CN106133145A - 从含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本分离核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从保存在含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本分离可扩增核酸的方法、组合物、试剂盒和系统。所述技术依赖于在升高的温度使用2‑咪唑烷酮和蛋白酶如蛋白酶K。有利地,可以分离RNA并用作核酸扩增反应中的模板。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请是提交于2014年2月28日的61/946,637的正式申请,该专利申请出于所有目的通过提述以其整体并入。
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说,本发明涉及从固定在含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样品分离核酸的方法,其中分离的RNA适合于用作核酸扩增程序中的模板。
背景技术
从事对分离自甲醛固定样品的核酸进行分子分析的实验室工作人员认识到,这种样品类型的用途存在某些限制。这是因为甲醛和某些其他化学固定剂对蛋白质和核酸进行了化学修饰。已知这些修饰损害了核酸在随后分析中的应用。
公知的DNA、RNA和蛋白质化学修饰会导致特定的困难。事实上,Masuda等,(Nucleic Acids Res.,27:4436-4443(1999)(Masuda等,《核酸研究》,第27卷,第4436-4443页,1999年)研究了福尔马林固定样品对于分子生物学应用而言是不良材料的原因。作者证明了,虽然用蛋白酶K处理了溶解的固定组织并允许进行RNA提取,但提取的RNA作为PCR模板仅有有限的用途。进一步研究揭示了单羟甲基(-CH2OH)与全部四种碱基的化学加成,以及通过亚甲基桥接进行腺嘌呤二聚化的证据。通过提高不含福尔马林的缓冲液的温度可逆转某些修饰。然而,RNA的不稳定性可能会使得不希望使用高的温度条件。
用于处理甲醛固定样品的早期方法已经取得了一些成果。例如,Khripin等在公开的美国专利申请2011/0196146Al中描述了,在从含甲醛的液基细胞学防腐剂中处理的细胞材料分离核酸的过程中,使用含肼和酰肼的甲醛清除化合物(例如,氨基脲;氨基硫脲;卡巴肼;硫代卡巴肼;N-氨基胍及其盐,包括盐酸盐;N,N-二氨基胍及其盐,包括二盐酸盐;乙酰肼;己二酸二酰肼;丁二酸二酰肼;甲酰肼;马来酸二酰肼;丙二酸二酰肼;苯磺酰肼;对甲苯磺酰肼;甲基磺酰肼)。发明人不采用核酸扩增作为核酸完整性的量度,而是采用杂交捕获方案,其中将RNA探针的混合物杂交至分离的核酸。接着使抗体结合至RNA:DNA杂交体并且随后进行信号扩增程序以确定DNA靶核酸的存在。事实上,Khripin等参考了U.S.6,228,578来指导核酸检测,其中该参考文献描述了在强碱和高温条件(已知用于水解RNA的条件)下处理核酸样品。因此,Khripin等没有解决如何能够使核酸适合用作核酸扩增反应中的模板,也没有给出足够的公开内容使得能够从甲醛固定的样本检测RNA靶。
本文中所公开的技术解决了从保存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本快速且有效分离完整核酸(如RNA)的需求。
发明内容
在一个方面,本发明涉及加工样本的方法,该样本包括在含甲醛的液基细胞学防腐剂中处理的临床样品。该方法以下列步骤开始:将样本与蛋白酶和2-咪唑烷酮或其他甲醛清除剂组合以创建反应混合物。接着,在升高的温度将反应混合物温育一段时间,这段时间足以逆转由甲醛造成的可包含在样本中的核酸的化学修饰。通过该步骤,由甲醛与核酸或蛋白质之间的反应引起的化学修饰中的至少一些被逆转。例如,化学交联可能被打断。接下来,在温育步骤之后是用于从反应混合物中分离核酸的步骤。最后,是用于使用来自分离步骤的核酸作为模板进行体外扩增反应的步骤。
在一些方法中,逆转从甲醛引发的与样本中多肽的交联释放样本中的核酸。在一些方法中,蛋白酶从甲醛引发的交联释放核酸,并且2-咪唑烷酮抑制样品中的核酸和多肽之间新交联的引发。
在一些方法中,在进行步骤(a)之前,样品已经在液基细胞学防腐剂中处理了7-120天。
在一些方法中,温育步骤不超过30分钟,或者温育步骤为约5分钟至30分钟,或者温育步骤不超过15分钟。
在一些方法中,在步骤(d)之后扩增的核酸的产率高于对照扩增中核酸的产率,所述对照扩增省去了蛋白酶或2-咪唑烷酮。在一些方法中,步骤(d)之后扩增的核酸的产率比省去了蛋白酶或2-咪唑烷酮的任一对照扩增中核酸的产率高至少10%。在一些方法中,在温育步骤之后,样品中至少90%的核酸分子无交联。
在一些方法中,在温育步骤之前,2-咪唑烷酮的最终浓度为甲醛的最终最大浓度的1至5或2-5倍(以摩尔计)。在一些方法中,蛋白酶是浓度为4.3至43U/ml的蛋白酶K。在一些方法中,温育步骤的温度为约60℃-100℃。在一些方法中,温育步骤的温度为85℃-95℃。在一些方法中,温育步骤的温度为91℃-95℃。在一些方法中,温育步骤的温度为90℃。
在一些方法中,蛋白酶和甲醛清除剂与样本同时组合。在一些方法中,蛋白酶先于甲醛清除剂与样本组合。在一些方法中,甲醛清除剂先于蛋白酶与样本组合。
在一些方法中,扩增是转录介导的扩增、单引物核酸扩增、基于核酸序列的扩增、聚合酶链式反应、链置换扩增、自动维持的序列复制或DNA连接酶链式反应。在一些方法中,核酸包括DNA,并且在一些方法中包括RNA。在一些方法中,分离的核酸为DNA,并且在一些方法中为RNA。
在一些方法中,与待分离的所述核酸以及与固定探针杂交的捕获探针通过捕获测定而分离核酸。在一些方法中,固定探针被固定至磁珠。
在一些方法中,扩增核酸的测定阳性高于从省去蛋白酶或甲醛清除剂的反应混合物中获得的扩增核酸的测定阳性。在一些方法中,扩增核酸的测定阳性比从省去蛋白酶或2-咪唑烷酮的反应混合物中获得的扩增核酸的测定阳性高至少约12%。在一些方法中,在步骤(d)之后,扩增核酸的测定阳性在21天之后为约95%。
在一些方法中,分离的核酸是人乳头瘤病毒(HPV)RNA靶核酸。在一些方法中,样本是子宫颈细胞样本。
在另一个方面,本发明涉及物质的组合物,包含以下组分:2-咪唑烷酮;蛋白酶K;EDTA;及pH缓冲剂。
在另一个方面,本发明涉及用于加工保存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本的试剂盒。该试剂盒包括第一小瓶,其包含冻干的蛋白酶K酶。该试剂盒还包括第二小瓶,其包含用于重构冻干的蛋白酶K酶的重构缓冲剂。此重构缓冲剂包括一定量的pH缓冲剂、一定量的EDTA和一定量的2-咪唑烷酮。
在另一个方面,本发明涉及用于加工保存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的含核酸样品的系统。该系统组件包括:可编程控制器;与所述可编程控制器连通的移液装置;用于反应小瓶的第一夹持器;以及用于试剂小瓶的第二夹持器。根据本发明的这一方面,可编程控制器由软件指令配置,从而当试剂小瓶容纳有包含2-咪唑烷酮、蛋白酶K、EDTA和pH缓冲剂的溶液时,引起所述移液装置将液体的等分试样从试剂小瓶转移至反应小瓶。同这些组分一样,反应小瓶可包含在其他组分之前或之后引入的保存在甲醛中的样本(如下文进一步描述)。可以使用相同或其他移液装置将样本引入到反应小瓶中,任选地,可编程控制器由软件配置从而引起这种移液装置运行。该系统还可包括用于将反应小瓶及其内容物加热一控制时间段的加热器,任选地受由适当软件配置的可编程控制器控制。
附图说明
图1是柱状图,示出了使用体外转录物来进行的HPV RNA扩增和检测测定中的阳性百分比。在该程序中用到的三种条件是:(1)保存在THINPREP液基细胞学防腐剂中的样本(实心填充);(2)保存在SUREPATH液基细胞学防腐剂中并用蛋白酶K酶处理的样本(斜线填充);及(3)保存在SUREPATH液基细胞学防腐剂中并用2-咪唑烷酮和蛋白酶K酶的组合在升高的温度下处理的样本(空心柱)。
图2A-2C是柱状图,示出了使用含有不同HPV类型的人类细胞系来进行的HPV RNA扩增和检测测定中的阳性百分比。图2A示出了使用含HPV16的SiHa细胞获得的结果。图2B示出了使用含HPV 18的HeLa细胞获得的结果。图2C示出了使用含HPV 45的MS751细胞获得的结果。在图2A-2C的每一个中,空白柱表示阳性百分比(左刻度),粗水平线表示平均信号/截点比(右刻度)。
图3A-3B是曲线图,示出了阳性反应百分比(纵轴)与时间(储存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的天数)的函数关系。两个图都显示了使用30个细胞/反应进行的过程的结果。图3A显示了使用SiHa细胞获得的结果。图3B显示了使用HeLa细胞获得的结果。不同的线表示单独用蛋白酶K处理(■),以及用2-咪唑烷酮和蛋白酶K的组合处理(◆)。
图4是曲线图,示出了阳性百分比作为在2℃-8℃的储存时间的函数。曲线显示了1:10稀释(◆)和1:100稀释(■)的临床样本的结果。
图5是示出了示例性工作流程的关键要素的示意图。
图6示出了甲醛、蛋白酶K和2-咪唑烷酮的可能的反应机理。
定义
除非另有说明,否则本文中所用的科学和技术术语具有与分子生物学领域技术人员通常基于如下文献理解的相同的含义:如Dictionary of Microbiology and MolecularBiology,第2版.(Singleton等,1994,John Wiley&Sons,New York,NY)(《微生物学和分子生物学词典》,第二版,Singleton等,1994年,约翰·威利父子出版社,纽约州纽约市)的技术文献或与分子生物学相关的其他知名技术出版物。除非另有说明,否则本文中使用或考虑的技术是分子生物学领域中熟知的标准方法。
本文所提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过提述以其整体并入。如果此部分示出的定义与通过提述并入本文的专利、专利申请、已公布专利申请和其他出版物示出的定义相反或者不一致,则此部分示出的定义优于通过提述并入本文的定义。
如本文所用,“一个”或“一种”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。
如本文在整个说明书和权利要求书中所使用的近似表述可应用于修饰任何定量或定性表示,这些定量或定性表示可获许可地变化而不会导致与其相关的基本功能的变化。因此,由术语如“约”或“大约”修饰的值并不限于所指定的精确值,而是可包括与该指定值不同的值。
为了清楚起见,“甲醛”的基本形式(CH2O)是气体。所谓“福尔马林”的液体实际上是甲醛气体和水的混合物。然而,如本文所用,“甲醛”可以指溶解在水溶液中的分子(CH2O)。
如本文所用,“液基细胞学”指的是液基的妇科样本采集,其中,以常规方式用刷子工具中的一种收集的用于子宫颈测试的样品,其被转移到液体防腐剂或“固定剂”的小瓶,而不是被铺展到载玻片上。保存的样本可用于显微镜或分子分析。
如本文所用,“样本”是作为具体种类东西的示例而收集的东西。生物样本包括来自可能含有被分析物(例如核酸被分析物)的活的或死的生物体的任何组织或材料。优选的生物样本包括呼吸组织、渗出物(例如,支气管肺泡灌洗)、活检物、痰、外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠组织、粪便、尿或其他体液、组织或材料。高度优选的生物样本包括从子宫颈外开口收集的细胞,如可以结合PAP测试获得。
如本文所用,术语“样品”是指用于测试的一部分或量的材料,其中,该部分可以提供关于其所取自的物的信息。样品可来自任何来源,例如生物样本或环境来源。
如本文所用,术语“核酸”是指包括寡核苷酸的多核苷酸化合物,该寡核苷酸包含具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷或核苷类似物,该核苷或核苷类似物通过标准的磷酸二酯键或其他键共价连接。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物或其类似物。
所谓“被分析物核酸”意指待检测或待定量的目标多核苷酸。特定病毒的基因组是被分析物核酸的示例。
如本文所用,“测试样品”是为确定特定被分析物核酸是否存在而研究的任何样品。
如本文所用,“升高的”温度条件是指高于室温的温度。优选地,升高的温度的范围是60℃-100℃,更优选地,范围是65℃-95℃,有时范围是80℃-90℃,有时81℃-98℃、85℃-98℃、85℃-95℃、90℃-95℃、91℃-95℃或91℃-99℃,有时约90℃。使用高于80℃(例如85℃-98℃、90℃或91-95℃)的温度可以得到如下文进一步定义的增加的测定灵敏度,这是令人惊讶的,因为随着温度增加超过65℃,蛋白酶K经受增加的变性,并且因为过度变性,通常不建议在高于85℃或者90℃的温度下使用。虽然本发明的实施不依赖于识别出更高的温度带来的这种意想不到的有益效果的机理,但这一结果可表明,2-咪唑烷酮在升高的温度下对清除甲醛的促进超过了对蛋白酶K活性一定程度降低的补偿。优选地,在所有这些情况下,包括液基细胞学防腐剂中的临床样品、2-咪唑烷酮、蛋白酶、EDTA和pH缓冲剂的反应混合物暴露于升高的温度一段时间,10分钟至30分钟,优选10分钟至不超过20分钟,有时长达15分钟或约15分钟。
“扩增子”是体外核酸扩增反应的多核苷酸产物,其中靶核酸序列充当用于合成拷贝或扩增产物的模板。
所谓“靶”或“靶核酸”意指含有待扩增、检测和/或定量的序列的核酸。待扩增的靶核酸序列优选被定位在两个相对设置的寡核苷酸之间,并包括与所述寡核苷酸中的每一个互补的靶核酸部分。
所谓“扩增”或“核酸扩增”或“体外核酸扩增”等意指用于获得靶核酸序列或其互补序列或它们的片段的多个拷贝的任何已知过程,允许用于RNA和DNA等同物。
为帮助理解本文公开的实施例中的一些,简要概括先前(例如,美国专利No.5,399,491、No.5,554,516和No.5,824,518)已详细描述的TMA方法。在TMA中,包含待扩增序列的靶核酸作为单链核酸(例如,ssRNA或ssDNA)提供。可以使用将双链核酸(例如,dsDNA)转化为单链核酸的任何常规方法。启动子引物在其靶序列处特异性地结合至靶核酸,并且逆转录酶(RT)使用靶链作为模板延伸该启动子引物的3’端,从而创建cDNA拷贝,获得RNA:cDNA双链体。RNase活性(例如,RT酶的RNase H)消化该RNA:cDNA双链体中的RNA,并且第二引物在该启动子-引物端的下游特异性地结合至cDNA中该第二引物的靶序列。随后RT通过使用该cDNA作为模板延伸该第二引物的3’端来合成新的DNA链,从而创建包含功能性启动子序列的dsDNA。特异于该功能性启动子的RNA聚合酶起始转录以产生与初始靶链互补的约100至1000个RNA转录物(经扩增的拷贝或者扩增子)。该第二引物特异性地结合至其在每个扩增子中的靶序列,并且RT从扩增子RNA模板创建cDNA以产生RNA:cDNA双链体。RNase从该RNA:cDNA双链体消化扩增子RNA,并且该启动子引物的靶特异性序列结合至其在新合成的DNA中的互补序列,并且RT延伸该启动子引物的3’端以及该cDNA的3’端,从而创建包含该RNA聚合酶所结合至的功能性启动子并且转录与该靶链互补的额外扩增子的dsDNA。在反应期间重复使用这些步骤的自催化循环产生该初始靶序列的约十亿倍扩增。可以通过使用特异性地结合至包含在扩增子中的序列的探针来在扩增期间(实时检测)或者在反应的终点(终点检测)检测扩增子。检测到从所结合的探针获得的信号指示样品中存在靶核酸。
如本文所用,扩增产物的“检测”可通过使用任何已知的方法来完成。例如,该扩增核酸可以与导致可检测的物理变化(例如,电性变化)的表面相关联。经扩增的核酸可以在溶液相中检测,或者通过在基质中或者基质上浓缩该核酸并且检测与其相关联的标记(例如,嵌入剂,如溴化乙锭)来检测。其他检测方法使用与扩增产物中的序列互补的探针并且检测探针:产物复合物的存在,或者使用探针复合物扩增从扩增产物中检测到的信号(例如,美国专利No.5,424,413、No.5,451,503和No.5,849,481)。其他检测方法使用其中信号产生与靶序列的存在相关联的探针,因为仅当该被标记探针如在分子信标、分子火炬或者杂交开关探针中结合至扩增产物时才发生信号变化(例如,美国专利No.5,118,801、No.5,312,728、No.5,925,517、No.6,150,097、No.6,361,945、No.6,534,274、No.6,835,542、No.6,849,412和No.8,034,554;和美国公布No.2006/0194240A1)。这样的探针通常使用附接到该探针的一端的标记(例如,荧光团)和附接到该探针的另一位置的相互作用化合物(例如,淬灭剂)来在所述探针处于指示该探针并未杂交至扩增产物的一个构象中(“关闭”)时抑制信号从该标记产生,但是当该探针杂交至改变探针构象(成“打开”)的扩增产物时产生可检测的信号。从与扩增产物特异性关联的直接或间接标记的探针检测到信号指示经扩增的靶核酸的存在。
如本文所用,“探针”是在促进杂交以形成可检测的杂交体的条件下,特异性地杂交至在核酸中、优选扩增的核酸中的靶序列的寡核苷酸。
如本文所用,术语“接触”表示使两种或更多种组分合并在一起。可以通过在流体或半流体混合物中混合所有的组分来实现接触操作。当一种或多种组分在固体表面上与一种或多种其他组分发生物理接触时也可实现接触操作,该固体表面如实体组织切片或者底物。
如本文所用,术语“靶捕获”是指将靶核酸与样品混合物中的其他组分选择性地分开,所述其他组分如细胞片段、细胞器、蛋白质、脂质、碳水化合物或者其他核酸。靶捕获体系可为特异性的并且从其他样品组分中选择性地分离预定的靶核酸(例如,通过使用特异于预期的靶核酸的核酸序列),或者该靶捕获体系可为非特异性的并且通过使用靶的其他特性(例如,靶核酸的区分其与其他样品组分的物理性状,所述其他样品组分不表现出那种物理特性,例如杂交至非特异性的核酸、结合至多孔玻璃珠,在二氧化硅填充柱中捕获并洗脱)从其他样品组分选择性地分离靶核酸。此前已经详细地描述了优选的核酸杂交靶捕获方法和组合物(美国专利No.5,750,338、No.6,060,246、No.6,110,678、No.6,534,273和No.7,993,853;和美国公布No.2008/0286775A1)。优选的靶捕获实施例使用溶液相中的靶捕获寡核苷酸以及附接到载体的经固定捕获探针来形成与该靶核酸的复合物并且将所捕获的靶从其他组分分离。
如本文所用,术语“靶捕获寡核苷酸”是指通过使用结合对成员桥接或者接合靶核酸与经固定的捕获探针的至少一种核酸寡核苷酸,所述结合对成员如互补的核酸序列或者生物素和链亲和素。在一种方法中,该靶捕获寡核苷酸非特异性地结合至靶核酸并且将该靶核酸固定至固体载体。在另一方法中,该靶捕获寡核苷酸的靶特异性(TS)序列特异性地结合至该靶核酸中的序列。在这两种方法中,该靶捕获寡核苷酸包括经固定的捕获探针-结合区域,该区域结合至经固定的捕获探针(例如,通过特定的结合对相互作用)。在其中TS序列和经固定的捕获探针-结合区域均为核酸序列的实施例中,所述TS序列和经固定的捕获探针-结合区域可共价地彼此接合,或者可通过一个或多个接头接合在不同的寡核苷酸上。
“经固定的捕获探针”提供了用于将靶捕获寡核苷酸接合至固体载体的方式。该经固定的捕获探针是接合至固体载体的碱基序列识别分子,所述探针促进从未结合材料分离结合的靶多核苷酸。可以使用任何已知的固体载体,如基质和溶液中游离的粒子。例如,固体载体可为硝化纤维、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合的聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯,以及优选地磁性吸引的粒子。特别优选的载体包括单分散性的磁球体(即,大小均匀度为±约5%),由此提供一致的结果,这特别有利于用于自动化测定。该经固定的捕获探针可直接接合(例如,通过共价键或离子相互作用),或者间接接合至该固体载体。可用的固体载体的常见例子包括磁性的粒子或珠。
如本文所用,术语“分离”或“纯化”一般是指移除混合物中的一种或多种组分如样品,以与该混合物中的一种或多种其他组分分离。样品组分包括大体水溶液相中的核酸,所述样品组分可包括细胞片段、蛋白质、碳水化合物、脂质以及其他化合物。优选的实施例从该混合物的其他组分分离或移除至少70%至80%,以及更优选地约95%的靶核酸。
所谓“试剂盒”意指通常旨在用于彼此结合使用的材料的成套组合。根据本发明的试剂盒可包括说明或其他“实体”形式的信息(例如打印的信息、以电子方式记录在计算机可读介质上的信息或以其他方式记录在机器可读介质上的信息,如用于储存数值的条形码)。
所谓“基本上由…组成”意指本发明可包括实质上不会改变本发明的基本特征和新颖特征的一种或多种附加组分、组合物或方法步骤。此术语不包括对本发明的基本特征和新颖特征有实质性影响的任何一种或多种组分、组合物或方法步骤。
除非语境中显而易见,否则“约”指可测量数值的准确性所内含的偏差。
“逆转”DNA的修饰是指将DNA从由甲醛引发的修饰(特别是与多肽的交联)中释放。逆转可以是部分的或完全的,并且可以或可以不得到以下结果:将DNA恢复到甲醛引发的修饰发生之前的精确状态。
具体实施方式
本文公开的是从保存在含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本分离核酸的方法、系统、组合物和试剂盒。简单地说,公开的方法依赖于将样品的等分试样(意指在液体防腐剂中处理的细胞样品)与2-咪唑烷酮和蛋白酶的组合接触。在高度优选的实施例中,蛋白酶是蛋白酶K酶。该混合物随后可以在高热条件下温育以灭活游离的甲醛,并逆转由甲醛引起的核酸化学修饰的至少一部分。相比现有方法,该方法有利地为快速的,并且得到可有效分离(例如,通过捕获探针杂交)、逆转转录(如果需要的话)及体外扩增的核酸(包括RNA)。
介绍和概述
本文所公开的技术有利于检测可能存在于包含在液基细胞学防腐剂中的生物样品中的核酸靶,所述液基细胞学防腐剂包含甲醛。这样的生物样品在进行分析之前可存放相当长的时间(例如,至少1、2、7、14、30、50或100天,或7-120天)。在储存期间,甲醛可以引发样品中核酸的修饰,特别是与样品中存在的多肽发生交联。这些修饰抑制了DNA的后续加工,包括它的杂交(例如,杂交至捕获探针上)或者被扩增的能力。修饰(包括交联)可以通过用如蛋白酶K的蛋白酶处理来打断。用蛋白酶处理可以增加可用于捕获和/或扩增的核酸分子,并最终得到更多的扩增产物和/或特定靶的更低检测阈值。通过用2-咪唑烷酮同时处理样品增强蛋白酶的这些有益效果。2-咪唑烷酮起到甲醛清除剂的作用,即它以这样的方式与甲醛反应:使其不能或至少大大降低其在核酸和多肽之间引发交联的能力。虽然2-咪唑烷酮在下面的许多描述中被用作示例性和优选的甲醛清除剂,但是,也可以替换地使用其他甲醛清除剂(例如在背景技术中描述的那些),除非上下文要求,否则在85℃或更高的温度下进行的实施例中尤其如此。通过除去反应性的甲醛,2-咪唑烷酮可以抑制多肽(包括通过蛋白酶的作用而释放的多肽)与样品中的核酸形成或再形成交联。2-咪唑烷酮通过除去甲醛也可以保护蛋白酶免于失活。虽然先前已报道2-咪唑烷酮是甲醛清除剂,但令人惊讶的是,考虑到样品可能被长时间储存并在提供蛋白酶和2-咪唑烷酮之前形成交联,2-咪唑烷酮在短期温育期间对新交联形成的潜在抑制会得到其中核酸用于捕获、扩增及后续加工的可用性改善的材料。因为一些咪唑啉类是已知的核酸变性剂,因此还令人惊讶的是,2-咪唑烷酮的存在本身不削弱核酸发生捕获、扩增或其他核酸杂交事件的能力。
可以在任何形式的核酸(包括DNA和RNA)上使用所述方法。DNA可以是基因组或cDNA等。RNA可以是mRNA、rRNA、hnRNA、tRNA或病毒RNA等。当DNA可为所期望的被分析物时,由于RNA化学不稳定性(包括在高的温度下的不稳定性),RNA对样品加工提出更严格的要求。因此,一直致力于寻求这样的用于分离RNA的过程:其展示了在最严格的条件下制备样品的新方法。
采用了使用含甲醛的液基细胞学防腐剂来采集妇科样本的模型系统以说明该核酸分离技术。在其实际应用中,该系统包括首先获得子宫颈细胞的拭子,将所获得的细胞样品转移至SUREPATH(TriPath Imaging公司的注册商标)液基细胞学防腐剂,然后加工该保存细胞用于随后的分子测试。在这种情况下的分子测试需要体外扩增和检测人乳头瘤病毒(HPV)RNA靶核酸。
HPV与子宫颈癌的发展有关,因此检测表达的HPV RNA作为诊断和监测测定手段具有特别的价值。事实上,与细胞学结合的HPV分子测试现在被推荐用于子宫颈癌筛查和病人管理。因此推断,液体巴氏检测将是下述检测系统的一个实例,该检测系统受益于通过改善加工保存在福尔马林或含甲醛的其他液基细胞学防腐剂中的样品来提高可扩增RNA的回收率。此外,基于体外扩增核酸随后检测HPV特异性扩增产物的自动测试过程也将受益。
HPV基因探针测定是从14种高风险HPV基因型(例如,产品目录号303585,美国加利福尼亚州圣地亚哥市的Gen-Probe Incorporated公司(Gen-ProbeIncorporated,San Diego,CA))中检测E6/E7mRNA的商用多重核酸测试法。在检测的基因型之中有HPV 16、HPV 18和HPV 45。该测定法依赖于使用核酸杂交方法的靶捕获,并且该测定法经证实已用于在不含甲醛的液基细胞学防腐剂中保存的子宫颈样本。基因探针测定还经证实已用于在液基细胞学试剂中保存的样本,在此之前,样本首先与样本运送培养基(STM)组合,然后用包含相对高水平的蛋白酶K酶(180单位/反应)的试剂处理。液基细胞学防腐剂含有甲醛、乙醇、甲醇和异丙醇。鉴于保存在THINPREP中的样本可迅速处理以供HPV基因探针测定测试,保存在中的样本需要用蛋白酶K在65℃消化两小时。这一要求损害后一种防腐剂的效用。通过下文描述的改善的方法,保存在液基细胞学试剂中的样本可使用更少的酶试剂以及仅15分钟的温育时间来处理。
优选的试剂组合物
本公开的用于从含有甲醛的液基细胞学防腐剂中制备核酸的技术依赖于组合使用蛋白酶和2-咪唑烷酮。本公开的技术进一步依赖于在高的温度下使用蛋白酶。在一个优选方法中,初始为冻干形式的蛋白酶使用包含2-咪唑烷酮的缓冲溶液重构。优选地,重构缓冲剂还包含EDTA。在一个高度优选的实施例中,蛋白酶为蛋白酶K酶,已知其在pH4.0-pH12.0的较宽范围内都保持活性。然而,用于重构蛋白酶的缓冲剂的pH优选地在从约pH7.5到约pH8.5的范围内。这个范围允许酶活性最佳,同时仍保护RNA在强碱条件下免于被水解切割。仍更优选地,用于重构缓冲剂中的缓冲剂包括pH约8.0的Tris缓冲剂。
当与可选稀释剂和含甲醛的液基细胞学防腐剂混合后,关键试剂组分的最终浓度落在优选范围内。可选的稀释剂可以是含溶解细胞膜的洗涤剂的缓冲溶液。示例性的洗涤剂包括阴离子洗涤剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸锂(LLS)。如非离子洗涤剂的其他洗涤剂也是可用的。有利地,强离子洗涤剂可使蛋白质变性,从而使它们成为供蛋白酶K酶蛋白水解的更好靶。优选地反应混合物中2-咪唑烷的最终浓度(以摩尔浓度计)被选择为落在甲醛最终最大浓度的1倍到5倍或更优选地2倍到5倍的范围内。由加入所有试剂后反应混合物增加的摩尔数除以体积确定2-咪唑烷酮的最终浓度。甲醛的最终浓度是在用于制作样本的防腐剂中存在的摩尔数除以所有试剂加入后反应混合物的体积。换句话说,不减去热温育前引发交联所消耗的甲醛。例如,如果通过将1ml液基细胞学防腐剂(例如包含细胞样本)、2.9ml稀释剂和0.3ml含2-咪唑烷酮、蛋白酶K酶、EDTA和缓冲剂的试剂组合制备的反应混合物具有的最终甲醛浓度为约28mM,那么,2-咪唑烷酮的最终浓度在约2倍过量,为约50mM到约60mM。相对于原本不使用2-咪唑烷酮的情况下的量,在本配方中蛋白酶K酶的最终浓度可有利地降低。尽管实践本发明不取决于对任何特定作用机理的理解,但据信蛋白酶K可以起到消化将蛋白酶与甲基桥连接的胺键的作用,继而释放核酸并使其可用于测定中依赖于杂交的靶捕获步骤中的靶捕获。蛋白酶K酶的最终浓度优选地落在约43U/ml到约4.3U/ml的范围内,其中约10-11U/ml的浓度是高度优选的。因此,4.2ml的反应体积将优选地包含约40U-50U或43U的蛋白酶K酶。EDTA的最终浓度优选地落在从10mM到100mM的范围内,更优选地落在从10mM到50mM的范围内,并且仍更优选地落在从30mM到40mM的范围内。缓冲剂的最终浓度基于试剂的结构是可变的,但要足够提供充足的缓冲能力以确保包含在样品中的RNA不会通过碱性水解而基本上分解。可通过使用如下最终缓冲剂浓度满足该要求:至少10mM最高至约500mM、更优选地最高至约250mM、仍更优选地最高至约100mM、以及进一步更优选地最高至约50mM的范围内。在升高的温度温育前,反应混合物中缓冲剂的高度优选的最终浓度范围是10mM到50mM。
样本可以任意顺序与蛋白酶和2-咪唑烷酮组合。例如,蛋白酶和2-咪唑烷酮可同时与样本组合。或者,蛋白酶可先与样本组合,再与2-咪唑烷酮组合,或者反之亦然。
重构缓冲剂和冻干蛋白酶都可为试剂盒的组分,并且可以在即将使用前组合。也就是说,试剂盒的最终用户可重构冻干态的酶来制备包含例如2-咪唑烷酮、蛋白酶K酶、EDTA和pH缓冲剂的酶试剂。优选地,试剂盒的单一溶液包含2-咪唑烷酮、EDTA和pH缓冲剂,但不包含蛋白酶K酶。蛋白酶K酶优选地包装于试剂盒的单独小瓶内,其中酶为冻干物形式。
优选的靶富集方法
在引发扩增反应前,可能有利的是使用靶捕获技术先富集或分离靶核酸。在一个优选方法中,在添加含2-咪唑烷酮和蛋白酶K酶的试剂之后,将在升高的温度温育的反应混合物中的核酸与具有固定探针设置在其上的固定载体接触。根据一个实施例,将已在升高的温度条件下和在EDTA和pH缓冲剂的存在下用2-咪唑烷酮和蛋白酶的组合处理过的靶核酸以序列特异性形式直接杂交至固定的捕获探针。在不同的实施例中,“靶捕获探针”用于将固体载体固定的捕获探针和待扩增的靶核酸桥接。该方法的一般特征由Weisburg等在U.S.6,534,273中公开,该文件的公开内容通过提述并入本文。不论选择何种方法,需要明确的是,涉及待扩增的靶核酸的杂交是该方法的本质特征。
可以与本文公开的技术结合使用并且依赖于非特异性杂交至待扩增靶的变型的靶捕获方法详细描述于公开的美国专利申请U.S.2008/0286775A1中,该文件的公开内容通过提述并入本文。根据非特异性杂交方法,捕获探针包含至少一个序列,其表现出与标准碱基配对(即G:C和A:T/U结合)相比,替代性的对靶核酸的碱基配对特性。通过该非特异性杂交方案纯化的靶核酸可为至少部分是单链的RNA或DNA。再次,应当清楚的是,这种非序列依赖性的靶捕获方法仍然依赖于核酸杂交。
本发明数据表明,即使没有2-咪唑烷酮靶捕获也可以发生,而且报道一些咪唑啉类可造成核酸的变性。
优选的核酸扩增方法
可与本发明结合使用的扩增方法的例子包括但不限于:转录介导的扩增(TMA)、单引物核酸扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、自动维持的序列复制(3SR)或DNA连接酶链式反应(LCR),以及使用自主复制多核苷酸分子和复制酶如MDV-1RNA和Q-beta酶的扩增方法。分别用于进行这些不同的扩增技术的方法可见于美国专利No.5,399,491、美国专利申请序列号11/213,519、公开的欧洲专利申请EP 0525 882、美国专利No.4,965,188、美国专利No.5,455,166、Guatelli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878(1990)(Guatelli等,《美国国家科学院院刊》,第87页,第1874-1878页,1990年)、国际公布No.WO 89/09835、美国专利No.5,472,840,以及Lizardi等,Trends Biotechnol.9:53-58(1991)(Lizardi等,《生物科技趋势》,第9卷,第53-58页,1991年)。这些文件中描述如何进行核酸扩增反应的公开内容由此通过提述并入。
反应机理
尽管本方法的实践不是基于对机理的理解,图6揭示了本方法中一种可能的反应机理。在酸性条件下,样本中的甲醛2可与核苷酸或多肽的亲核官能团反应。然后通过脱水生成反应性亚胺4。随后另一个核苷酸可进一步与该亚胺反应形成二聚体5。作为丝氨酸蛋白酶的蛋白酶K水解并切割氮亚甲基接头。此切割可重新生成起始核苷酸和甲醛。作为甲醛清除剂的2-咪唑烷酮可与两个甲醛分子反应生成咪唑烷酮甲醇化合物7。该反应有效防止甲醛与释放的核苷酸或多肽再次反应。
灵敏度
用蛋白酶和2-咪唑烷酮按上述操作对样本进行处理,可逆转对样品中核酸的更多修饰(特别是交联),更多核酸从交联的多肽中释放出来,得到更高的捕获核酸产率、更高的扩增核酸产率,和改进的测定灵敏度(即,靶DNA作为靶存在所需的阈值更低)。这些改进可相对于其中省去蛋白酶或2-咪唑烷酮或两者的可比对照来测定。优选地,与其中省去蛋白酶的对照和其中省去2-咪唑烷酮的对照两者相比均显示出改进。改进指使其超过典型实验变差(p<0.05)的足够大小的改进。例如,在一些方法中,处理可导致从交联中释放的核酸或捕获的核酸或扩增核酸的产率至少5%、10%、20%或30%的改进。交联的存在可通过按分子量进行分离的测定法(如凝胶电泳法或多种形式的柱层析法)来评估。在一些方法中,处理导致至少50%、60%、70%、80%或90%的从与多肽的交联中释放的核酸分子,因而潜在地进行杂交捕获测定或扩增。在一些方法中,处理导致更高的测定阳性(或更低的检测阈值),这意味着某些样品在经过根据本发明方法的处理,而不是省去蛋白酶或2-咪唑烷酮的对照处理后,产生阳性结果(存在靶核酸)。
优选实施例
以下实例公开了所进行的实验过程,以证实用2-咪唑烷酮和蛋白酶K酶的组合在升高的温度处理含甲醛液基细胞学防腐剂中的样本的有益效果。在一个优选的实施例中,该组合在存在Tris缓冲剂和EDTA的情况下使用。所有情况下,SUREPATH液基细胞学防腐剂均用作含甲醛的模型液基细胞学防腐剂。在以下描述中,“恢复剂(demodifier)溶液”指含EDTA(500mM)和2-咪唑烷酮(范围在740mM至750mM)的pH缓冲溶液(pH 8.0)。用于恢复剂溶液中的优选缓冲剂包括Tris缓冲剂。如本文所用,“样本运送培养基”(STM)指磷酸盐缓冲洗涤剂溶液,该溶液除溶解细胞外,还通过抑制RNase(可在经受测试的样品中为活性的)的活性而保护释放的RNA。用于STM的优选洗涤剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸锂(LLS),其中稍微更优选LLS。当要将含甲醛的液基细胞学防腐剂中的样品与恢复剂溶液和蛋白酶K酶组合时,冻干态的酶可方便地用恢复剂溶液重构,然后可将重构酶溶液的等分试样加入含液基细胞学防腐剂的反应容器中。
实例1描述了用于通过测试如下实验组评估实验系统的分析灵敏度的方法,所述实验组包括14种高风险HPV基因型的每一种的体外转录物。涉及在升高的温度条件用2-咪唑烷酮和蛋白酶K进行处理的核酸加工技术的成功通过使用商用测定法检测HPV RNA来量度。如下所述,结果显示处理条件不影响HPV RNA的扩增和检测。
实例1
使用合成的转录物确立HPV测定的分析灵敏度
体外合成的转录物充当常规TMA反应中的扩增模板,该常规TMA反应使用用于扩增和检测HPV RNA的HPV基因探针测定进行。用于每种不同的HPV类型的转录物拷贝数对应于APTIMA HPV基因探针测定的检测限(LOD),已在预备过程中使用保存在THINPREP液基细胞学防腐剂(即不含甲醛的模型防腐剂)中的样本建立该基因探针测定。LOD是导致所有测试样本中至少95%的最小阳性的拷贝水平。在这种情况下,体外转录物均酌情以20至600个拷贝/反应使用。
测试了三种不同的样品加工条件。首先,将体外转录物添加到STM中的液基细胞学防腐剂样品(1ml样品和2.9ml STM),然后根据HPV基因探针测定的制造商的说明处理。其次,将体外转录物添加到STM中的临床HPV阴性残余SUREPATH液基细胞学防腐剂样本(1ml样品和2.9ml STM)。混合物的等分试样(各3.9ml)与100μl的蛋白酶K试剂(Tris缓冲剂(pH 8.0)、叠氮化钠和CaCl2中的1.8U/μl蛋白酶K)组合,然后在65℃温育2小时。在酶消化步骤之后,根据APTIMA HPV基因探针测定的制造商的说明处理混合物。最后,如在第二种情况下那样,将体外转录物添加到STM中的临床HPV阴性残余SUREPATH液基细胞学防腐剂样本。在这种情况下,将每个样品STM混合物的3.9ml等分试样与0.3ml的包括Tris-EDTA缓冲剂中的2-咪唑烷酮的蛋白酶K酶试剂组合。已通过使用恢复剂溶液重构冻干的蛋白酶K制备此试剂。最终的混合物包含36mM EDTA、36mM Tris-HCl、约53mM 2-咪唑烷酮和43U蛋白酶K酶。在90℃温育混合物15分钟,然后根据HPV基因探针测定的制造商的说明进行处理。在扩增和检测HPV RNA之后,在平行实验中比较阳性HPV检测的频率。
图1示出了使用体外转录物进行的分析灵敏度评价的结果。对于14种HPV基因型中的11种,保存在SUREPATH液基细胞学防腐剂中的样品的测定阳性为至少95%;3种基因型HPV 56、58和59分别得到93.3%、91.7%和90%的阳性。这些结果与保存在THINPREP液基细胞学防腐剂中的样品获得的结果类似,并且类似于或优于被保存在SUREPATH液基细胞学防腐剂中随后用蛋白酶K酶单独处理的样品。这确定了HPV测试系统的效用,并显示在升高的温度条件下使用2-咪唑烷酮和蛋白酶K酶的组合基本上不会抑制体外扩增和检测反应。
实例2描述了用于通过测试一组含HPV的人细胞而评估HPV测定的分析灵敏度的方法。方法大体如实例1中所述,只是:(1)使用HPV表达细胞系代替体外转录物;和(2)在含甲醛防腐剂的存在下温育样品延长的时间。
实例2
使用含HPV的人细胞系确立HPV测定的分析灵敏度
将含HPV的人细胞系掺入SUREPATH液基细胞学防腐剂的样本汇集物中,在25℃储存7天,然后在90℃用恢复剂溶液和蛋白酶K的组合处理15分钟后,或在65℃单独用蛋白酶K处理2小时后,以半对数稀释(3至30个细胞/反应)测试。如实例1中那样,通过用恢复剂溶液重构冻干的蛋白酶K而将恢复剂溶液和蛋白酶K的组合作为单一等分试样方便地提供。当然,对于以这种方式组合试剂没有要求。在此方法中使用的细胞是:(1)SiHa细胞(表达HPV16);(2)HeLa细胞(表达HPV 18);和(3)MS751细胞(表达HPV 45)。再次,根据制造商的说明使用APTIMA HPV基因探针测定来捕获、扩增并检测HPV核酸。将在这两个条件下处理的样品的阳性进行比较。
图2A-2C示出了使用已经在25℃在SUREPATH液基细胞学防腐剂中储存7天的细胞系所得到的分析灵敏度的结果。SiHa细胞、HeLa细胞和MS751细胞的浓度分别为30、10和30个细胞/反应时,用恢复剂溶液和蛋白酶K酶的组合处理的样品中所有三种HPV阳性细胞系的测定阳性为至少95%。这些结果类似于或优于使用已经在25℃在SUREPATH液基细胞学防腐剂中储存7天然后单独用蛋白酶K酶处理的样品所获得的结果。在以最低输入细胞计数使用HeLa细胞的试验中观察到最显著的差异。使用2-咪唑烷酮与蛋白酶K和高的温度的组合的样品加工处理存在明显的统计学上的显著优势。
实例3描述的方法展示了在升高的温度条件下组合使用2-咪唑烷酮和蛋白酶K如何改善来自长时间储存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的样品的可扩增核酸的回收率。如下文所讨论,与用蛋白酶K单独处理的试验相比,RNA回收率的差异在延长的时间段中最明显。
实例3
增强来自储存于含甲醛液基细胞学防腐剂中细胞样本的可扩增mRNA的回收率
为模拟临床样本,将SUREPATH液基细胞学防腐剂中使用APTIMA HPV基因探针测定先前确认为HPV阴性的残余样本的十个汇集物分成两半,分别掺入SiHa细胞或HeLa细胞。所有试管在25℃整齐放置(store neat)多达42天。在每个测试日,将每个汇集物的等份试样以1:2.9的SUREPATH:STM基质稀释到最终细胞浓度为30和100个细胞/反应。样品通过在65℃用蛋白酶K单独处理2小时,或用恢复剂溶液和蛋白酶K的组合(该组合作为用恢复剂溶液重构的蛋白酶K的单一等份试样提供)在90℃处理15分钟来进行加工。再次,根据制造商的说明使用APTIMA HPV基因探针测定捕获、扩增并检测HPV核酸。
图3A-3B展示的结果支持了包括用2-咪唑烷酮和蛋白酶K的组合在升高的温度条件下处理的样品加工相对于单独使用蛋白酶K处理具有优势。本研究期间的所有结果均是有效的。在30个细胞/反应中,用2-咪唑烷酮和蛋白酶K的组合(例如,用恢复剂溶液重构的蛋白酶K)处理的SiHa细胞和HeLa细胞直到第14天保持100%阳性。这段储存期过后,组合处理与用蛋白酶K单独处理相比,更大程度地增强了可扩增RNA的回收率。在100个细胞/反应中,HeLa细胞直到第28天保持100%阳性,而SiHa细胞直到第21天保持100%阳性(数据未显示)。
实例4描述的方法用于证实储存于含甲醛的液基细胞学防腐剂中的临床样品可用2-咪唑烷酮和蛋白酶K的组合在升高的温度条件下处理,然后经加工产生基本上恒定量的RNA,而与临床样品的已经储存的时长无关。
实例4
组合处理允许对于延长储存期的临床样品有效回收RNA
在本研究中评估了在SUREPATH液基细胞学防腐剂中的、从转诊群体中获取的三十个已验证为HPV阳性的临床样本。将每个样本的等份试样(0.5ml)加入2.9ml STM后用0.5:2.9SP:STM基质稀释到1:10和1:100。稀释液储存在4℃,之后在不同时间点用APTIMA HPV基因探针测定测试进行120天(对于每个样品N=4,每个时间点总共120份重复)。在每个测试日,将样品的1ml等分试样与2.9ml STM和0.3ml含蛋白酶K的试剂混合,其中蛋白酶K在恢复剂溶液中重构至最终浓度为143U/ml的蛋白酶K。混合物在90℃温育15分钟,加工以通过靶捕获规程分离核酸,然后用APTIMA HPV基因探针测定在自动测试仪上进行测试。
图4显示的结果表明,含甲醛的液基细胞学防腐剂中保存的临床样本可通过2-咪唑烷酮和蛋白酶K的组合在升高的温度条件下短时间处理,实现基本上恒定的RNA回收率。所有以1:10稀释的样本在4℃储存120天后保持至少97.5%的阳性。所有30份以1:100稀释的样本在本研究过程中保持74.2%到87.5%的阳性,未观察到阳性的一致降低。
实例5
温度依赖性
靶的制备:含HPV18感染的HeLa细胞的试管在37℃解冻,然后汇集到一个试管。向该试管中加入磷酸盐缓冲盐水,并在离心机中以1100rcf旋转以形成细胞沉淀。通过移液移去上层清液。加入来源于细胞沉淀的HPV阴性临床样本的汇集物(NCPP)以模拟SurePath临床样本。将含HeLa细胞和NCPP的试管倒转以破碎沉淀并在25℃温育(浓度:1000个细胞/毫升)。在0、7和14天后,从试管中移出等份试样,加入STM,并稀释到最终浓度为10个细胞/反应(NCPP:STM的最终比例为1:2.9)。对试管进行处理(参见下一部分)并根据制造商的说明用HPV试剂盒进行测试。
处理方法:在25℃温育并加入STM后(参见之前部分),将试管分为3组。加热:将300μL TE(试管中浓度:36mM Tris,36mM EDTA)加入反应试管。将试管加盖,放入90℃水浴中15分钟,并在APTIMA HPV上测试。PK:将50mg蛋白酶K溶解于1mL Fast Express稀释剂。将100μL PK溶液加入反应试管(每个试管180单位蛋白酶K)。将试管加盖,放入65℃水浴中2小时,并在APTIMA HPV上测试。加热+PK:将50mg蛋白酶K溶解于12ml TE。将300μL TE+PK溶液加入反应试管(试管中浓度:36mM Tris、36mM EDTA、45单位PK)。将试管加盖,放入90℃水浴中15分钟,并根据制造商的说明用HPV试剂盒进行测试。结果示于表1中。
表1
N=20
这些数据指示,对于经历了最长储存的样品,组合处理最有效的。此外,在高的温度下用蛋白酶K处理的样品比那些在低的温度下用蛋白酶K处理的样品或单独用高的温度处理的样品得到更大的回收率。
实例6
甲醛清除剂、蛋白酶K和高的温度
基本上如上文实例5中所述那样制备靶。简言之,在SurePath溶液中温育HeLa细胞系(HPV-18+)、SiHa细胞系(HPV-16+)、MS751细胞系(HPV-45+)和毛滴虫细胞系(毛滴虫+)7天。7天之后,将每个SurePath细胞样品的等分试样随后按表2中所示的条件混合。
表2
条件 | 配方* |
1 | 蛋白酶K |
2 | 蛋白酶K和Tris/EDTA |
3 | 蛋白酶K、Tris/EDTA和1X 2-咪唑烷酮** |
4 | 蛋白酶K、Tris/EDTA和2X 2-咪唑烷酮** |
5 | 蛋白酶K、Tris/EDTA和丁二酸二酰肼 |
*在180U蛋白酶K的存在下和45U蛋白酶K的存在下温育Hela细胞和SiHa细胞。
**1X和2X是指溶液中2-咪唑烷酮的摩尔浓度。1×表示摩尔浓度约等于溶液中甲醛的摩尔浓度;2×表示摩尔浓度是甲醛摩尔浓度的两倍;
随后将混合溶液在65℃或90℃的温度温育15分钟或2小时。温育条件示于表3中。
表3
温育后,对样品进行分析,以测定在不同处理条件下核酸的回收率。在第一分析中,将条件1-4下的HeLa细胞的3个细胞/反应,并且将条件1-4下的SiHa细胞的10个细胞/反应(参见表3),使用APTIMA HPV试剂盒(产品目录号303585,Gen-Probe Incorporated公司)基本上按照制造商说明书进行分析。在第二分析中,将条件1、2和4下的毛滴虫细胞的0.05个细胞/反应(参见表3),使用APTIMA阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)测定(产品目录号303563,Gen-Probe Incorporated公司)基本上按照制造商说明书进行分析。在第三分析中,将条件1、2和5下、各用45U蛋白酶K温育的HeLa、SiHa和MS751细胞的3个细胞/反应(参见表3),使用APTIMA HPV试剂盒(产品目录号303585,Gen-Probe Incorporated公司)基本上按照制造商说明书进行分析。在第四分析中,将条件1、2和5下、各用用45U蛋白酶K温育的HeLa、SiHa和MS751细胞的3个细胞/反应(参见表3),使用APTIMA HPV基因分型试剂盒(产品目录号303234,Gen-Probe Incorporated公司)基本上按照制造商说明书进行分析。结果示于表4至7中。
表4
HPV检测分析和180U蛋白酶K
处理 | 细胞系 | 条件 | 温度 | 时间 | 阳性百分比 | |
第一分析 | ||||||
1 | HeLa | 1 | 65℃ | 2小时 | 33% | |
2 | HeLa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 73% | |
3 | HeLa | 3 | 90℃ | 15分钟 | 78% | |
4 | HeLa | 4 | 90℃ | 15分钟 | 83% | |
6 | SiHa | 1 | 65℃ | 2小时 | 80% | |
7 | SiHa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 83% | |
8 | SiHa | 3 | 90℃ | 15分钟 | 92% | |
9 | SiHa | 4 | 90℃ | 15分钟 | 90% |
表5
阴道毛滴虫分析和180U蛋白酶K
处理 | 细胞系 | 条件 | 温度 | 时间 | 阳性百分比 | |
第二分析 | ||||||
14 | 毛滴虫 | 1 | 65℃ | 2小时 | 33% | |
15 | 毛滴虫 | 2 | 90℃ | 15分钟 | 67% | |
16 | 毛滴虫 | 4 | 90℃ | 15分钟 | 97% |
表6
HPV检测分析和45U蛋白酶K
处理 | 细胞系 | 条件 | 温度 | 时间 | 阳性百分比 | |
第三分析 | ||||||
1 | HeLa | 1 | 65℃ | 2小时 | 30% | |
2 | HeLa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 40% | |
5 | HeLa | 5 | 90℃ | 15分钟 | 85% | |
6 | SiHa | 1 | 65℃ | 2小时 | 75% | |
7 | SiHa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 70% | |
10 | SiHa | 5 | 90℃ | 15分钟 | 90% | |
11 | MS715 | 1 | 65℃ | 2小时 | 15% | |
12 | MS715 | 2 | 90℃ | 15分钟 | 30% | |
13 | MS715 | 5 | 90℃ | 15分钟 | 30% |
表7
HPV基因分型分析和46U蛋白酶K
处理 | 细胞系 | 条件 | 温度 | 时间 | 阳性百分比 | |
第四分析 | ||||||
1 | HeLa | 1 | 65℃ | 2小时 | 30% | |
2 | HeLa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 40% | |
5 | HeLa | 5 | 90℃ | 15分钟 | 85% | |
6 | SiHa | 1 | 65℃ | 2小时 | 75% | |
7 | SiHa | 2 | 90℃ | 15分钟 | 70% | |
10 | SiHa | 5 | 90℃ | 15分钟 | 90% | |
11 | MS715 | 1 | 65℃ | 2小时 | 15% | |
12 | MS715 | 2 | 90℃ | 15分钟 | 30% | |
13 | MS715 | 5 | 90℃ | 15分钟 | 30% |
这些数据表明,含甲醛的液基细胞学防腐剂中保存的样本可使用甲醛清除剂、蛋白酶K和升高的温度的组合短时间进行处理,实现基本上恒定的RNA回收率。这些数据还表明,在已知会使蛋白酶K变性并失活,还已知会破坏RNA的高的温度,含蛋白酶K的配方十分有用,还提供与更低的温度下的回收率相比更优异的核酸回收率。这些数据进一步表明,该配方允许从含福尔马林的溶液中使用降低浓度的蛋白酶回收核酸。
实例7
进行了以下分析以确定来自已用试剂处理7天的样品的RNA的回收百分比,所述样品用蛋白酶K在多个高的温度处理了15分钟。基本上按照实例6所述制备样品。简言之,将HeLa细胞系(HPV-18+)和SiHa细胞系(HPV-16+)在中于25℃温育7天。7天之后,将每个细胞样品的等分试样随后组合入如上表2中所示的条件3。然后将组合的溶液在多个温度温育15分钟,并使用HPV检测试剂盒(产品目录号303585,Gen-Probe Incorporated公司)进行分析,如表8所示。
表8
进行以下分析以确定来自已用试剂处理7天的样品的RNA的回收百分比,所述样品用蛋白酶K在90℃以多个短温育时间进行处理。基本上按照实例6所述制备样品。简言之,将HeLa细胞系(HPV-18+)和SiHa细胞系(HPV-16+)在中于25℃温育7天。7天之后,将每个细胞样品的等分试样随后组合入如上表2中所示的条件3。然后将组合的溶液在90℃以多个数分钟的时间温育,并使用HPV检测试剂盒(产品目录号303585,Gen-Probe Incorporated公司)进行分析,如表9所示。
表9
进行以下分析以确定来自已用试剂处理7天的样品的RNA的回收百分比,所述样品用多个浓度的蛋白酶K在90℃处理15分钟的温育时间。基本上按照实例6所述制备样品。简言之,将HeLa细胞系(HPV-18+)和SiHa细胞系(HPV-16+)于2℃在中温育7天。7天后,将每个SurePath细胞样品的等分试样组合入基本上像上述表2中所示的条件3的条件,不同之处在于列在表C中的蛋白酶K浓度。接着将组合的溶液在90℃温育15分钟,之后用HPV检测试剂盒(产品目录号303585,Gen-Probe Incorporated公司)测定,如表10中所示。
表10
进行以下测定以确定来自已用SurePath试剂处理7天的样品的RNA的回收百分比,所述样品用多个浓度的2-咪唑烷酮在90℃处理15分钟的温育时间。基本上按照实例6所述制备样品。简言之,将HeLa细胞系(HPV-18+)和SiHa细胞系(HPV-16+)在Surepath中于25℃温育7天。7天后,将每个SurePath细胞样品的等分试样组合入基本上像上述表2中所示的条件3的条件混合,不同之处在于列在表D中的2-咪唑烷酮浓度。接着将组合的溶液在90℃温育15分钟,之后用HPV检测试剂盒(产品目录号303585,Gen-ProbeIncorporated公司)测定,如表11中所示。
表11
对于所有测定,重复的数目为40。
实例8
并入加工保存在含甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本的工作流程
实例8描述了用于加工临床样品的典型的工作流程。将使用拭子装置得到的临床样品引入装有含甲醛的液基细胞学防腐剂的小瓶中,然后将小瓶盖严。SUREPATH液基细胞学防腐剂可用作液基细胞学防腐剂。将分散在小瓶的液体内容物中的细胞材料运送至临床实验室进行测试,包括核酸的分子分析。在临床实验室,将小瓶的等分试样与稀释剂(例如缓冲洗涤剂溶液)的等分试样混合。磷酸盐缓冲洗涤剂溶液是优选的稀释剂的一个例子。用于此应用中的洗涤剂优选地为阴离子洗涤剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)或月桂基硫酸锂(LLS)。混合物进一步与2-咪唑烷酮和蛋白酶组合。用于此目的的蛋白酶可以是蛋白酶K酶。在一个简化的方法中,在包含pH缓冲剂、EDTA和2-咪唑烷酮的溶液中重构冻干的蛋白酶K。pH缓冲剂可以是Tris缓冲剂,并且重构的酶溶液可具有约8.0的pH。随后将包括稀释的临床样品、2-咪唑烷酮和蛋白酶的最终混合物加热到升高的温度持续5分钟-30分钟。优选地将该混合物加热到约90℃持续约15分钟。使样品中的核酸适于纯化并用作体外扩增反应中的模板。例如,通过将RNA捕获到固体载体上来纯化RNA,例如使用序列特异性杂交至固定的核酸链,然后在核酸扩增反应中扩增。核酸扩增反应可以是转录介导的扩增(TMA)反应。将扩增产物与序列特异性杂交探针接触,以确定特定靶序列的存在或不存在。特定的靶序列可以是HPV靶序列。工作流程图示于图5中。
本发明已参考其许多具体的实例和实施方式进行了描述。当然,对于本领域普通技术人员来说,当回顾上述详细说明时,将想到本发明的许多不同实施方式。因此,参考所附的权利要求书来确定本发明的真正范围。除非从语境中显而易见,否则本发明的任何实施方式、方面、步骤或特征可与任何其他实施方式、方面、步骤或特征一起使用。
Claims (42)
1.一种加工样本的方法,所述样本包括在含甲醛的液基细胞学防腐剂中处理的临床样品,所述方法包括以下步骤:
(a)将所述样本与蛋白酶和甲醛清除剂混合,形成反应混合物;
(b)在升高的温度将所述反应混合物温育一段时间,所述时间足以逆转由所述液基细胞学防腐剂中的甲醛造成的可包含在所述样本中的核酸的化学修饰;
(c)在所述温育步骤之后,从所述反应混合物分离核酸;以及
(d)使用来自所述分离步骤的所述核酸作为模板进行体外扩增反应。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述甲醛清除剂是2-咪唑烷酮。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述逆转从甲醛引发的与所述样本中多肽的交联释放所述样本中的核酸。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中所述蛋白酶从所述甲醛引发的交联释放所述核酸,并且2-咪唑烷酮抑制所述样品中的核酸和多肽之间新交联的引发。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在进行在步骤(a)之前,所述样品已经在所述液基细胞学防腐剂中处理了7-120天。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述温育步骤不超过30分钟。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述温育步骤为约5分钟至30分钟。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述温育步骤不超过15分钟。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(d)之后扩增的核酸的产率高于对照扩增中核酸的产率,所述对照扩增省去了蛋白酶或2-咪唑烷酮。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(d)之后扩增的核酸的产率比省去了蛋白酶或2-咪唑烷酮的任一对照扩增中核酸的产率高至少10%。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在所述温育步骤之后,所述样品中至少90%的所述核酸分子无交联。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法,其中在所述温育步骤之前,2-咪唑烷酮的最终浓度为所述甲醛的最终最大浓度的1至5倍,以摩尔计。
13.根据权利要求12所述的方法,其中在所述温育步骤之前,2-咪唑烷酮的最终浓度为甲醛的最终最大浓度的2至5倍,以摩尔计。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述蛋白酶是浓度为4.3至43U/ml的蛋白酶K。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述温育步骤的温度为约60℃-100℃。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述温育步骤的温度为85-95℃。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述温育步骤的温度为91-95℃。
18.根据权利要求15所述的方法,其中所述温度为约90℃。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述蛋白酶和甲醛清除剂与所述样本同时组合。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述蛋白酶先于甲醛清除剂与所述样本组合。
21.根据权利要求1所述的方法,其中所述甲醛清除剂先于所述蛋白酶与所述样本组合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述扩增是转录介导的扩增、单引物核酸扩增、基于核酸序列的扩增、聚合酶链式反应、链置换扩增、自动维持的序列复制或DNA连接酶链式反应。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸包括DNA。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述核酸包括RNA。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述分离的核酸是DNA。
26.根据权利要求24所述的方法,其中所述分离的核酸是RNA。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中用与待分离的所述核酸以及与固定探针杂交的捕获探针通过捕获测定而分离所述核酸。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述固定探针被固定至磁珠。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(d)之后扩增核酸的测定阳性高于从省去蛋白酶或所述甲醛清除剂的反应混合物中获得的扩增核酸的测定阳性。
30.根据权利要求29所述的方法,其中在步骤(d)之后扩增核酸的所述测定阳性比从省去蛋白酶或2-咪唑烷酮的反应混合物获得的扩增核酸的测定阳性高至少约12%。
31.根据权利要求29所述的方法,其中在步骤(d)之后扩增核酸的所述测定阳性在21天之后为约95%。
32.根据权利要求24所述的方法,其中所述分离的核酸是人乳头瘤病毒(HPV)RNA靶核酸。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述样本是子宫颈细胞样本。
34.物质的组合物,包含:
(a)2-咪唑烷酮
(b)蛋白酶K
(c)EDTA
(d)pH缓冲剂。
35.一种用于加工保存在含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)第一小瓶,其含有冻干的蛋白酶K酶;
(b)第二小瓶,其含有用于重构冻干的蛋白酶K酶的重构缓冲剂,
其中所述重构缓冲剂包含一定量的pH缓冲剂、一定量的EDTA和一定量的2-咪唑烷酮。
36.一种用于加工保存在含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的含核酸样品的系统,所述系统组件包括:
可编程控制器;
与所述可编程控制器连通的移液装置;
用于反应小瓶的第一夹持器;
用于试剂小瓶的第二夹持器;以及
加热元件
其中所述可编程控制器由软件指令配置,从而当所述试剂小瓶含有包含甲醛清除剂、蛋白酶K、EDTA和pH缓冲剂的溶液时,引起所述移液装置将液体的等分试样从所述试剂小瓶转移至所述反应小瓶,并且
其中所述可编程控制器由软件指令配置,从而引起所述加热元件将所述反应小瓶加热至65℃至95℃的温度。
37.根据权利要求36所述的系统,其中所述可编程控制器由软件指令配置,从而引起所述加热元件将所述反应小瓶加热至85℃至95℃的温度。
38.根据权利要求37所述的系统,其中所述反应小瓶中的所述试剂包含2-咪唑烷酮作为所述甲醛清除剂。
39.根据权利要求38所述的系统,其中所述反应小瓶中的所述试剂包含浓度为42U至45U的蛋白酶K。
40.根据权利要求36所述的系统,其中所述可编程控制器由软件指令配置,从而引起所述加热元件将所述反应小瓶加热至90℃至95℃的温度。
41.根据权利要求40所述的系统,其中所述可编程控制器由软件指令配置,从而引起所述加热元件将所述反应小瓶加热至90℃至95℃的温度持续15分钟至30分钟的一段时间。
42.根据权利要求41所述的系统,其中所述反应小瓶中的所述试剂包含浓度为42U至45U的蛋白酶K。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114269915A (zh) * | 2019-08-20 | 2022-04-01 | 卢米耐克斯公司 | 通过还原/氧化反应的快速细胞裂解 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105483119A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-04-13 | 华南农业大学 | 一种固定线虫单条虫dna粗提液及其制备方法与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1610752A (zh) * | 2001-10-26 | 2005-04-27 | 免疫公司 | 多参数全面分析核酸以及同样样品上的形态学特征 |
Family Cites Families (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US5750338A (en) | 1986-10-23 | 1998-05-12 | Amoco Corporation | Target and background capture methods with amplification for affinity assays |
WO1989009835A1 (en) | 1988-04-08 | 1989-10-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Ligase-based amplification method |
JP3276955B2 (ja) | 1988-09-30 | 2002-04-22 | ジーン−トラック・システムス | Rnaの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法 |
US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
US5849481A (en) | 1990-07-27 | 1998-12-15 | Chiron Corporation | Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides |
US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
DE69233285T2 (de) | 1991-08-02 | 2004-11-25 | bioMérieux B.V. | Quantifikation von Nukleinsäuren |
DE69230693T2 (de) | 1991-11-14 | 2000-06-15 | Dgi Inc | Nicht-radioaktives hybridisations testverfahren und satz |
US5424413A (en) | 1992-01-22 | 1995-06-13 | Gen-Probe Incorporated | Branched nucleic acid probes |
WO1993022461A1 (en) | 1992-05-06 | 1993-11-11 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
WO1994002638A1 (en) * | 1992-07-17 | 1994-02-03 | Aprogenex, Inc. | Free radical scavengers useful for reducing autofluorescence in fixed cells |
WO1994007532A1 (en) | 1992-09-10 | 1994-04-14 | Streck Laboratories, Inc. | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
CA2252048C (en) | 1996-04-12 | 2008-03-11 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detection probes, kits and assays |
US6060246A (en) | 1996-11-15 | 2000-05-09 | Avi Biopharma, Inc. | Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences |
AU738708B2 (en) | 1997-05-02 | 2001-09-27 | Gen-Probe Incorporated | Two-step hybridization and capture of a polynucleotide |
US6534273B2 (en) | 1997-05-02 | 2003-03-18 | Gen-Probe Incorporated | Two-step hybridization and capture of a polynucleotide |
DE19814873A1 (de) * | 1998-04-02 | 1999-10-07 | Basf Ag | Verfahren zur Verminderung des C¶1¶-C¶2¶-Aldehyd-Gehalts aus Verbindungen mit CH¶2¶-CHR-0- oder -CH¶2¶-CH(OH)-Gruppen |
ATE440963T1 (de) | 1998-07-02 | 2009-09-15 | Gen Probe Inc | Molekulare fackeln |
CN1463753A (zh) * | 2002-06-11 | 2003-12-31 | 成都航利生物材料研究所 | 一种新型甲醛清除剂 |
US20060008807A1 (en) * | 2002-08-23 | 2006-01-12 | O'hara Shawn M | Multiparameter analysis of comprehensive nucleic acids and morphological features on the same sample |
CN1878866B (zh) | 2003-07-25 | 2012-08-01 | 安比恩股份有限公司 | 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物 |
KR101211448B1 (ko) * | 2004-05-13 | 2012-12-12 | 아사히 파이바 그라스 가부시끼가이샤 | 폴리카보네이트 수지 강화용 유리 섬유 및 폴리카보네이트수지 성형품 |
JP5020818B2 (ja) | 2004-07-01 | 2012-09-05 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 生物学的試料中の核酸を検出するための方法及び組成物 |
WO2006039563A2 (en) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Epigenomics Ag | Method for providing dna fragments derived from an archived sample |
US9464310B2 (en) | 2005-02-10 | 2016-10-11 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Integrated method for collection and maintenance of detectability of a plurality of microbiological agents in a single clinical sample and for handling a plurality of samples for reporting a sum of diagnostic results for each sample |
AU2006218794A1 (en) | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods of detecting an analyte by using a nucleic acid hybridization switch probe |
US7993853B2 (en) | 2005-05-06 | 2011-08-09 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nucleic acid target capture |
DE102005060738A1 (de) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben |
AU2007278425B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-17 | Qiagen Gmbh | Device for processing samples |
EP3159417B1 (en) | 2006-08-01 | 2021-10-06 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nonspecific target capture of nucleic acids |
US7914462B2 (en) * | 2006-08-15 | 2011-03-29 | Cytyc Corporation | Methods for processing cell block |
JP2008043332A (ja) * | 2006-08-17 | 2008-02-28 | Panomics Inc | 組織スライドからの核酸定量 |
DE102007013368A1 (de) | 2007-03-16 | 2008-09-18 | Merck Patent Gmbh | Verwendung einer Mischung eines Selbstbräuners mit einem Formaldehydfänger |
CN105441549A (zh) * | 2007-03-30 | 2016-03-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 烷基胺改进甲醛固定的生物样品组分的检测 |
US20090082245A1 (en) | 2007-05-04 | 2009-03-26 | Ecolab Inc. | Method for formulating a branded cleaning product |
EP2173874A2 (en) | 2007-06-22 | 2010-04-14 | Response Genetics, Inc | Methods for isolating long fragment rna from fixed samples |
CN101903354B (zh) * | 2007-12-21 | 2013-06-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 永久自由流动性亚乙基脲 |
WO2010054467A1 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | Walker Industries Holdings Limited | Wax emulsions incorporating formaldehyde scavengers and methods of preparation thereof |
JP2012509100A (ja) | 2008-11-17 | 2012-04-19 | ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー | 空中浮遊ホルムアルデヒドを減少させる方法 |
US8578768B2 (en) | 2008-11-17 | 2013-11-12 | Hangzhou Hamaton Tyre Valves Co., Ltd. | Tire valve with electronic box of tire pressure monitoring system for automobile |
DE102008055120A1 (de) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Qiagen Gmbh | Präparation und Amplifikation von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel |
EP2459985B1 (en) | 2009-07-30 | 2020-10-21 | Denator Aktiebolag | Stabilization method for biological samples by combination of heating and chemical fixation. |
EP2478087B1 (en) | 2009-09-14 | 2017-01-18 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
EP2521778B1 (en) | 2010-01-04 | 2014-03-19 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples |
BR112012018545A2 (pt) | 2010-01-29 | 2016-05-03 | Qiagen Gaithersburg Inc | método de determinação e confirmação da presença de um hpv em uma amostra |
DK2539449T3 (en) | 2010-02-26 | 2018-08-06 | Qiagen Gmbh | PROCEDURE FOR PARALLEL ISOLATION AND CLEANING RNA AND DNA |
JP2011188855A (ja) * | 2010-03-11 | 2011-09-29 | Samsung Techwin Co Ltd | 切断可能なキメラプローブを使用したサルモネラのリアルタイム検出方法 |
US20110256530A1 (en) * | 2010-04-12 | 2011-10-20 | Genvault Corporation | Products and methods for tissue preservation |
EP2468862A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Qiagen GmbH | Method and kit for processing wax-embedded biological samples |
US20120196274A1 (en) | 2011-01-07 | 2012-08-02 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for genotyping and quantifying a high-risk human papillomavirus |
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
CN1610752A (zh) * | 2001-10-26 | 2005-04-27 | 免疫公司 | 多参数全面分析核酸以及同样样品上的形态学特征 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
振华是猪圈: "2-咪唑烷酮", 《百度百科》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114269915A (zh) * | 2019-08-20 | 2022-04-01 | 卢米耐克斯公司 | 通过还原/氧化反应的快速细胞裂解 |
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