CN114269915A - 通过还原/氧化反应的快速细胞裂解 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了用于从生物样品中快速制备可扩增核酸的方法，其可应用于多种应用，例如即时诊断、服务实验室诊断和分子生物学应用。这些方法可在15分钟或更少的时间内进行，并且优选在5分钟或更少的时间内进行。对于大多数应用，不需要进一步纯化核酸。

Description

通过还原/氧化反应的快速细胞裂解
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月20日提交的美国临时专利申请序列号62/889,160的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景
1.技术领域
本发明一般地涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及用于使用还原-氧化反应进行快速细胞裂解以获得可扩增核酸的方法。
2.背景技术
PCR和RT-PCR反应需要输入通常通过从固相表面纯化DNA/RNA而获得的核酸。由于需要核酸结合、洗涤和从表面洗脱，这些方法可能是耗时的。需要在缩短的时间尺度上提供可扩增核酸的方法。
发明内容
因此，本文中提供了用于快速自动化细胞裂解和核酸制备的方法。这些方法可以是自动化的或手动进行。在一些方面中，这些方法不使用在进行DNA或RNA扩增之前需要被洗掉的抑制性试剂(例如，某些变性剂、离液剂、有机溶剂)。然而，RT-PCR反应中可耐受一定量的抑制性试剂。
在一个实施方案中，提供了从生物样品中获得可扩增核酸的方法，该方法包括：(a)使生物样品与过碳酸盐、核酸酶抑制剂和螯合剂接触；(b)将生物样品在40℃至95℃下孵育至少30秒；(c)将生物样品在60℃至100℃下孵育至少30秒；以及(d)搅拌生物样品。
在一些方面中，步骤(b)包括将生物样品在50℃至70℃下孵育至少1分钟。在一些方面中，步骤(b)包括将生物样品在50℃至70℃下孵育至少2分钟。在一些方面中，步骤(b)包括将生物样品在60℃下孵育至少2分钟。
在一些方面中，步骤(c)包括将生物样品在70℃至90℃下孵育至少30秒。在一些方面中，步骤(c)包括将生物样品在70℃至90℃下孵育至少1分钟。在一些方面中，步骤(c)包括将生物样品在80℃下孵育至少1分钟。
在一些方面中，步骤(d)包括将样品搅拌至少30秒。在一些方面中，步骤(d)包括将样品搅拌至少1分钟。在一些方面中，步骤(d)的搅拌包含涡旋或声处理。
在一些方面中，步骤(a)至(d)在小于15分钟内进行。在一些方面中，步骤(a)至(d)在小于5分钟内进行。
在一些方面中，生物样品包含二氧化硅珠。在一些方面中，过碳酸盐包含过碳酸钠。在一些方面中，核酸酶抑制剂是蛋白酶K。在一些方面中，螯合剂是EDTA。
在一些方面中，核酸包含DNA。在一些方面中，核酸包含RNA。在一些方面中，核酸包含DNA与RNA的组合。在一些方面中，核酸是双链的。在一些方面中，核酸是单链的。
在一些方面中，生物样品包含细菌细胞、病毒、寄生虫细胞和/或真核细胞。在某些方面中，真核细胞是植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。在某些方面中，真菌细胞是酵母细胞、霉菌细胞或蘑菇细胞。在某些方面中，哺乳动物细胞是人细胞、灵长类细胞或犬细胞。
在一些方面中，可扩增核酸适合用作PCR和/或RT-PCR中的模板。在一些方面中，该方法还包括(e)扩增至少一部分可扩增核酸。在某些方面中，步骤(e)包括通过PCR或RT-PCR扩增至少一部分可扩增核酸。
就指定组分而言，本文中使用的“基本上不含”在本文中用于意指没有任何指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染导致的指定组分的总量远低于0.05％。最优选的是其中用标准分析方法未能检测到指定组分的量的组合物。
如本文说明书中使用的，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个或更多个。
在本申请通篇，术语“约”用于指示值包括用来确定所述值的装置、方法的固有误差变化，或者研究对象之间存在的变化。
从以下具体实施方式中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然示出了本发明的一些优选实施方案，但是具体实施方式和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该具体实施方式，本发明的精神和范围内的多种变化和修改将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的一些具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图1–使用氧化还原方案快速裂解多种培养基中的样品。在每对条中，左边的条表示氧化还原方案，并且右边的条表示ARIES台式(benchtop)。
具体实施方式
本文中提供了用于从生物样品中快速制备核酸的方法，其可应用于多种即时诊断应用。这些方法可在15分钟或更少的时间内完成，并且优选在5分钟或更少的时间内完成。对于大多数应用，不需要进一步纯化核酸。因此，这些方法缺乏抑制PCR和RT-PCR的试剂，例如如强变性剂或离液剂(例如，异硫氰酸胍(GITC))和/或有机溶剂(例如，异丙醇(IPA))。然而，可存在一定量的抑制性试剂。然而，任何抑制性试剂的浓度均太低而不能抑制RT-PCR反应，并且因此在RT-PCR反应中是可耐受的。
在此提供的是方案的一般描述：在初始氧化还原反应之前，将100微米二氧化硅低结合珠(例如，约30毫克)添加至生物样品。生物样品的体积可至少根据可用材料的量而变化。例如，生物样品可以为约50μL至约300μL，例如50μL、75μL、100μL、125μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL或300μL，或可从其中来源的任何其他值。氧化还原反应包括向生物样品添加过碳酸钠(例如，约35mM终浓度)、螯合剂(例如，约0.1mM终浓度的EDTA)和核酸酶抑制剂(例如，约0.04mg的蛋白酶K)。过碳酸钠产生破坏细胞从而使其更易于裂解的H2O2。将螯合剂(例如，EDTA)添加至样品以抑制DNA酶。将核酸酶抑制剂(例如，蛋白酶K)添加至样品以抑制RNA酶。氧化还原反应在约60℃下孵育约两分钟。随后将样品在约80℃下加热约一分钟，并且随后进行声处理约一分钟。最后，将裂解物在50mM Tris(pH 7)中至少1:4进行稀释并直接添加至扩增反应，例如如RT-PCR反应主混合物。
“生物样品”意指包含其样品可制备成用于本发明方法的任何生物材料的样品。这包括但不限于细菌培养物、酵母培养物、感染病毒的细胞、分离的病毒、组织培养物、细胞系、被细菌污染的食物、血液、血清、患者样品、尿、其他体液、UTMTM样品、eSwabTM样品和RemelTM样品。
细胞的“裂解”意指细胞膜(和细胞壁，在适用的情况下)的破坏、破裂、穿孔、透化、消化或分解，使得细胞的核酸组分可释放到外部溶液中。根据本发明，细胞膜不需要被完全破坏、破裂、透化或消化以实现核酸的释放。
“螯合剂”意指与金属离子反应形成稳定的水溶性复合物的化学化合物。螯合剂通常以浓缩水溶液的形式提供，适当时，该水溶液用少量浓酸或碱调节pH以达到生理范围内的pH。作为替代地，可使用数种公知缓冲液中的任一种来调节pH。螯合剂将具有约pH 7.0至约pH 8.0的pH，优选约7.5+/-0.1pH单位的pH。螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，或其盐；更优选地，螯合剂是EDTA。术语“EDTA”和“EGTA”将用于指酸和盐形式二者，并且在本发明中可使用任一种形式，但是盐形式是优选的。
“核酸酶抑制剂”意指抑制生物样品中存在的任何核酸酶的功能的试剂。这样的核酸酶抑制剂可通过降解存在的任何核酸酶来发挥作用。例如，核酸酶抑制剂可以是非特异性蛋白酶，例如如蛋白酶K。用蛋白酶K孵育生物样品将消化样品中存在的任何蛋白质，包括核酸酶。蛋白酶可在螯合剂之后或与螯合剂同时添加至样品。为了完成对存在的蛋白质的消化，将具有添加的蛋白酶的生物样品在足以使蛋白酶起作用的温度(例如，约50℃至约65℃，优选约60℃)下和时间(例如，约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟或约5分钟)内孵育。这些条件是本领域普通技术人员公知并且容易确定的。
本文中使用的“核酸”意指单链的或双链的DNA或RNA。
术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR、组装PCR等。反应体积范围从数百纳升(例如200nL)到数百微升(例如200μL)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指在逆转录反应之前进行的PCR，该逆转录反应将靶RNA转化为互补单链DNA，然后对其进行扩增，例如美国专利No.5,168,038。“实时PCR”意指随反应进行而监测反应产物(即扩增子)量的PCR。实时PCR有许多形式，其不同之处主要在于用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand et al.,美国专利No.5,210,015(“Taqman”)；Wittweret al.,美国专利No.6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi et al.,美国专利No.5,925,517(分子信标)。用于实时PCR的检测化学在Mackay et al.,Nucleic AcidsResearch,30:1292-1305(2002)中进行了综述。“嵌套PCR”意指两阶段PCR，其中第一PCR的扩增子成为使用新引物组的第二PCR的样品，其中至少一个与第一扩增子的内部位置结合。如本文所用，提及嵌套扩增反应的“初始引物”意指用于产生第一扩增子的引物，而“第二引物”意指用于产生第二或嵌套扩增子的一个或更多个引物。“多重PCR”意指其中在同一反应混合物中同时进行多个靶序列(或单个靶序列和一个或更多个参考序列)的PCR。通常，对于每种所扩增的序列都使用不同的引物组。“定量PCR”意指旨在用于测量样品或标本中一种或更多种特定靶序列丰度的PCR。
如本文所用的，“扩增(amplification)”或“扩增(amplifying)”是指核酸序列的另外拷贝的产生。扩增通常使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)技术来进行。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR、组装PCR等。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指在逆转录反应之前进行的PCR，该逆转录反应将靶RNA转化为互补单链DNA，然后对其进行扩增。“实时PCR”意指随反应进行而监测反应产物(即扩增子)量的PCR。实时PCR有许多形式，其不同之处主要在于用于监测反应产物的检测化学，例如美国专利No.5,210,015(“Taqman”)；美国专利No.6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；美国专利No.5,925,517(分子信标)。“嵌套PCR”意指两阶段PCR，其中第一PCR的扩增子成为使用新引物组的第二PCR的样品，其中至少一个与第一扩增子的内部位置结合。“多重PCR”意指其中在同一反应混合物中同时进行多个靶序列(或单个靶序列和一个或更多个参考序列)的PCR。通常，对于每种所扩增的序列都使用不同的引物组。“定量PCR”意指旨在用于测量样品或标本中一种或更多种特定靶序列丰度的PCR。
术语“扩增反应系统”是指用于使靶核酸序列的拷贝增多的任何体外手段。术语“扩增反应混合物”是指包含用于扩增靶核酸的多种试剂的水溶液。这些可包括酶(例如，热稳定聚合酶)、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸、核苷三磷酸，以及任选地，至少一个经标记的探针和/或任选地，至少一种用于确定扩增的靶核酸解链温度的试剂(例如，在存在双链核酸的情况下表现出荧光变化的荧光嵌入剂)。
本文中描述的扩增方法可以包括“实时监测”或“持续监测”。这些术语是指在PCR循环期间监测多次，优选在温度转变期间，并且更优选在每个温度转变中获得至少一个数据点。术语“均匀检测测定(homogeneous detection assay)”用来描述包括偶联的扩增和检测的测定，其可以包括“实时监测”或“持续监测”。
如果期望确定例如检测到的微生物的类型、种类和菌株，则可通过任何常规检测技术，包括例如扩增技术例如PCR、TMA、NASBA、RT-PCR对RT-PCR级核酸进行检测和/或分析，任选地随后进行测序分析。
实施例
包含以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并因此可被认为构成了用于本发明实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对所公开的一些具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1–使用≤15分钟氧化还原方案进行快速裂解
使用病原体混合物测定多个DNA/RNA靶标。病原体混合物由RNA病毒(甲型流感、乙型流感和RSV)、革兰氏阴性细菌(副百日咳鲍特菌(Bordetella parapertussis))、革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus))和酵母(白色念珠菌(C.albicans))构成。
在初始氧化还原反应之前，向100μL病原体混合物添加约30毫克的100微米二氧化硅低结合珠。氧化还原反应包括向病原体混合物添加过碳酸钠(35mM终浓度)、蛋白酶K(0.04mg)和EDTA(0.1mM终浓度)。将氧化还原反应在约60℃下孵育约两分钟。将样品在约80℃下加热约一分钟，然后进行声处理约一分钟。最后，将病原体混合物在50mM Tris(pH 7)中以1:4稀释，并直接添加至RT-PCR反应主混合物(master mix)。
作为过程控制，除了仅添加水而不是氧化还原反应组分之外，使病原体混合物经受相同的条件。作为阳性对照，使用Luminex
Figure BDA0003510565400000071
台式系统提取病原体混合物并纯化。结果在表1中提供。
表1.≤15分钟氧化还原方案的实时RT-PCR结果
Figure BDA0003510565400000072
如表1所示，除金黄色葡萄球菌之外，氧化还原反应导致了较低的靶Ct，这表明其表现优于其他两种测试方法，例如ARIES台式和过程控制。此外，标准偏差小于1，这表明氧化还原反应过程具有良好的重现性。Avg Ct：来自9个数据点(3个生物学重复和3个技术重复＝9个Ct值)的平均Ct；StdDev Ct：针对该9个数据点确定的变异性；Avg Tm：使PCR产物熔化所需的平均温度；阳性率：从9个扩增反应中成功检测到靶标的百分比，例如，9个中的9个＝100％。
实施例2–使用5分钟氧化还原方案进行快速裂解
使用病原体混合物测定多个DNA/RNA靶标。病原体混合物由RNA病毒(甲型流感/乙型流感)、革兰氏阴性细菌(副百日咳鲍特菌)、革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)和酵母(白色念珠菌)构成。
在初始氧化还原反应之前，向100μL病原体混合物添加约30毫克的100微米二氧化硅低结合珠。氧化还原反应包括向病原体混合物添加过碳酸钠(35mM终浓度)、蛋白酶K(0.04mg)和EDTA(0.1mM终浓度)。将氧化还原反应在约60℃下孵育约两分钟。在氧化还原反应之后，将样品在约80℃下加热约分钟，然后进行声处理约60秒。最后，将病原体混合物在50mM Tris(pH 7)中以1:4稀释，并直接添加至RT-PCR反应主混合物。
作为过程控制，除了仅添加水而不是氧化还原反应组分之外，使病原体混合物经受相同的条件。作为阳性对照，使用Luminex
Figure BDA0003510565400000082
台式系统分析病原体混合物。结果在表2中提供。
表2. 5分钟氧化还原方案的实时RT-PCR结果
Figure BDA0003510565400000081
Figure BDA0003510565400000091
如表2所示，氧化还原反应导致DNA靶标的靶Ct较低，但RNA靶Ct略高于ARIES台式。Avg Ct：来自9个数据点(3个生物学重复和3个技术重复＝9个Ct值)的平均Ct；StdDev Ct：针对该9个数据点确定的变异性；Avg Tm：使PCR产物熔化所需的平均温度；阳性率：从9个扩增反应中成功检测到靶标的百分比，例如，9个中的9个＝100％。
实施例3–使用5分钟氧化还原方案在多种培养基中快速裂解样品
进行了与如实施例2中所述相同的实验，病原体混合物也含有培养基除外。测试了三种不同类型的培养基，以确定它们是否抑制5分钟氧化还原裂解方案。受试的培养基是eSwabTM(Copan)、MicroTestTMM5TM(RemelTM,Thermo Fisher)和UTMTM(Copan)。作为阳性对照，还使用Luminex
Figure BDA0003510565400000092
台式系统对样品进行了分析。图1中的图显示，相对于阳性对照，没有任何培养基抑制5分钟氧化还原裂解方案。
实施例4–使用5分钟氧化还原方案快速裂解临床样品
进行了与如实施例2中所述相同的实验，除了受试样品是已知对表3所示的病原体呈阳性的临床样品。测试了四种不同的病原体：甲型流感、乙型流感、RSV和白色念珠菌。作为阳性对照，使用Luminex
Figure BDA0003510565400000101
台式系统分析样品。结果在表3中提供。
表3.使用临床样品的5分钟氧化还原方案的实时RT-PCR结果
Figure BDA0003510565400000102
表3突出了使用氧化还原反应时，相对于ARIES台式的参考方法的临床样品的阳性率测试。Avg Ct：来自3个数据点(1个生物学提取和3个技术重复＝3个Ct值)的平均Ct；StdDev Ct：针对该3个数据点确定的变异性；Avg Tm：使PCR产物熔化所需的平均温度；阳性率：从3个扩增反应中成功检测到靶标的百分比，例如，3个中的3个＝100％。
***
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法均可在不进行过度实验的情况下做出和执行。虽然已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文中所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，将明显的是，在化学和生理学两方面均相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂同时将实现相同或类似的结果。对本领域技术人员来说明显的是，所有这样的类似替代和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (28)

1.从生物样品中获得可扩增核酸的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与过碳酸盐、核酸酶抑制剂和螯合剂接触；
(b)将所述生物样品在40℃至95℃下孵育至少30秒；
(c)将所述生物样品在60℃至100℃下孵育至少30秒；以及
(d)搅拌所述生物样品。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括将所述生物样品在50℃至70℃下孵育至少1分钟。
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)包括将所述生物样品在50℃至70℃下孵育至少2分钟。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将所述生物样品在60℃下孵育至少2分钟。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将所述生物样品在70℃至90℃下孵育至少30秒。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将所述生物样品在70℃至90℃下孵育至少1分钟。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将所述生物样品在80℃下孵育至少1分钟。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括将所述样品搅拌至少30秒。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括将所述样品搅拌至少1分钟。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述搅拌包含涡旋或声处理。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(a)至(d)在小于15分钟内进行。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(a)至(d)在小于5分钟内进行。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含二氧化硅珠。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述过碳酸盐包含过碳酸钠。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述核酸酶抑制剂是蛋白酶K。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述核酸包含DNA。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述核酸包含RNA。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述核酸包含DNA与RNA的组合。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述核酸是双链的。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述核酸是单链的。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含细菌细胞、病毒、寄生虫细胞和/或真核细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述真核细胞是植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
24.权利要求23所述的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞、霉菌细胞或蘑菇细胞。
25.权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞、灵长类细胞或犬细胞。
26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述可扩增核酸适合用作PCR和/或RT-PCR中的模板。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括(e)扩增至少一部分所述可扩增核酸。
28.权利要求27所述的方法，其中步骤(e)包括通过PCR或RT-PCR扩增至少一部分所述可扩增核酸。
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