CN115011713B - 基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法 - Google Patents

基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法，该检测探针组包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb2+，发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构且均含有8‑17DNAzyme碱基序列，发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8‑17DNAzyme特异性切割位点；发夹型探针H1连接有与牛结核分枝杆菌靶序列互补的碱基序列和引发链；发夹型探针H2包含有与引发链、信号链S3互补的碱基序列。本发明检测探针将Pb2+依赖型8‑17DNAzyme作为双循环信号放大体系的中心元件，实现牛结核杆菌检测信号高效放大的目的，同时本方法不依赖胞内酶系，能够在体外进行检测筛选，实现对牛结核分枝杆菌DNA的快速高灵敏检测。

Description

基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其 检测方法
技术领域
本发明涉及生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法。
背景技术
牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的是一种人畜共患病，该病确诊需要病原分离与鉴定。目前，鉴定牛结核分枝杆菌的方法主要有微生物培养、免疫学方法、分子检测等。前两种诊断方法虽然可以检测牛结核分枝杆菌感染，但它们对亚临床或潜伏期感染的敏感度和特异性较低、微生物培养还存在孵育时间长和检测工作量大的问题。分子检测中，常用实时荧光定量PCR进行检测。实时荧光定量PCR要求使用荧光报告基团，目前实时荧光定量PCR常用的荧光标记如，SYBR Green I、Tapman探针、分子信标等，但都存在一定的缺点：SYBR Green I对引物要求高且易出现非特异性条带；Tapman探针虽特异性高但价格高昂；分子信标虽特异性好但仅适用于特定目标。实时荧光定量PCR还需要用到荧光定量PCR仪，这增加了检测的成本，不适用于普通场所。因此为了提高检测对特异性、灵敏度的要求，同时降低检测成本和降低对大型设备的依赖性，核酸层面的快检技术成为现阶段的发展趋势。
8-17 DNAzyme是一种具有DNA切割活性的核酸酶，能催化一系列化学反应，它比RNA和蛋白质更容易操作，并在不对称催化、生物传感器、DNA纳米技术以及临床诊断方面得到了广泛的应用。2000年，美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu教授等人筛选出对铅离子具有高度亲和力、能特异性结合的8-17DNAzyme。专利CN201510895100.X公开了一种固相检测技术用于环境中Pb2+的检测方法，利用固定在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带荧光标记的部分底物链，借助于发射波激发捕获的底物链，建立荧光信号与Pb2+浓度的关系。同样地，另一公开的专利(CN201810857689.8)利用这一特点与核酸外切酶Ⅲ构建了目标信号级联放大的扩增策略用于检测环境中Pb2+。迄今为止，已经构建了许多基于HCR的DNAzyme生物传感器用于检测核酸、癌细胞、蛋白质、代谢物和金属离子。但是，受限于金属离子，基于8-17 DNAzyme构建的体内检测体系不能安全地实施。
因此，为了提高检测对特异性、灵敏度的要求，核酸层面的快检技术成为现阶段的发展趋势，但大多数核酸检测策略是基于聚合酶链式反应(PCR)，有易污染、成本高、序列错配、需要高度纯化的核酸样品才能维持聚合酶的活性等缺点，开发一种基于8-17 DNAzyme构建体外检测体系用于对牛结核分枝杆菌特异性DNA序列具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法，通过设计一种依赖Pb2+催化的8-17 DNAzyme双循环体系，实现牛结核分枝杆菌特异性DNA序列的体外快速检测，该双循环体系能够显著提高牛结核分枝杆菌的体外检测灵敏度和特异性。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb2+；
所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构，所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均含有8-17 DNAzyme碱基序列，所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8-17 DNAzyme特异性切割位点；
所述发夹型探针H1的游离3’端和环部区分别连接有a1区和b1区，所述a1区和b1区分别为与牛结核分枝杆菌靶序列5’端和3’端互补的碱基序列，所述发夹型探针H1环部区还包含有引发链序列；
所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列，所述发夹型探针H2的游离3’端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区，所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的5’端和3’端互补的碱基序列；
所述信号链S3的两端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团。
作为优选，所述a1区基因序列如SEQ ID NO.1所示：GTCTGCACA；所述b1区基因序列如SEQ ID NO.2所示：TAGTCCTCT。
作为优选，所述a2区基因序列如SEQ ID NO.3所示：AACTAAGA；所述b2区基因序列如SEQ ID NO.4所示：GAACTATCT。
作为优选，所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ ID NO.5所示：GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点；
所述牛结核分枝杆菌靶序列的基因序列如SEQ ID NO.8所示：TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA。
作为优选，所述发夹型探针H2的基因序列如SEQ ID NO.6所示：GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATTTTTGATAAGAACTATCTCCGAGCCGGACGAAACTAAGA；
所述信号链S3的基因序列如SEQ ID NO.7所示：TCTTAGTTrAGGATAGTT，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点。
作为优选，所述荧光基团为FAM基团，所述荧光淬灭基团为BHQ基团。
基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组的检测方法，包括以下步骤：
S1、探针序列预处理：将探针H1、H2和信号链S3的冻干粉用缓冲溶液溶解，然后对探针H1、H2进行退火以形成茎环结构；
S2、双循环体系反应：取步骤S1中的缓冲溶液、退火后的探针H1、H2溶液与待检测样品混合加入EP管中混合均匀，然后避光加入信号链S3溶液混合反应，一步构建双循环反应体系；
S3、荧光值测定：将步骤S2混合反应液在黑暗条件下用荧光计进行检测，并记录下荧光值，通过荧光值判断待检测物是否含有牛结核分枝杆菌；
所述缓冲溶液含有Pb2+。
作为优选，所述缓冲液包括Tris-HCl、NaCl和PbCl2。
作为优选，所述步骤S1中退火温度设置为:95℃,5min；85℃,5min；70℃,15min；65℃,15min；50℃,15min；40℃,15min；30℃,15min；25℃,90min。
作为优选，所述步骤S3中荧光计的激发波长为470nm。
本发明提供的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组检测原理为：
本发明检测探针组以8-17 DNAzyme为体系核心作用元件，分别在上、下游设计了包含有8-17 DNAzyme序列的探针。为确保循环正确启动，分别对H1、H2发夹型探针中做出如下设计：
(1)发夹型探针H1
为了确保H1与牛结核分枝杆菌靶序列正确识别进而启动上游循环，(以3’端为起点，第一个碱基为1，左方向为正，以此类推确定功能序列范围)在其游离3’端1～9碱基处设计了a1区(5’-GTCTGCACA-3’)与靶序列5’端结合，在其环部45～53碱基处设计了b1区(5’-TAGTCCTCT-3’)与靶序列3’端结合，并在13～26碱基处固定8-17 DNAzyme序列，最后在发夹探针环部中心(第41个碱基)设计了一个8-17 DNAzyme RNA碱基切割位点，此处检测性能最好，切割后释放下游引发链。
(2)信号链S3
信号链S3的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有BHQ荧光猝灭基团，序列中心位置设计有8-17 DNAzyme的特异性切割位点。
(3)发夹型探针H2
为了打开H2发夹结构进而引发下游循环，在其环部设计了与上游引发链互补配对的碱基，以3’端为起点，第一个碱基为1，左方向为正，以此类推确定功能序列范围。为了确保信号链S3能够与打开的H2结合使切割准确进行从而促使S3上的荧光基团释放，在其3’端1～8碱基处设计了a2区(5’-AACTAAGA-3’)与信号链S3的5’端结合，22～30碱基处设计了b2区(5’-GAACTATCT-3’)与信号链S3的3’端结合，9～21碱基处固定8-17 DNAzyme序列以确保切割准确进行。
双循环反应过程：
在上游循环中，当牛结核分枝杆菌特异性DNA靶序列片段存在时，靶序列的5’端将与发夹型探针H1的3’端a1区结合，同时不稳定的杂交链中H1茎部被打开，暴露出b1区与牛结核靶序列3’端结合。所形成的杂交链分子在拉伸以及结合过程中产生分子复合力，在复合力的作用下，环部缩小，位于环部的特异性切割位点(从H1的3’端开始第41个RNA碱基rA)暴露在8-17 DNAzyme序列附近。随后在Pb2+催化下，8-17 DNAzyme形成活性中心并切割特异性位点。切割后杂交链断裂成三条DNA链，其中一条链(牛结核分枝杆菌特异性DNA靶序列)将重新返回上游循环与H1进行杂交，另外一条链将作为下游引发链开启下游循环。
在下游循环中，当上游切割反应产生的引发链与H2靠近时，引发链将与H2环部互补配对。新形成的杂交链不稳定使H2的茎部打开，暴露出b2区并与信号链S3的3’端结合，同时信号链S3的5’端与H2 3’端a2互补序列杂交。随后，在Pb2+催化下，包含在H2中的8-17DNAzyme序列片段形成活性中心，对信号链S3上的特异性切割位点进行切割使信号链S3上修饰的荧光基团和猝灭基团分离，体系发出荧光。在本体系中，牛结核分枝杆菌特异性DNA序列片段浓度越高，体系所检测的荧光值越高，根据与空白的荧光差值建立线性曲线，可实现对牛结核分枝杆菌特异性DNA序列片段的定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，构建Pb2+依赖型的8-17 DNAzyme探针识别和切割特异性序列，Pb2+依赖型8-17DNAzyme作为双循环信号放大体系的中心元件，分别对探针H1和H2进行设计并包含8-17 DNAzyme特异切割序列，以8-17 DNAzyme切割活性为信号驱动力，分别构建了上游和下游循环，其中上游循环能够识别牛结核分枝杆菌靶序列，高效地将靶序列进行循环利用，实现上游“齿轮”式动力激发下游循环，同时下游有效利用上游释放的引发链，实现了人工构建的级联信号放大目的，从而实现了牛结核杆菌检测性信号高效放大的目的，提高了牛结核分枝杆菌检测的灵敏度；
2、本发明提供的检测探针组中，在探针H1识别臂上设置了与牛结核分枝杆菌靶序列互补配对的碱基，通过实验证明当至少存在3个错配碱基时其结果与空白无异，该检测探针组的能够对靶序列进行高特异性检测；
3、本发明提供的牛结核分枝杆菌检测方法不依赖胞内酶系，能够在体外进行检测筛选，反应操作步骤简便，无需高温变性、洗脱等其他步骤，检测时间相比传统检测方法显著降低，可以实现对牛结核分枝杆菌DNA的快速、高灵敏度、高特异性的检测；
4、本发明提供的检测方法准确性高、无需热循环仪器和昂贵试剂、成本低廉，具有方便快捷且准确性高的特点，便于市场推广运用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组检测体系原理图；
图2为本发明实施例1中发夹型探针H1、H2、S3的结构图；
图3为本发明实施例1中牛结核分枝杆菌DNA检测信号饱和曲线图；
图4为本发明实施例1不同浓度牛结核分枝杆菌DNA响应校准曲线图；
图5为本发明实验例1中Pb2+催化的DNAzyme双循环检测探针组对牛结核分枝杆菌检测方法可行性分析结果图；
图6为本发明实验例2中Pb2+催化的DNAzyme双循环检测探针组对牛结核分枝杆菌DNA的特异性选择分析结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
本发明涉及到的探针均购自上海生工生物工程股份有限公司
实施例1
基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组检测牛结核分枝杆菌靶序列Target DNA
(1)设计发夹型探针H1、发夹型探针H2和信号链S3
发夹型探针H1、发夹型探针H2结构如图1所示：发夹型探针H1在其游离3’端设计了a1区(5’-GTCTGCACA-3’，SEQ ID NO.1)与靶序列5’端结合，在其环部设计了b1区(5’-TAGTCCTCT-3’，SEQ ID NO.2)与靶序列3’端结合，并在发夹探针环部中心设计了一个8-17DNAzyme RNA碱基特异性切割位点；其基因序列为：
GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA，SEQID NO.5；该序列中rA为RNA碱基；
发夹型探针H2在其环部设计了与上游引发链互补配对的碱基，在其3’游离端设计了a2区(5’-AACTAAGA-3’，SEQ ID NO.3)与信号链S3的5’端结合，在茎部互补区设计了b2区(5’-GAACTATCT-3’，SEQ ID NO.4)与信号链S3的3’端结合；其基因序列为：
GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATTTTTGATAAGAACTATCTCCGAGCCGGACGAAACTAAGA，SEQID NO.6；
信号链S3的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有BHQ荧光猝灭基团，其基因序列为：TCTTAGTTrAGGATAGTT，SEQ ID NO.7；该序列中rA为RNA碱基；
牛结核分枝杆菌靶序列Target DNA的基因序列为：
TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA，SEQ ID NO.8。
(2)探针序列预处理
将发夹型探针H1、H2的冻干粉用缓冲溶液(pH 7.4、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、0.2mM PbCl2)配置成100μM溶液，进一步将H1、H2稀释至1μM并放至-20℃冰箱保存备用。反应开始前，需对探针进行退火以形成发夹结构，退火温度设置为:95℃,5min；85℃,5min；70℃,15min；65℃,15min；50℃,15min；40℃,15min；30℃,15min；25℃,90min。退火完毕，将探针置于4℃冰箱保存。
信号链S3冻干粉用缓冲溶液(pH 7.4、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、0.2mM PbCl2)配置成100μM溶液并进一步稀释至1μM，-20℃冰箱保存备用，其中信号链S3的分装稀释均在避光环境中进行。
Target DNA冻干粉用缓冲液(pH 7.4、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、0.2mM PbCl2)配置成100μM溶液，取Target DNA 100μM溶液以对应倍数的浓度差稀释至不同浓度的Target DNA(0、100aM、150aM、200aM、500aM、100fM、500fM、1pM、100pM、500pM、1nM、10nM、100nM)，-20℃冰箱保存备用。
(3)双循环体系反应
取11.6μL缓冲液(pH 7.4、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、0.2mM PbCl2)与2μL100nM的H1、2μL 100nM的H2、2μL不同浓度的Target DNA于200μLEppendorf管中混匀，最后避光加入2.4μL、120nM的信号链S3混合均匀。
混合体系总体积为20μL，在37℃下充分反应1h，反应原理如图2所示。
(4)荧光基团与猝灭基团的分离和荧光值测定
1h后，将上述反应体系在避光条件下，用去离子水补足至200μL，在黑暗条件下于便携式荧光计(激发波长为470nm)进行检测，并记录下不同浓度的Target DNA的荧光值，结果如图3～图4所示。
图3为牛结核分枝杆菌DNA检测信号饱和曲线图，当牛结核分枝杆菌DNA低于1nM时，测得各自荧光值随着牛结核分枝杆菌DNA浓度的增加而增大，在1nM以后趋于饱和，达到最高荧光值，随后信号值略有波动，但总体趋于稳定。
图4为不同浓度牛结核分枝杆菌DNA响应校准曲线图，牛结核分枝杆菌DNA浓度在200aM-1pM之间有较好的线性趋势。曲线回归方程为：F＝4.834C(牛结核分枝杆菌DNA)+4.057，线性相关系数R2＝0.9853，检出限为100aM(LOD＝3σ/S)。该检测方法实现了对牛结核分枝杆菌DNA的高灵敏检测。其中，牛结核分枝杆菌DNA浓度(200aM、500aM、100fM、500fM、1pM)均平行重复6次实验计算平均值。
实验例1
牛结核分枝杆菌目标DNA检测的可行性分析
设计了5组实验对本发明实施例1中牛结核分枝杆菌检测探针组进行对比验证，对关键影响因素进行分析。其中，第1组不加入Target DNA靶标，第2组不加入发夹型探针H1，第3组不加入发夹型探针H2，第4组不加入信号链S3，第5组为正常实验组，上述变量均采用加入与其等体积的缓冲溶液作为替代，Target DNA靶标浓度为500 pM，其余实验条件同实施例1，结果如图5所示。
从图5可知，由于S3与H2存在一定的结合以及少量S3不稳定等因素导致第1组、第2组、第3组皆存在少许荧光值，但都明显低于第5组正常实验组；第4组无S3信号值为0。第5组正常识别Target DNA引发了双循环体系，从而产生了较高的荧光值。该结果表明，在体系完整且牛结核分枝杆菌靶标存在时，信号值较高，实现了人工构建的级联信号放大目的，从而实现了牛结核杆菌检测性信号高效放大的目的，提高了牛结核分枝杆菌检测的灵敏度，因此，该检测探针组体系可用于牛结核分枝杆菌的检测。
实验例2
牛结核分枝杆菌检测探针组对靶标的特异性分析
设置5组实验考察实施例1中牛结核分枝杆菌检测探针组检测牛结核分枝杆菌的特异性，其中A～D组对牛结核分枝杆菌的靶标序列的不同位置进行了三碱基替换，分别为Target-a、Target-b、Target-c、Target-d，E组为正常牛结核分枝杆菌的靶标Target DNA，各靶标序列如下所示：
Target-a 5’-TGTGCTGTGGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA-3’；(SEQ ID NO.9)
Target-b 5’-TGTGCTGTCGGTGAGGACTTGATTTGTCAGA-3’；(SEQ ID NO.10)
Target-c 5’-TGTGCAGACGGTGTGCACTA GATTTGTCAGA-3’；(SEQ ID NO.11)
Target-d 5’-TGTGCAGTGGGTGAGGACTAGATTTGTCAG A-3’；(SEQ ID NO.12)
Target 5’-TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA-3’；(SEQ ID NO.8)
上述A～E组中各靶标序列浓度均为100pM，其余实验条件均同实施例1，进行6次平行实验，计算各组的平均荧光值，结果如图6所示。
由图6可知，在相同反应检测条件下，加入100pM Target DNA牛结核分枝杆菌特异性序列的反应完成后的荧光值明显高于等浓度的进行碱基替换的非特异性序列，由此表明该技术对牛结核分枝杆菌靶序列DNA具有较高的特异性选择。
实验例3
血液中牛结核分枝杆菌检测
为考察实施例1提供的牛结核分枝杆菌检测探针组及检测方法在实际样品体外检测中的检测性能，采用加标法(灭活菌加入法)模拟实际样本进行检测。以含有108CFU/mL的灭活牛结核分枝杆菌菌液为母液，加入牛血中，提取并制备牛结核分枝杆菌DNA浓度分别为100fmol/L、500fmol/L、1pmol/L的实际样品，其余检测条件同实施例1，实验结果如表2所示。
表2血浆样品中加标回收实验结果
由表2结果可知，实际样品检测的平均回收率为93.2％-107.1％之间，相对标准偏差(RSD)在1.05％-4.37％之间。说明该牛结核分枝杆菌检测探针组及检测方法对牛血样品中的牛结核分枝杆菌有较好的灵敏度和特异性，在较低牛结核分枝杆菌浓度进行检测时能够准确检测反应出牛结核分枝杆菌的存在和浓度情况，具备良好的市场推广运用前景。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 湖南工程学院
<120> 基于DNA zyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctgcaca 9
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtcctct 9
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aactaaga 8
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaactatct 9
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatcaaaaa tagtcctcta ctagtctttt tttttgatcc gagccggacg aagtgtctgc 60
aca 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagatagtt cagtagagga ctatttttga taagaactat ctccgagccg gacgaaacta 60
aga 63
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcttagttag gatagtt 17
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgcagacg gagaggacta gatttgtcag a 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtgctgtgg gagaggacta gatttgtcag a 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtgctgtcg gtgaggactt gatttgtcag a 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtgcagacg gtgtgcacta gatttgtcag a 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtgcagtgg gtgaggacta gatttgtcag a 31

Claims (6)

1.一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb2+；
所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构，所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均含有8-17 DNAzyme碱基序列，所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8-17 DNAzyme 特异性切割位点；
所述发夹型探针H1的茎部区游离3’端和环部区分别连接有a1区和b1区，所述a1区和b1区分别为与牛结核分枝杆菌靶序列5’端和3’端互补的碱基序列，所述发夹型探针H1还包含有引发链序列；
所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列，所述发夹型探针H2的游离3’端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区，所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的5’端和3’端互补的碱基序列；
所述信号链S3的两端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团；
所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ ID NO.5所示：
GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点；
所述牛结核分枝杆菌靶序列的基因序列如SEQ ID NO.8所示：TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA；
所述发夹型探针H2的基因序列如SEQ ID NO.6所示：GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATTTTTGATAAGAACTATCTCCGAGCCGGACGAAACTAAGA；
所述信号链S3的基因序列如SEQ ID NO.7所示：TCTTAGTTrAGGATAGTT，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点。
2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，所述荧光基团为FAM基团，所述荧光淬灭基团为BHQ基团。
3.一种如权利要求1~2任一项所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、探针序列预处理：将探针H1、H2和信号链S3的冻干粉用缓冲溶液溶解，然后对探针H1、H2进行退火以形成茎环结构；
S2、双循环体系反应：取步骤S1中的缓冲溶液、退火后的探针H1、H2溶液与待检测样品混合加入EP管中混合均匀，然后避光加入信号链S3溶液混合反应，一步构建双循环反应体系；
S3、荧光值测定：将步骤S2混合反应液在黑暗条件下用荧光计进行检测，并记录下荧光值，通过荧光值判断待检测物是否含有牛结核分枝杆菌；
所述缓冲溶液含有Pb2+，所述检测方法非用于疾病诊断治疗。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括Tris-HCl、NaCl和PbCl2。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中退火温度设置为:95℃,5min；85℃,5min；70℃,15min；65℃,15min；50℃,15min；40℃,15min；30℃,15min；25℃,90min。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中荧光计的激发波长为470nm。
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