分析的结果；其中A为浓度0～25000pM靶序列产生的荧光信号，B为荧光信号随靶浓度的变化趋势图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的工作流程及功效，但本发明并不仅限于此。

以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其他未具体注明的实验条件按照常规或以其制造厂商所建议的条件。

荧光检测所用仪器为荧光分光光度计(Hitachi F-4500，日本)。荧光光谱测量条件：氙灯激发，激发和发射狭峰宽度均为2.5nm，电压PMT950V，响应时间2S。激发波长为320nm，发射波长扫描范围330-600nm。用3mL石英比色皿进行测量，样品体积1mL，室温。

链亲和素修饰的超顺磁性颗粒(magnetic micro-particles，MMPs)购于Promega公司，颗粒直径为1.0μm左右，固含量为1mg/mL，结合能力为1.25nmol探针/mg MMPs。

纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得(如Grabar，K.C.；Freeman，R.G；Hommer，M.B.；Natan，M.J.Anal.Chem.1995，67，735-743)。取浓度为0.1％的氯金酸溶液100mL，在带有回流装置的圆底烧瓶中加热至沸腾，然后向其中迅速加入3.5mL浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌并加热15分钟。然后停止加热，继续搅拌20分钟，冷却至室温，用0.2μm的硝酸纤维素膜过滤，4℃冷藏备用。根据此方法，即可制备浓度为2.3nM，粒径为15nm左右的纳米金溶胶。

各种DNA序列如表1所示，均购自上海生物工程技术有限公司。其中，DNA3为特异性的靶序列，为乳腺癌易感基因BRCA1。

表1 寡聚核苷酸碱基组成表

功能	名称	碱基组成
功能	名称	碱基组成	捕获探针信号探针特异性靶非同源序列spacer	DNA1DNA2DNA3DNA4DNA	5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-BIOTIN-3’5’-SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTTTTGTATGAATTATAATCAAA-3’5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3’5’-ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATA ACGTT-3’5’-SH-TTTTTTTTTT-3’

实施例所用各种溶液成分如表2所示，其中的纳米酶工作液中所用的纳米酶是由实施例1制备的纳米酶1。

表2溶液成分表

溶液名称	溶液组成
溶液名称	溶液组成	0.5×SSCTTLTTA杂交液封闭液纳米酶储备液纳米酶工作液荧光底物反应液1M PBS0.1M PBS	75mM NaCl，7.5mM柠檬酸钠，pH7.4100mM Tris-HCl，0.1％(v/v)Tween 20，1M LiCl，pH 8.0250mM Tris-HCl，0.1％(v/v)Tween 20，5％(w/v)BSA，pH7.4750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，pH7.410mM PB，100mM NaCl，1.5％(w/v)PEG，1％(w/v)BSA，pH7.410mM PB，0.1M NaCl，1％(w/v)BSA，0.01(w/v)％硫柳汞，pH7.437μL杂交液，2.5μL of 10％(w/v)BSA，0.7μL 73μM spacer DNA，6μL以纳米金计浓度为10nM的纳米酶0.1M Tris-HCl，0.05％(w/v)HPPA，0.0075％(v/v)H₂O₂，pH8.5100mM PB，1M NaCl，pH7.410mM PB，0.1M NaCl，pH7.4

实施例1 纳米酶的制备

纳米酶1制备的方法为：将100μL浓度为1％(w/v)HRP(购自Sigma公司)溶液加入到5mL纳米金溶液中(HRP：纳米金摩尔比为1250∶1)，用NaOH溶液调节pH为9.0。然后37℃温育30分钟，温育的同时轻轻振荡(350rpm)。然后用离心法(13,000rpm，30min，4℃)浓缩到1mL(纳米金浓度约为10nM)。然后加入巯基修饰的DNA2溶液(终浓度1.5μM，巯基修饰的信号探针摩尔数为纳米金的300倍)，室温温育16小时。然后逐次加入一定量1M PBS至NaCl终浓度为0.1M，室温静置过夜。之后再加入100μL浓度为10％(w/v)BSA溶液封闭金颗粒表面的空余位点，室温封闭30分钟。然后将此混合物离心、洗涤，以去除游离的DNA，HRP和BSA，洗涤液为0.1M PBS。重复三次，最后用等体积的纳米酶储备液重新悬浮，然后用其配置纳米酶工作液。

纳米酶2制备的方法为：将200μL浓度为1％(w/v)HRP溶液加入到5mL纳米金溶液中(HRP：纳米金摩尔比为2500∶1)，用NaOH溶液调节pH为7.0。然后37℃温育30分钟，温育的同时轻轻振荡(350rpm)。然后用离心法(13,000rpm，30min，4℃)浓缩到1mL。然后加入巯基修饰的DNA2溶液(终浓度0.5μM，巯基修饰的信号探针摩尔数为纳米金的100倍)，室温温育16小时。然后逐次加入一定量1M PBS至NaCl终浓度为0.1M，室温静置过夜。之后再加入100μL浓度为10％(w/v)BSA溶液封闭金颗粒表面的空余位点，室温封闭60分钟。然后将此混合物离心、洗涤，以去除游离的DNA，HRP和BSA，洗涤液为0.1MPBS。重复三次，最后用等体积的纳米酶储备液重新悬浮，4℃储存备用。

纳米酶3制备的方法为：将100μL浓度为1％(w/v)HRP溶液加入到5mL纳米金溶液中(HRP：纳米金摩尔比为1250∶1)，用NaOH溶液调节pH为9.0。然后37℃温育30分钟，温育的同时轻轻振荡(350rpm)。然后用离心法(13,000rpm，30min，4℃)浓缩到1mL。然后加入巯基修饰的DNA2溶液(终浓度2.5μM，巯基修饰的信号探针摩尔数为纳米金的500倍)，室温温育16小时。然后逐次加入一定量1M PBS至NaCl终浓度为0.1M，室温静置过夜。之后再加入100μL浓度为10％(w/v)BSA溶液封闭金颗粒表面的空余位点，室温封闭30分钟。然后将此混合物离心、洗涤，以去除游离的DNA，HRP和BSA，洗涤液为0.1MPBS。重复三次，最后用等体积的纳米酶储备液重新悬浮，4℃储存备用。

以上制备的三种纳米酶，通过实验过程中观察纳米酶的颜色、离心时的沉淀速度、聚集状态、稳定性等因素评价纳米酶的优劣。纳米金的颜色为酒红色，若制备的纳米酶与纳米金相比颜色基本不变，也为酒红色，说明制备的纳米酶较好，稳定性和分散性都较好。若纳米酶的颜色有偏紫甚至偏兰的倾向，则表明纳米酶的稳定性很差，容易发生聚集，基本不能使用。

本实施例考察纳米酶制备的适用条件和优选条件。结果表明，制备的纳米酶1性能最好，颜色与纳米金的颜色完全一致，仍然为酒红色，可于4℃冰箱保存3周以上仍无明显变化。纳米酶2和3性能稍差，新鲜制备的样品颜色为酒红色，性能较好，但是4℃放置2周以上就出现极少量聚集、肉眼可见紫色的颗粒，不宜再使用。

实施例2本发明反应温度对靶基因检测的影响

按产品说明书要求，MMPs在使用前首先用0.5×SSC缓冲液洗涤3次，然后将biotin(生物素)标记的捕获探针DNA 1加入到含有TTL缓冲液的MMPs中，轻轻混合约10分钟。捕获探针的表面密度约为4～6×10¹¹链/cm²。然后将MMPs和捕获探针的复合物(MMPs-capture probe，记为MMPs-cp)用TTA缓冲液洗两次，悬浮于杂交液中，4℃冷藏备用。

将50μL MMPs-cp加入到1.5mL离心管中，磁性分离弃上清，然后加入1mL杂交缓冲液，同时加入浓度0～25nM之间的特异性靶向DNA3，分别在25℃，37℃和42℃的温度下，800rpm，反应1小时。然后加入50μL纳米酶工作液，37℃再反应1小时。最后，磁性分离去除游离纳米酶，接着用杂交液洗2-3次。然后加入底物反应液，室温反应30分钟，磁性分离收集上清，进行荧光测定。其工作原理如图1所示。

本实施例考察反应温度对靶基因检测的影响，结果见图2。结果表明，反应温度较高(42℃)时，有利于低浓度靶DNA的杂交，但是不利于较高浓度靶DNA的杂交，这可能是因为在高浓度靶DNA体系中，部分三明治结构(磁性颗粒-靶-纳米酶的复合物)发生了解链的缘故。反应温度较低(25℃)时，又会大大降低低浓度靶DNA的杂交效率。相比之下，反应温度为37℃时，完全能满足对各种浓度靶DNA进行检测的需要。

实施例3本发明对DNA检测的特异性

参照实施例2中的条件进行实验，反应温度为37℃，分析本发明检测方法对DNA检测的特异性。分别对浓度为250pM的特异性靶向序列DNA3和浓度为250nM的非同源序列DNA4进行了检测。

结果如图3所示。可以看出，即使是浓度高达1000倍的非同源序列，也可以与特异性靶显著区分，表明该方法具有较高的特异性。

实施例4本发明DNA的检测灵敏度

参照实施例2中的条件进行反应，分别对浓度为0～25000pM的靶向序列DNA3进行检测。

本实施例分析该检测方法的灵敏度，结果如图4所示。由图可知，采用这种磁性颗粒辅助的纳米酶放大的荧光检测方法，可灵敏检测2.5pM～25nM范围内的靶基因，在该范围内，荧光信号与靶浓度的关系符合Sigmoid曲线。与本发明人曾经报道的基于共轭高分子的放大方法相比(H.Xu，H.Wu，F.Huang，S.Song，W.Li，Y.Cao C.Fan，Nucl.Acids Res.2004，33，e83)，灵敏度提高了近三个数量级。与Mirkin等报道的基于纳米金的bio-bar-code放大方法相比，具有无需对信号进行分离即可实现检测的优点。

Claims

1、一种用于DNA检测的纳米金信号探针，其为表面组装有信号探针DNA的纳米金颗粒，其特征是该纳米金颗粒表面还同时组装了可以产生显色或荧光信号的蛋白质，所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质为能催化底物生成具有颜色或荧光信号的产物的酶，或具有自发光性能的荧光蛋白。

2、根据权利要求1所述的纳米金信号探针，其特征是所述的能催化底物生成具有颜色或荧光信号的产物的酶是辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或荧光素酶；所述的具有自发光性能的荧光蛋白是绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋或藻红荧光蛋白。

3、根据权利要求1所述的纳米金信号探针，其特征是所述的纳米金颗粒的粒径是10～20nm。

4、一种如权利要求1～3任一项所述的纳米金信号探针的制备方法，其特征是其包括下列步骤：

1)将可以产生显色或荧光信号的蛋白质溶液加入到纳米金溶液中，调节pH，振荡温育，然后离心浓缩；

2)加入巯基修饰的信号探针DNA溶液，室温温育组装；

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述的加入的可以产生显色或荧光信号的蛋白质的摩尔量是纳米金的1250～2500倍，所述的pH为7～9；步骤2)中所述的加入的巯基修饰的信号探针摩尔数为纳米金的100～500倍。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述的加入的可以产生显色或荧光信号的蛋白质的摩尔量是纳米金的1250倍，所述的pH为9；步骤2)中所述的加入的巯基修饰的信号探针摩尔数为纳米金的300倍。

7、根据权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤3)中所述的封闭液为10mM PB，100mM NaCl，1.5w/v％PEG，1w/v％BSA，pH7.4的PBS缓冲溶液；所述的洗涤液为10mM PB，0.1M NaCl，pH7.4的PBS缓冲溶液；步骤1)或步骤3)所述的离心条件均为13,000rpm，30min，4℃。

8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤3)洗涤后的纳米金信号探针用等体积的储备液重新悬浮，4℃储存备用，所说的储备液为含有10mM PB，0.1M NaCl，1w/v％BSA，0.01w/v％硫柳汞，pH7.4的PBS。

9、一种DNA的检测方法，其特征是其包括以下步骤：

2)加入权利要求1～3任一项所述的纳米金信号探针，通过DNA之间的杂交形成固相载体-靶向DNA-纳米金信号探针的三明治复合物；

10、根据权利要求9所述的检测方法，其特征是步骤2)所述纳米金信号探针的溶液中包含间隔DNA分子；步骤3)中所述的可以产生显色或荧光信号的蛋白质为辣根过氧化酶时，加入其荧光底物3-(4-羟基苯丙酸)和H₂O₂进行反应，采用荧光法进行检测。