JP2002506984A - 検出方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
溶液相核酸サンドイッチアッセイを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、ここで、固形支持体は光平面導波路であり、そしてラベルは導波路のエバネッセント場内で励起する発光を測定することによって検出される。全自動化システムを用いることができる。該方法は極めて低濃度での疾患に関連する核酸の検出に有益であることができる。
Description
【０００１】 本発明は、ポリヌクレオチドの非同位体的定量化、特に光学センサー技術を用
いる配列特異的認識及び定量化に関する。
いる配列特異的認識及び定量化に関する。
【０００２】 分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）技術を用いる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ
型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）の臨床サンプル中の核酸を直接的に定量する方法が開発されいる（De
war et al (1994) J. Infect. Dis. 170, 1172-1179; US 4,868,105）。シグナ ル増幅及び酵素シグナル発生のための多分枝オリゴヌクレオチドを用いるこの方
法は、与えられたウイルスの数千ゲノム（生理的濃度）を検出することができる
。ｂＤＮＡ技術を用いる溶液相核酸サンドイッチアッセイがＵＳ４,８６８,１０
５に記載されている。
型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）の臨床サンプル中の核酸を直接的に定量する方法が開発されいる（De
war et al (1994) J. Infect. Dis. 170, 1172-1179; US 4,868,105）。シグナ ル増幅及び酵素シグナル発生のための多分枝オリゴヌクレオチドを用いるこの方
法は、与えられたウイルスの数千ゲノム（生理的濃度）を検出することができる
。ｂＤＮＡ技術を用いる溶液相核酸サンドイッチアッセイがＵＳ４,８６８,１０
５に記載されている。
【０００３】 液相核酸サンドイッチアッセイは、表面上の（キャプチャープローブ／標的核
酸／ラベルプローブ中サンドイッチの）ラベルプローブを固定化することによっ
て標的核酸を検出するための、キャプチャープローブの最小限セット及びラベル
プローブの最小限セットを使用し、そうして結合及び非結合ラベルの分離及び結
合（又は非結合）ラベルそしてそれゆえ標的核酸の検出／定量を可能にする。キ
ャプチャー及びラベルプローブは、ＵＳ４,８６８,１０５に記載されているよう
なｂＤＮＡを含むことができる。
酸／ラベルプローブ中サンドイッチの）ラベルプローブを固定化することによっ
て標的核酸を検出するための、キャプチャープローブの最小限セット及びラベル
プローブの最小限セットを使用し、そうして結合及び非結合ラベルの分離及び結
合（又は非結合）ラベルそしてそれゆえ標的核酸の検出／定量を可能にする。キ
ャプチャー及びラベルプローブは、ＵＳ４,８６８,１０５に記載されているよう
なｂＤＮＡを含むことができる。
【０００４】 シグナル増幅方法の使用は、高感度の検出及び定量を可能にするが、特にもし
測定すべき標的ポリヌクレオチドが血液、組織又は植物抽出物のような複合媒質
中に得られた場合には定量が正確でないという不都合を有する。サンプル中に存
在する分子が、シグナル増幅を妨害することができ、そしてこれによって再現性
が低下し、そしてそれゆえに定量方法としての使用の適合性が低下する。妨害す
る夾雑物のレベルを低下させるためのサンプル調整工程を実施することができる
が、これらは時間がかかり、また別の変動要因を持ち込むかもしれない。
測定すべき標的ポリヌクレオチドが血液、組織又は植物抽出物のような複合媒質
中に得られた場合には定量が正確でないという不都合を有する。サンプル中に存
在する分子が、シグナル増幅を妨害することができ、そしてこれによって再現性
が低下し、そしてそれゆえに定量方法としての使用の適合性が低下する。妨害す
る夾雑物のレベルを低下させるためのサンプル調整工程を実施することができる
が、これらは時間がかかり、また別の変動要因を持ち込むかもしれない。
【０００５】 このようにシグナル増幅方法、特にｂＤＮＡの不都合は、i）更なる増幅工程 の必要性、ii）アッセイの最後の２工程、すなわち、結合標識ＤＮＡ複合体表面
へのｂＤＮＡのハイブリダイゼーション及びｂＤＮＡへのラベルプローブ（かさ
高な酵素ラベル）のハイブリダイゼーションによる、かなり高率のＮＳＢ／非特
異的ハイブリダイゼーション（ＮＳＨ）に恐らく関連する扱いにくい化学的性質
、iii）遅い、緩慢な結合速度、それゆえのｂＤＮＡ工程それ自体の低効率、iv ）延長された（長くなった）アッセイ方法である。
へのｂＤＮＡのハイブリダイゼーション及びｂＤＮＡへのラベルプローブ（かさ
高な酵素ラベル）のハイブリダイゼーションによる、かなり高率のＮＳＢ／非特
異的ハイブリダイゼーション（ＮＳＨ）に恐らく関連する扱いにくい化学的性質
、iii）遅い、緩慢な結合速度、それゆえのｂＤＮＡ工程それ自体の低効率、iv ）延長された（長くなった）アッセイ方法である。
【０００６】 ポリヌクレオチドは、タンパク質のような他の荷電した高分子と強く結合する
傾向を有する。経験則では、この結合は、より大きい／よりかさ高いヌクレオチ
ドほど強くなることができる。ｂＤＮＡはサンプル媒質中の高分子に結合するこ
とができるため、１の工程で全ｂＤＮＡアッセイを実施することを不可能にする
。溶液相中のか又は表面上の複合体への多様な種類の非特異的な結合が、アッセ
イ後期中の過剰量のｂＤＮＡを捕獲する可能性がある。これらの全てが、特に複
合サンプルを扱う場合に、増大した測定変動性をもたらす。
傾向を有する。経験則では、この結合は、より大きい／よりかさ高いヌクレオチ
ドほど強くなることができる。ｂＤＮＡはサンプル媒質中の高分子に結合するこ
とができるため、１の工程で全ｂＤＮＡアッセイを実施することを不可能にする
。溶液相中のか又は表面上の複合体への多様な種類の非特異的な結合が、アッセ
イ後期中の過剰量のｂＤＮＡを捕獲する可能性がある。これらの全てが、特に複
合サンプルを扱う場合に、増大した測定変動性をもたらす。
【０００７】 上記方法では、非結合ラベルから標的ポリヌクレオチドに結合しているラベル
を分離する必要もある。これは、測定へ更なる変動性を持ち込む可能性がある。
もしラベルを蛍光、化学発光又は吸光によって検出するとすれば、サンプル媒質
の光学不透過率がサンプル媒質中に残存するラベルの検出を障害することができ
、そして更なる変動性を持ち込む可能性がある。
を分離する必要もある。これは、測定へ更なる変動性を持ち込む可能性がある。
もしラベルを蛍光、化学発光又は吸光によって検出するとすれば、サンプル媒質
の光学不透過率がサンプル媒質中に残存するラベルの検出を障害することができ
、そして更なる変動性を持ち込む可能性がある。
【０００８】 低濃度でポリヌクレオチドを検出する他の方法は、検出方法の使用に先立ち標
的ポリヌクレオチドのコピー数を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応のよう
な増幅方法を利用する。ＰＣＲのような標的増幅方法で動作する診断システムは
、他の定量化問題、すなわち増幅過程中に持ち込む誤差を欠点として持つ可能性
がある。標的ポリヌクレオチド配列での突然変異も、検出能力に対する数百倍の
影響を有することもありうる（Urdea (1994) Biotechnology 12, 926-928）。
的ポリヌクレオチドのコピー数を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応のよう
な増幅方法を利用する。ＰＣＲのような標的増幅方法で動作する診断システムは
、他の定量化問題、すなわち増幅過程中に持ち込む誤差を欠点として持つ可能性
がある。標的ポリヌクレオチド配列での突然変異も、検出能力に対する数百倍の
影響を有することもありうる（Urdea (1994) Biotechnology 12, 926-928）。
【０００９】 したがって、増幅工程を必要とせず、またサンプル物質の成分によってより干
渉され難い、非常に低濃度で標的ポリヌクレオチドを検出する方法の必要性があ
る。
渉され難い、非常に低濃度で標的ポリヌクレオチドを検出する方法の必要性があ
る。
【００１０】 発明の要約 この必要性は、光導波路のエバネッセント場で励起した発光の検出に基づく方
法によって満足させることができる。
法によって満足させることができる。
【００１１】 標的ポリヌクレオチドを検出する方法は、溶液相核酸サンドイッチアッセイを
用い、ここで、固体支持体は、光平面導波路であり、そしてラベルを、導波路の
エバネッセント場で励起した発光を測定することによってか、又は導波路の場近
辺で生じた発光を測定することによって検出する。
用い、ここで、固体支持体は、光平面導波路であり、そしてラベルを、導波路の
エバネッセント場で励起した発光を測定することによってか、又は導波路の場近
辺で生じた発光を測定することによって検出する。
【００１２】 エバネッセント場の現象は、光平面導波路の例を用いて説明することができる
。もし光波が、低屈折率の媒質によって囲まれている光平面導波路内に結合する
とすれば、それは、導波層境界での近−全反射によって制限される。最も簡単な
場合としては、光平面導波路は、３層のシステム：基質、導波層、上層（又は調
査すべきサンプル）からなり、導波層が、最高の屈折率を有する。さらなる中間
層は、光平面導波路の作用を更に改善することができる。
。もし光波が、低屈折率の媒質によって囲まれている光平面導波路内に結合する
とすれば、それは、導波層境界での近−全反射によって制限される。最も簡単な
場合としては、光平面導波路は、３層のシステム：基質、導波層、上層（又は調
査すべきサンプル）からなり、導波層が、最高の屈折率を有する。さらなる中間
層は、光平面導波路の作用を更に改善することができる。
【００１３】 この装置においては、１部分の電磁エネルギーは、より低い屈折率の媒質に入
射する。この部分を、エバネッセント（減衰）場と呼ぶ。エバネッセント場の強
度は、導波層それ自体の厚さ及び導波層とその周囲媒質との屈折率の比に極めて
大きな程度で依存する。薄い導波路、すなわち、層の厚さが導波すべき波長と同
じか又はそれより小さい場合には、導波光の離散モードを識別することができる
。
射する。この部分を、エバネッセント（減衰）場と呼ぶ。エバネッセント場の強
度は、導波層それ自体の厚さ及び導波層とその周囲媒質との屈折率の比に極めて
大きな程度で依存する。薄い導波路、すなわち、層の厚さが導波すべき波長と同
じか又はそれより小さい場合には、導波光の離散モードを識別することができる
。
【００１４】 エバネッセント場を用いると、例えば、比較的低い屈折率の媒質中での発光を
励起し、そして導波領域のみに隣接する発光を励起することができる。この原理
は、エバネッセント発光励起として公知である。
励起し、そして導波領域のみに隣接する発光を励起することができる。この原理
は、エバネッセント発光励起として公知である。
【００１５】 エバネッセント発光励起は、励起が導波層の隣接部に限られることから分析に
用いられる。したがって、導波層に隣接しないあらゆる発光分子を、検出するこ
とはなく、また、導波路表面で、例えば生化学的相互作用によって結合している
発光分子を測定するために除去すべき必要性もない。
用いられる。したがって、導波層に隣接しないあらゆる発光分子を、検出するこ
とはなく、また、導波路表面で、例えば生化学的相互作用によって結合している
発光分子を測定するために除去すべき必要性もない。
【００１６】 発光色素でラベルした抗体及び抗原のエバネッセント発光励起を測定する方法
及び装置は公知であり、例えばＵＳ−Ａ−４,５８２,８０９に記載されている。
その中に記載されている装置は、エバネッセント発光励起のために光ファイバー
を用いる。そのような光ファイバーは、一般的には、１mmまでの直径を有し、レ
ーザー光がその中へ結合するとき多数のモードを導波する。エバネッセント励起
発光は、ファイバーに戻って結合する部分を用いるだけで容易に測定することが
できる。この装置は、比較的大きく、そして比較的大量のサンプルを必要とする
。感度は、高マルチモード導波路に関連する比較的弱いエバネッセント場強度に
よって制限される。感度は、更に、端面出力結合によって制限される：励起及び
発光放射が共線的に伝播し、そしてビームスプリッター及びフィルター（例えば
カットオフフィルター又は帯域フィルター）によって分離されなければならない
ため、フィルターユニットの識別性が検出感度を制限する。
及び装置は公知であり、例えばＵＳ−Ａ−４,５８２,８０９に記載されている。
その中に記載されている装置は、エバネッセント発光励起のために光ファイバー
を用いる。そのような光ファイバーは、一般的には、１mmまでの直径を有し、レ
ーザー光がその中へ結合するとき多数のモードを導波する。エバネッセント励起
発光は、ファイバーに戻って結合する部分を用いるだけで容易に測定することが
できる。この装置は、比較的大きく、そして比較的大量のサンプルを必要とする
。感度は、高マルチモード導波路に関連する比較的弱いエバネッセント場強度に
よって制限される。感度は、更に、端面出力結合によって制限される：励起及び
発光放射が共線的に伝播し、そしてビームスプリッター及びフィルター（例えば
カットオフフィルター又は帯域フィルター）によって分離されなければならない
ため、フィルターユニットの識別性が検出感度を制限する。
【００１７】 光平面導波路を用いるエバネッセント励起条件下でのバイオセンサーの発光を
測定するための測光計器も、同様に公知であり、そして１６０nm〜１０００nmの
厚さの平面導波路を用いる例がＷＯ９０／０６５０３に記載されている。
測定するための測光計器も、同様に公知であり、そして１６０nm〜１０００nmの
厚さの平面導波路を用いる例がＷＯ９０／０６５０３に記載されている。
【００１８】 様々な試みがエバネッセント励起発光を増加させるため及び統合光センサーを
製造するために行われてきた。これらは、高度に均一な光学特性、及び再現性の
ある一定の層の厚さの平面導波路の製造における改良、並びに回折格子の使用を
含む導波路層へ光波を結合する性質の改良を含んでいる（Chemical, Biochemica
l and Environmental Fiber Sensors V (1994), Proc. SPIE, 2068, 313-325） 。発光と組み合わせた回折格子の使用が、ＵＳ−Ａ−５,０８１,０１２及びＷＯ
９５／３３１９８に記載されている。ＵＳ−Ａ−５,０８１,０１２では、励起光
は２００nm〜１０００nmの厚さの導波フィルムに結合し、次いで検出領域として
用いる部分を通じて第２反射回折格子まで伝播し、その結果、結合している光波
を回折格子間のセンサー領域を通じて少なくとも２倍に伝えなければならない。
これが感度を増強させると思われる。しかし、反射が励起光の散乱の増加、及び
バックグラウンド放射強度の増大をもたらす可能性があることが不都合である。
ＷＯ９５／３３１９８では、第１回折格子を、導波路の結合励起光のために用い
、そして伝播される励起モードに沿って励起しそして導波路に戻り結合している
第２分離回折格子を、その発光量をアウトカップリングするために用いている。
製造するために行われてきた。これらは、高度に均一な光学特性、及び再現性の
ある一定の層の厚さの平面導波路の製造における改良、並びに回折格子の使用を
含む導波路層へ光波を結合する性質の改良を含んでいる（Chemical, Biochemica
l and Environmental Fiber Sensors V (1994), Proc. SPIE, 2068, 313-325） 。発光と組み合わせた回折格子の使用が、ＵＳ−Ａ−５,０８１,０１２及びＷＯ
９５／３３１９８に記載されている。ＵＳ−Ａ−５,０８１,０１２では、励起光
は２００nm〜１０００nmの厚さの導波フィルムに結合し、次いで検出領域として
用いる部分を通じて第２反射回折格子まで伝播し、その結果、結合している光波
を回折格子間のセンサー領域を通じて少なくとも２倍に伝えなければならない。
これが感度を増強させると思われる。しかし、反射が励起光の散乱の増加、及び
バックグラウンド放射強度の増大をもたらす可能性があることが不都合である。
ＷＯ９５／３３１９８では、第１回折格子を、導波路の結合励起光のために用い
、そして伝播される励起モードに沿って励起しそして導波路に戻り結合している
第２分離回折格子を、その発光量をアウトカップリングするために用いている。
【００１９】 導波路表面に近接する発光分子の励起のための導波層中に伝播する励起光に関
連するエバネッセント場を用いることの他に、慣用的な透過照度立体配置又は表
面照度を用いて導波路の場近辺で発光団を励起することも可能である。導波する
層の表面に位置する分析物を、平面導波路の支持体を通してか又は導波する層の
反対の放射を通してかのいずれかの励起光で直接的に照射する。場近辺は、導波
する発光のエバネッセント場の侵入深度により定義されることが理解される。こ
の場合、導波路を伝播する励起光の量は無視し得る。しかし、導波路の場近辺内
の発光団を起源とする発光量から、有意量が導波路内に結合され、そしてアウト
カップリング回折回折格子を用いる光検出器に伝えられることができる。この立
体配置を有するバックカップリングメカニズムの高い幾何学的空間選択性のため
に、極めて低いバックグラウンドシグナル、高い選択性を達成することができる
。
連するエバネッセント場を用いることの他に、慣用的な透過照度立体配置又は表
面照度を用いて導波路の場近辺で発光団を励起することも可能である。導波する
層の表面に位置する分析物を、平面導波路の支持体を通してか又は導波する層の
反対の放射を通してかのいずれかの励起光で直接的に照射する。場近辺は、導波
する発光のエバネッセント場の侵入深度により定義されることが理解される。こ
の場合、導波路を伝播する励起光の量は無視し得る。しかし、導波路の場近辺内
の発光団を起源とする発光量から、有意量が導波路内に結合され、そしてアウト
カップリング回折回折格子を用いる光検出器に伝えられることができる。この立
体配置を有するバックカップリングメカニズムの高い幾何学的空間選択性のため
に、極めて低いバックグラウンドシグナル、高い選択性を達成することができる
。
【００２０】 複数のサンプルで同時のか又は急速な遷移のエバネッセント的励起発光の検出
を可能にすることもまた改良点である。例えば、ＷＯ９４／２７１３７は、エバ
ネッセント的励起蛍光を用いるイムノアッセイを実施する装置及び方法を提言し
ている。
を可能にすることもまた改良点である。例えば、ＷＯ９４／２７１３７は、エバ
ネッセント的励起蛍光を用いるイムノアッセイを実施する装置及び方法を提言し
ている。
【００２１】 ＷＯ９２／１９９７６は、複合的シグナル、例えば人工鼻による匂いの検出を
検出するための複数の統合測定片を含む装置を記載している。
検出するための複数の統合測定片を含む装置を記載している。
【００２２】 ＷＯ９６／３５９４０は、普通の基質での少なくとも２個の平面の、別個の、
無機の、誘電性の導波領域に基づくセンサー基盤を記載しており、この基盤は平
行エバネッセント励起、及び同一又は異なる分析物の発光の検出に適している。
これらの別個の導波領域は、各々が１個以上の結合回折格子を有することができ
る。センサー基盤の実質的な利点は、例えば、いくつかのサンプル溶液を高感度
で同時に分析することができることである。リアルタイム検出能力のゆえに、個
々の測定の間の洗浄又はクリーニング工程を必要とせず、その結果、単位時間当
たりの高いサンプル処理能力が達成された。同時の複数サンプル溶液の分析に加
えて、同時に試験すべきいくつかの分析物の１個のサンプル溶液又は１つのセン
サー基盤で連続してもまた可能である。これは、血液又は血清の場合に特に有利
であり、したがって特に速くかつ経済的に実施することができる。いくつかのサ
ンプル溶液を同時に分析するとき、独立した導波領域は、異なるサンプルからの
発光シグナル間の混信を防止する。高度の選択性及び低誤差率が、この方法で達
成された。
無機の、誘電性の導波領域に基づくセンサー基盤を記載しており、この基盤は平
行エバネッセント励起、及び同一又は異なる分析物の発光の検出に適している。
これらの別個の導波領域は、各々が１個以上の結合回折格子を有することができ
る。センサー基盤の実質的な利点は、例えば、いくつかのサンプル溶液を高感度
で同時に分析することができることである。リアルタイム検出能力のゆえに、個
々の測定の間の洗浄又はクリーニング工程を必要とせず、その結果、単位時間当
たりの高いサンプル処理能力が達成された。同時の複数サンプル溶液の分析に加
えて、同時に試験すべきいくつかの分析物の１個のサンプル溶液又は１つのセン
サー基盤で連続してもまた可能である。これは、血液又は血清の場合に特に有利
であり、したがって特に速くかつ経済的に実施することができる。いくつかのサ
ンプル溶液を同時に分析するとき、独立した導波領域は、異なるサンプルからの
発光シグナル間の混信を防止する。高度の選択性及び低誤差率が、この方法で達
成された。
【００２３】 個々の独立した導波領域は、光学的、化学的又は流体工学的に選択的に扱うこ
とができる。
とができる。
【００２４】 １個のモードか又は少数個のモードだけを導波する、物理的にか又は光学的に
分離している平面導波領域を有するセンサー基盤は、特に適切である。このよう
なセンサー基盤は、ＷＯ９５／３３１９７に記載されている。特に高感度及び極
めて小さい構造であることが優れている。ＷＯ９５／３３１９７に記載されてい
るような導波フィルムパラメーターを用いると、導波する光波の減衰を３dＢ／c
m未満にすることができ、それによってその周囲の媒質への長距離ガイドビーム 及びガイド波の低散乱をもたらす。このようなセンサー基盤は、“チップ”とし
て公知である可能性がある。一般に、同程度の感度は、平面構造のマルチモード
導波路を用いて達成されない。
分離している平面導波領域を有するセンサー基盤は、特に適切である。このよう
なセンサー基盤は、ＷＯ９５／３３１９７に記載されている。特に高感度及び極
めて小さい構造であることが優れている。ＷＯ９５／３３１９７に記載されてい
るような導波フィルムパラメーターを用いると、導波する光波の減衰を３dＢ／c
m未満にすることができ、それによってその周囲の媒質への長距離ガイドビーム 及びガイド波の低散乱をもたらす。このようなセンサー基盤は、“チップ”とし
て公知である可能性がある。一般に、同程度の感度は、平面構造のマルチモード
導波路を用いて達成されない。
【００２５】 ポリヌクレオチドの検出及び定量方法に基づくエバネッセント励起蛍光の使用
は、ＷＯ９５／３３１９８、ＷＯ９６／３５９４０及びＷＯ９５／３３１９７に
言及されているが検出感度を最適化する方法は記載されていない。
は、ＷＯ９５／３３１９８、ＷＯ９６／３５９４０及びＷＯ９５／３３１９７に
言及されているが検出感度を最適化する方法は記載されていない。
【００２６】 本発明は、特に低濃度でのポリヌクレオチドの検出方法でのエバネッセント励
起蛍光の検出感度を開発する。この方法は、光平面導波路の表面上にキャプチャ
ーしている（すなわち変性しかつ固定化している）標的ポリヌクレオチドに結合
しているか又は結合する複数の蛍光ラベルをしたポリヌクレオチド（ラベルエク
ステンダープローブ）を使用する。標的ポリヌクレオチドは、導波路に結合して
いるキャプチャープローブの単一種の複数のコピーに結合する、１個又は一連の
キャプチャーエクステンダープローブに結合することによってキャプチャーされ
ている。別の方法として、キャプチャーエクステンダープローブ（キャプチャー
プローブを用いない場合）又はキャプチャープローブは、導波路表面に結合して
いるレセプターに結合することができるリガンドを更に含むことができる。エバ
ネッセントはその表面からの距離に対し指数的に減衰するため、導波路表面から
遠すぎるラベルを設置しないようにできる。結合しているラベルを、次にエバネ
ッセント場で検出する。結合しているラベルは、アッセイサンプル中に存在する
標的ポリヌクレオチドの量に比例し、標的ポリヌクレオチドの量は、既知量の標
的ポリヌクレオチドを含むサンプルとの参照によってか、又は既知濃度又は純度
の同一配列を有する任意のポリヌクレオチドを用いて作成したマスターカーブを
用いることによって定量することができる。定量は、内部標準又は２又は複数の
波長アプローチ、すなわちエネルギー転移又は２ラベル一致アプローチを用いる
こともできる。内部標準は、標的ポリヌクレオチドでなければならない；内部標
準として用いるべき基準を満たすために設計されたあらゆる配列であることがで
きる。
起蛍光の検出感度を開発する。この方法は、光平面導波路の表面上にキャプチャ
ーしている（すなわち変性しかつ固定化している）標的ポリヌクレオチドに結合
しているか又は結合する複数の蛍光ラベルをしたポリヌクレオチド（ラベルエク
ステンダープローブ）を使用する。標的ポリヌクレオチドは、導波路に結合して
いるキャプチャープローブの単一種の複数のコピーに結合する、１個又は一連の
キャプチャーエクステンダープローブに結合することによってキャプチャーされ
ている。別の方法として、キャプチャーエクステンダープローブ（キャプチャー
プローブを用いない場合）又はキャプチャープローブは、導波路表面に結合して
いるレセプターに結合することができるリガンドを更に含むことができる。エバ
ネッセントはその表面からの距離に対し指数的に減衰するため、導波路表面から
遠すぎるラベルを設置しないようにできる。結合しているラベルを、次にエバネ
ッセント場で検出する。結合しているラベルは、アッセイサンプル中に存在する
標的ポリヌクレオチドの量に比例し、標的ポリヌクレオチドの量は、既知量の標
的ポリヌクレオチドを含むサンプルとの参照によってか、又は既知濃度又は純度
の同一配列を有する任意のポリヌクレオチドを用いて作成したマスターカーブを
用いることによって定量することができる。定量は、内部標準又は２又は複数の
波長アプローチ、すなわちエネルギー転移又は２ラベル一致アプローチを用いる
こともできる。内部標準は、標的ポリヌクレオチドでなければならない；内部標
準として用いるべき基準を満たすために設計されたあらゆる配列であることがで
きる。
【００２７】 本方法は、ｂＤＮＡ研究方法と比べてより高い効率の検出カスケード（すなわ
ち、キャプチャーラベルの極めて高い全収率）、及び、したがって、関連する生
物学的標的サンプル（例えばＨＩＶウイルスｍＲＮＡ）の生理的濃度に相当する
ことができる５０未満の標的配列の検出を可能にする感度に相当するか又はより
高い感度をもたらす。
ち、キャプチャーラベルの極めて高い全収率）、及び、したがって、関連する生
物学的標的サンプル（例えばＨＩＶウイルスｍＲＮＡ）の生理的濃度に相当する
ことができる５０未満の標的配列の検出を可能にする感度に相当するか又はより
高い感度をもたらす。
【００２８】 “光平面導波路”は、実質的に平面の支持体からなる導波路及び支持体、並び
に該支持体より高い屈折率を有する１つの表面上の薄い透明層からなる導波路を
いい、その表面上の支持体及び薄い導波層の両者は、少なくとも検出すべき励起
及び発光波長間のスペクトル領域内で透明である。励起光のインカップリング（
incoupling）のため、導波層と接触して光結合素子、好ましくは回折光素子（Ｄ
ＯＥ）を変調する。好ましくは、ＤＯＥは、レリーフ回折格子である。回折格子
を、Proc. SPIE, 2068 (1993)313-325に記載されるように、例えば写真製版法に
よって、支持体層に最初に生成しそして次に導波層の蒸着によって導波層を転写
することができるか、又は蒸着した導波層内で生成することができる。より好ま
しくは、導波層内では、２個の独立した回折格子（一方を不結合回折格子として
用い、他方を励起している発光のアウトカップリング（outcoupling）として用 いる）で変調する。回折格子定数及び寸法は、ＷＯ９５／３３１９８、ＥＰ−Ａ
−０７５９１５９及びＷＯ９６／３５９４０に記載されている。光導波路技術は
、例えば、上記文献に記載されているように、当該技術分野で周知である。ここ
で、そして下記において透明性とは、励起波長〜検出すべき発光波長のスペクト
ル領域での透明性を意味する。
に該支持体より高い屈折率を有する１つの表面上の薄い透明層からなる導波路を
いい、その表面上の支持体及び薄い導波層の両者は、少なくとも検出すべき励起
及び発光波長間のスペクトル領域内で透明である。励起光のインカップリング（
incoupling）のため、導波層と接触して光結合素子、好ましくは回折光素子（Ｄ
ＯＥ）を変調する。好ましくは、ＤＯＥは、レリーフ回折格子である。回折格子
を、Proc. SPIE, 2068 (1993)313-325に記載されるように、例えば写真製版法に
よって、支持体層に最初に生成しそして次に導波層の蒸着によって導波層を転写
することができるか、又は蒸着した導波層内で生成することができる。より好ま
しくは、導波層内では、２個の独立した回折格子（一方を不結合回折格子として
用い、他方を励起している発光のアウトカップリング（outcoupling）として用 いる）で変調する。回折格子定数及び寸法は、ＷＯ９５／３３１９８、ＥＰ−Ａ
−０７５９１５９及びＷＯ９６／３５９４０に記載されている。光導波路技術は
、例えば、上記文献に記載されているように、当該技術分野で周知である。ここ
で、そして下記において透明性とは、励起波長〜検出すべき発光波長のスペクト
ル領域での透明性を意味する。
【００２９】 本発明の方法は、結合ラベルのみが検出されるため、結合又は非結合ラベルの
分離を必ずしも必要としない。サンプルの光学的不透明性は、結合ラベルの検出
に有意には影響しないという利点を有する。組み込まれている３部分からなる選
択性、すなわち、空間分解能のためのエバネッセント場、化学的選択性のための
生化学的認識、並びに強化された検出選択性及び検出感度のための蛍光ラベリン
グは、冗長なサンプル調製をすることなく血液、組織又は植物抽出物のような複
合サンプル中の微量の分析物の測定を可能にすることが見出された。
分離を必ずしも必要としない。サンプルの光学的不透明性は、結合ラベルの検出
に有意には影響しないという利点を有する。組み込まれている３部分からなる選
択性、すなわち、空間分解能のためのエバネッセント場、化学的選択性のための
生化学的認識、並びに強化された検出選択性及び検出感度のための蛍光ラベリン
グは、冗長なサンプル調製をすることなく血液、組織又は植物抽出物のような複
合サンプル中の微量の分析物の測定を可能にすることが見出された。
【００３０】 本発明の方法は、上記で論じたように、固体支持体が光平面導波路であり、結
合ラベルを結合ラベルの測定前に非結合ラベルと分離することができるか又は分
離しないことができ、及び該ラベルを導波路のエバネッセント場で励起している
発光を測定することによってか又は導波路の場近辺で生成する発光を測定するこ
とによって検出することを除いて、上記で検討したように、ＵＳ４,８６８,１０
５に記載されているものと同一であることができる溶液相核酸サンドイッチアッ
セイを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法を使用することができるとい
うことが理解される。
合ラベルを結合ラベルの測定前に非結合ラベルと分離することができるか又は分
離しないことができ、及び該ラベルを導波路のエバネッセント場で励起している
発光を測定することによってか又は導波路の場近辺で生成する発光を測定するこ
とによって検出することを除いて、上記で検討したように、ＵＳ４,８６８,１０
５に記載されているものと同一であることができる溶液相核酸サンドイッチアッ
セイを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法を使用することができるとい
うことが理解される。
【００３１】 エバネッセント場への蛍光ラベルを持ち込むために必要な２又は３のハイブリ
ダイゼーション相互作用が、単一のハイブリダイゼーション相互作用をもくろむ
光導波路を利用するポリヌクレオチド検出の上記方法に比べて本発明の方法をよ
り選択的にすることが見出されている。複数キャプチャー及び標的ポリヌクレオ
チドに結合することができるラベルエクステンダープローブが、上記方法に比べ
本方法をより高感度にすることが見出されている。
ダイゼーション相互作用が、単一のハイブリダイゼーション相互作用をもくろむ
光導波路を利用するポリヌクレオチド検出の上記方法に比べて本発明の方法をよ
り選択的にすることが見出されている。複数キャプチャー及び標的ポリヌクレオ
チドに結合することができるラベルエクステンダープローブが、上記方法に比べ
本方法をより高感度にすることが見出されている。
【００３２】 標的ポリヌクレオチドを導波路（種々のポリヌクレオチドでの再被覆を必要と
することができる）に結合しているポリヌクレオチドに直接的にハイブリダイズ
させる以前に記載されている方法（例えば、ＷＯ９５／３３１９８及びＷＯ９６
／３５９４０）とは対照的に、標的ポリヌクレオチドがキャプチャープローブに
直接ハイブリダイズしないことから、本発明の方法を用いる異なる標的ポリヌク
レオチドを検出するために、キャプチャープローブでの導波路の再被覆が必須で
なくてよいことが理解される。
することができる）に結合しているポリヌクレオチドに直接的にハイブリダイズ
させる以前に記載されている方法（例えば、ＷＯ９５／３３１９８及びＷＯ９６
／３５９４０）とは対照的に、標的ポリヌクレオチドがキャプチャープローブに
直接ハイブリダイズしないことから、本発明の方法を用いる異なる標的ポリヌク
レオチドを検出するために、キャプチャープローブでの導波路の再被覆が必須で
なくてよいことが理解される。
【００３３】 本発明の第１の側面は、２セットの試薬、すなわちラベリングセット及びキャ
プチャーセットを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、そして
ここで光平面導波路を用い、該方法は、 ２セットの試薬、すなわちラベリングセット及びキャプチャーセットを用いる
標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、そしてここで光平面導波路を用
い、該方法が １）ａ）ラベル部分、及び標的ポリヌクレオチドの同一又は異なる配列と相補的
である、同一又は異なる配列Ｌ１（好ましくは約５〜１００ヌクレオチド（nt）
長、より好ましくは約８〜１００nt長）を有する核酸部分（好ましくは１本鎖で
ある）、及び場合により、ラベル部分と、標的ポリヌクレオチド又はキャプチャ
ーエクステンダー若しくはキャプチャープローブ（約５００nt長未満である）の
配列のいずれにも相補的でない配列Ｌ１との間の第２配列（ラベル部分は、エバ
ネッセント性励起発光を包含する発光によって検出することができるシグナルを
提供するラベルを含む）を各々に含む、複数のラベルプローブ、又は ｂ）ラベル結合性核酸配列Ｌ２及び核酸配列Ｌ１（ここで、配列Ｌ１は、標的ポ
リヌクレオチドの核酸配列と相補的であり、そして配列Ｌ２は、ラベルプローブ
の核酸配列Ｌ３と相補的である）を各々に含む複数のラベルエクステンダープロ
ーブ（ｂ１）、及び場合により、Ｌ２の配列と相補的である核酸配列Ｌ３を含む
ラベルプローブ（ラベル部分は、エバネッセント性励起発光を包含する発光によ
って検出可能であるシグナルを提供するラベルを含む）（ｂ２）、 を含むラベリングセットの試薬を提供する工程、並びに ２）ｃ）標的ポリヌクレオチドの核酸配列と相補的である同一又は異なる核酸配
列Ｄ１を含む複数のキャプチャープローブ（ここで、核酸配列Ｄ１（好ましくは
約１０〜１００nt長）は、ラベルプローブ及びラベルエクステンダープローブに
含まれる配列Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と相補的でなく、そしてキャプチャープローブ
は直接的にか又は結合基を介して、導波路の導波層表面に結合しているか又は特
異的に結合することができる）、又は ｄ）標的ポリヌクレオチドの配列と相補的である配列Ｃ１（好ましくは約１０〜
１００nt長）を有する核酸領域（好ましくは１本鎖）、及び場合により、標的ポ
リヌクレオチドの配列と相補的ではなく、そして好ましくは約５００nt長未満で
ある第２の領域を各々に含み、そしてキャプチャープローブ認識核酸配列Ｃ２を
更に含む複数のキャプチャーエクステンダープローブ（ｄ１）、及び配列Ｃ２と
相補的である核酸配列Ｄ２を含むキャプチャープローブ（ｄ２）（ここで、配列
Ｌ１及びＣ１は同一でなく、非相補的配列である） を含む、キャプチャーリングセットの試薬を提供する工程、 ３）相補的配列の結合性条件下での水性媒質中で、標的ポリヌクレオチドの存在
を測定すべきサンプル（標的ポリヌクレオチドが一本鎖形態で存在するために処
理されていることができる）と、 （ａ）組成物１ａ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）及び２ｄ）、又は（ｂ）組成
物１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１ａ）、
１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１
ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）若しくは１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）、又は（ｄ）組成物
１ａ）、１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）とを結合させて複合物を形成する工程、 ４）工程３の複合物を、キャプチャープローブの（キャプチャープローブは、工
程３の複合物に結合する前に導波路に結合することができるか、又は工程３の複
合物に結合した後に導波路に結合することができる）複数のコピーによって導波
路に結合する工程、 ５）もし組成物１ｂ）が、ラベルプローブを含まず、そしてラベルが、工程３に
含まれず該複合物をラベルするときには、工程４の結合している複合物と該ラベ
ルとを結合する工程、並びに ６）導波路のエバネッセント場で励起する発光を測定することによってか、又は
導波路の場近辺で生成する発光を測定することによって標的ポリヌクレオチドに
結合しているラベルを検出する工程 を含む。
プチャーセットを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、そして
ここで光平面導波路を用い、該方法は、 ２セットの試薬、すなわちラベリングセット及びキャプチャーセットを用いる
標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、そしてここで光平面導波路を用
い、該方法が １）ａ）ラベル部分、及び標的ポリヌクレオチドの同一又は異なる配列と相補的
である、同一又は異なる配列Ｌ１（好ましくは約５〜１００ヌクレオチド（nt）
長、より好ましくは約８〜１００nt長）を有する核酸部分（好ましくは１本鎖で
ある）、及び場合により、ラベル部分と、標的ポリヌクレオチド又はキャプチャ
ーエクステンダー若しくはキャプチャープローブ（約５００nt長未満である）の
配列のいずれにも相補的でない配列Ｌ１との間の第２配列（ラベル部分は、エバ
ネッセント性励起発光を包含する発光によって検出することができるシグナルを
提供するラベルを含む）を各々に含む、複数のラベルプローブ、又は ｂ）ラベル結合性核酸配列Ｌ２及び核酸配列Ｌ１（ここで、配列Ｌ１は、標的ポ
リヌクレオチドの核酸配列と相補的であり、そして配列Ｌ２は、ラベルプローブ
の核酸配列Ｌ３と相補的である）を各々に含む複数のラベルエクステンダープロ
ーブ（ｂ１）、及び場合により、Ｌ２の配列と相補的である核酸配列Ｌ３を含む
ラベルプローブ（ラベル部分は、エバネッセント性励起発光を包含する発光によ
って検出可能であるシグナルを提供するラベルを含む）（ｂ２）、 を含むラベリングセットの試薬を提供する工程、並びに ２）ｃ）標的ポリヌクレオチドの核酸配列と相補的である同一又は異なる核酸配
列Ｄ１を含む複数のキャプチャープローブ（ここで、核酸配列Ｄ１（好ましくは
約１０〜１００nt長）は、ラベルプローブ及びラベルエクステンダープローブに
含まれる配列Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と相補的でなく、そしてキャプチャープローブ
は直接的にか又は結合基を介して、導波路の導波層表面に結合しているか又は特
異的に結合することができる）、又は ｄ）標的ポリヌクレオチドの配列と相補的である配列Ｃ１（好ましくは約１０〜
１００nt長）を有する核酸領域（好ましくは１本鎖）、及び場合により、標的ポ
リヌクレオチドの配列と相補的ではなく、そして好ましくは約５００nt長未満で
ある第２の領域を各々に含み、そしてキャプチャープローブ認識核酸配列Ｃ２を
更に含む複数のキャプチャーエクステンダープローブ（ｄ１）、及び配列Ｃ２と
相補的である核酸配列Ｄ２を含むキャプチャープローブ（ｄ２）（ここで、配列
Ｌ１及びＣ１は同一でなく、非相補的配列である） を含む、キャプチャーリングセットの試薬を提供する工程、 ３）相補的配列の結合性条件下での水性媒質中で、標的ポリヌクレオチドの存在
を測定すべきサンプル（標的ポリヌクレオチドが一本鎖形態で存在するために処
理されていることができる）と、 （ａ）組成物１ａ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）及び２ｄ）、又は（ｂ）組成
物１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１ａ）、
１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１
ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）若しくは１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）、又は（ｄ）組成物
１ａ）、１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）とを結合させて複合物を形成する工程、 ４）工程３の複合物を、キャプチャープローブの（キャプチャープローブは、工
程３の複合物に結合する前に導波路に結合することができるか、又は工程３の複
合物に結合した後に導波路に結合することができる）複数のコピーによって導波
路に結合する工程、 ５）もし組成物１ｂ）が、ラベルプローブを含まず、そしてラベルが、工程３に
含まれず該複合物をラベルするときには、工程４の結合している複合物と該ラベ
ルとを結合する工程、並びに ６）導波路のエバネッセント場で励起する発光を測定することによってか、又は
導波路の場近辺で生成する発光を測定することによって標的ポリヌクレオチドに
結合しているラベルを検出する工程 を含む。
【００３４】 配列Ｌ１の各々は、それぞれ物理的に別個の、該標的ポリヌクレオチドの非重
複領域と相補的であることが好ましく；そしてＬ１及びＣ１配列それぞれは、好
ましくは、それぞれ物理的に別個の該標的ポリヌクレオチドの非重複領域に相当
する、同一でなく非相補的な配列であることが好ましい。
複領域と相補的であることが好ましく；そしてＬ１及びＣ１配列それぞれは、好
ましくは、それぞれ物理的に別個の該標的ポリヌクレオチドの非重複領域に相当
する、同一でなく非相補的な配列であることが好ましい。
【００３５】 本発明において複数とは、少なくとも２個のラベルプローブ若しくはラベルエ
クステンダー、キャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダープローブ
が、異なる標的核酸配列と相補的である異なる核の配列を有して用いることを意
味する。それらは、１００個まで、好ましくは５〜８０個、より好ましくは５〜
５０個、最も好ましくは５〜４０個そして特に好ましくは１０〜３０個を用いる
ことができる。
クステンダー、キャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダープローブ
が、異なる標的核酸配列と相補的である異なる核の配列を有して用いることを意
味する。それらは、１００個まで、好ましくは５〜８０個、より好ましくは５〜
５０個、最も好ましくは５〜４０個そして特に好ましくは１０〜３０個を用いる
ことができる。
【００３６】 好ましくは、発光は、光結合素子を用いる導波されそしてアウトカップルされ
る導波路に結合される。
る導波路に結合される。
【００３７】 Ｃ１、Ｃ２、Ｌ１及びＤ１は、互いに同一でなくそしてＣ１、Ｌ１及びＤ１は
、互いに相補的でないことが好ましい。ラベルエクテンダーが、ラベルの結合部
位を含み、そしてその結合部位が、一本鎖核酸配列（Ｌ２）及びＬ２と相補的な
一本鎖核酸配列（Ｌ３）を含むラベルを含む場合には、そのＬ３はＤ１と相補的
でないことが好ましい。
、互いに相補的でないことが好ましい。ラベルエクテンダーが、ラベルの結合部
位を含み、そしてその結合部位が、一本鎖核酸配列（Ｌ２）及びＬ２と相補的な
一本鎖核酸配列（Ｌ３）を含むラベルを含む場合には、そのＬ３はＤ１と相補的
でないことが好ましい。
【００３８】 これに関連して本発明の好ましい実施態様としては、導波路のエバネッセント
場で励起する発光を検出する。
場で励起する発光を検出する。
【００３９】 別の実施態様は、導波路の場近辺で生成する発光、化学発光、生物発光又は電
界発光の検出を包含する。該発光は、好ましくは、光結合素子を用いる導波され
そしてアウトカップルされる導波路への結合である。
界発光の検出を包含する。該発光は、好ましくは、光結合素子を用いる導波され
そしてアウトカップルされる導波路への結合である。
【００４０】 導波路への励起光の結合、又は導波路から導波された発光の結合のための好ま
しい光結合素子は、支持媒質の導波層内で変調する回折格子である。
しい光結合素子は、支持媒質の導波層内で変調する回折格子である。
【００４１】 本発明の別の側面は、 １）表面に付着し、そして表面から伸長する複数のキャプチャープローブを有す
る表面を提供する工程、 ２）i）標的ポリヌクレオチドの特異的領域に結合するように適合している標的 部分及びii）該キャプチャープローブに結合するように適合しているキャプチャ
ー部分の各々を有する複数のキャプチャーエクテンダープローブを提供する工程
、 ３）キャプチャーエクテンダープローブをサンプルに暴露し、もしサンプル中に
存在すれば、標的ポリヌクレオチドを、キャプチャーエクステンダープローブに
結合させる工程、 ４）こうして結合した標的ポリヌクレオチドを、表面に付着している該キャプチ
ャープローブに暴露し、キャプチャーエクステンダープローブをキャプチャープ
ローブに結合させる工程、 ５）該標的ポリヌクレオチドを、i）標的ポリヌクレオチドの領域と特異的に結 合させるように適合されている標的部分及び ii）光学的に検出可能なラベルで 構成されるか、又はそれと結合するように適合されているラベル部分を各々有す
る複数のラベルエクステンダープローブ（該ラベルエクステンダープローブは、
本アッセイの条件下では、キャプチャープローブを結合することができない）に
暴露させる工程、及び ６）ラベルを検出する工程 を含む、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するアッセイ方法であって、
ラベルを光平面導波路の使用によって検出することを特徴とする。
る表面を提供する工程、 ２）i）標的ポリヌクレオチドの特異的領域に結合するように適合している標的 部分及びii）該キャプチャープローブに結合するように適合しているキャプチャ
ー部分の各々を有する複数のキャプチャーエクテンダープローブを提供する工程
、 ３）キャプチャーエクテンダープローブをサンプルに暴露し、もしサンプル中に
存在すれば、標的ポリヌクレオチドを、キャプチャーエクステンダープローブに
結合させる工程、 ４）こうして結合した標的ポリヌクレオチドを、表面に付着している該キャプチ
ャープローブに暴露し、キャプチャーエクステンダープローブをキャプチャープ
ローブに結合させる工程、 ５）該標的ポリヌクレオチドを、i）標的ポリヌクレオチドの領域と特異的に結 合させるように適合されている標的部分及び ii）光学的に検出可能なラベルで 構成されるか、又はそれと結合するように適合されているラベル部分を各々有す
る複数のラベルエクステンダープローブ（該ラベルエクステンダープローブは、
本アッセイの条件下では、キャプチャープローブを結合することができない）に
暴露させる工程、及び ６）ラベルを検出する工程 を含む、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するアッセイ方法であって、
ラベルを光平面導波路の使用によって検出することを特徴とする。
【００４２】 下記の点は、ここに記載するような本発明の１個以上の側面に関することがで
きることが理解される。
きることが理解される。
【００４３】 光平面導波路は、連続性基質上の光平面導波路であることが好ましい。基質は
、透明ガラス、石英又はポリカーボネートのような透明熱可塑性プラスチック材
料であることが更に好ましい。更に、これらは、導波層の屈折率より低い屈折率
、好ましくは基質の屈折率よりも低い屈折率を有する、基質と導波層との間の透
明中間層であることができる。
、透明ガラス、石英又はポリカーボネートのような透明熱可塑性プラスチック材
料であることが更に好ましい。更に、これらは、導波層の屈折率より低い屈折率
、好ましくは基質の屈折率よりも低い屈折率を有する、基質と導波層との間の透
明中間層であることができる。
【００４４】 導波層の屈折率は、用いられる、基質及びあらゆる中間層の屈折率を上回るべ
きである。平面の、透明導波層は、好ましくは１．８より大きい屈折率、更によ
り好ましくは２．０より大きい屈折率を有する物質から好ましくはなる。好適材
料は、例えば、無機物質、特に酸化無機金属、例えばＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ 5 、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2を包含する。ＴｉＯ2又はＴａ2Ｏ5が好ましい
。酸化無機金属の組み合わせは用いないことが好ましい。
きである。平面の、透明導波層は、好ましくは１．８より大きい屈折率、更によ
り好ましくは２．０より大きい屈折率を有する物質から好ましくはなる。好適材
料は、例えば、無機物質、特に酸化無機金属、例えばＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｎｂ2Ｏ 5 、Ｔａ2Ｏ5、ＨｆＯ2又はＺｒＯ2を包含する。ＴｉＯ2又はＴａ2Ｏ5が好ましい
。酸化無機金属の組み合わせは用いないことが好ましい。
【００４５】 導波層の厚さは、好ましくは４０〜１０００nm、より好ましくは４０〜３００
nmそして最も好ましくは７０〜１６０nmである。
nmそして最も好ましくは７０〜１６０nmである。
【００４６】 回折格子の変調深度は、好ましくは３〜６０nm、より好ましくは３〜３０nmで
ある。変調深度と導波層の厚さの比は、好ましくは０．５以下、そしてより好ま
しくは０．２以下である。
ある。変調深度と導波層の厚さの比は、好ましくは０．５以下、そしてより好ま
しくは０．２以下である。
【００４７】 回折格子は、光回折回折格子の形態、好ましくはレリーフ回折格子の形態であ
ることができる。レリーフ構造は、種々の形態、例えば、正弦、長方形又は鋸歯
状構造であることができる。
ることができる。レリーフ構造は、種々の形態、例えば、正弦、長方形又は鋸歯
状構造であることができる。
【００４８】 回折格子構造は、基質上に製造することができ、次に導波層に移動することが
でき、ここで回折格子構造は次にそれ自身を複製するか、又は回折格子は導波層
それ自身を生成する。
でき、ここで回折格子構造は次にそれ自身を複製するか、又は回折格子は導波層
それ自身を生成する。
【００４９】 回折格子周期は、２００〜１０００nmであることができ、光を最初の回折次数
で導波層の中か又は外で結合させることを可能にするために選択することができ
る。
で導波層の中か又は外で結合させることを可能にするために選択することができ
る。
【００５０】 導波層は、好ましくは１、２、３又は４モードだけを導波し、そしてより好ま
しくは単一モードの導波路である。
しくは単一モードの導波路である。
【００５１】 ラベルエクステンダープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ及びキ
ャプチャープローブは、一本鎖核酸領域を含むことができることが理解される。
ャプチャープローブは、一本鎖核酸領域を含むことができることが理解される。
【００５２】 “核酸”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）又は他の改変オリゴヌ
クレオチド、例えば、２′−Ｏ−メチル又はＰ＝Ｓ（ホスホロチオアート）類似
体を包含することが更に認められる。修飾オリゴヌクレオチド及び核酸類似体は
、アッセイの感度及び特異性を最適化することに有用であることができる。更に
、修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼで消化することがでないため、血液
血清又は植物抽出物の様な実際のサンプル中で、より安定であることができる。
クレオチド、例えば、２′−Ｏ−メチル又はＰ＝Ｓ（ホスホロチオアート）類似
体を包含することが更に認められる。修飾オリゴヌクレオチド及び核酸類似体は
、アッセイの感度及び特異性を最適化することに有用であることができる。更に
、修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼで消化することがでないため、血液
血清又は植物抽出物の様な実際のサンプル中で、より安定であることができる。
【００５３】 この工程は、記載順で実施しなくてもよいことに留意すべきであるが、この工
程を記載順に実施することは好ましい。特に、標的ポリヌクレオチド、ラベルエ
クステンダープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ、キャプチャープ
ローブ及びラベル（ラベルエクステンダープローブが含まれる場合）結合の順序
は、本発明の操作に重要ではないことに留意すべきである。標的ポリヌクレオチ
ドを、キャプチャープローブ（例えば、“プレインキュベーション”工程を実施
する）に結合する前にラベルエクスパンダープローブ及びキャプチャーエクステ
ンダープローブに結合することが好ましい。これは、シグナルを最適化しそして
バックグラウンドを最小限にすることができる。
程を記載順に実施することは好ましい。特に、標的ポリヌクレオチド、ラベルエ
クステンダープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ、キャプチャープ
ローブ及びラベル（ラベルエクステンダープローブが含まれる場合）結合の順序
は、本発明の操作に重要ではないことに留意すべきである。標的ポリヌクレオチ
ドを、キャプチャープローブ（例えば、“プレインキュベーション”工程を実施
する）に結合する前にラベルエクスパンダープローブ及びキャプチャーエクステ
ンダープローブに結合することが好ましい。これは、シグナルを最適化しそして
バックグラウンドを最小限にすることができる。
【００５４】 ハイブリダイゼーションアッセイを、特異的アッセイ標的（ｓｓ又はｄｓ；Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ）に応じて、いかなる可能な順序及び組み合わせでも実施すること
ができ、そして特定のアッセイでは、感度又は特異性のいずれかが最重要である
。両極端は： １）全アッセイを、その場所（in situ）、例えば、固定化レセプターを用いる か又は別個のプレインキュベーションチャンバー内で、溶液が平面導波路（ＰＷ
Ｇ）表面に接触するウェル内で、１工程で実施する方法。固定化レセプターは、
キャプチャーエクステンダーと結合することができ、したがって、ラベルを包含
する、溶液中に形成される全サンドイッチと結合することができる。 ２）別の同時ハイブリダイゼーション工程は、ＰＷＧの表面上で直接に逐次的に
実施する（例えば、連続的プロセス）。これらの両極端間のいかなる変化をも採
用することができる。
ＮＡ、ＲＮＡ）に応じて、いかなる可能な順序及び組み合わせでも実施すること
ができ、そして特定のアッセイでは、感度又は特異性のいずれかが最重要である
。両極端は： １）全アッセイを、その場所（in situ）、例えば、固定化レセプターを用いる か又は別個のプレインキュベーションチャンバー内で、溶液が平面導波路（ＰＷ
Ｇ）表面に接触するウェル内で、１工程で実施する方法。固定化レセプターは、
キャプチャーエクステンダーと結合することができ、したがって、ラベルを包含
する、溶液中に形成される全サンドイッチと結合することができる。 ２）別の同時ハイブリダイゼーション工程は、ＰＷＧの表面上で直接に逐次的に
実施する（例えば、連続的プロセス）。これらの両極端間のいかなる変化をも採
用することができる。
【００５５】 このように本発明の１側面は、上記第１の実施態様に記載している方法の工程
３及び４を合わせた方法であり、標的ポリヌクレオチドの存在を検出すべきサン
プルを、ラベルエクステンダープローブ及びキャプチャープローブと組み合わせ
、そしてキャプチャープローブは場合により該平面導波路に結合しており、それ
ゆえにキャプチャープローブを介して該平面導波路に結合している（ラベルエク
ステンダープローブ）＋（標的ポリヌクレオチド）＋（キャプチャーエクステン
ダープローブ）＋（キャプチャープローブ）複合体を形成する。キャプチャープ
ローブは、導波路表面に固定化するのが好ましいが、より複雑な複合なサンドイ
ッチ配置も可能であることが理解される。
３及び４を合わせた方法であり、標的ポリヌクレオチドの存在を検出すべきサン
プルを、ラベルエクステンダープローブ及びキャプチャープローブと組み合わせ
、そしてキャプチャープローブは場合により該平面導波路に結合しており、それ
ゆえにキャプチャープローブを介して該平面導波路に結合している（ラベルエク
ステンダープローブ）＋（標的ポリヌクレオチド）＋（キャプチャーエクステン
ダープローブ）＋（キャプチャープローブ）複合体を形成する。キャプチャープ
ローブは、導波路表面に固定化するのが好ましいが、より複雑な複合なサンドイ
ッチ配置も可能であることが理解される。
【００５６】 アッセイ工程での溶液は、水性溶液であることが好ましい。あらゆる適切なバ
ッファー溶液、例えば、ｐＨ７．０に調整した７５mMクエン酸ナトリウム、７５
０mM塩化ナトリウム、０．１％テルギトール（Tergitol）ＮＰ−４０（Tergitol
は、一連の湿潤剤の登録商標である）であることができる。
ッファー溶液、例えば、ｐＨ７．０に調整した７５mMクエン酸ナトリウム、７５
０mM塩化ナトリウム、０．１％テルギトール（Tergitol）ＮＰ−４０（Tergitol
は、一連の湿潤剤の登録商標である）であることができる。
【００５７】 適切なバッファー成分は、 ０〜２M クエン酸ナトリウム ０〜２M 塩化ナトリウム ０〜２％ Tergitol NP-40 ０〜２％w/v Tween-20若しくは80又は他の界面活性剤 ０〜２M Tris-ＨＣｌ、ｐＨ６〜８ ０〜２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０〜５００mM ＥＤＴＡ ０〜２％w/v タートラジン
【００５８】 “相補的配列”とは、本アッセイで用いる条件下でポリヌクレオチド配列と結
合することができる配列を意味する。“ハイブリダイズ”とは、配列が、共に安
定構造を形成することができ、それを当該技術分野で周知のハイブリダイゼーシ
ョンアッセイによって検出することができることを意味する。これらの条件は、
ハイブリダイゼーションが、配列が少なくとも６０％が逆に同一、より好ましく
は少なくとも８０％が逆に同一、更により好ましくは少なくとも９０％が逆に同
一そして最も好ましくは少なくとも９５％が逆に同一である場合にのみ生じるも
のであることができる。“％が逆に同一”とは、一本鎖配列を、一方を５′−３
′にそしてもう一方を３′−５′で整列させたとき、理論的に塩基対を形成する
ことができる塩基（検討すべき領域内での）の百分率を意味する。ハイブリダイ
ゼーション工程は、上記バッファー中で、０〜９０℃で実施することができ；好
ましくは５３℃で実施する。
合することができる配列を意味する。“ハイブリダイズ”とは、配列が、共に安
定構造を形成することができ、それを当該技術分野で周知のハイブリダイゼーシ
ョンアッセイによって検出することができることを意味する。これらの条件は、
ハイブリダイゼーションが、配列が少なくとも６０％が逆に同一、より好ましく
は少なくとも８０％が逆に同一、更により好ましくは少なくとも９０％が逆に同
一そして最も好ましくは少なくとも９５％が逆に同一である場合にのみ生じるも
のであることができる。“％が逆に同一”とは、一本鎖配列を、一方を５′−３
′にそしてもう一方を３′−５′で整列させたとき、理論的に塩基対を形成する
ことができる塩基（検討すべき領域内での）の百分率を意味する。ハイブリダイ
ゼーション工程は、上記バッファー中で、０〜９０℃で実施することができ；好
ましくは５３℃で実施する。
【００５９】 標的ポリヌクレオチド又はシグナルを、検出前に増幅することができるが、こ
の増幅は必須ではないことが理解される。
の増幅は必須ではないことが理解される。
【００６０】 ポリヌクレオチドは、非常に低濃度で検出できることができることが理解され
る。これは、１０4コピー未満、好ましくは１０3コピー未満、更により好ましく
は１０2コピー以下の標的ポリヌクレオチドを検出できることを意味する。サン プル容量は、１０nl〜１０mlであることができる。実施例に記載しているように
、１０μLのサンプル中のゲノムＤＮＡの１０００当量未満が検出可能であるこ とが示されている。
る。これは、１０4コピー未満、好ましくは１０3コピー未満、更により好ましく
は１０2コピー以下の標的ポリヌクレオチドを検出できることを意味する。サン プル容量は、１０nl〜１０mlであることができる。実施例に記載しているように
、１０μLのサンプル中のゲノムＤＮＡの１０００当量未満が検出可能であるこ とが示されている。
【００６１】 特異的標的関連シグナルをキャプチャーリングする前にサンプル及び非結合ラ
ベルを除去することは必須ではない。非常に高感度のときは、表面に非常に近接
して（エバネッセント場で）一時的存在のラベルを表す“バルク”シグナルが、
実験に用いる標的レベルに比べて高いラベル濃度のために特異的シグナルを遮断
することが生じることができる。このような場合には、シグナル記録より前の非
結合ラベルの除去（細胞を洗浄することによる）が有利である。
ベルを除去することは必須ではない。非常に高感度のときは、表面に非常に近接
して（エバネッセント場で）一時的存在のラベルを表す“バルク”シグナルが、
実験に用いる標的レベルに比べて高いラベル濃度のために特異的シグナルを遮断
することが生じることができる。このような場合には、シグナル記録より前の非
結合ラベルの除去（細胞を洗浄することによる）が有利である。
【００６２】 標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｓｓ又はｄｓであることができ
る。例えば、ｍＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ又は病原体のゲノム配列であることがで
きる。例えば、実験又は診断目的の関心の遺伝子であることができる。標的ポリ
ヌクレオチドは、植物病原体又は動物病原体若しくはヒト病原体由来であること
ができることが理解される。標的ポリヌクレオチド由来の植物病原体の例として
は、Pseudocercosporella herpotrichoides由来であることができる。臨床診断 に重要な好ましい選択としては、病原体がウイルスであることである。ウイルス
がＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ
型肝炎ウイルス）又はＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）である場合が、特に好ま
しい。例えば、本アッセイは、Ｃ型肝炎ウイルスの５種の遺伝型を同定しそして
区別するために使用することができる（Cha et al (1992) PNAS 89, 7144-7148 ）。他の標的は、マーカー遺伝子又は薬剤応答メッセージ、すなわちその発生量
が特定の薬剤に応答して変化するｍＲＮＡである。
る。例えば、ｍＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ又は病原体のゲノム配列であることがで
きる。例えば、実験又は診断目的の関心の遺伝子であることができる。標的ポリ
ヌクレオチドは、植物病原体又は動物病原体若しくはヒト病原体由来であること
ができることが理解される。標的ポリヌクレオチド由来の植物病原体の例として
は、Pseudocercosporella herpotrichoides由来であることができる。臨床診断 に重要な好ましい選択としては、病原体がウイルスであることである。ウイルス
がＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ
型肝炎ウイルス）又はＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）である場合が、特に好ま
しい。例えば、本アッセイは、Ｃ型肝炎ウイルスの５種の遺伝型を同定しそして
区別するために使用することができる（Cha et al (1992) PNAS 89, 7144-7148 ）。他の標的は、マーカー遺伝子又は薬剤応答メッセージ、すなわちその発生量
が特定の薬剤に応答して変化するｍＲＮＡである。
【００６３】 標的ポリヌクレオチドは、疾患に関連する配列を含むポリヌクレオチドである
ことができることも認められる。例えば、ガン又はガンの特定の形態と統計的に
関連する突然変異を含むことができる。特定の突然変異に関連するガンの形態の
例としては、前立腺ガン、肺ガン、大腸ガン及び白血病を含む。疾患と関連する
ことができる突然変異の例としては、嚢胞性線維症遺伝子がある。Ｐ４５０酵素
を含むことができる、薬理遺伝学及び毒性遺伝学によって同定される酵素の突然
変異もまた検出することができる。
ことができることも認められる。例えば、ガン又はガンの特定の形態と統計的に
関連する突然変異を含むことができる。特定の突然変異に関連するガンの形態の
例としては、前立腺ガン、肺ガン、大腸ガン及び白血病を含む。疾患と関連する
ことができる突然変異の例としては、嚢胞性線維症遺伝子がある。Ｐ４５０酵素
を含むことができる、薬理遺伝学及び毒性遺伝学によって同定される酵素の突然
変異もまた検出することができる。
【００６４】 ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションを用いる平面導波路技術の組み合わせ
は、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、又は変性２本鎖ＤＮＡのような疾患マーカー
の検出を可能にする。ＤＮＡ標的は、例えばＤＮＡフラグメント、ウイルスＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡであることができる。
は、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、又は変性２本鎖ＤＮＡのような疾患マーカー
の検出を可能にする。ＤＮＡ標的は、例えばＤＮＡフラグメント、ウイルスＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡであることができる。
【００６５】 ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチド又は３重らせんであるときは、検
出前に変性すべきである。変性は、加熱、又はイオン強度若しくはｐＨの変化の
ような適切な方法によって実施することができる。別の方法として、１本鎖コピ
ーを非対称ＰＣＲで作成することができる。上記のように、ＰＣＲ工程の使用は
変動性を持ち込み得るため、非対称ＰＣＲより変性による方法の方が好ましい。
変性は標的ポリヌクレオチドを含有するサンプルとアッセイ試薬とを結合した後
に実施することができることが理解される。好ましくは、該結合後に実施する。
これは、アッセイ試薬と接触する前の標的ポリヌクレオチドの復元の機会を減少
させる利点を有する。変性は、９５℃、５分間の加熱によって好都合に実施する
ことができる。
出前に変性すべきである。変性は、加熱、又はイオン強度若しくはｐＨの変化の
ような適切な方法によって実施することができる。別の方法として、１本鎖コピ
ーを非対称ＰＣＲで作成することができる。上記のように、ＰＣＲ工程の使用は
変動性を持ち込み得るため、非対称ＰＣＲより変性による方法の方が好ましい。
変性は標的ポリヌクレオチドを含有するサンプルとアッセイ試薬とを結合した後
に実施することができることが理解される。好ましくは、該結合後に実施する。
これは、アッセイ試薬と接触する前の標的ポリヌクレオチドの復元の機会を減少
させる利点を有する。変性は、９５℃、５分間の加熱によって好都合に実施する
ことができる。
【００６６】 所定の標的ポリヌクレオチドを検出するためのラベルエクステンダープローブ
のセットは、プローブの少なくとも２タイプを含み、そしてプローブの３０タイ
プまでを含むことができる。セットが、プローブの５〜３０タイプ、より好まし
くは１０〜２５タイプ，そして最も好ましくは１５〜２５タイプを含むときが好
ましい。（i）セットの最適サイズは標的及びアッセイ依存であることができ、 そして（ii）達成された増幅は用いたラベルエクスパンダープローブの数に比例
することが理解される。各ラベルエクステンダープローブは、１本鎖核酸領域及
びラベル部分、標的ポリヌクレオチドの配列と相補的である配列Ｌ１を有する核
酸領域、並びに発光によって検出可能なシグナル、例えばエバネッセント励起発
光提供するラベル、又は該ラベルの結合部位を含むラベル部分を含む（ここで、
各該配列Ｌ１は、該標的ポリヌクレオチドの物理的に異なり、非重複の領域と相
補的である）。各ラベルエクステンダープローブは、標的ポリヌクレオチドの配
列と相補的でなくそして約５００ntより小さい第２核酸領域を更に含むことがで
きる。
のセットは、プローブの少なくとも２タイプを含み、そしてプローブの３０タイ
プまでを含むことができる。セットが、プローブの５〜３０タイプ、より好まし
くは１０〜２５タイプ，そして最も好ましくは１５〜２５タイプを含むときが好
ましい。（i）セットの最適サイズは標的及びアッセイ依存であることができ、 そして（ii）達成された増幅は用いたラベルエクスパンダープローブの数に比例
することが理解される。各ラベルエクステンダープローブは、１本鎖核酸領域及
びラベル部分、標的ポリヌクレオチドの配列と相補的である配列Ｌ１を有する核
酸領域、並びに発光によって検出可能なシグナル、例えばエバネッセント励起発
光提供するラベル、又は該ラベルの結合部位を含むラベル部分を含む（ここで、
各該配列Ｌ１は、該標的ポリヌクレオチドの物理的に異なり、非重複の領域と相
補的である）。各ラベルエクステンダープローブは、標的ポリヌクレオチドの配
列と相補的でなくそして約５００ntより小さい第２核酸領域を更に含むことがで
きる。
【００６７】 ラベルの結合部位は、１本鎖ポリヌクレオチド配列を含むことができる。配列
（Ｌ２）は、１個以上のラベル分子を結合するポリヌクレオチド配列（Ｌ３）と
相補的であることができる。この第２配列は、標的ポリヌクレオチド配列の配列
、又はサンプル中で遭遇する可能性のある他のあらゆる配列と相補的であるよう
に選択する。ラベルの結合部位が１本鎖ポリヌクレオチド配列を含むときには、
ラベルエクステンダープローブは、当該技術分野で既知であるいくつかのサンド
イッチアッセイに用いられるような“鎖エクテンダー”に相当することができ、
そしてラベルは“ラベルプローブ”に相当することができることが理解される。
（Ｌ２）は、１個以上のラベル分子を結合するポリヌクレオチド配列（Ｌ３）と
相補的であることができる。この第２配列は、標的ポリヌクレオチド配列の配列
、又はサンプル中で遭遇する可能性のある他のあらゆる配列と相補的であるよう
に選択する。ラベルの結合部位が１本鎖ポリヌクレオチド配列を含むときには、
ラベルエクステンダープローブは、当該技術分野で既知であるいくつかのサンド
イッチアッセイに用いられるような“鎖エクテンダー”に相当することができ、
そしてラベルは“ラベルプローブ”に相当することができることが理解される。
【００６８】 結合部位及びラベルは、代わるものとして、それぞれ高い特異性及び相互の親
和性を有する分子、例えば、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンを含む
ことができる。したがって、結合部位は、ビオチン及びアビジンを含むことがで
きるラベル、又はその逆の場合も同様に含むことができる。別のラベルをラベル
エクステンダープローブに直接結合することができる。
和性を有する分子、例えば、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンを含む
ことができる。したがって、結合部位は、ビオチン及びアビジンを含むことがで
きるラベル、又はその逆の場合も同様に含むことができる。別のラベルをラベル
エクステンダープローブに直接結合することができる。
【００６９】 一般的に、領域Ｌ１は５〜５０００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５００ヌ
クレオチド、更により好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。領域Ｌ
１は３′及び５′末端において標的ポリヌクレオチドの配列と相補的でない第２
核酸領域と結合することができることが理解される。
クレオチド、更により好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。領域Ｌ
１は３′及び５′末端において標的ポリヌクレオチドの配列と相補的でない第２
核酸領域と結合することができることが理解される。
【００７０】 相補的配列は、結合するキャプチャーエクステンダープローブの標的ポリヌク
レオチドの配列から離れるように選択する。通常、配列の少なくとも２５ヌクレ
オチド離れて利用できる。ラベルエクステンダープローブと相補的な配列は離れ
ているか又は実質的に隣接していることができる。これらはキャプチャーエクス
テンダープローブの配列と相補的である配列と替えることができる。ラベル及び
キャプチャーエクステンダープローブと相補的である配列は、標的配列全体に広
がり、そして交互になっていることが好ましい。
レオチドの配列から離れるように選択する。通常、配列の少なくとも２５ヌクレ
オチド離れて利用できる。ラベルエクステンダープローブと相補的な配列は離れ
ているか又は実質的に隣接していることができる。これらはキャプチャーエクス
テンダープローブの配列と相補的である配列と替えることができる。ラベル及び
キャプチャーエクステンダープローブと相補的である配列は、標的配列全体に広
がり、そして交互になっていることが好ましい。
【００７１】 配列及び標的ポリヌクレオチドと相補的であるキャプチャーエクステンダープ
ローブの数は、特定の基準に基づいて選択することができる。例えば、もし特定
の突然変異を有するポリヌクレオチドの量を定量することを所望すれば、配列は
アッセイの条件下で特定の突然変異を有するポリヌクレオチド分子に結合するだ
けのものを選択することができる。
ローブの数は、特定の基準に基づいて選択することができる。例えば、もし特定
の突然変異を有するポリヌクレオチドの量を定量することを所望すれば、配列は
アッセイの条件下で特定の突然変異を有するポリヌクレオチド分子に結合するだ
けのものを選択することができる。
【００７２】 ラベルエクステンダープローブは、オリゴヌクレオチド合成の既知の方法によ
ってか又はクローニングによって好都合に調製することができ、ラベリングに適
したように改変することができる。配列は合成によって調製されていることが好
ましい。好都合な官能性を有する末端基を用意することによって、ラベルされた
分子は官能基を介して結合することができる。例としては、カルボキシ、チオ、
アミン又はヒドラジンを包含する。
ってか又はクローニングによって好都合に調製することができ、ラベリングに適
したように改変することができる。配列は合成によって調製されていることが好
ましい。好都合な官能性を有する末端基を用意することによって、ラベルされた
分子は官能基を介して結合することができる。例としては、カルボキシ、チオ、
アミン又はヒドラジンを包含する。
【００７３】 ラベルは、発光化合物を含む。好ましくは、化合物は３３０nm〜１０００nmの
範囲の発光波長を有する。例として、これに制限されないが、ローダミン、フィ
コエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、テキサスレッド、フルオレセイ
ン誘導体、クマリン誘導体、ジスチリルビフェニル、スチルベン誘導体、フタロ
シアニン、ナフトアロシアニン、ポリピリジル／ルテニウム錯体、例えばトリス
（２，２′−ビピリジル）ルテニウムクロリド、トリス（１，１０−フェナント
ロリン）ルテニウムクロリド、トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナ
ントロリン）ルテニウムクロリド及びポリピリジル／フェナジン／ルテニウム錯
体、プラチナ／ポルフィリン錯体、例えばオクタエチル−プラチナ−ポルフィリ
ン、寿命の長いユーロピウム及びテルビウム錯体又はシアニドが包含される。血
液又は血清中の分析のために特に適切なものは、６００〜９００nmの範囲の吸収
及び発光波長を有する色素である。
範囲の発光波長を有する。例として、これに制限されないが、ローダミン、フィ
コエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、テキサスレッド、フルオレセイ
ン誘導体、クマリン誘導体、ジスチリルビフェニル、スチルベン誘導体、フタロ
シアニン、ナフトアロシアニン、ポリピリジル／ルテニウム錯体、例えばトリス
（２，２′−ビピリジル）ルテニウムクロリド、トリス（１，１０−フェナント
ロリン）ルテニウムクロリド、トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナ
ントロリン）ルテニウムクロリド及びポリピリジル／フェナジン／ルテニウム錯
体、プラチナ／ポルフィリン錯体、例えばオクタエチル−プラチナ−ポルフィリ
ン、寿命の長いユーロピウム及びテルビウム錯体又はシアニドが包含される。血
液又は血清中の分析のために特に適切なものは、６００〜９００nmの範囲の吸収
及び発光波長を有する色素である。
【００７４】 フルオレセインイソチオシアナートのような共有結合することができる官能基
を包含しているフルオレセイン誘導体のような染料が好ましい。Biological Det
ection Systems Inc.から市販されている官能発光染料、例えば単官能及び２官 能Ｃｙ５（登録商標）染料（Clin. Chemistry (1994) 40(9),1819-1822）が特に
好ましい。
を包含しているフルオレセイン誘導体のような染料が好ましい。Biological Det
ection Systems Inc.から市販されている官能発光染料、例えば単官能及び２官 能Ｃｙ５（登録商標）染料（Clin. Chemistry (1994) 40(9),1819-1822）が特に
好ましい。
【００７５】 更に、赤色及びＮＩＲ（近赤外線）染料のより広範な発光波長は、エバネッセ
ント場のより深い侵入深度（エバネッセント場のより長い波長より大きい侵入深
度）のゆえに、特定の適用のために有利である。ＤＮＡ合成の最終工程中にオリ
ゴヌクレオチドをラベルすることは、ラベルされたオリゴヌクレオチド、例えば
Ｃｙ５（登録商標）の高い収率及び高い均一性という結果になる。
ント場のより深い侵入深度（エバネッセント場のより長い波長より大きい侵入深
度）のゆえに、特定の適用のために有利である。ＤＮＡ合成の最終工程中にオリ
ゴヌクレオチドをラベルすることは、ラベルされたオリゴヌクレオチド、例えば
Ｃｙ５（登録商標）の高い収率及び高い均一性という結果になる。
【００７６】 キャプチャープローブは、キャプチャープローブ認識配列と相補的な核酸配列
（ここで、核酸配列は約１０〜１００nt長であり、そしてラベルエクステンダー
プローブに含まれる配列と相補的ではなく、またキャプチャープローブは平面導
波路に結合するか又は特異的に結合することができる）を含むことができる。長
さで、１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好
ましくは１８〜３０ヌクレオチドのポリヌクレオチドであることができる。キャ
プチャープローブは、いくつかの異なる標的ポリヌクレオチドの検出に用いるこ
とができるような“普遍的”配列を有することができる。好ましいキャプチャー
プローブ配列は、３′−ＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣ−５′である。
この配列は、表面の３′末端の固定化のためにエキソヌクレアーゼに対する有益
な安定性を有する。３′末端でのキャプチャープローブの付着は有益である、何
故ならばキャプチャープローブは３′末端での多くのオリゴヌクレオチドを攻撃
するエキソヌクレアーゼによって消化されないことができるからである。
（ここで、核酸配列は約１０〜１００nt長であり、そしてラベルエクステンダー
プローブに含まれる配列と相補的ではなく、またキャプチャープローブは平面導
波路に結合するか又は特異的に結合することができる）を含むことができる。長
さで、１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好
ましくは１８〜３０ヌクレオチドのポリヌクレオチドであることができる。キャ
プチャープローブは、いくつかの異なる標的ポリヌクレオチドの検出に用いるこ
とができるような“普遍的”配列を有することができる。好ましいキャプチャー
プローブ配列は、３′−ＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣ−５′である。
この配列は、表面の３′末端の固定化のためにエキソヌクレアーゼに対する有益
な安定性を有する。３′末端でのキャプチャープローブの付着は有益である、何
故ならばキャプチャープローブは３′末端での多くのオリゴヌクレオチドを攻撃
するエキソヌクレアーゼによって消化されないことができるからである。
【００７７】 キャプチャープローブを、既知の合成プロトコールによって合成することがで
きる。３′末端で固定するために導波路“チップ”上で合成することが好ましい
。（例えば、Gait（1990）Oligonucleotide synthesis: a practical approach,
Oxford University Press, NYに記載されているように）粒子上でのオリゴヌク
レオチド合成のために用いられる標準方法の改変によって３−グリシジルオキシ
プロピルトリメトキシシランでシラン処理した導波路チップ上で直接的に、オリ
ゴヌクレオチド合成機（Applied Biosystems 394B）で合成することができる。 標準的合成の代わりに、４−（４，４−ジメトキシトリチル）ヒドロキシ酪酸を
表面のオリゴヌクレオチドの３′末端に固着するための安定な結合基として用い
る。表面は、アッセイでの使用の前に水で洗浄することができる。
きる。３′末端で固定するために導波路“チップ”上で合成することが好ましい
。（例えば、Gait（1990）Oligonucleotide synthesis: a practical approach,
Oxford University Press, NYに記載されているように）粒子上でのオリゴヌク
レオチド合成のために用いられる標準方法の改変によって３−グリシジルオキシ
プロピルトリメトキシシランでシラン処理した導波路チップ上で直接的に、オリ
ゴヌクレオチド合成機（Applied Biosystems 394B）で合成することができる。 標準的合成の代わりに、４−（４，４−ジメトキシトリチル）ヒドロキシ酪酸を
表面のオリゴヌクレオチドの３′末端に固着するための安定な結合基として用い
る。表面は、アッセイでの使用の前に水で洗浄することができる。
【００７８】 上記方法を用いることができるが、一方下記の、 ａ）ＰＷＧ−チップをＣＨＣｌ3で洗浄し、 ｂ）ＰＷＧ−チップの液相シラン化を、高温（すなわち５０〜９０℃）で数時間
２％（v/v）３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び０．２％（v
/v）Ｎ−エチルジイソプロピルアミンを含むｏ−キシレンでの処理よって実施し
、 ｃ）シラン処理したＰＷＧ−チップをＣＨ3ＣＮ中で洗浄し、 ｄ）ＰＷＧ−チップを減圧下にデシケーター内で乾燥し、 ｅ）オリゴヌクレオチドの固定化すなわち、 エポキシ環を結合する表面を、改変オリゴヌクレオチドの末端アミノ又はチオー
ル基で開環によって反応させることができる：チオール又はアミノ末端キャプチ
ャープローブ１０nmolを含有する溶液１００μLをｐＨ８．２の１００mM水性炭 酸バッファー中で、一晩３５℃でインキュベートし、 ｆ）固定化キャプチャープローブを有するＰＷＧ−チップを水で洗浄し、乾燥し
、そしてＰＷＧセットアップで用いるまで−２０℃で保存する方法が好ましい。
２％（v/v）３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び０．２％（v
/v）Ｎ−エチルジイソプロピルアミンを含むｏ−キシレンでの処理よって実施し
、 ｃ）シラン処理したＰＷＧ−チップをＣＨ3ＣＮ中で洗浄し、 ｄ）ＰＷＧ−チップを減圧下にデシケーター内で乾燥し、 ｅ）オリゴヌクレオチドの固定化すなわち、 エポキシ環を結合する表面を、改変オリゴヌクレオチドの末端アミノ又はチオー
ル基で開環によって反応させることができる：チオール又はアミノ末端キャプチ
ャープローブ１０nmolを含有する溶液１００μLをｐＨ８．２の１００mM水性炭 酸バッファー中で、一晩３５℃でインキュベートし、 ｆ）固定化キャプチャープローブを有するＰＷＧ−チップを水で洗浄し、乾燥し
、そしてＰＷＧセットアップで用いるまで−２０℃で保存する方法が好ましい。
【００７９】 キャプチャープローブを別の方法で導波路上に固着することもできる。例えば
、WO 94/27137に記載されているような光化学的架橋を用いることができる。付 着促進層は導波領域及び固定化キャプチャープローブの間に位置することができ
る。付着促進層の厚さは、好ましくは５０nm以下、より好ましくは２０nm未満、
そして更に好ましくは１０nm未満である。
、WO 94/27137に記載されているような光化学的架橋を用いることができる。付 着促進層は導波領域及び固定化キャプチャープローブの間に位置することができ
る。付着促進層の厚さは、好ましくは５０nm以下、より好ましくは２０nm未満、
そして更に好ましくは１０nm未満である。
【００８０】 キャプチャープローブを含有する溶液を、圧電性駆動部を有するマルチピペッ
トヘッド又は改変インクジェット印刷ヘッドを用いて滴下法で適用することがで
きる。この方法は迅速に実施することができ、そして極めて少量を用いることが
できるという利点を有する。“普遍的”キャプチャープローブを用いるときは、
全ての検出領域について同様の溶液を適用することができる。
トヘッド又は改変インクジェット印刷ヘッドを用いて滴下法で適用することがで
きる。この方法は迅速に実施することができ、そして極めて少量を用いることが
できるという利点を有する。“普遍的”キャプチャープローブを用いるときは、
全ての検出領域について同様の溶液を適用することができる。
【００８１】 キャプチャープローブ及びその後の試薬は、フローセルを用いて検出領域に送
達することができる。領域の分離は、層流の場合は、分割バーの使用によって機
械的にか又は流体工学的に達成することができる。
達することができる。領域の分離は、層流の場合は、分割バーの使用によって機
械的にか又は流体工学的に達成することができる。
【００８２】 直接的にか又は付着促進層によってかのいずれかでの、検出領域だけの特異的
認識要素の選択的固定化は、導波及び非導波領域の両者を覆うサンプルセルを用
いるときには、シグナル生成のために使用しない領域での分析物の非特異的結合
が減少することから、検出方法の感度の増加をもたらす。
認識要素の選択的固定化は、導波及び非導波領域の両者を覆うサンプルセルを用
いるときには、シグナル生成のために使用しない領域での分析物の非特異的結合
が減少することから、検出方法の感度の増加をもたらす。
【００８３】 付着促進層は、導波領域にのみ選択的に適用することができるか、又は、例え
ば光化学的活性化若しくは上記送達方法によって非導波領域で非活性化すること
ができることが理解される。
ば光化学的活性化若しくは上記送達方法によって非導波領域で非活性化すること
ができることが理解される。
【００８４】 一般感覚では（すなわち、もしキャプチャープローブがオリゴヌクレオチド配
列に制限されずタンパク質であるならば）、キャプチャープローブは、導波領域
への疎水的な吸着若しくは直接的な共有結合を含む方法によってか、又は、表面
の化学的修飾後に、例えばシラン化若しくはポリマー層の適用によって固定化す
ることができる。導波層上の直接的なキャプチャープローブの固定化を促進する
ために、例えばＳｉＯ2からなる（Boksanyi et al (1976) Advanc. Colloid int
erface Sci. 6, 95-137）中間薄層を付着促進層として適用することができる。
列に制限されずタンパク質であるならば）、キャプチャープローブは、導波領域
への疎水的な吸着若しくは直接的な共有結合を含む方法によってか、又は、表面
の化学的修飾後に、例えばシラン化若しくはポリマー層の適用によって固定化す
ることができる。導波層上の直接的なキャプチャープローブの固定化を促進する
ために、例えばＳｉＯ2からなる（Boksanyi et al (1976) Advanc. Colloid int
erface Sci. 6, 95-137）中間薄層を付着促進層として適用することができる。
【００８５】 キャプチャープローブがポリヌクレオチドであるときは、疎水性結合は可能性
のないことが理解される。共有結合又はイオン結合が一般的に好ましいが、他の
レセプター／リガンド、例えばアビジン／ビオチン、抗体−ハプテン又はＮＴＡ
（ニトリロトリ酢酸）に対する（Ｈｉｓ）6−タグ化オリゴヌクレオチドのよう な認識システムもまた好ましい。
のないことが理解される。共有結合又はイオン結合が一般的に好ましいが、他の
レセプター／リガンド、例えばアビジン／ビオチン、抗体−ハプテン又はＮＴＡ
（ニトリロトリ酢酸）に対する（Ｈｉｓ）6−タグ化オリゴヌクレオチドのよう な認識システムもまた好ましい。
【００８６】 付着プロモーターは、官能基（例えば、エポキシ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＯ ＯＨ、−ＮＨＳ、マレイミド）を有する官能基化シラン層又は官能基化ポリマー
層であることができる（例えば、ポリリシン；M. Schena, D. Shalon, R. Helle
r, A. Chai, P. O. Brown and R. W. Davis：Parallel human genome analysis:
microarray based expression monitoring of 1000 genes, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93(1996) 10614-10619）（ここで、該官能基は、官能基化キャプチ ャープローブ（上に記載したような官能基）の結合の前に活性化すべきである）
。イオン結合の場合は、キャプチャープローブの固着官能基（ただしキャプチャ
ー配列又は全検出カスケードのメンバーではない）と付着促進（イオン性、相補
的荷電もまた）層との間のイオン性相互作用に有利な条件を用いるべきである。
層であることができる（例えば、ポリリシン；M. Schena, D. Shalon, R. Helle
r, A. Chai, P. O. Brown and R. W. Davis：Parallel human genome analysis:
microarray based expression monitoring of 1000 genes, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93(1996) 10614-10619）（ここで、該官能基は、官能基化キャプチ ャープローブ（上に記載したような官能基）の結合の前に活性化すべきである）
。イオン結合の場合は、キャプチャープローブの固着官能基（ただしキャプチャ
ー配列又は全検出カスケードのメンバーではない）と付着促進（イオン性、相補
的荷電もまた）層との間のイオン性相互作用に有利な条件を用いるべきである。
【００８７】 非共有結合性結合の場合は、表面の再生を、表面のキャプチャープローブの解
離に有利な条件を創出することによって実施することができる。
離に有利な条件を創出することによって実施することができる。
【００８８】 キャプチャープローブが無傷でありそして導波層が同一又は異なる標的ポリヌ
クレオチドの検出のために再び用いることができるというような方法で、導波路
表面から標的ポリヌクレオチド、キャプチャーエクステンダープローブ及びラベ
ルエクステンダープローブを除去することは可能であることができる。例えば、
低ｐＨ又は高ｐＨ、高温、有機溶媒又はカオトロピック剤（塩）を標的ポリヌク
レオチド、キャプチャーエクステンダープローブ及びラベルエクステンダープロ
ーブを解離するために用いることができる。４未満のｐＨは、ＤＮＡを損傷し、
そしてそれゆえ好ましくない。高ｐＨ、例えば１０mMＮａＯＨ、又は５０％水性
尿素溶液をセンサー表面のｄｓＤＮＡを変成させるために用いることができ、そ
してそれによってキャプチャープローブから標的ポリヌクレオチド及びキャプチ
ャーエクステンダープローブを解離することができる。
クレオチドの検出のために再び用いることができるというような方法で、導波路
表面から標的ポリヌクレオチド、キャプチャーエクステンダープローブ及びラベ
ルエクステンダープローブを除去することは可能であることができる。例えば、
低ｐＨ又は高ｐＨ、高温、有機溶媒又はカオトロピック剤（塩）を標的ポリヌク
レオチド、キャプチャーエクステンダープローブ及びラベルエクステンダープロ
ーブを解離するために用いることができる。４未満のｐＨは、ＤＮＡを損傷し、
そしてそれゆえ好ましくない。高ｐＨ、例えば１０mMＮａＯＨ、又は５０％水性
尿素溶液をセンサー表面のｄｓＤＮＡを変成させるために用いることができ、そ
してそれによってキャプチャープローブから標的ポリヌクレオチド及びキャプチ
ャーエクステンダープローブを解離することができる。
【００８９】 各キャプチャーエクステンダープローブは２個の１本鎖核酸領域を含み、第１
の核酸領域は、約１０〜１００nt長の配列Ｃ１を有し、標的ポリヌクレオチドの
配列と相補的であり、また第２の領域は、約５００nt長未満であり、標的ポリヌ
クレオチドの配列と相補的でなく、そしてキャプチャープローブ認識配列Ｃ２を
更に含む（ここで、配列Ｌ１及びＣ１は同一でなく、非相補的配列であり、それ
ぞれは該標的ポリヌクレオチドの物理的に異なる非重複配列と相補的である）。
の核酸領域は、約１０〜１００nt長の配列Ｃ１を有し、標的ポリヌクレオチドの
配列と相補的であり、また第２の領域は、約５００nt長未満であり、標的ポリヌ
クレオチドの配列と相補的でなく、そしてキャプチャープローブ認識配列Ｃ２を
更に含む（ここで、配列Ｌ１及びＣ１は同一でなく、非相補的配列であり、それ
ぞれは該標的ポリヌクレオチドの物理的に異なる非重複配列と相補的である）。
【００９０】 標的ポリヌクレオチドの１個以上のタイプをサンプル中で直ちに検出すること
ができることが理解される。もし異なる発光波長を有するラベルを用い、そして
それゆえに適切な導波路システムで識別することができるならば、異なる特異性
キャプチャーエクステンダープローブ及びラベルエクステンダープローブを混合
することができ、そして異なる標的ポリヌクレオチドを別々に検出しそして定量
することができることが理解される。
ができることが理解される。もし異なる発光波長を有するラベルを用い、そして
それゆえに適切な導波路システムで識別することができるならば、異なる特異性
キャプチャーエクステンダープローブ及びラベルエクステンダープローブを混合
することができ、そして異なる標的ポリヌクレオチドを別々に検出しそして定量
することができることが理解される。
【００９１】 標的対キャプチャーエクステンダーの比率は、特定標的ポリヌクレオチド及び
濃度範囲の最適化を必要とすることが理解される。これは一定の標的対ラベルエ
クステンダー比を用いると同時に、キャプチャーエクステンダープローブ対標的
ポリヌクレオチドの比率を変化させることによって行うことができることが理解
される。最適化方法は、特異的結合対非特異的結合（すなわち標的ポリヌクレオ
チドの不在下での結合）の比率に関する最良の結果を測定することになる。
濃度範囲の最適化を必要とすることが理解される。これは一定の標的対ラベルエ
クステンダー比を用いると同時に、キャプチャーエクステンダープローブ対標的
ポリヌクレオチドの比率を変化させることによって行うことができることが理解
される。最適化方法は、特異的結合対非特異的結合（すなわち標的ポリヌクレオ
チドの不在下での結合）の比率に関する最良の結果を測定することになる。
【００９２】 標的対ラベルエクステンダーの比率は、一定の標的対キャプチャーエクステン
ダー比率を適用し標的対ラベルエクステンダーの最適比率を見出すことよって同
様に最適化することができる。
ダー比率を適用し標的対ラベルエクステンダーの最適比率を見出すことよって同
様に最適化することができる。
【００９３】 重量比、又は成分、例えば、ラベルエクステンダー（ＬＥ）、キャプチャーエ
クステンダー（ＣＥ）及びラベルプローブ（ＬＰ）の濃度は、基本的にアッセイ
特異的（すなわちサンプルの性質によって決めることができる）及び標的特異的
であり、そして各標的に最適化すべきであることが理解される。
クステンダー（ＣＥ）及びラベルプローブ（ＬＰ）の濃度は、基本的にアッセイ
特異的（すなわちサンプルの性質によって決めることができる）及び標的特異的
であり、そして各標的に最適化すべきであることが理解される。
【００９４】 もし濃度が下記範囲： １）０．１〜３０nM、より好ましくは０．５〜２０nM、そして最も好ましくは０
．５〜１０nMのＬＥ、 ２）０．０１〜２０nM、より好ましくは０．１〜１０nM、そして最も好ましくは
０．１〜５nMのＣＥ、 ３）０．１〜３０nM、より好ましくは０．５〜２０nM、そして最も好ましくは０
．５〜１０nMのＬＰ、 の範囲内にあれば好ましい。
．５〜１０nMのＬＥ、 ２）０．０１〜２０nM、より好ましくは０．１〜１０nM、そして最も好ましくは
０．１〜５nMのＣＥ、 ３）０．１〜３０nM、より好ましくは０．５〜２０nM、そして最も好ましくは０
．５〜１０nMのＬＰ、 の範囲内にあれば好ましい。
【００９５】 本発明は、平面導波路を用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法（ここで
、標的ポリヌクレオチドは２クラスの結合性相互作用によって導波路上に固定化
されており、第１のクラスの結合性相互作用は複数のキャプチャーエクステンダ
ープローブについてであり、そして第２のクラスの結合性相互作用は少なくとも
１個の該キャプチャーエクステンダープローブと、光平面導波路の表面に結合し
ているか又は結合する能力がありそしてその後そのように結合している少なくと
も１個の複合キャプチャープローブとの間である）を含むことが理解される。
、標的ポリヌクレオチドは２クラスの結合性相互作用によって導波路上に固定化
されており、第１のクラスの結合性相互作用は複数のキャプチャーエクステンダ
ープローブについてであり、そして第２のクラスの結合性相互作用は少なくとも
１個の該キャプチャーエクステンダープローブと、光平面導波路の表面に結合し
ているか又は結合する能力がありそしてその後そのように結合している少なくと
も１個の複合キャプチャープローブとの間である）を含むことが理解される。
【００９６】 本発明の方法は、完全自動化分析システム、例えば、Sensors and Actuators
(1997) Vol B38-39, 88-95 に記載されている１つを用いて実施することができ ることが理解される。このシステムは、リアルタイムでバイオアフィニティー相
互作用を調べるために設計されている。このシステムの高感度及び高選択性、短
いアッセイサイクル、及びほんの微量のサンプル標品の必要性は、ＰＣＲによる
標的増幅又はシグナル増幅のための分岐ＤＮＡの使用を必要としないでポリヌク
レオチドの検出を可能にすることができる。これは、感染性疾患のマーカーとし
ての、例えば、ｍＲＮＡの定量を劇的に容易化及び簡略化することができる。
(1997) Vol B38-39, 88-95 に記載されている１つを用いて実施することができ ることが理解される。このシステムは、リアルタイムでバイオアフィニティー相
互作用を調べるために設計されている。このシステムの高感度及び高選択性、短
いアッセイサイクル、及びほんの微量のサンプル標品の必要性は、ＰＣＲによる
標的増幅又はシグナル増幅のための分岐ＤＮＡの使用を必要としないでポリヌク
レオチドの検出を可能にすることができる。これは、感染性疾患のマーカーとし
ての、例えば、ｍＲＮＡの定量を劇的に容易化及び簡略化することができる。
【００９７】 本発明の更なる側面は、疾患、又は標的ポリヌクレオチドに関連する生体のそ
の他の反応の、研究又は診断のための本発明の方法の使用である。例えば、生物
は遺伝子発現の一時的又は空間的変化によって、その環境の変化、例えば、温度
、浸透圧ショック、又は重金属イオン濃度の変化に反応することができる。した
がって熱又は寒冷ショックは、特定遺伝子の発現レベルの変化を誘導することが
できる。組換え遺伝子の発現は、例えば、その発現を熱ショックプロモーターに
よって制御されている組換え遺伝子を測定することができることが理解される。
の他の反応の、研究又は診断のための本発明の方法の使用である。例えば、生物
は遺伝子発現の一時的又は空間的変化によって、その環境の変化、例えば、温度
、浸透圧ショック、又は重金属イオン濃度の変化に反応することができる。した
がって熱又は寒冷ショックは、特定遺伝子の発現レベルの変化を誘導することが
できる。組換え遺伝子の発現は、例えば、その発現を熱ショックプロモーターに
よって制御されている組換え遺伝子を測定することができることが理解される。
【００９８】 本発明のなお更なる側面は、 ａ）上記２ｃ）によって定義されるような複数のキャプチャープローブ、又は
上記請求項１の２ｄ）によって定義されるような複数のキャプチャーエクステン
ダープローブ及びキャプチャープローブ； ｂ）キャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダープローブに結合する
標的ポリヌクレオチド；及び ｃ）標的ポリヌクレオチドに結合している上記請求項１の１ａ）によって定義さ
れるような複数のラベルプローブ、又は標的ポリヌクレオチドと結合している上
記請求項１の１ｂ）によって定義されるような複数のラベルプローブエクステン
ダー及び該ラベルプローブエクステンダーに結合している上記請求項１の１ｂ）
によって定義されるようなラベルプローブ を平面導波路の導波層の表面に結合している光平面導波路である。
上記請求項１の２ｄ）によって定義されるような複数のキャプチャーエクステン
ダープローブ及びキャプチャープローブ； ｂ）キャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダープローブに結合する
標的ポリヌクレオチド；及び ｃ）標的ポリヌクレオチドに結合している上記請求項１の１ａ）によって定義さ
れるような複数のラベルプローブ、又は標的ポリヌクレオチドと結合している上
記請求項１の１ｂ）によって定義されるような複数のラベルプローブエクステン
ダー及び該ラベルプローブエクステンダーに結合している上記請求項１の１ｂ）
によって定義されるようなラベルプローブ を平面導波路の導波層の表面に結合している光平面導波路である。
【００９９】 好ましくは、キャプチャープローブは、１０〜１００ヌクレオチドの長さのポ
リヌクレオチドである。更により好ましくは、キャプチャープローブは、上記及
び実施例１に記載しているように、導波路の表面に共有結合している。
リヌクレオチドである。更により好ましくは、キャプチャープローブは、上記及
び実施例１に記載しているように、導波路の表面に共有結合している。
【０１００】 本発明の更なる側面は、特定の標的ポリヌクレオチドについて本発明の方法を
実施するための、キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ
、ラベルエクステンダープローブ及び場合により上記全ラベルを含んでいる部分
のキットである。
実施するための、キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ
、ラベルエクステンダープローブ及び場合により上記全ラベルを含んでいる部分
のキットである。
【０１０１】 本発明のなお更なる側面は、標的ポリヌクレオチドを検出するための核酸サン
ドイッチアッセイでの導波路の使用である。
ドイッチアッセイでの導波路の使用である。
【０１０２】 更なる側面は、導波介在ポリヌクレオチド検出アッセイでの非ラベル増幅サン
ドイッチアッセイの使用である。“非ラベル増幅サンドイッチアッセイ”とは、
ｂＤＮＡを用いない核酸サンドイッチアッセイをいう。
ドイッチアッセイの使用である。“非ラベル増幅サンドイッチアッセイ”とは、
ｂＤＮＡを用いない核酸サンドイッチアッセイをいう。
【０１０３】 本発明の更なる側面は、光平面導波路を用いる標的ポリヌクレオチドを検出す
るためのサンドイッチアッセイである。
るためのサンドイッチアッセイである。
【０１０４】 本発明のなお更なる側面は、光平面導波路を含む構成（ここで、導波層の表面
には、直接的又は間接的にキャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダ
ー／キャプチャープローブが結合しており、該キャプチャーエクステンダー／キ
ャプチャープローブには標的ポリヌクレオチドが結合しており、該標的にはラベ
ルエクステンダープローブ、及び、もしラベルエクステンダープローブがラベル
の結合部位を含んでいるならば、該ラベルが結合している（ここで、全ての成分
は本発明の上記の側面と同義である））である。
には、直接的又は間接的にキャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダ
ー／キャプチャープローブが結合しており、該キャプチャーエクステンダー／キ
ャプチャープローブには標的ポリヌクレオチドが結合しており、該標的にはラベ
ルエクステンダープローブ、及び、もしラベルエクステンダープローブがラベル
の結合部位を含んでいるならば、該ラベルが結合している（ここで、全ての成分
は本発明の上記の側面と同義である））である。
【０１０５】 ここで、下記の図及び実施例を参照してより詳細に本発明を記載している。
【０１０６】 実施例１：Pseudocercosporella herpotrichoides のアッセイ：ＩＴＳ領域の
配列特異的検出
配列特異的検出
【０１０７】 コムギの眼点病（eyespot disease）の原因物質であるPseudocercosporella h
erpotrichoides の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域は、配列決定され、そし てＰＣＲに基づく診断学プロジェクトで独特の標的遺伝子として用いられている
。ＩＴＳ配列は既知であるから、オリゴヌクレオチドプローブの開発は全く直接
的である。更に、上記診断学プロジェクトによって特徴づけられた感染の様々な
レベルでの眼点病感染小麦抽出物が入手可能である。このような理由によって、
眼点ＩＴＳ領域は、ＤＮＡアッセイに基づくモデル平面導波路の優れた標的を意
味する。表１は、Pseudocercosporella herpotrichoides のゲノムＤＮＡ及びＰ
ＣＲ増幅したＩＴＳフラグメントの分子量及び塩基対数を示す。これらの標的は
、すべて２本鎖ＤＮＡであり、使用前に変性させなければならない。アッセイ条
件の最適化のために、１本鎖ＩＴＳフラグメントを目的の配列を増幅するプライ
マーの２０倍過剰量を用いる非対称ＰＣＲによって調製した。
erpotrichoides の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域は、配列決定され、そし てＰＣＲに基づく診断学プロジェクトで独特の標的遺伝子として用いられている
。ＩＴＳ配列は既知であるから、オリゴヌクレオチドプローブの開発は全く直接
的である。更に、上記診断学プロジェクトによって特徴づけられた感染の様々な
レベルでの眼点病感染小麦抽出物が入手可能である。このような理由によって、
眼点ＩＴＳ領域は、ＤＮＡアッセイに基づくモデル平面導波路の優れた標的を意
味する。表１は、Pseudocercosporella herpotrichoides のゲノムＤＮＡ及びＰ
ＣＲ増幅したＩＴＳフラグメントの分子量及び塩基対数を示す。これらの標的は
、すべて２本鎖ＤＮＡであり、使用前に変性させなければならない。アッセイ条
件の最適化のために、１本鎖ＩＴＳフラグメントを目的の配列を増幅するプライ
マーの２０倍過剰量を用いる非対称ＰＣＲによって調製した。
【０１０８】 表１：Pseudocercosporella herpotrichoides の異なるサイズの２本鎖標的Ｄ
ＮＡ分子 標的 塩基対数 分子量（Ｄａ） ｓｓＩＴＳフラグメント ６２７bp ２．０７×１０5 ｄｓＩＴＳフラグメント ６２７bp ４．１４×１０5 プラスミドベクター ４５５９bp ３．０１×１０6 ゲノムＤＮＡ ４０Ｍbp ２．６４×１０10
ＮＡ分子 標的 塩基対数 分子量（Ｄａ） ｓｓＩＴＳフラグメント ６２７bp ２．０７×１０5 ｄｓＩＴＳフラグメント ６２７bp ４．１４×１０5 プラスミドベクター ４５５９bp ３．０１×１０6 ゲノムＤＮＡ ４０Ｍbp ２．６４×１０10
【０１０９】 標的１本鎖ＩＴＳ配列を下記に記載している。２０個のラベルエクステンダー
（ＬＥ）及び５個のキャプチャーエクステンダー（ＣＥ）のため選択される領域
も示す。
（ＬＥ）及び５個のキャプチャーエクステンダー（ＣＥ）のため選択される領域
も示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】 用いるラベルエクステンダープローブ及びキャプチャーエクステンダープロー
ブを表２に示す。それらは、ライ麦病原型の P. herpotrichoides に特異的であ
るべく設計された。現在のプローブ及びハイブリダイゼーション条件は、小麦病
原型ののP. herpotrichoides（そのＩＴＳ領域に９８％遺伝子保存）と交差反応
させるためのアッセイを可能にすることができる。
ブを表２に示す。それらは、ライ麦病原型の P. herpotrichoides に特異的であ
るべく設計された。現在のプローブ及びハイブリダイゼーション条件は、小麦病
原型ののP. herpotrichoides（そのＩＴＳ領域に９８％遺伝子保存）と交差反応
させるためのアッセイを可能にすることができる。
【０１１２】 表２：ラベルエクステンダー及びキャプチャーエクステンダープローブ ３１− ５０ ＬＥ１ ３１７−３３７ ＬＥ１１ ５４− ７１ ＣＥ１ ３４１−３６１ ＬＥ１２ ７５− ９２ ＬＥ２ ３６５−３８２ ＬＥ１３ ９６−１１２ ＬＥ３ ３８６−４０２ ＬＥ１４ １１６−１３３ ＬＥ４ ４０６−４２６ ＬＥ１５ １３７−１５８ ＣＥ２ ４２９−４４７ ＬＥ１６ １６２−１７８ ＬＥ５ ４５１−４６７ ＣＥ４ １８２−１９８ ＬＥ６ ４７１−４８９ ＬＥ１７ ２０２−２１８ ＬＥ７ ４９３−５１４ ＬＥ１８ ２２２−２４２ ＣＥ３ ５１８−５３５ ＬＥ１９ ２４６−２６９ ＬＥ８ ５３９−５５６ ＣＥ５ ２７３−２９１ ＬＥ９ ５６０−５７９ ＬＥ２０ ２９５−３１３ ＬＥ１０
【０１１３】 この領域は種レベルで極めて分岐していることから、ＩＴＳ領域はアッセイ開
発のための標的として優れた遺伝子領域である。ＩＴＳ領域中のより広範囲に渡
る配列分岐は、ＰＣＲアッセイの開発に基づいており、これは Septoria, Mycos
phaerella, P. herpotrichoides 及び Verticillium を包含する植物病原体のを
検出することができる。
発のための標的として優れた遺伝子領域である。ＩＴＳ領域中のより広範囲に渡
る配列分岐は、ＰＣＲアッセイの開発に基づいており、これは Septoria, Mycos
phaerella, P. herpotrichoides 及び Verticillium を包含する植物病原体のを
検出することができる。
【０１１４】 プローブの同様のセットは、目的のあらゆる標的病原体からのあらゆる既知の
ＩＴＳ配列に対して開発することができる。これらは、小麦病原体である Septo
ria nodorum, Sptoria tritici, Seprotia avenae f. sp. triticea, Fusarium
spp, Microdochium nivale, Drechslera tritici-repentis 及び Rhizoctonia c
erealisを含むことができる。ＩＴＳ領域が既知であることから、アッセイは、 トウモロコシ病原体である Cercospora zea-maydis, Puccinia sorghi, Kabatie
lla zeae, Helminthosporium turcicum, Helminthosporium maydis 及び Helmin
thosporium carbonum に対して開発することもできる。
ＩＴＳ配列に対して開発することができる。これらは、小麦病原体である Septo
ria nodorum, Sptoria tritici, Seprotia avenae f. sp. triticea, Fusarium
spp, Microdochium nivale, Drechslera tritici-repentis 及び Rhizoctonia c
erealisを含むことができる。ＩＴＳ領域が既知であることから、アッセイは、 トウモロコシ病原体である Cercospora zea-maydis, Puccinia sorghi, Kabatie
lla zeae, Helminthosporium turcicum, Helminthosporium maydis 及び Helmin
thosporium carbonum に対して開発することもできる。
【０１１５】 アッセイ特性を下記に示すように要約する。 センシング容量：１０μL 標的濃度：１．７aM〜１７fM（１０μL当たり１．７×１０-23〜１．７×１０-1 9 モル） ラベルエクステンダー：各１nM（全２０ラベルエクステンダーの１０μL当たり １×１０-14モル） キャプチャーエクステンダー：各０．１nM（全５キャプチャーエクステンダーの
１０μL当たり１×１０-15モル） アッセイ方法：１０分間平衡／洗浄 ３０分間インキュベーション（流動停止） １０分間洗浄 ５分間再生 ５分間洗浄 検出：洗浄工程中のインキュベーション工程後５分間 変性：９５℃、３０分間 サンプルラック：１℃ ネットシグナル（３測定の平均）：ブランク４０１３±５７cps、１．７aM ３ ９８２±１７５cps、１７aM４７１１±３６５、１７０aM５７２１±２３７、１ ．７fM１１６４１±１６３、１７fM２３５０９±１２７０cps ＬＯＤ：１０aM
１０μL当たり１×１０-15モル） アッセイ方法：１０分間平衡／洗浄 ３０分間インキュベーション（流動停止） １０分間洗浄 ５分間再生 ５分間洗浄 検出：洗浄工程中のインキュベーション工程後５分間 変性：９５℃、３０分間 サンプルラック：１℃ ネットシグナル（３測定の平均）：ブランク４０１３±５７cps、１．７aM ３ ９８２±１７５cps、１７aM４７１１±３６５、１７０aM５７２１±２３７、１ ．７fM１１６４１±１６３、１７fM２３５０９±１２７０cps ＬＯＤ：１０aM
【０１１６】 普遍的キャプチャープローブ（チップ−３′−ＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＡＡ
ＴＧＣＣ−５′）を下記 ａ）表面官能基化：ＰＷＧチップの液相シラン化を、高温（すなわち５０〜９０
℃）で数時間、２％（v/v）３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン 及び０．２％（v/v）Ｎ−エチルジイソプロピルアミンを含むｏ−キシレンでの 処理によって実施し；シラン化ＰＷＧチップをＣＨ3ＣＮ中で洗浄し、減圧下に デシケーター中で乾燥し、 ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化：エポキシ環を結合する表面を修飾オリゴヌク
レオチドの末端アミノ基又はチオール基での開環によって反応させ：チオール末
端化又はアミノ末端化キャプチャープローブ１０nmolを含む溶液１００μLを、 １００mM水性炭酸バッファー（ｐＨ８．２）中で、一晩３５℃でインキュベート
し；固定化キャプチャープローブを有するチップを水で洗浄し、乾燥し次いでＰ
ＷＧセットアップに使用するまで−２０℃で保存した 方法によってチップ表面の３′末端を介して固定化した。
ＴＧＣＣ−５′）を下記 ａ）表面官能基化：ＰＷＧチップの液相シラン化を、高温（すなわち５０〜９０
℃）で数時間、２％（v/v）３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン 及び０．２％（v/v）Ｎ−エチルジイソプロピルアミンを含むｏ−キシレンでの 処理によって実施し；シラン化ＰＷＧチップをＣＨ3ＣＮ中で洗浄し、減圧下に デシケーター中で乾燥し、 ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化：エポキシ環を結合する表面を修飾オリゴヌク
レオチドの末端アミノ基又はチオール基での開環によって反応させ：チオール末
端化又はアミノ末端化キャプチャープローブ１０nmolを含む溶液１００μLを、 １００mM水性炭酸バッファー（ｐＨ８．２）中で、一晩３５℃でインキュベート
し；固定化キャプチャープローブを有するチップを水で洗浄し、乾燥し次いでＰ
ＷＧセットアップに使用するまで−２０℃で保存した 方法によってチップ表面の３′末端を介して固定化した。
【０１１７】 Ｒ−病原型ゲノムＤＮＡ標的（１０〜１０5ゲノム当量）を、５種のキャプチ ャーエクステンダー（ＣＥ、各０．１nM）及び２０種のＣｙ５でラベルしたラベ
ルエクステンダー（ＬＥ１〜２０、各１nM）のハイブリダイゼーションバッファ
ー（ｐＨ７．０、７５mMクエン酸ナトリウム、７５０mM塩化ナトリウム、０．１
％テルギトールＮＰ−４０）溶液と混合した。この混合液の２００μLを３０分 間９５℃まで加熱し、続いてサンプルラック中に１℃で３０分間保存した。ハイ
ブリダイゼーションアッセイを、同様のハイブリダイゼーションバッファー中で
、５３℃で実施した。サンプル混合液を、ハイブリダイゼーションアッセイ中で
３０分間インキュベート（流動停止器具及び方法を用いて）した。標的ＤＮＡの
最小検出量は、３回反復での陰性コントロールで決定したシグナルの３つの標準
偏差を超えるシグナルとして決定した１００ゲノム当量（容量１０μL中の）で あった。
ルエクステンダー（ＬＥ１〜２０、各１nM）のハイブリダイゼーションバッファ
ー（ｐＨ７．０、７５mMクエン酸ナトリウム、７５０mM塩化ナトリウム、０．１
％テルギトールＮＰ−４０）溶液と混合した。この混合液の２００μLを３０分 間９５℃まで加熱し、続いてサンプルラック中に１℃で３０分間保存した。ハイ
ブリダイゼーションアッセイを、同様のハイブリダイゼーションバッファー中で
、５３℃で実施した。サンプル混合液を、ハイブリダイゼーションアッセイ中で
３０分間インキュベート（流動停止器具及び方法を用いて）した。標的ＤＮＡの
最小検出量は、３回反復での陰性コントロールで決定したシグナルの３つの標準
偏差を超えるシグナルとして決定した１００ゲノム当量（容量１０μL中の）で あった。
【０１１８】 実施例２：Pseudocercosporella herpotrichoides アッセイ特異性：（ゲノム
ＤＮＡの配列特異的検出）
ＤＮＡの配列特異的検出）
【０１１９】 ゲノムＤＮＡ上の標的領域は、そのＩＴＳ領域であり、またＣＥ及びＬＥプロ
ーブを実施例１に記載している。
ーブを実施例１に記載している。
【０１２０】 目的（Pseudocercosporella herpotrichoides #308, Ｒ病原型）の穀類病原体
の検出の特異性を、同一濃度を用いて他の穀類病原体によって得られた非特異的
シグナルと比較した：Microdochium nivale #18222, Fusarium graminearum R-8
417, Septoria tritici #26517, Ceratobasidium cereale (Rhizoctonia cereal
is) #44234, Drechslera sorokiniana #11404, Cercospora arachidicula #5247
6及びSeptoria nodorum #24425。各穀類病原体の１０4ゲノム当量の標的レベル で、６．１の特異的対非特異的シグナル比がPseudocercosporella herpotrichoi
des #308Ｒ病原型のアッセイで認められたのに対して、他の全穀類病原体では１
．０の特異的対非特異的シグナル比が測定された。
の検出の特異性を、同一濃度を用いて他の穀類病原体によって得られた非特異的
シグナルと比較した：Microdochium nivale #18222, Fusarium graminearum R-8
417, Septoria tritici #26517, Ceratobasidium cereale (Rhizoctonia cereal
is) #44234, Drechslera sorokiniana #11404, Cercospora arachidicula #5247
6及びSeptoria nodorum #24425。各穀類病原体の１０4ゲノム当量の標的レベル で、６．１の特異的対非特異的シグナル比がPseudocercosporella herpotrichoi
des #308Ｒ病原型のアッセイで認められたのに対して、他の全穀類病原体では１
．０の特異的対非特異的シグナル比が測定された。
【０１２１】 アッセイ特性を下記に示すように要約する。 センシング容量：１０μL 標的濃度：１．７fM（１０μL当たり１．７×１０-18モル） ラベルエクステンダー：各１nM（全２０ラベルエクステンダーの１０μL当たり １×１０-14モル） キャプチャーエクステンダー：各０．１nM（全５キャプチャーエクステンダー当
たり１×１０-15モル） アッセイ方法：１０分間平衡／洗浄 ３０分間インキュベーション（流動停止） １０分間洗浄 ５分間再生 ５分間洗浄 検出：洗浄工程中のインキュベーション工程後５分間 変性：９５℃、３０分間 サンプルラック：１℃ ネットシグナル（３測定の平均）： ブランク 1201±97cps； 目的の病原体： Pseudocercosporella herpotrichoides #308, Ｒ病原型 7270±200cps； Microdochium nivale #18222 1136±206cps； Fusarium graminearum R-8417 1235±84cps； Septoria tritici #26517 1166±106cps； Ceratobasidium cereale (Rhizoctonia cerealis) #44234 1295±308cps； Drechslera sorokiniana #11404 1172±192cps； Cercospora arachidicula #52476 1091±115cps； Septoria nodorum #24425 1020±63cps
たり１×１０-15モル） アッセイ方法：１０分間平衡／洗浄 ３０分間インキュベーション（流動停止） １０分間洗浄 ５分間再生 ５分間洗浄 検出：洗浄工程中のインキュベーション工程後５分間 変性：９５℃、３０分間 サンプルラック：１℃ ネットシグナル（３測定の平均）： ブランク 1201±97cps； 目的の病原体： Pseudocercosporella herpotrichoides #308, Ｒ病原型 7270±200cps； Microdochium nivale #18222 1136±206cps； Fusarium graminearum R-8417 1235±84cps； Septoria tritici #26517 1166±106cps； Ceratobasidium cereale (Rhizoctonia cerealis) #44234 1295±308cps； Drechslera sorokiniana #11404 1172±192cps； Cercospora arachidicula #52476 1091±115cps； Septoria nodorum #24425 1020±63cps
【図１】 図１は平面導波路アッセイ〔マルチプルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイ（ＭＯＨＡ）と名づけた〕の１つの可能性を示す。平面導波路は
透明支持体１及び導波層２を含む。導波層の表面上では、核酸配列Ｄ２を有する
キャプチャープローブ３を結合し、それには配列Ｃ２を介して、複数の異なる核
酸配列Ｃ１を有する複数のキャプチャーエクステンダープローブ４が結合してい
る。標的ポリヌクレオチド５は配列Ｃ１に結合している。標的ポリヌクレオチド
には、核酸配列Ｌ１及びＬ２を有する複数のラベルエクステンダープローブ６が
結合している。該ラベルエクステンダープローブは、その核酸配列Ｌ３を介して
、核酸配列Ｌ３を有するラベルプローブ７を結合している。他の例としては複数
のキャプチャープローブ３′は核酸配列Ｄ１を有する標的に直接に結合すること
ができる。他の変形としては、複数のラベルプローブ６′は選択される標的配列
と相補的な核酸配列を介して標的に直接結合することができる。
ションアッセイ（ＭＯＨＡ）と名づけた〕の１つの可能性を示す。平面導波路は
透明支持体１及び導波層２を含む。導波層の表面上では、核酸配列Ｄ２を有する
キャプチャープローブ３を結合し、それには配列Ｃ２を介して、複数の異なる核
酸配列Ｃ１を有する複数のキャプチャーエクステンダープローブ４が結合してい
る。標的ポリヌクレオチド５は配列Ｃ１に結合している。標的ポリヌクレオチド
には、核酸配列Ｌ１及びＬ２を有する複数のラベルエクステンダープローブ６が
結合している。該ラベルエクステンダープローブは、その核酸配列Ｌ３を介して
、核酸配列Ｌ３を有するラベルプローブ７を結合している。他の例としては複数
のキャプチャープローブ３′は核酸配列Ｄ１を有する標的に直接に結合すること
ができる。他の変形としては、複数のラベルプローブ６′は選択される標的配列
と相補的な核酸配列を介して標的に直接結合することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 オロシュラン，ペーテル スイス国 ツェーハー−4053 バーゼル デルスベルガーアレー 11／３ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA35 CB21 DA12 FA29 FB02 FB07 FB13 GC15 4B063 QA01 QA19 QQ10 QQ42 QQ52 QQ53 QR32 QR56 QR66 QR82 QS34 QS36 QS39 QX02
Claims (15)
- 【請求項１】 ２セットの試薬、すなわちラベリングセット及びキャプチャ
ーセットを用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、そしてここで
光平面導波路を用い、該方法が １）ａ）ラベル部分、及び標的ポリヌクレオチドの同一又は異なる配列と相補的
である、同一又は異なる配列Ｌ１（好ましくは約５〜１００ヌクレオチド（nt）
長、より好ましくは約８〜１００nt長）を有する核酸部分（好ましくは１本鎖で
ある）、及び場合により、ラベル部分と、標的ポリヌクレオチド又はキャプチャ
ーエクステンダー若しくはキャプチャープローブ（約５００nt長未満である）の
配列のいずれにも相補的でない配列Ｌ１との間の第２配列（ラベル部分は、エバ
ネッセント性励起発光を包含する発光によって検出することができるシグナルを
提供するラベルを含む）を各々に含む、複数のラベルプローブ、又は ｂ）ラベル結合性核酸配列Ｌ２及び核酸配列Ｌ１（ここで、配列Ｌ１は、標的ポ
リヌクレオチドの核酸配列と相補的であり、そして配列Ｌ２は、ラベルプローブ
の核酸配列Ｌ３と相補的である）を各々に含む複数のラベルエクステンダープロ
ーブ（ｂ１）、及び場合により、Ｌ２の配列と相補的である核酸配列Ｌ３を含む
ラベルプローブ（ラベル部分は、エバネッセント性励起発光を包含する発光によ
って検出可能であるシグナルを提供するラベルを含む（ｂ２）、 を含むラベリングセットの試薬を提供する工程、並びに ２）ｃ）標的ポリヌクレオチドの核酸配列と相補的である同一又は異なる核酸配
列Ｄ１を含む複数のキャプチャープローブ（ここで、核酸配列Ｄ１（好ましくは
約１０〜１００nt長）は、ラベルプローブ及びラベルエクステンダープローブに
含まれる配列Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と相補的でなく、そしてキャプチャープローブ
は直接的にか又は結合基を介して、導波路の導波層表面に結合しているか又は特
異的に結合することができる）、又は ｄ）標的ポリヌクレオチドの配列と相補的である配列Ｃ１（好ましくは約１０〜
１００nt長）を有する核酸領域（好ましくは１本鎖）、及び場合により、標的ポ
リヌクレオチドの配列と相補的ではなく、そして好ましくは約５００nt長未満で
ある第２の領域を各々に含み、そしてキャプチャープローブ認識核酸配列Ｃ２を
更に含む複数のキャプチャーエクステンダープローブ（ｄ１）、及び配列Ｃ２と
相補的である核酸配列Ｄ２を含むキャプチャープローブ（ｄ２）（ここで、配列
Ｌ１及びＣ１は同一でなく、非相補的配列である） を含む、キャプチャーリングセットの試薬を提供する工程、 ３）相補的配列の結合性条件下での水性媒質中で、標的ポリヌクレオチドの存在
を測定すべきサンプル（標的ポリヌクレオチドが一本鎖形態で存在するために処
理されていることができる）と、 （ａ）組成物１ａ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）及び２ｄ）、又は（ｂ）組成
物１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１ａ）、
１ｂ）及び２ｃ）、若しくは、１ａ）、１ｂ）及び２ｄ）、又は（ｃ）組成物１
ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）若しくは１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）、又は（ｄ）組成物
１ａ）、１ｂ）、２ｃ）及び２ｄ）とを結合させて複合物を形成する工程、 ４）工程３の複合物を、キャプチャープローブ（キャプチャープローブは、工程
３の複合物に結合する前に導波路に結合することができるか、又は工程３の複合
物に結合した後に導波路に結合することができる）の複数のコピーによって導波
路に結合する工程、 ５）もし組成物１ｂ）が、ラベルプローブを含まず、そしてラベルが、工程３に
含まれず該複合物をラベルするときには、工程４の結合している複合物と該ラベ
ルとを結合する工程、並びに ６）導波路のエバネッセント場で励起する発光を測定することによってか、又は
導波路の場近辺で生成する発光を測定することによって標的ポリヌクレオチドに
結合しているラベルを検出する工程 を含む方法。 - 【請求項２】 １）表面に付着し、そして表面から伸長する複数のキャプチ
ャープローブを有する表面を提供する工程、 ２）i）標的ポリヌクレオチドの特異的領域に結合するように適合されている標 的部分及び ii）該キャプチャープローブに結合するように適合されているキャ プチャー部分の各々を有する複数のキャプチャーエクテンダープローブを提供す
る工程、 ３）キャプチャーエクテンダープローブをサンプルに暴露し、もしサンプル中に
存在すれば、標的ポリヌクレオチドを、キャプチャーエクステンダープローブに
結合させる工程、 ４）こうして結合した標的ポリヌクレオチドを、表面に付着している該キャプチ
ャープローブに暴露し、キャプチャーエクステンダープローブをキャプチャープ
ローブに結合させる工程、 ５）該標的ポリヌクレオチドを、i）標的ポリヌクレオチドの領域と特異的に結 合させるように適合されている標的部分及び ii）光学的に検出可能なラベルで 構成されるか、又はそれと結合するように適合されているラベル部分を各々有す
る複数のラベルエクステンダープローブ（該ラベルエクステンダープローブは、
本アッセイの条件下では、キャプチャープローブを結合することができない）に
暴露させる工程、及び ６）ラベルを検出する工程 を含む、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 表面が光平面導波路の導波層であり、そしてラベルをラベル発光団の励起によっ
て検出することを特徴とする方法。 - 【請求項３】 工程４より前に工程３及び５を実施する、請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】 ラベル部分がラベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項５】 固形の支持体が光平面導波路であり、そしてラベルを導波路
のエバネッセント場内で励起する発光、又は導波路の場近辺で発生する発光を測
定することによって検出する、溶液相核酸サンドイッチアッセイを用いる、請求
項１〜４記載の標的ポリヌクレオチドを検出する方法。 - 【請求項６】 標的ポリヌクレオチドを２クラスの結合性相互作用（第１の
クラスの結合性相互作用は、少なくとも１個のキャプチャーエクステンダープロ
ーブであり、そして第２のクラスの結合性相互作用は、平面導波路の導波層の表
面に結合しているか又は結合することができ、そして実質的に結合している、少
なくとも１個の該キャプチャーエクステンダープローブと少なくとも１個の複合
性キャプチャープローブとの間である）によって導波路上に固定化する、請求項
１〜５に記載の光平面導波路を用いる標的ポリヌクレオチドを検出する方法。 - 【請求項７】 結合したラベルの測定前に、結合したラベルを結合していな
いラベルと分離しない、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 １０4コピー未満の標的ポリヌクレオチドが存在するとき、 標的ポリヌクレオチドを検出する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
- 【請求項９】 キャプチャープローブを光平面導波路上で合成する、請求項
１〜８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 サンプル中で、１を越えるタイプの標的ポリヌクレオチド
を検出する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 標的ポリヌクレオチドが病原性生物からの配列であるか又
は疾患若しくは生体の他の応答に関連する配列を含むポリヌクレオチドである、
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】 病原性生物がウイルスである、請求項１１記載の方法。
- 【請求項１３】 標的ポリヌクレオチドに関連する疾患の研究又は診断のた
めの、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法の使用。 - 【請求項１４】 キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープロ
ーブ、ラベルエクステンダープローブ及び場合により請求項１〜１２のいずれか
１項で定義されるような全てのラベルを含む部分のキット。 - 【請求項１５】 ａ）上記２ｃ）によって定義されるような複数のキャプチ
ャープローブ、又は上記請求項１の２ｄ）によって定義されるような複数のキャ
プチャーエクステンダープローブ及びキャプチャープローブ； ｂ）キャプチャープローブ又はキャプチャーエクステンダープローブに結合して
いる標的ポリヌクレオチド；及び ｃ）標的ポリヌクレオチドに結合している上記請求項１の１ａ）によって定義さ
れるような複数のラベルプローブ、又は標的ポリヌクレオチドと結合している上
記請求項１の１ｂ）によって定義されるような複数のラベルプローブエクステン
ダー及び該ラベルプローブエクステンダーに結合している上記請求項１の１ｂ）
によって定義されるようなラベルプローブ を平面導波路の導波層の表面に結合している光平面導波路。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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