KR20230037430A - 핵산효소를 이용한 분석물질 검출 방법 - Google Patents

핵산효소를 이용한 분석물질 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤어핀 핵산효소(hairpin nucleic acid enzyme, HNE)와 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고, 상기 헤어핀 핵산효소는 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하며, 상기 ICS-IHS 2 연속 서열이 SBS 2-IBS 연속 서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하는 분석물질 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

핵산효소를 이용한 분석물질 검출 방법 {A method to detect analytes using nucleic acid enzyme}
본 발명은 신호를 증폭함으로써 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소 활성이 있는 핵산인, 핵산효소를 이용하여 신호를 증폭함으로써 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 출원일자 2021년 9월 9일자, 출원번호 10-2021-0120416, 명칭 "핵산효소를 이용한 신호 증폭 시스템"에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 발명의 일부로 포함시킨다.
단백질 효소(protein enzyme)는 매우 효율적인 촉매로서 분석물질(analyte)을 검출하는데 많이 이용되고 있다. 예를 들어 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)에서는 DNA 중합효소를 이용하여 적은 개수의 목표 핵산(target nucleic acid)을 여러 개로 증폭함으로써 민감한 검출을 가능하게 한다. 또한 효소결합면역흡착측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay)에서는 peroxidase와 같이 색깔이 있는 생성물을 생성할 수 있는 효소를 표지로 사용하여 신호를 증폭하기도 한다. 그러나 단백질 효소는 열이나 pH와 같은 인자에 의해 쉽게 변성되는 단점이 있다.
생물체에 존재하는 대부분의 효소는 단백질 효소이지만 예외적으로 RNA가 효소로 작용하는 경우가 발견되었는데 그런 RNA를 ribozyme이라고 한다. ribozyme의 발견 이후 효소로 작용할 수 있는 핵산(nucleic acid)에 대한 연구가 많이 이루어져 효소로 작용할 수 있는 DNA인 DNAzyme(또는 deoxyrinucleozyme)들이 개발되었다(Santoro and Joyce, Biochemistry, 1998, 37, 13330-13342; Schlosser et al., Nucleic Acids Research, 2008, 36, 1472-1481). ribozyme이나 DNAzyme과 같은 핵산효소(nucleic acid enzyme)들은 단백질 효소에 비해 활성은 낮지만 변성에 강한 장점이 있다. 또한 혼성화(hybridization) 반응에 의해 다른 핵산과 특이적으로 결합할 수 있고, 단백질, 세포, 유기분자 등 다른 분석물질(analyte)과 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer)의 개발이 가능한 장점도 있다. 따라서 이러한 핵산효소를 이용하여 분석물질을 검출하는 여러 가지 방법들이 개발되었지만 감도가 충분히 높지 못하거나, 방법이 복잡하거나, 단백질 효소를 함께 사용해야 하는 단점이 있었다(Safdar et al., Trends in Biotechnology, 2020, 38, 1343-1359).
본 발명의 목적은 헤어핀 핵산효소(hairpin nucleic acid enzyme, HNE)와 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고, 상기 헤어핀 핵산효소는 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하며, 상기 ICS-IHS 2 연속 서열이 SBS 2-IBS 연속 서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하는 분석물질 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 복수의 헤어핀 핵산효소 HNE 1과 HNE 2, 및 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고, 상기 HNE 1은 5'-말단부터 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하고, 상기 HNE 2는 5'-말단부터 HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) 및 IBS 상보서열(ICS)과 상보적으로 결합할 수 있는 연결서열(linking sequence, LKS); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제1 억제서열(IHS 1); 및 LKS의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 서열(LKS complementary sequence, LCS)을 순차적으로 포함하는 분석물질 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석물질 검출용 조성물을, (a) 분석물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; (b) 분석물질이 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)에 상보적으로 결합하는 단계; HNE 1의 억제서열(IHS) 및 IBS의 상보서열(ICS)이 HNE 2의 상기 HNE 1의 IHS 및 ICS와 상보적으로 결합하는 단계; HNE 2의 상기 HNE 1의 개시자 결합서열과 상보적으로 결합할 수 있는 결합서열이 다시 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)과 상보적으로 결합하여 반복되는 혼성화 연쇄반응 단계; (c) 기질 핵산이 상기 헤어핀 구조가 풀린 핵산효소에 결합하여 상기 기질 핵산이 절단되는 단계; (d) 상기 시료로부터 분석물질의 존재 여부를 분석하는 단계를 포함하는 분석물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석물질 검출용 조성물을 포함하는 분석물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서 DNA, RNA, 세포, 바이러스, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 등 다양한 물질을 높은 감도로 검출할 수 있게 해주는, 핵산효소를 이용한 분석물질 검출 방법을 찾고자 노력하였다.
지금까지 여러 가지 핵산효소들이 개발되었으며 한 가지 예를 들면 RNA를 절단하는 8-17 DNAzyme(Santoro and Joyce, Biochemistry, 1998, 37, 13330-13342)이 있다. 핵산효소에 의해 절단되는 핵산을 기질 핵산(substrate nucleic acid)이라고 하면, 핵산효소는 기질 핵산이 결합할 수 있는 기질결합서열(substrate binding sequence, SBS)과, SBS에 결합한 기질 핵산을 절단하는 활성을 가진 촉매 서열(catalytic sequence, CTS)을 포함한다(도 1). 그리고 기질 핵산은 핵산효소의 SBS에 결합할 수 있는 효소결합서열(enzyme binding sequence, EBS)과 절단 반응(cleavage reaction)이 일어나는 절단 서열(cleavage sequence, CLS)을 포함한다. 8-17 DNAzyme의 경우 CTS는 두 개의 SBS 사이에 있고, 기질 핵산의 CLS는 두 개의 EBS 사이에 있다(도 1). 8-17 DNAzyme의 CLS는 두 개의 뉴클레오타이드로 구성되는데 첫 번째 뉴클레오타이드가 G일 때 잘 절단된다. 8-17 DNAzyme은 RNA를 절단하는 효소이지만 CLS의 두 뉴클레오타이드 가운데 첫 번째 뉴클레오타이드만 리보뉴클레오타이드(rN)이고 나머지는 DNA로 되어 있어도 상관없다.
핵산효소에 염기서열을 추가하여 헤어핀(hairpin) 구조로 만들면 효소 활성을 억제할 수 있다. 헤어핀 구조의 핵산효소를 hairpin nucleic acid enzyme(HNE)으로 부르고, 헤어핀 구조에서 이중가닥 부분은 줄기(stem), 나머지 부분은 고리(loop)로 부르기로 한다. 한 예를 들면 SBS 2의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 억제 서열 2(inhibitor sequence, IHS 2)를 추가하여 헤어핀 구조를 만들 수 있다(도 2a).
양 끝에 개시자(initiator)가 결합할 수 있는 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)과 IBS의 전부 또는 일부에 상보적인 IBS 상보 서열(ABS complementary sequence, ICS)을 각각 추가하면 헤어핀 구조를 더 안정화시킬 수 있다(도 2b).
이 구조에서 IHS 2와 SBS 2의 결합 길이를 조절함으로써 개시자가 결합할 때 헤어핀 구조가 열리도록 할 수 있다. 여기에서 헤어핀 구조가 열린다는 것은 줄기(stem)를 형성하던 가닥들이 서로 분리되는 것을 의미한다. 즉 IHS 2와 SBS 2의 결합만으로는 헤어핀 구조가 유지될 수 없도록 IHS 2와 SBS 2의 결합 길이를 조절하면, IBS가 개시자와 결합하면서 ICS로부터 해리될 때, 헤어핀 구조가 열리게 된다. 이를 위해서, SBS 2와 IHS 2가 상보적으로 결합하는 길이는, 개시자가 없을 때는 핵산효소 활성을 효과적으로 억제하지만, 개시자가 IBS에 결합하면 헤어핀이 열려 활성화되도록 최적화해야 한다. 여기에서 개시자의 결합을 촉진하기 위해, ICS를 IBS보다 짧게 하여 IBS 일부를 발판 서열(toehold sequence, THS)로 남겨놓을 수도 있다(도 2b).
이와 같은 형태의 핵산효소는 분석물질에 의해 헤어핀 구조가 열려 활성화되기 때문에, 핵산효소의 활성은 개시자의 수에 비례하게 된다. 또한 개시자에 의해 활성화된 각 핵산효소는 여러 개의 기질 핵산을 절단할 수 있어, 이를 이용한 신호 증폭이 가능하다.
또한 SBS 서열들을 조절하여 추가적인 내부 줄기를 형성하도록 함으로써 핵산효소 활성을 더욱 효과적으로 억제할 수도 있다. 따라서 헤어핀 핵산효소의 고리에 있는 단일 가닥 서열 일부가 상보적으로 결합함으로써 추가적인 내부 줄기를 형성할 수 있다(도 2c). 이러한 내부 줄기 구조의 길이는, 전체 HNE의 구조를 더 안정하게 만드는 데는 기여하지만, 그 자체로는 안정성이 낮아 개시자가 IBS에 결합했을 때는 헤어핀 구조가 해체될 수 있는 수준으로 조절해야 한다.
여기에서 개시자는 분석물질일 수 있다. 예를 들어 분석물질이 DNA나 RNA와 같은 핵산이라면 IBS는 분석물질의 염기서열과 상보적인 서열이 될 수 있다.
또한 분석물질이 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 등 핵산이 아닌 다른 물질일 때는 그 분석물질과 결합할 수 있는 압타머(aptamer) 서열을 IBS에 사용할 수 있다.
또한 분석물질이 개시자로 작용하도록 하는 대신 별도의 매개자(mediator)를 개시자로 사용할 수도 있다.
분석물질 검출용 조성물은 매개자(mediator)를 추가로 포함하고, 매개자는 분석물질과 결합할 수 있는 분석물질 결합서열(analyte binding sequence, ABS), 헤어핀 구조의 줄기를 연장하는 줄기 연장 서열(stem extension sequence, SES), 헤어핀 구조의 고리를 형성하는 고리 서열(loop sequence, LPS), SES 서열과 상보적인 SES 상보 서열(SES complementary sequence, SCS), 그리고 ABS의 전부 또는 일부와 상보적인 ABS 상보 서열(ABS complementary sequence, ACS)을 순차적으로 포함한다(도 3). 또한 상기 고리서열(LPS)부터 분석물질 결합서열의 상보서열(ACS)까지의 서열 가운데 전부 또는 일부가 개시자로 작용할 수도 있다.
여기에서 분석물질이 DNA나 RNA와 같은 핵산이라면 ABS는 분석물질의 염기서열과 상보적인 서열이 될 수 있다.
또한 분석물질이 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 등 핵산이 아닌 다른 물질일 때는 그 분석물질과 결합할 수 있는 압타머(aptamer) 서열을 ABS에 사용할 수 있다.
분석물질이 매개자에 결합하면서 헤어핀 구조가 열리면 LPS부터 ACS까지 단일 가닥으로 노출되기 때문에, 이 서열 가운데 일부를 HNE의 개시자로 사용할 수 있다. 그러나 분석물질이 없는 상태에서는 LPS만 고리 부분에 노출되어 있어 개시자로 사용되기에는 불충분하다. 특히 LPS와 SCS만 개시자로 사용할 경우, HNE는 ABS와 관련된 서열을 전혀 포함하지 않기 때문에, 분석물질의 종류와 상관없이 사용할 수 있는 범용 HNE를 만들 수 있다.
신호를 더욱 증폭하기 위해 두 개의 HNE를 이용하여 혼성화연쇄반응(hybridization chain reaction, HCR)을 일으킬 수 있다. HCR은 도 4a와 같이 서로 혼성화(hybridization)될 수 있는 두 종류의 헤어핀 구조 단일 가닥 핵산, H1과 H2를 이용한다(Dirks and Pierce, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 15275). 여기에서 a와 a*, b와 b*, c와 c*는 서로 상보적으로 결합하는 염기서열을 나타낸다. 목표 핵산(I)의 a*-b* 서열이 H1의 a-b 서열에 결합하면 H1의 헤어핀 구조가 열려 H1의 c-b* 서열이 노출된다(도 4b). 노출된 c-b* 서열이 H2의 c*-b에 결합하면 H2의 헤어핀 구조가 열려 H2의 a*-b* 서열이 노출된다(도 4c).
일 실시예에 따르면, 서로 혼성화될 수 있는 두 종류의 헤어핀 핵산효소, HNE 1과 HNE 2를 이용하여 혼성화 연쇄 반응을 일으킬 수 있다(도 6).
따라서, 본 발명은 헤어핀 핵산효소(hairpin nucleic acid enzyme, HNE)와 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고, 상기 헤어핀 핵산효소는 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하며, 상기 ICS-IHS 2 연속 서열이 SBS 2-IBS 연속 서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하는, 분석물질 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 복수의 헤어핀 핵산효소 HNE 1과 HNE 2, 및 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고, 상기 HNE 1은 5'-말단부터 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하고, 상기 HNE 2는 5'-말단부터 HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) 및 IBS 상보서열(ICS)과 상보적으로 결합할 수 있는 연결서열(linking sequence, LKS); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제1 억제서열(IHS 1); 및 LKS의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 서열(LKS complementary sequence, LCS)을 순차적으로 포함한다(도 5).
상기 HNE 1은 5`-말단부터 IBS의 일부에 상보적으로 결합하는 상보서열(ICS)인 a, 제2 억제서열(IHS 2)인 b, 제 1 기질 결합서열(SBS 1), 촉매서열(CTS), 제 2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)인 a` 및 c 를 순차적으로 포함하고, 상기 a-b 연속서열이 상기 SBS 2-a` 연속서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하고, 상기 c는 단일 가닥으로 노출되어 개시자의 결합을 촉진하기 위한 제1 발판 서열(toehold sequence 1, THS 1)로 작용하며, 상기 HNE 2는 5`-말단부터 상기 HNE 1의 IHS 2(b) 및 ICS(a)에 각각 상보적인 b` 및 a`를 포함하는 연결서열(LKS), 제1 기질 결합서열(SBS 1), 촉매서열(CTS), 제2 기질 결합서열(SBS 2), 제1 억제서열(IHS 1)인 c` 및 LKS의 일부에 상보적으로 결합하는 상보서열(LCS)인 a를 순차적으로 포함하고, 상기 a`-SBS 1 연속서열이 상기 c`-a 연속서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하고, 상기 b`는 상기 HNE 1의 a-b 연속서열이 상기 HNE 2의 LKS에 상보적으로 결합하는 것을 촉진하기 위한 제2 발판 서열(THS 2)로 작용한다(도 5).
여기에서는 각 서열의 상호작용을 나타내기 위해 각 서열을 알파벳으로 표시하였으며, a와 a', b와 b', c와 c'는 서로 상보적인 서열을 의미한다. 화살표는 핵산의 5'→3'방향을 나타낸 것이다. HNE 1의 IBS 가운데 THS를 서열 c, 나머지를 서열 a', IHS 2를 서열 b라고 할 때, HNE 2의 THS에 b'를 도입하고, IHS 1에 c'를 도입하면 도 6과 같이 HCR 반응이 가능하게 된다. (1) 먼저 개시자가 HNE 1의 c-a' 서열에 결합하면서 헤어핀 구조가 열리고 HNE 1의 b-a 서열이 노출된다. (2) HNE 1의 노출된 b-a 서열에 HNE 2의 b'-a' 서열이 결합하면서 HNE 2의 헤어핀 구조가 열리고 HNE 2의 c'-a 서열이 노출된다. (3) HNE 2의 노출된 c'-a 서열에 HNE 1의 c-a' 서열이 결합하면서 HNE 1의 헤어핀 구조가 열리고 HNE 1의 b-a 서열이 노출된다. (4) 단계 2와 3의 반복으로 여러 개의 HNE 1과 HNE 2가 연쇄적으로 혼성화되어 여러 개의 핵산효소가 활성화된다. 이때 활성화된 핵산효소의 수는 개시자의 수에 비례하기 때문에, 핵산효소의 활성을 측정함으로써 개시자를 정량적으로 분석할 수 있다.
따라서, HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) b 및 IBS의 상보서열(ICS)인 a가 HNE 2의 연결서열(LKS)인 b` 및 a`와 상보적으로 결합 가능하고, HNE 2의 제1 억제서열(IHS 1)인 c` 및 LKS의 상보서열(LCS)인 a가 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS) c 및 a`과 상보적으로 결합 가능하다.
여기에서 IBS의 상보서열(ICS)인 a와 LKS의 상보서열(LCS)인 a는 동일한 서열일 수 있다.
동일한 원리를 적용하여 두 종류 이상의 HNE를 이용한 HCR도 가능하다. 만약 1번부터 n번까지 n 종류의 HNE를 혼성화 연쇄반응에 사용한다면, 1번 HNE는 분석물질과 결합하여 헤어핀 구조가 열리도록 설계하고, 앞 번호 HNE의 IHS와 ACS가 다음 번호의 ABS와 결합하도록 만든다. 그리고, 마지막 n번 IHS와 ACS가 다시 1번 HNE의 ABS와 결합하도록 만든다. 이렇게 설계된 n 종류의 HNE에 분석물질이 더해지면 분석물질이 1번 HNE에 결합하면서 1번 HNE의 IHS와 ACS가 단일 가닥으로 노출되고 여기에 2번 HNE의 ABS가 결합하며 열리게 된다. 이와 같은 방식으로 n번 HNE까지 연쇄적으로 결합하며 헤어핀 구조가 열리면 여기에 다시 1번 HNE의 ABS가 결합하며 연쇄적인 혼성화 반응이 반복된다.
본 발명은 혼성화 연쇄반응을 일으킬 때도 분석물질이 직접 개시자로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 개시자는 핵산인 분석물질(analyte)이고, 상기 개시자 결합서열(IBS)은 상기 개시자와 상보적으로 결합할 수 있는 핵산서열일 수 있다. 또한, 상기 개시자는 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 가운데 하나인 분석물질이고, 상기 개시자 결합서열(IBS)은 상기 개시자와 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명은 분석물질의 결합으로 헤어핀 구조가 열린 매개자가 개시자로 사용될 수도 있다. 상기 분석물질 검출용 조성물은 매개자(mediator)를 추가로 포함하고, 상기 매개자는 분석물질과 결합할 수 있는 분석물질 결합서열(analyte binding sequence, ABS), 줄기 연장서열(stem extension sequence, SES), 고리 서열(loop sequence, LPS), 줄기 연장서열의 상보서열(SES complementary sequence, SCS), 및 상기 분석물질 결합서열(ABS)의 전부 또는 일부에 상보적인 분석물질 결합서열의 상보서열(ABS complementary sequence, ACS)을 차례로 포함하고, 상기 고리서열(LPS)부터 분석물질 결합서열의 상보서열(ACS)까지의 서열 가운데 전부 또는 일부가 개시자로 작용한다(도 3).
여기서, 상기 분석물질은 핵산이고, 상기 분석물질 결합서열의 상보서열(ABS)은 상기 분석물질 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 핵산서열일 수 있다. 또한, 상기 분석물질은 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 가운데 하나이고, 상기 분석물질 결합서열(ABS)은 상기 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer)일 수 있다.
이렇게 활성화된 핵산효소의 활성은 여러 가지 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명의 기질 핵산은 상기 헤어핀 구조의 핵산효소의 제1 및 제2 기질 결합서열(SBS) 에 각각 상보적인 제1 및 제2 효소 결합서열(enzyme binding sequence, EBS)과 상기 두 개의 효소 결합서열 사이에 절단반응이 일어나는 절단서열(cleavage sequence, CLS)을 포함한다(도 1). 따라서 상기 기질 핵산은 상기 헤어핀 핵산효소의 제1 기질 결합서열(SBS 1) 에 상보적인 제1 효소 결합서열(enzyme binding sequence 1, EBS 1), 절단반응이 일어나는 절단서열(cleavage sequence, CLS), 상기 헤어핀 핵산효소의 제2 기질 결합서열(SBS 2)에 상보적인 제2 효소 결합서열(EBS 2)을 순차적으로 포함한다.
먼저 양 끝에 각각 형광 원자단(fluorescent group)과 소광 원자단(quenching group)을 포함하는 기질 핵산을 사용할 수 있다(도 7a). 각 기질 핵산에 있는 형광 원자단은 소광 원자단의 영향으로 형광이 억제되어 있다. 그러나 기질 핵산이 핵산효소에 의해 절단되면 형광 원자단이 있는 조각과 소광 원자단이 있는 조각 사이의 거리가 멀어지며 형광이 강해지므로 형광 변화를 측정함으로써 핵산효소 활성을 평가할 수 있다(도 7b).
또한 lateral flow assay(LFA) 방식의 측정도 가능하다. 한 가지 예를 들면 LFA strip의 T line에는 비오틴과 결합하는 리간드를, C line에는 토끼 면역글로불린에 대한 이차항체인 anti-rabbit immunoglobulin G antibody를 각각 고정시키고, conjugation pad에 rabbit anti-FAM antibody로 기능화된 금나노입자를 포함시켜 놓는다(도 8). 그리고 양 끝에 비오틴(biotin)과 fluorescein amidite(FAM)가 있는 기질 핵산을 사용하면, 핵산효소에 의해 절단되지 않은 기질 핵산은 conjugation pad에서 금나노입자와 결합하고 T line에서 비오틴 리간드에 다시 결합하기 때문에 T line에 금나노입자의 붉은색이 나타난다(Negative). 반면에 핵산효소에 의해 기질 핵산이 절단되면 비오틴이 있는 조각은 T line에 결합하고 FAM이 있는 나머지 조각은 금나노입자와 결합하여 C line에 결합하게 된다. 따라서 T line의 색이 줄어들고 C -line의 색이 증가하는 것을 통해 핵산효소의 활성을 측정할 수 있다.
기질 핵산은 도 7a와 같이 선형으로 만들 수도 있지만, 도 9와 같이 서로 상보적인 두 개의 줄기 서열(stem sequence, STS), STS 1과 STS 2를 추가로 포함시켜 헤어핀 구조로 만들 수도 있다(도 9).
따라서, 기질 핵산은 헤어핀 기질 핵산일 수 있으며, 상기 헤어핀 기질 핵산은 제1 줄기서열(stem sequence 1, STS 1), 상기 헤어핀 핵산효소의 제1 기질 결합서열(SBS 1) 에 상보적인 제1 효소 결합서열(enzyme binding sequence 1, EBS 1), 절단반응이 일어나는 절단서열(cleavage sequence, CLS), 상기 헤어핀 핵산효소의 제2 기질 결합서열(SBS 2)에 상보적인 제2 효소 결합서열(EBS 2), 상기 제1 줄기서열(STS 1)에 상보적인 제2 줄기서열(stem sequence 2, STS 2)을 순차적으로 포함할 수 있다.
헤어핀 기질 핵산(hairpin substrate nucleic acid, HSN)을 만들 때 줄기의 길이가 너무 길면 절단 후에도 분리되지 않을 수 있고 너무 짧으면 헤어핀 구조가 제대로 형성되지 않을 수 있다. 따라서 절단 전에는 헤어핀 구조로 존재하고 절단 후에는 두 조각이 분리되도록 줄기의 길이를 6 내지 10개의 뉴클레오타이드로, 바람직하게는 7 내지 9개의 뉴클레오타이드로 하는 것이 좋다. 이와 같은 헤어핀 구조에서는 형광 원자단과 소광 원자단의 거리가 더 가까워지기 때문에 소광 효과가 더 강해질 수 있고 따라서 절단 후 더 큰 형광 변화를 기대할 수 있다.
HSN은 절단 전에는 줄기 부분이 이중나선 구조를 형성하지만, 절단 후에는 두 개의 단일 가닥으로 분리되기 때문에, 이 특성을 이용하여 핵산효소의 활성을 측정할 수 있다. 편의상 HSN의 절단으로 생성된 두 개의 단일 가닥 생성물을 각각 CHS-1(cleaved hairpin substrate 1)과 CHS-2로 부르기로 한다(도 9).
일 실시예에 따르면, 상기 헤어핀 구조의 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나와 상보적인 핵산서열을 갖는 프로브 L1이 고정된 표지(label)와, 상기 프로브 L1의 전부 또는 일부에 상보적인 프로브 S1이 고정된 고체상(solid phase)을 추가로 포함하고, 상기 프로브 L1과 프로브 S1의 상보적인 결합으로 상기 표지가 상기 고체상에 결합하며, 상기 단일 가닥 핵산이 상기 프로브 L1에 상보적으로 결합하면서, 상기 고체상에 결합한 표지가 해리시킬 수 있다(도 10).
따라서, 먼저 CHS를 이용하여 고체상으로부터 표지를 방출시킬 수 있다(도 10). 이때 두 개의 CHS를 모두 이용할 수 있지만, 여기에서는 CHS-1을 이용하는 방법을 제시하였다. 서로 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드, 프로브 S1과 프로브 L1을 각각 고체상과 표지에 고정시킨다. 이때 프로브 S1은 CHS-1과 동일한 서열로 제조하고, 프로브 L1은 CHS-1과 상보적인 서열로 제조한다. 여기에서 프로브 S1을 조금 짧게 하여 CHS-1이 프로브 L1에 결합하는 발판을 제공할 수 있다. 이때 절단되지 않은 헤어핀 기질 핵산이 고체상 프로브에 결합하는 것을 방지하기 위해 발판 부분은 HSN의 고리보다는 줄기 쪽 서열을 이용하는 것이 좋다. 고체상에 표지를 더하면 프로브 S1과 프로브 L1의 결합에 의해 표지가 고체상에 결합한다. 핵산효소가 HSN을 절단하면 CHS-1이 프로브 L1에 결합하면서 고체상으로부터 표지가 방출된다. 따라서 방출된 표지를 측정함으로써 핵산효소 활성을 평가할 수 있다. 물론 반대로 프로브 L1을 CHS-1과 동일한 서열로 제조하고, 프로브 S1을 CHS-1과 상보적인 서열로 제조하는 것도 가능하다.
또한, 일 실시예에 따르면, 프로브 S2가 고정된 고체상을 추가로 포함하고, 상기 헤어핀 구조 기질 핵산의 한쪽 끝에 표지가 고정되어 있으며, 상기 프로브 S2는 상기 헤어핀 구조 기질 핵산의 절단으로 생성된 두 개의 단일 가닥 핵산 중 표지가 고정된 가닥에 전부 또는 일부와 상보적인 핵산서열을 가지고, 상기 프로브 S2가 상기 단일 가닥 핵산에 상보적으로 결합하면서 상기 고체상에 표지가 결합될 수 있다(도 11).
따라서, CHS를 이용하여 표지를 고체상으로부터 해리시키는 대신 표지를 고체상에 결합시킬 수도 있다. 두 개의 CHS 가운데 CHS-1을 이용하는 방법은 다음과 같다. CHS-1 쪽 끝에 표지를 고정시킨 기질 핵산이 핵산효소에 의해 절단되면 표지가 고정된 CHS-1이 생성된다(도 11a). 이 생성물을 CHS-1에 상보적인 프로브 S2가 고정된 고체상에 더하면 표지가 고정된 CHS-1은 고체상에 결합하지만 절단되지 않은 기질 핵산은 결합하지 못한다(도 11b). 따라서 세척 후 고체상에 결합한 표지를 측정함으로써 핵산효소 활성을 평가할 수 있다. 이때 고정된 CHS-1은 고체상에 결합하지만 절단되지 않은 기질 핵산은 결합하지 못하도록 CHS-1과 프로브 S2가 결합하는 길이를 최적화해야 한다. 특히 헤어핀 구조 기질 핵산에서 고리 부분은 단일 가닥으로 노출되어 있기 때문에, 고리 부분이 프로브 S2와 결합하는 길이를 최소화하는 것이 좋다.
여기에서 CHS-1 쪽 끝에 표지를 직접 고정시키는 대신 표지와 결합할 수 있는 리간드를 고정시킬 수도 있다. 이 경우 리간드가 포함된 CHS-1이 고체상에 결합한 후 다시 표지를 넣어 결합시키면 된다. 기질 핵산에 표지를 직접 고정시키기 어렵거나, 표지의 가격이 비싸거나, 기질 핵산이 절단되는 반응이나 CHS-1이 프로브 S2에 결합하는 반응에 표지가 영향을 미칠 때는 이 방법이 유용하다.
따라서, 프로브 S2가 고정된 고체상 및 표지를 추가로 포함하고, 상기 헤어핀 구조 기질 핵산의 한쪽 끝에 표지와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 고정되어 있으며, 상기 프로브 S2는 상기 헤어핀 기질 핵산의 절단으로 생성된 두 개의 단일 가닥 핵산 중 리간드가 고정된 가닥의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 가질 수 있다.
상기 표지는 효소, 형광물질, 금나노입자, 방사성물질 등 측정 가능한 물질은 모두 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 고체상은 자성입자, 실리카입자, 바이오칩 표면 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
한쪽 끝에 FAM이 고정된 헤어핀 기질 핵산을 사용하면 LFA 방식의 측정 방법을 더욱 개선할 수 있다(도 12a). 여기에 사용되는 LFA strip은 도 8과 유사하지만, T line에 비오틴 리간드 대신 CHS-1에 상보적인 프로브 T가 고정된 점이 다르다(도 12b). 프로브 T는 도 11의 프로브 S2와 유사하다. 핵산효소에 의해 기질 핵산이 절단되면 CHS-1은 프로브 T에 결합할 수 있다. 그리고 CHS-1 끝에 있는 FAM에 anti-FAM antibody로 기능화된 금나노입자가 결합하기 때문에 T line에 붉은색이 나타난다. 그러나 절단되지 않은 기질 핵산은 프로브 T에 결합하지 못하기 때문에, 기질 핵산과 결합한 금나노입자는 C line에 있는 이차항체에 결합하여 붉은색을 띠게 된다. 이 방법은 기질 핵산의 한쪽에만 FAM을 고정시키기 때문에 더 간단한 장점이 있다. 또한 도 8의 방법에서는 절단되지 않은 기질 핵산이 T line에 결합하기 때문에, 기질 핵산의 농도를 제한해야 하는 단점이 있다. 그러나, 이 방법에서는 절단된 기질 핵산이 T line에 결합하기 때문에 기질 핵산의 농도를 자유롭게 변화시킬 수 있다. 물론 이 방법에서 CHS-1 대신 CHS-2를 사용하는 것도 가능하다.
CHS를 이용하여 추가 증폭 반응을 일으킬 수도 있다. 따라서 비효소적 증폭반응(non-enzymatic amplification reaction)을 위한 핵산들이 추가로 포함되며, 상기 헤어핀 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나 이상에 의해 상기 비효소적 증폭반응이 일어날 수 있다.
예를 들어 CHS가 개시자로 작용하는 2차 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR)을 일으킬 수도 있고, 그 외에 catalyzed hairpin assembly(CHA; Jiang et al., 2014, J. Am. Chem. Soc., 135, 7430)나 entropy driven circuit reaction(EDCR; Lv et al., 2015, Anal. Chem., 87, 11714)과 같은 다른 방식의 증폭 반응을 일으킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 가이드 RNA(guide RNA), CRISPR-Cas 효소, 보고자 DNA(reporter DNA)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 추가로 포함하고, 상기 헤어핀 구조의 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나가 상기 CRISPR-Cas 효소를 활성화함으로써 보고자 DNA의 절단을 통해 형광신호를 발생하는 것인 분석물질 검출용 조성물을 제공한다(도 13).
따라서, CRISPR-Cas 시스템을 이용한 추가 증폭 반응도 가능하다. 예를 들어 CRISPR-Cas12는 guide RNA(G-RNA)에 상보적으로 결합할 수 있는 이중가닥 또는 단일 가닥 표적 DNA(target DNA, T-DNA)에 의해 활성화되어 다른 단일 가닥 보고자 DNA(reporter DNA, R-DNA)를 절단하는 trans-cleavage 활성을 가지고 있다(도 13). 따라서 R-DNA의 양 끝에 형광 원자단과 소광 원자단을 고정시켜 형광 변화로 T-DNA를 검출하는 방법이 개발되었다(Chen et al., 2018, Science, 360, 436). 만약 CHS가 결합할 수 있는 G-RNA를 포함하는 CRISPR-Cas12를 제작하면 CHS가 T-DNA로 작용하기 때문에 CHS 농도에 비례하여 형광이 증가하게 된다.
CHS를 직접 T-DNA로 사용하는 대신 CHS를 이용하여 T-DNA를 생성할 수도 있다. 예를 들어, 도 14와 같이 단일 가닥 T-DNA 전구체(precursor)를 만들고 여기에 CHS가 결합하면서 헤어핀 구조가 열리면, 단일 가닥으로 노출되는 부분의 전부 또는 일부를 T-DNA로 사용할 수 있다. 단일 가닥 T-DNA 전구체는 안정하게 만들 수 있기 때문에, 이 방법은 CHS를 직접 T-DNA로 사용하는 것보다 누출 반응(leakage reaction)을 더 감소시킬 수 있다(도 14). 여기에서 누출 반응은 절단되지 않은 헤어핀 구조 기질 핵산의 헤어핀 구조가 열려 일어나는 반응을 의미한다. 또한 CHS를 catalytic hairpin assembly(CHA) 반응의 촉매(catalyst, C)로 사용하여 이중가닥 T-DNA를 생성할 수 있다. 단일 가닥 핵산인 C가 첫 번째 헤어핀 구조 단일 가닥 핵산, H1에 결합하면, H1의 헤어핀 구조가 풀려 C가 결합하지 않은 나머지 부분이 단일 가닥으로 노출된다(도 15, 단계 a). 이렇게 노출된 단일 가닥 부분이 두 번째 헤어핀 구조 단일 가닥 핵산, H2에 결합하기 시작하면, H2의 헤어핀 구조가 풀리면서 C를 밀어내고 대신 결합한다(도 15, 단계 b). 결과적으로 H1과 H2가 결합한 이중가닥 핵산이 형성되고 C는 H1으로부터 해리되어 다시 CHA 반응을 시작한다(도 15, 단계 c). 따라서 이렇게 형성된 H1-H2 이중가닥 핵산을 T-DNA로 인식하는 CRISPR-Cas 효소를 제작하면 추가 증폭이 가능하다.
이러한 방법들은 Cas9이나 Cas13과 같은 다른 CRISPR-Cas 시스템에도 적용될 수 있다. 그러나 Cas13은 RNA를 목표 핵산으로 인식하기 때문에, DNA가 아닌 RNA 헤어핀 구조 기질 핵산이나 T-RNA 전구체를 제작해서 사용해야 한다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 분석물질 검출용 조성물을, (a) 분석물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; (b) 분석물질이 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)에 상보적으로 결합하는 단계; HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) 및 IBS의 상보서열(ICS)이 HNE 2의 연결서열(LKS)과 상보적으로 결합하는 단계: HNE 2의 제1 억제서열(IHS 1) 및 LKS의 상보서열(LCS)이 다시 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)과 상보적으로 결합하여 반복되는 혼성화 연쇄반응 단계; (c) 기질 핵산이 상기 헤어핀 구조가 풀린 효소핵산에 결합하여 상기 기질 핵산이 절단되는 단계; (d) 상기 시료로부터 분석물질의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 분석물질 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 분석물질 검출용 조성물을 포함하는 분석물질 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 시약이 별도의 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "분석물질"은 진핵세포나 박테리아 같은 세포, 바이러스 입자, DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온과 같은 물질 등 검출 대상이 될 수 있는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "상보적으로 결합"은 뉴클레오티드 서열 간에 상보적 염기쌍을 형성하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "시료"란 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "검출(detection)"은 시료 내 목표핵산의 존재 여부 및 정량적 분석을 포함할 수 있으며, 분석(analysis)의 의미를 포함하는 용어로 사용될 수 있다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 키트는 "구획화된" 키트일 수 있다. 구획화된 키트는 시약이 별도의 용기, 예컨대 작은 유리 용기, 플라스틱 용기, 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되어 있는 임의의 키트를 포괄한다. 이러한 용기들은 시료 및 시약의 교차오염을 방지하면서 시약을 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 효율적으로 전달하게 할 수 있고/있거나, 각각의 용기의 물질 또는 용액을 한 구획으로부터 또 다른 구획으로 정량적 방식으로 첨가하게 할 수 있다. 이러한 키트는 시험될 시료는 수용할 용기, 분석에서 사용될 시약을 함유하는 용기, 세척 시약을 함유하는 용기, 및 검출 시약을 함유하는 용기도 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 원하는 방법을 수행하기 위해 키트 성분의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 쓰이고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 쓰인다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 신호 증폭 시스템을 이용하면 단백질 효소를 사용하지 않고도 극미량의 물질을 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한 현장에서 사용할 수 있는 간단하고 경제적인 분석물질 검출 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 이전 발명에서 8-17 DNAzyme과 그 기질 핵산의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 활성이 억제된 헤어핀 DNAzyme 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 매개자(mediator)의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 이전 발명에서 혼성화 연쇄반응(hybridization chain reaction)이 일어나는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 혼성화 연쇄반응이 가능한 두 종류의 헤어핀 핵산효소(hairpin nucleic acid enzyme, HNE), HNE 1과 HNE 2의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 두 종류의 헤어핀 핵산효소, HNE 1과 HNE 2에 의해 혼성화 연쇄반응이 일어나는 과정을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에서 양 끝에 형광 원자단과 소광 원자단이 부착된 기질 핵산을 이용하여 활성화된 핵산효소의 활성을 측정하는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 lateral flow assay 방법으로 핵산효소의 활성을 측정하는 것을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산의 구조와 이를 이용한 핵산효소 활성 측정 방법을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하여 표지를 고체상으로부터 해리시킴으로써 핵산효소 활성을 측정하는 방법을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하여 표지를 고체상에 결합시킴으로써 핵산효소 활성을 측정하는 방법을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하여 lateral flow assay 방법으로 활성화된 핵산효소의 활성을 측정하는 것을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산과 CRISPR-Cas 효소를 이용하여 이차 증폭하는 것을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하여 CRISPR-Cas 효소의 단일 가닥 표적 핵산을 생성하는 방법을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하여 CRISPR-Cas 효소의 이중가닥 표적 핵산을 생성하는 방법을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 한 실시예에서 핵산효소와 기질 핵산 사이의 결합 길이에 따른 절단 반응 속도를 비교한 결과이다.
도 17은 본 발명의 한 실시예에서 두 개의 헤어핀 핵산효소를 이용하는 혼성화 연쇄반응으로 단일 가닥 DNA를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 한 실시예에서 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용한 핵산효소 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
[실시예]
본 발명은 분석물질(analyte)을 높은 감도로 검출하기 위해, 핵산효소(nucleic acid enzyme)가 연쇄적으로 활성화되는 반응을 이용하는 신호 증폭 시스템에 관한 것이다.
이해를 돕기 위해 표 1에 명세서에서 사용된 주요 약자들을 정리하였다.
Figure pat00001
실시예 1: 기질결합서열(SBS)과 효소결합서열(EBS)의 길이에 따른 절단 반응 속도
본 실시예에서는 8-17 DNAzyme에서 기질결합서열(SBS)과 효소결합서열(EBS)의 길이를 최적화하는 실험을 하였다. SBS와 EBS의 결합 길이가 너무 짧으면 기질 핵산이 핵산효소에 결합하지 못하기 때문에 절단될 수 없고, 반면에 SBS와 EBS의 결합 길이가 너무 길면 절단된 기질 핵산이 핵산효소로부터 해리되지 않기 때문에 핵산효소가 다음 기질 핵산을 절단할 수 없게 된다. 따라서 다음 표 2와 같이 SBS의 길이가 10+11인 8-17 DNAzyme(Dz)과 EBS의 길이가 각각 8+9, 9+10, 10+11인 세 가지 기질 핵산 S9, S10, S11을 이용하여 기질 핵산이 절단되는 속도를 측정하였다. Dz에 각 기질이 결합한 상태에서 해리되는 온도, Tm을 괄호 안에 표시하였다. EBS의 길이가 8+8이 되면 Tm이 40℃로 37℃에서 잘 결합하지 못할 것으로 예상되기 때문에 EBS가 더 짧은 기질 핵산은 실험하지 않았다.
Figure pat00002
서로 다른 microplate well에 Dz와 기질 핵산(S9, S10, 또는 S11)을 각각 100 nM 농도로 넣어주었다. microplate well을 37℃에서 반응시키며 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다.
그 결과 SBS와 EBS의 결합 길이가 8+9(S9)일 때 가장 형광 변화가 크고 결합 길이가 9+10(S10)과 10+11(S11)로 길어질수록 형광 변화가 감소하였다(도 16). 이는 기질 핵산의 EBS 길이가 8+9보다 길어지거나 Tm이 45℃ 이상이면 절단 반응의 효율성이 감소할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 기질 핵산의 EBS의 길이는 Tm이 45℃ 이하가 되도록 하는 것이 좋다.
실시예 2: HNE 1 과 HNE 2의 혼성화 연쇄반응에 따른 단일 가닥 DNA 검출
본 실시예에서는 도 6과 도 7의 방법을 따라 혼성화 연쇄반응이 가능한 두 개의 8-17 DNAzyme을 이용하고, 단일 가닥 DNA가 개시자로 작용하는 실험을 하였다. 이 실험에서 사용된 두 개의 DNAzyme(HNE 1과 HNE 2), 그리고 기질 핵산(S), 개시자 DNA(T)의 염기서열을 다음 표 3에 정리하였다. S의 양 끝에 있는 FAM과 BHQ1은 각각 형광 원자단과 소광 원자단이고 중간에 있는 rG는 리보뉴클레오타이드이다. 절단 반응이 일어나는 부분만 리보뉴클레오타이드로 되어 있어도 8-17 DNAzyme에 의해 절단될 수 있다.
Figure pat00003
서로 다른 microplate well에 HNE 1, HNE 2, S를 각각 100 nM 농도로 넣어주고 T를 0부터 100 nM 까지 서로 다른 농도로 넣어주었다. microplate well을 37℃에서 반응시키며 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었는데 이 그래프에서 T의 농도가 0인 시료는 C로 표시하였고 S만 들어있는 시료는 S로 표시하였다. 이 결과에서 T가 들어있는 시료들은 T의 농도가 0인 시료보다 형광이 빨리 증가하는 것을 볼 수 있고 증가 속도는 농도에 비례하는 것을 알 수 있다. 이는 T가 없을 때는 혼성화 연쇄반응이 일어나지 않은 상태에서 S가 HNE 1 또는 HNE 2에 결합하여 느린 속도로 반응이 일어나지만 T가 있으면 혼성화 연쇄반응이 일어나 활성화된 HNE 1과 HNE 2에 S가 결합하여 반응하기 때문에 속도가 빨라졌다는 것을 의미한다.
이 결과를 통해 혼성화 연쇄반응으로 핵산효소를 활성화시키는 방법을 이용하면 매우 간단한 방법으로도 최저 1 pM까지 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 헤어핀 구조의 기질 핵산을 이용한 핵산 효소 활성 측정
도 9와 같은 헤어핀 구조 기질 핵산을 이용하는 핵산효소 활성 측정 방법에서는, 기질 핵산이 절단 전에는 헤어핀 구조로 존재하고 절단 후에는 두 개의 단일 가닥으로 분리되어야 한다. 따라서 본 실시예에서는 개시자의 결합에 의해 활성화되는 한 개의 8-17 DNAzyme을 이용하여 헤어핀 기질 핵산을 절단하는 실험을 진행하였다. 이 실험에서 사용된 DNAzyme(D), 기질 핵산(S), 개시자 DNA(T)의 염기서열을 다음 표 4에 정리하였다. S의 양 끝에 있는 FAM과 BHQ1은 각각 형광 원자단과 소광 원자단이고 중간에 있는 rG는 리보뉴클레오타이드이다.
[표 4]
Figure pat00004
서로 다른 microplate well에 D와 S를 각각 100 nM 농도로 넣어주고 T를 0부터 100 nM 까지 서로 다른 농도로 넣어주었다. microplate well을 37℃에서 반응시키며 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었는데 이 그래프에서 T의 농도가 0인 시료는 C로 표시하였다. 이 결과에서 T가 없는 시료(C)는 형광이 거의 증가하지 않지만, T가 들어있는 시료들은 T의 농도에 비례하여 형광이 증가하는 것을 볼 수 있다. 이는 분석물질의 결합에 의해 활성화된 핵산효소가 헤어핀 기질 핵산을 절단할 수 있을 뿐만 아니라, 절단된 기질 핵산은 두 개의 단일 가닥으로 분리된다는 것을 보여준다. 따라서 분리된 단일 가닥을 이용한 여러 가지 활성 측정 방법들이 가능할 것으로 예상할 수 있다.
<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> A method to detect analytes using nucleic acid enzyme <130> P22U12C0239 <150> KR 10-2021-0120416 <151> 2021-09-09 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNAzyme(Dz) <400> 1 ctcgtagatc ctgtcagcga ctcgaaccat tggcac 36 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 9(S9) <400> 2 gccaatggrg gggatctacg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 10(S10) <400> 3 tgccaatggr ggggatctac ga 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid 11(S11) <400> 4 gtgccaatgg rggggatcta cgag 24 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Initiator DNA(T) <400> 5 cacattggca cccgcaatcc tgctaacaat 30 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hairpin nucleic acid enzyme 1(HNE 1) <400> 6 attgttagca ggattgcggg tgccaatgtg ggtggttcct gtcagcgact cgaacccaca 60 agggtgggca cccacattgg cacccgcaat 90 <210> 7 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hairpin nucleic acid enzyme 2(HNE 2) <400> 7 cacattggca cccgcaatcc tgctaacggt ggttcctgtc agcgactcga acccacaagg 60 attgcgggtg ccaatgtggg tgcccac 87 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid(S) <400> 8 ccttgtgggr ggggaaccac c 21 <210> 9 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNAzyme(D) <400> 9 attgttagca ggattgcggg tgccaatgtg ctcgtagatc ctgtcagcga ctcgaacaca 60 ttggcacccg caat 74 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate nucleic acid(S) <400> 10 gccaatggrg gggatctacg 20

Claims (23)

  1. 헤어핀 핵산효소(hairpin nucleic acid enzyme, HNE)와 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고,
    상기 헤어핀 핵산효소는 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하며, 상기 ICS-IHS 2 연속 서열이 SBS 2-IBS 연속 서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하는, 분석물질 검출용 조성물.
  2. 복수의 헤어핀 핵산효소 HNE 1과 HNE 2, 및 기질 핵산(substrate nucleic acid)을 포함하고,
    상기 HNE 1은 5'-말단부터 개시자 결합서열(initiator binding sequence, IBS)의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 IBS 상보서열(IBS complementary sequence, ICS); 제2 기질 결합서열(substrate binding sequence 2, SBS 2)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제2 억제서열(inhibitor sequence 2, IHS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(catalytic sequence, CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)을 순차적으로 포함하고,
    상기 HNE 2는 5'-말단부터 HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) 및 IBS 상보서열(ICS)과 상보적으로 결합할 수 있는 연결서열(linking sequence, LKS); 제1 기질 결합서열(SBS 1); 기질 절단 촉매서열(CTS); 제2 기질 결합서열(SBS 2); 제1 기질 결합서열(SBS 1)의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 제1 억제서열(IHS 1); 및 LKS의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 서열(LKS complementary sequence, LCS)을 순차적으로 포함하는, 분석물질 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 HNE 1은 5`-말단부터 IBS의 일부에 상보적으로 결합하는 상보서열(ICS)인 a, 제2 억제서열(IHS 2)인 b, 제 1 기질 결합서열(SBS 1), 촉매서열(CTS), 제 2 기질 결합서열(SBS 2) 및 개시자 결합서열(IBS)인 a` 및 c 를 순차적으로 포함하고, 상기 a-b 연속서열이 상기 SBS 2-a` 연속서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하고, 상기 c는 단일 가닥으로 노출되어 개시자의 결합을 촉진하기 위한 제1 발판 서열(toehold sequence 1, THS 1)로 작용하며,
    상기 HNE 2는 5`-말단부터 상기 HNE 1의 IHS 2(b) 및 ICS(a)에 각각 상보적인 b` 및 a`를 포함하는 연결서열(LKS), 제1 기질 결합서열(SBS 1), 촉매서열(CTS), 제2 기질 결합서열(SBS 2), 제1 억제서열(IHS 1)인 c` 및 LKS의 일부에 상보적으로 결합하는 상보서열(LCS)인 a를 순차적으로 포함하고, 상기 a`-SBS 1 연속서열이 상기 c`-a 연속서열과 상보적으로 결합하여 줄기를 형성하고, 상기 b`는 상기 HNE 1의 a-b 연속서열이 상기 HNE 2의 LKS에 상보적으로 결합하는 것을 촉진하기 위한 제2 발판 서열(THS 2)로 작용하는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 헤어핀 핵산효소의 고리에 있는 단일 가닥 서열 일부가 상보적으로 결합함으로써 추가적인 내부 줄기를 형성하는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 개시자는 핵산인 분석물질(analyte)이고,
    상기 개시자 결합서열(IBS)은 상기 개시자와 상보적으로 결합할 수 있는 핵산서열인, 분석물질 검출용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 개시자는 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 가운데 하나인 분석물질이고,
    상기 개시자 결합서열(IBS)은 상기 개시자와 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer)인, 분석물질 검출용 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 분석물질 검출용 조성물은 매개자(mediator)를 추가로 포함하고,
    상기 매개자는 분석물질과 결합할 수 있는 분석물질 결합서열(analyte binding sequence, ABS), 줄기 연장서열(stem extension sequence, SES), 고리 서열(loop sequence, LPS), 줄기 연장서열의 상보서열(SES complementary sequence, SCS), 및 상기 분석물질 결합서열(ABS)의 전부 또는 일부에 상보적인 분석물질 결합서열의 상보서열(ABS complementary sequence, ACS)을 순차적으로 포함하고,
    상기 고리서열(LPS)부터 분석물질 결합서열의 상보서열(ACS)까지의 서열 가운데 전부 또는 일부가 개시자로 작용하는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 분석물질은 핵산이고,
    상기 분석물질 결합서열의 상보서열(ABS)은 상기 분석물질 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 핵산서열인 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 분석물질은 세포, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 가운데 하나이고,
    상기 분석물질 결합서열(ABS)은 상기 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 압타머(aptamer)인, 분석물질 검출용 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 각 기질 결합서열(SBS)의 길이는 7 내지 9개의 뉴클레오타이드인, 분석물질 검출용 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기질 핵산은 상기 헤어핀 핵산효소의 제1 기질 결합서열(SBS 1) 에 상보적인 제1 효소 결합서열(enzyme binding sequence 1, EBS 1), 절단반응이 일어나는 절단서열(cleavage sequence, CLS), 상기 헤어핀 핵산효소의 제2 기질 결합서열(SBS 2)에 상보적인 제2 효소 결합서열(EBS 2)을 순차적으로 포함하는, 분석물질 검출용 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기질 핵산은 헤어핀 기질 핵산이며,
    상기 헤어핀 기질 핵산은 제1 줄기서열(stem sequence 1, STS 1), 상기 헤어핀 핵산효소의 제1 기질 결합서열(SBS 1) 에 상보적인 제1 효소 결합서열(enzyme binding sequence 1, EBS 1), 절단반응이 일어나는 절단서열(cleavage sequence, CLS), 상기 헤어핀 핵산효소의 제2 기질 결합서열(SBS 2)에 상보적인 제2 효소 결합서열(EBS 2), 상기 제1 줄기서열(STS 1)에 상보적인 제2 줄기서열(stem sequence 2, STS 2)을 순차적으로 포함하는, 분석물질 검출용 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기질 핵산은 양 끝에 각각 형광 원자단(fluorophore)과 소광 원자단(quencher)이 결합되어 있는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 헤어핀 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나와 상보적인 핵산서열을 갖는 프로브 L1이 고정된 표지(label)와,
    상기 프로브 L1의 전부 또는 일부에 상보적인 프로브 S1이 고정된 고체상(solid phase)을 추가로 포함하고,
    상기 프로브 L1과 프로브 S1의 상보적인 결합으로 상기 표지가 상기 고체상에 결합하며,
    상기 단일 가닥 핵산이 상기 프로브 L1에 상보적으로 결합하면서, 상기 고체상에 결합한 표지가 해리되는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    프로브 S2가 고정된 고체상을 추가로 포함하고,
    상기 헤어핀 기질 핵산의 한쪽 끝에 표지가 고정되어 있으며,
    상기 프로브 S2는 상기 헤어핀 구조 기질 핵산의 절단으로 생성된 두 개의 단일 가닥 핵산 중 표지가 고정된 가닥에 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 가지고,
    상기 프로브 S2가 상기 표지가 고정된 단일 가닥 핵산에 상보적으로 결합하면서 상기 고체상에 표지가 결합되는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  16. 제12항에 있어서,
    프로브 S2가 고정된 고체상 및 표지를 추가로 포함하고,
    상기 헤어핀 구조 기질 핵산의 한쪽 끝에 표지와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 고정되어 있으며,
    상기 프로브 S2는 상기 헤어핀 기질 핵산의 절단으로 생성된 두 개의 단일 가닥 핵산 중 리간드가 고정된 가닥의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 가진, 분석물질 검출용 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 표지는 효소, 형광물질, 금나노입자, 방사성물질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 분석물질 검출용 조성물.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 고체상은 자성입자, 실리카입자, 바이오칩 표면으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 분석물질 검출용 조성물.
  19. 제12항에 있어서,
    비효소적 증폭반응(non-enzymatic amplification reaction)을 위한 핵산들이 추가로 포함되며,
    상기 헤어핀 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나 이상에 의해 상기 비효소적 증폭반응이 일어나며,
    상기 비효소적 증폭반응은 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR), 촉매 헤어핀 자기조립(catalytic hairpin assembly, CHA), 엔트로피-구동 회로 반응(entropy-driven circuit reaction, EDCR)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  20. 제12항에 있어서,
    가이드 RNA(guide RNA), CRISPR-Cas 효소, 보고자 DNA(reporter DNA)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 추가로 포함하고,
    상기 헤어핀 기질 핵산이 절단되어 생성된 단일 가닥 핵산 중 하나 이상이 상기 CRISPR-Cas 효소를 활성화함으로써 보고자 DNA의 절단을 통해 형광신호를 발생하는 것인, 분석물질 검출용 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 따른 분석물질 검출용 조성물을,
    (a) 분석물질을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계;
    (b) 분석물질이 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)에 상보적으로 결합하는 단계; HNE 1의 제2 억제서열(IHS 2) 및 IBS의 상보서열(ICS)이 HNE 2의 연결서열(LKS)과 상보적으로 결합하는 단계; HNE 2의 제1 억제서열(IHS 1) 및 LKS의 상보서열(LCS)이 다시 HNE 1의 개시자 결합서열(IBS)과 상보적으로 결합하여 반복되는 혼성화 연쇄반응 단계;
    (c) 기질 핵산이 상기 헤어핀 구조가 풀린 핵산효소에 결합하여 상기 기질 핵산이 절단되는 단계;
    (d) 상기 시료로부터 분석물질의 존재 여부를 분석하는 단계를 포함하는, 분석물질 검출 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 따른 분석물질 검출용 조성물을 포함하는, 분석물질 검출용 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 키트는 시약이 별도의 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립 내에 제공되는 것을 포함하는, 분석물질 검출용 키트.
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