JP3062250B2 - イオン性界面活性剤による、酵素により媒介される反応に対する阻害の抑制方法 - Google Patents

イオン性界面活性剤による、酵素により媒介される反応に対する阻害の抑制方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、診断および臨床試料中に可溶化および蛋白
変性剤としてしばしば存在するイオン性界面活性剤、例
えば、ラウリル硫酸リチウム（LLS）およびドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）の存在下で酵素反応を行うことに
関するものである。それゆえ、本発明は、所望反応を開
始する前に分析物または酵素基質から界面活性剤を分離
するための時間と労力を要する手順の必要性をなくす。
さらに本発明は、界面活性剤除去工程を必要とせずにLL
Sのごときアニオン性界面活性剤の存在下でポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）のごとき酵素により媒介される核酸
増幅反応または制限酵素消化を行う方法に関する。
発明の背景 本発明は、インビトロで行われる酵素により媒介され
る化学反応、および界面活性剤存在下で該反応の阻害を
防止する方法に関する。界面活性剤は、主として、水溶
液のみに不溶性または不完全に溶解する種々の蛋白、細
胞壁および膜成分、並びに他の細胞オルガネラ、下位構
造および成分を可溶化させる能力により、医学および生
物学の研究室においてありふれた道具となっている。よ
って、界面活性剤は、しばしば、抽出液または溶解バッ
ファーの成分であり、溶解剤および所望でない酵素活
性、例えば、粗細胞溶解物中に通常存在するプロテアー
ゼおよびヌクレアーゼにより関与される反応の効果的な
阻害剤の両方として用いられる。さらに、かかる界面活
性剤は、しばしば、核酸の精製において同じ目的に使用
される。
応用分子化学および生化学において道具として使用さ
れる大部分の酵素は界面活性剤、特に、ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）またはラウリル硫酸リチウム（LLS）の
ごとき強イオン性界面活性剤に対して非常に感受性があ
る。かかるイオン性界面活性剤は蛋白に強力に結合で
き、しばしば蛋白の不可逆的変性を引き起こす（アメリ
カン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー，
マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・ジェネラル・バ
クテリオロジー（American Society for Microbiology,
Manual of Methods for General Bacteriology）57〜78
頁（1981年）参照）。しかしながら、正確にはこのよう
なわけで、LLSのごときイオン性界面活性剤は、しばし
ば、非常に貴重で安価な溶液中の核酸の短期間〜中期間
用保存料である。よって、かかる剤は、微生物を用いる
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの第１段階；微生
物細胞または粒子からの核酸の抽出を行うことにおける
有用な助けとなっている。イオン性界面活性剤は細胞壁
および細胞膜を可溶化し、同時にヌクレアーゼによる核
酸の分解を防止することを助ける（上記文献参照）。そ
のうえ、SDSまたはLLSのごとき強イオン性界面活性剤
は、しばしば、溶解、透過の際に添加され、あるいは分
析のために臨床標本が研究室に運搬される場合の輸送媒
体に添加される。
しばしば、生物学的試料から得られた核酸は、その
後、制限エンドヌクレアーゼまたはDNAもしくはRNAに特
異的なエキソヌクレアーゼでの消化のごとき酵素的処理
に供される。さらに、かかる試料から得られた核酸は、
しばしば、核酸ハイブリダイゼーション法により直接的
に検出および／または定量されるに十分な量で存在しな
い。よって、通常には、かかる試料中の目的核酸配列を
酵素的に増幅して検出しなければならない。
１ラウンドまたはそれ以上のラウンドの核酸増幅また
は別の酵素により媒介される反応に供される生物学的ま
たは臨床試料において、酵素を反応混合物に添加する前
に界面活性剤を溶液中の核酸から分離しなければならな
い。通常は溶液からうまく低分子を除去する透析または
限界濾過は、界面活性剤分子の凝集により形成されるミ
セルのサイズ並びにより大型の溶質への界面活性剤のイ
オン結合もしくは疎水結合により、大部分の界面活性剤
を効果的に除去しないであろう。そのうえ、透析も限界
濾過も、市販診断キットにおける使用に容易には適合し
ない。
分析のために生物学的試料を研究室に運搬するのに用
いられるのと同じ試験管または収集容器中、すなわち、
SDSまたはLLS中での核酸増幅または制限的消化のごとき
酵素により媒介される反応を行うことは便利で経費的に
も効果的であろう。これとは別に、さらなる界面活性剤
除去工程に試料を供するよりはむしろ、即時に反応を開
始できる材料を用いた反応を行うことが望ましいであろ
う。SDSをアセトンのごとき溶媒とともに沈殿させるこ
とができるが、アセトンはいくつかの酵素を変性または
沈殿させる可能性がある。そのうえ、痕跡量のアセトン
または他の沈殿剤により、所望反応が阻害されるかもし
れない。
現在、一般的には粗試料中の核酸は、増幅を行う前
に、フェノール／クロロホルム抽出、次いで、エタノー
ル沈殿により精製される。本発明方法は、イオン性およ
び非イオン性界面活性剤双方を利用してかかる工程の必
要性をなくし、それにより、通常は反応を阻害する一定
量の界面活性剤を試料が含有している場合でさえも生物
学的試料中の核酸を用いて酵素により媒介される反応を
行うことを可能にする。
好ましくは、本発明は、ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）またはラウリル硫酸リチウム（LLS）のごときアニオ
ン性界面活性剤の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）または転写に基づく増幅系のごとき核酸増幅反応を
行う方法である。しかしながら、本発明は、制限的消
化、エンド−ならびにエキソヌクレアーゼ消化、および
キナーゼならびにトランスフェラーゼ反応に対するイオ
ン性界面活性剤による阻害をも同様に防止できるはずで
ある。また、出願人は、本願が核酸を用いる酵素反応に
限定されると考えていない。よって、本明細書中の本発
明の具体例は増幅反応における本発明の利用を説明する
のであるが、かかる具体例は例示のためだけであり、本
発明の範囲は本明細書末尾の請求の範囲によってのみ定
義される。
理論により拘束されることを望まないが、出願人は、
非イオン性およびイオン性界面活性剤分子の不均一ミセ
ルからなるミセルコロイド状凝集物の生成により、イオ
ン性界面活性剤分子が溶液から効果的に除去され、かく
して、それらは次いで添加される酵素に結合することあ
るいは変性させることには用いられないと考える。
いくつかの酵素の活性を促進または保持する界面活性
剤の能力が報告されている（サイトー・エム（Saito,
M.）ら、アクション・オブ・アルスロバクター・ウレア
ファシエンス・シアリダーゼ・オン・シアログリコリピ
ッド・サブストレイツ（Action of Arthrobacter ureaf
aciens Sialidase on Sialoglycolipid Substrates）、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）第254巻、7845〜7854頁（1979年））。界
面活性剤により阻害された蛋白の再活性化のための方法
としてのイオン性および非イオン性界面活性剤の不均一
ミセルの使用も報告されている（エイ・ピー・エル（E
y.P.L.）およびファーバー・イー（Ferber,E.）、カー
フ・シマス・アルカライン・ホスファターゼ II.イン
ターラクション・ウィズ・ディタージェンツ（Calf Thy
mus Alkaline Phosphatase II.Interaction with Deter
gents）、ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）第480巻、163〜177頁（1977年）；バ
ージ，アール・ケイ（Berge,R.K.）ら、バリエイション
ズ・イン・ザ・アクティビティー・オブ・ミクロソーマ
ル・パルミトイル−CoA・ヒドロラーゼ・イン・ミック
スト・ミセル・ソリューションズ・オブ・パルミトイル
−CoA・アンド・ノン−イオニック・ディタージェンツ
・オブ・ザ・トリトン Ｘ シリーズ（Variations in
the Activity of Microsomal Palmitoyl−CoA Hydrolas
e in Mixed Micelle Solutions of Palmitoyl−CoA and
Non−Ionic Detergents of the Triton X Series）、
ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ第666巻、25〜35頁
（1981年）；タンドン，エス（Tandon,S.）およびホロ
ビッツ，ピー・エム（Horowitz,P.M.）、ディタージェ
ント−アシステッド・リフォールディング・オブ・グア
ニジニウム・クロライド−デナチュアド・ロダナーゼ
（Detergent−assisted Refolding of Guanrdinium Chl
oride−denatured Rhodanase）、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー第262巻、4486〜4491頁（1
987年））。さらに、イオン性および非イオン性界面活
性剤の不均一ミセルの生成が、可溶化酵素標品からの非
イオン性界面活性剤の阻害性濃縮物の除去方法として報
告されている（ストラルフォース，ピー（Stralfors,
P.）ら、リムーバル・オブ・ノンイオニック・ディター
ジェント・フロム・プロテインズ・フラクショネイテッ
ド・バイ・エレクトロフォーカシング（Removal of Non
ionic Detergent from Proteins Fractionated by Elec
trotocusing）、ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ第5
33巻、90〜97頁（1978年））。
上記刊行物に述べられたすべての方法は、界面活性剤
溶液中での酵素の活性化または再活性化に関する。これ
らの方法は、活性酵素の添加前の酵素基質含有溶液中の
不均一ミセルの生成を教示または示唆するものではな
い。さらに、これらすべての場合において、酵素の可溶
化、精製、または活性化を行うために界面活性剤が用い
られた。酵素自体というよりむしろ酵素基質を可溶化
し、安定化するために先ず界面活性剤が添加される場合
はない。
定義 本願において、特記しない限り、以下の用語は下記の
意味を有する。
「実質的な阻害」および「実質的に阻害する」は、酵
素活性についての信頼でき、高感度な、しかも再現性の
あるアッセイに関して得られる酵素活性よりも酵素活性
が減少していることを意味する。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または
「標的配列」は、特定の核酸配列、またはそれに相補的
な核酸配列を意味する。
「不均一ミセル」は、液体媒体中のイオン性および非
イオン性界面活性剤のモノマーからなる疎水性凝集物を
意味する。
「混合ミセル」は、この開示において定義される「不
均一ミセル」を意味する。
「相補的」は、分別核酸ハイブリダイゼーションに適
した条件下で１の核酸鎖のある領域と、もう１本の核酸
鎖の領域との核酸塩基間に安定な水素結合が形成される
核酸配列を有することを意味する。すなわち、最も通常
には、水素結合は、一方の鎖上のアデノシン（Ａ）残基
ともう一方の鎖上のチミジン（Ｔ）またはウラシル
（Ｕ）残基との間、および一方の鎖上のグアニン（Ｇ）
残基ともう一方の鎖上のシトシン（Ｃ）残基との間に形
成される。一般的には、かかる相補的領域は、各核酸鎖
の12個ないし100個またはそれ以上の連続したヌクレオ
チドを含んでいる。
「十分に相補的」は、非相補的核酸を標的核酸にハイ
ブリダイゼーションさせないでおくのに適した条件下で
標的核酸と２本鎖水素結合領域を形成しうることを意味
する。特定の連続対応領域にわたり100％の相補性を有
する場合には２本の核酸鎖が十分に相補的であるが、10
0％未満の相補性の領域を有する２本の１本鎖核酸が選
択的ハイブリダイゼーション条件下で２本鎖領域を形成
できることが当業者に知られている。ゆえに、100％の
相補性はないがこれらのハイブリダイゼーション条件下
で安定な２本鎖領域を形成することのできるかかる領域
を、十分に相補的であると見なす。
「類似」は、１の１本鎖核酸領域が、比較される第２
の１本鎖核酸の領域と同じであるかまたは同様であるこ
とを意味する。例えば、この語は、該領域において第２
の核酸中に存在するチミジンのかわりに第１の核酸がウ
ラシルを含んでいる核酸、および機能的に同様もしくは
同一の生物学的剤またはその一部分をコードあるいは含
有する核酸領域を包含する。
「十分に類似」は、第１の１本鎖核酸と比較すると、
第２の１本鎖核酸が核酸ハイブリダイゼーション条件下
で第３の核酸と安定な水素結合２本鎖領域を形成するこ
とを可能にする核酸配列を有することを意味する。ここ
に、第３の核酸は第１の核酸に対して十分に相補的であ
るとする。
「RNAse阻害剤」は、RNAse活性を有する酵素によるRN
Aの分解を妨げることのできるすべての剤を意味する。
該用語は、プロテアーゼのごとき酵素、架橋試薬、抗
体、およびRNAse分子の活性部位をブロックする化合物
を包含するが、これらに限定しない。
「核酸」は、少なくとも２個、好ましくは10個または
それ以上のヌクレオチドの長さのポリデオキシリボヌク
レオチドまたはポリリボヌクレオチドを意味する。用語
は「核酸」は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、
およびDNAまたはRNA分子を包含する。「核酸」は、１本
鎖またた２本鎖いずれかのポリヌクレオチド、あるいは
その両方をいうことができる。
「標的核酸」は、標的核酸配列からなる核酸を意味す
る。
「生物学的試料」または「試験試料」は、いずれかの
時点で核酸を含む生きた生物から得られた物質を含有す
るすべての標本または試料を意味する。かかる試料は、
食品または農業試料；環境試料；尿、血液、乳、脊髄
液、痰、唾液、大便、肺からの吸引物、涙、リンパ液も
しくは精液のような体液、分泌物もしくは排泄分合有試
料；咽頭もしくは性器の綿棒かきとり物；および細菌、
ウイルス、植物もしくは動物細胞培養物、懸濁液または
溶解物を包含するが、これらに限定しない。
「増幅」または「標的の増幅」は、標的核酸配列を有
する標的核酸分子の数を増加させることを意味する。
核酸検出方法は当該分野においてよく知られており、
一般的には、プローブが標的核酸の配列に十分に相補的
な配列を有し、その存在を知る必要がある標的核酸が特
別な配列を有する場合に、ハイブリダイゼーション条件
下、少なくとも１種の標識１本鎖核酸プローブを１本鎖
標的核酸と接触させることからなる。かかる方法は、マ
ニアティス，ティー（Maniatis,T.）ら、モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual）（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）、1982年）に記載されている。２本鎖
ハイブリッド分子の検出は使用標識の性質に左右され
る。一般的には、プローブは、32P、3H、または14Cのご
とき放射活性同位体を含んでいるか、あるいは蛍光部
分、ハプテン、または別の非放射活性リポーター基に結
合している。例えば、マニアティス、上記、およびアー
ノルド（Arnold）ら、PCT US88/02746参照（両方と
も、参照により本開示の一部とみなす）。
多くの酵素により媒介される増幅系を用いて標的核酸
のコピー数を増加させることにより、診断での核酸ハイ
ブリダイゼーションの感度および信頼性を改善すること
ができる。一般的には、かかる方法は標的核酸を少なく
とも１種の核酸ポリメラーゼの鋳型として用い、繰り返
しサイクルにおいてポリメラーゼを２種またはそれ以上
の核酸プライマーと協奏的に使用して標的核酸を指数的
に増加させてもよい。当業者によく知られた増幅系の例
は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（ムリス（Mullis）
ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）第155巻、335〜350頁（1987年））、および
複数の１本鎖RNA転写物を作るための鋳型としての２本
鎖PCR生成物の使用（ムラカワ（Murakawa）ら、DNA第７
巻、287〜295頁（1988年））を包含する。他の増幅系
は、標的核酸を増幅するためのRNA鋳型および転写に基
づく別のラウンドのDNA合成を包含する。バーグ（Bur
g）ら、WO89/1050;ギンゲラス（Gingeras）ら、WO88/10
315;カシアン（Kacian）およびフルツ（Fultz）、EPO出
願第89313号参照（いずれも参照により本開示の一部と
みなす）。上記リストは種々の増幅方法の全部のリスト
ではなく、核酸増幅系での使用に適した他の核酸ポリメ
ラーゼが当業者に知られている。増幅後、得られた増幅
核酸を上記検出系を用いて同定することができる。
よって、第１の態様において、本発明方法は、イオン
性界面活性剤に変性を起こさせない、あるいは核酸増幅
反応系に使用する酵素の活性を実質的に阻害させない方
法に関し、該核酸増幅系は、１）標的核酸、２）１種ま
たはそれ以上の核酸プライマー（それぞれが共通の標的
核酸に対して十分に相補的であり、適当な選択的ハイブ
リダイゼーション条件下で標的と２本鎖水素結合領域を
形成する）、３）必要なヌクレオシドトリホスフェー
ト、塩、ならびに増幅を行うために必要な他の成分、お
よび４）一定量のイオン性界面活性剤からなる。本発明
方法は、透析またはクロマトグラフィーのごとき界面活
性剤除去工程を必要としない。該方法は、非イオン性界
面活性剤の試料への添加およびイオン性ならびに非イオ
ン性界面活性剤分子の混合ミセルを形成させるための試
料の撹拌を包含する。不均一ミセルの形成後、核酸ポリ
メラーゼおよび増幅を行うために必要な他の酵素を試料
に添加し、通常どおり核酸増幅反応を行うことができ
る。
本発明の第２の態様において、微生物または核酸を含
有する生物学的試料を溶解もしくは抽出バッファーと接
触させ、引き続き行う増幅および核酸検出アッセイにお
ける使用のために、LLSまたはSDSのごときイオン性界面
活性剤を含有するバッファー中に遊離した核酸を貯蔵す
る。増幅工程に先立って、抽出した核酸混合物に一定量
の非イオン性界面活性剤を添加するが、この添加は、有
効量のリボ−もしくはデオキシリボヌクレオチドトリホ
スフェート、一般的には２種またはそれ以上の核酸プラ
イマー、および酵素反応に必要ないずれかのコファクタ
ーもしくは金属イオンの添加と同時または前のいずれか
に行う。次いで、溶液を激しく撹拌し、その後、核酸ポ
リメラーゼを混合物に添加する。使用増幅方法、例え
ば、サーモサイクリングまたはイソサーマル増幅プロト
コールに適するように反応混合物をインキュベーション
する。例えば、アメリカン・ソサエティー・フォー・マ
イクロバイオロジー、ダイアグノスティック・モレキュ
ラー・マイクロバイオロジー：プリンシプルズ・アンド
・アプリケイションズ（American Society for Microbi
ology,Diagnostic Molecular Microbiology:Principles
and Applications）、56〜70頁（1993年）参照（参照
により本明細書に記載されているものと見なす）。次い
で、増幅標的核酸を上記ハイブリダイゼーション法によ
り検出する。
もう１つの態様において、本発明方法を用いて、工
業、医療、研究室および商業的処方に通常使用する他の
酵素に対する阻害を防止してもよい。例えば、本発明方
法を用いて、溶液から最初にアニオン性界面活性剤を除
去する必要なく、アニオン性界面活性剤含有試料中の制
限酵素消化に対する阻害を防止してもよい。
上記開示は本発明および溶液に対するその一般的手段
により解決される課題を説明するが、上記開示は本発明
またはその適用を何ら限定せず、本開示の後に続く請求
の範囲によってのみ定義されるということが理解されよ
う。
発明の概要 本発明は、通常は酵素活性を阻害するに十分な濃度の
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはラウリル硫酸リ
チウム（LLS）のごときイオン性界面活性剤を含有する
溶液中で酵素反応を行う方法に関する。１の具体例にお
いて、本発明は、核酸標的増幅反応における少なくとも
１種の酵素の阻害を防止する方法に関する。該方法は、
アニオン性界面活性剤（好ましくは、SDSまたはLLS）お
よび分析すべき核酸を含有する溶液に、一般的には２種
またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオシドプライマー
（１のプライマーは標的核酸配列に十分に相補的な配列
を有し、他のプライマーは標的核酸配列に十分に類似の
配列を有する）;4種の異なるヌクレオチド;MgCl2または
NaClのごとき必要な塩およびコファクター；および一定
量、好ましくは、８〜20％（v/v）の非イオン性界面活
性剤、好ましくはポリオキシエチレン（20）ソルビタン
モノアルキレート（ツインシリーズの界面活性剤）また
はポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール誘導
体（トリトンＸ−100およびトリトンＸ−102）を添加す
ることに関する。これらの構成成分を混合し、核酸ポリ
メラーゼ、好ましくは細菌サーマス・アクアティカス
（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq D
NAポリメラーゼ）のごとき耐熱性DNAポリメラーゼを反
応混合物に添加し、混合物を核酸増幅工程、好ましくは
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供する。
もう１つの好ましい具体例において、２種の酵素:MML
V RTのごときRNAse Ｈ活性を有する逆転写酵素、およ
びT7ポリメラーゼのごときRNAポリメラーゼを増幅反応
に用いる。
もう１つの好まし具体例において、本発明方法を用い
て、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）存在下での制限酵
素に対する阻害を防止する。プラスミドpUC19（メリー
ランド州ゲイサースバーグ（Gaithersburg）のベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories））を、単一EcoR1部位において制限エンドヌ
クレアーゼEcoR1で消化した。直鎖状にした後、該プラ
スミドDNAを、イー・コリ（E.coli）DNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントを用いて［α］−32P dATPで
放射性標識した。放射性標識プローブを沈殿させ、異な
る量のSDSおよびツイン20を含有する溶液中に再懸濁し
た。次いで、DNAに過剰の制限エンドヌクレアーゼPvu I
Iを作用させ、37℃で１時間インキュベーションした。
得られた試料を非変性条件下の７％ポリアクリルアミド
ゲルで分析した。
おそらく酵素阻害性イオン性界面活性剤を溶液から除
去することにより、疎水性相互作用が酵素反応の脱阻害
において重要な役割を果たすであろうが、ミセル生成の
みが本明細書記載の方法における特別な非イオン性界面
活性剤の適性に関する唯一の決定因子であるとはいえな
い。よって、出願人により混合ミセルの生成は本発明の
実施において重要であると考えられるが、出願人は、イ
オン性界面活性剤の存在下において酵素活性を保持する
正確な機構ついてははっきりわからないままである。
通常は阻害量または変性量のLLSまたはSDSのごときイ
オン性界面活性剤の存在下で標的増幅反応を行う方法を
提供することが本発明の１の目的である。
核酸およびLLSまたはSDSのごときイオン性界面活性剤
を含有する生物学的または臨床的試料の訂正および／ま
たは定量分析を行う方法を提供することも本発明の目的
であって、かかる分析は、特定の核酸配列の増幅または
制限的消化のごとき少なくとも１の酵素により媒介され
る反応を用いるものである方法であり、反応を行う前に
イオン性界面活性剤から核酸分析対象を分離する必要は
ない。
試験試料における核酸増幅反応の阻害を防止する方法
を提供することが本発明のもう１つの目的であって、該
試料は、１）特定の配列の存在または不存在について試
験される核酸；および２）約0.1〜1.5％のイオン性界面
活性剤、好ましくは約0.3〜0.7％SDSまたはLLSを含み、
核酸増幅反応に用いる酵素または酵素（複数）は、好ま
しくはTaq DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、
および／またはレトロウイルスのRNA指向DNAポリメラー
ゼである。該方法は、非イオン性界面活性剤、好ましく
は約８〜20％のポリオキシエチレン（20）ソルビタンモ
ノラウレート（ツイン−20）またはポリオキシエチレン
（９）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（トリトンＸ−10
0）を核酸およびイオン性界面活性剤に添加し、溶液を
激しく撹拌して不均一界面活性剤ミセルを生成させ、有
効量の核酸ポリメラーゼ、好ましくは約２〜８ユニット
のTaq DNAポリメラーゼを添加し、次いで、反応混合物
をPCRのごとき核酸増幅手順に供する工程からなる。
核酸または核酸を含む微生物を含有する生物学的試料
の適性分析または定量分析、あるいはその両方するため
のキットを提供することが本発明のさらなる目的であ
る。試料が微生物を含有している場合、かかるキット
は、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性を阻害し細胞
壁および膜の溶解を促進するために、約0.1％〜1.5％の
イオン性界面活性剤、好ましくはSDSまたはLLSを含む溶
解、透過、または試料輸送用試薬を提供すべきである。
かかる試薬中において、遊離した核酸は、イオン性界面
活性剤によってヌクレアーゼ分解から保護される。該キ
ットは第２の試薬を提供すべきであり、該第２の試薬
は、１）一般的には、標的核酸配列の配列に十分に相補
的な核酸配列を有し、ハイブリダイゼーション条件下で
かかる標的配列を有する送付的核酸鎖の一方または両方
と水素結合領域を形成する２種またはそれ以上の核酸プ
ライマー;2）0.5〜10mM MgCl2またはMnCl2;3）有効量
のジスルフィド開裂剤、好ましくは0.5〜10mMのジチオ
スレイトール（DTT）；および４）８〜20％（v/v）の非
イオン性界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノラウレート（ツイン−20）または
ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート
（ツイン−80）を含有している。溶解、透過または輸送
用媒体中の遊離核酸を含有する試料溶液の一部を第２の
溶液に添加し、激しく撹拌する。次いで、約２〜８ユニ
ットの少なくとも１種の核酸ポリメラーゼ、好ましくは
Taq DNAポリメラーゼを反応混合物に添加し、ポリメラ
ーゼ連鎖反応の通常の手順により混合物をを処理する。
この後、核酸ハイブリダイゼーション法および標識核酸
プローブを用いて少なくとも１つの特定の核酸配列の存
在または不存在について試料を試験する。
イオン性界面活性剤、好ましくは0.3ないし0.7％LLS
の存在下での核酸の増幅方法を提供することが本発明の
さらにもう１つの目的である。この方法において、出発
溶液の最終組成は以下のものを含有する:1）約50mMのTr
is−HCl（pH 7.6）、175mM MgCl2、25mM KClおよび2
mM スペルミジン、２）それぞれ約25mMの４種の異なる
リボヌクレオチドトリホスフェート（Ａ、Ｕ、Ｇおよび
Ｃ）および４種の異なるデオキシリボヌクレオチドトリ
ホスフェート（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）、３）約1mMのDT
T、４）約20ピコモルの一般的には２種またはそれ以上
の１本鎖核酸プライマーであって、標的核酸配列の配列
に十分に相補的な核酸配列を有し、ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、かかる標的核酸配列を有するポジティブ
またはネガティブセンス核酸鎖のいずれかあるいはその
両方と２本鎖水素結合領域を形成するプライマー、５）
少なくとも１コピーの特定の標的核酸配列約を有する6x
10-3ないし6x10-9ピコモルの核酸。
好ましい具体例の詳細な説明 請求の範囲の方法およびキットは、イオン性界面活性
剤の存在下での標的増幅反応を行うための一連の工程、
ならびにかかる工程を行うための試薬の組み合わせに関
する。
１の好ましい具体例において、本発明は、分析すべき
試料がイオン性界面活性剤を含有している場合に核酸増
幅反応を行うための方法および手段を提供する。該方法
は、一定量の非イオン性界面活性剤を試料溶液に添加
し、酵素または酵素（複数）を添加して増幅反応を開始
する前にイオン性および非イオン性界面活性剤を一緒に
して激しく混合することを包含する。
出願人はその具体例のいくつかにおいて精製核酸を用
いたが、標的核酸を含んでいるがまたは含む可能性があ
る限り、精製または未精製のいずれの核酸源であっても
使用可能である。この配列はDNAまたはRNA中に存在して
もよく、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。前の
増幅反応から得られる核酸によっては、これらの核酸の
混合物を用いてもよい。それゆえ、本発明は、一般的に
は、分析すべき核酸を含む試料における界面活性剤の阻
害効果を克服する有用な方法である。
材料 非イオン性界面活性剤ツイン−20、ツイン−40、ツイ
ン−80、トリトンＸ−100およびトリトンＸ−102を、ミ
ズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chem
ical）社から購入した。
標準的ホスホラミダイト化学を用いて核酸プライマー
を合成した。種々のかかる方法は当該分野において知ら
れており、例えば、カルサーズ（Carruthers）ら、メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー第154巻、287頁（1987
年）；バット（Bhatt）ら、U.S.第07/319,570号（1989
年６月３日出願）、およびクレム（Klem）ら、PCT WO9
2/07864参照（参照によりこれらを本開示の一部とみな
す）。出願人は380A型DNA合成装置（カリフォルニア州
フォスター・シティー（Foster City）のアプライド・
バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Bi
osystems,Inc.）社製）を用いてプローブを調製する。
検出方法 標的配列にハイブリダイゼーションする検出可能な化
学発光アクリジニウムエステル標識核酸プローブを用い
て増幅生成物を定量した。詳細には、増幅した試料を特
定のハイブリダイゼーション条件下で標識プローブと接
触させ、ハイブリダイゼーションしないプローブに結合
したアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、次
いで、存在しているアクリジニウムエステルの化学発光
をルミノメーターで測定することにより２本鎖ハイブリ
ッド分子を検出する。例えば、アーノルド（Arnold）
ら、PCT US88/02746およびネルソン（Nelson）ら、ノ
ンアイソトーピック・DNA・プローブ・テクニックス（N
onisotopic DNA Probe Techniques）275頁（アカデミッ
ク・プレス（Academic Press）、サン・ティエゴ（San
Diego）、1992年）参照（参照によりこれらを本明細書
に記載されているものとみなす）。
下記実施例は、必ずしも、本発明の用点の最適条件を
示すものではなく、それらは説明だけのものであって、
本発明の目下好ましい具体例を示すものである。これら
の実施例は、請求の範囲の方法の可能な具体例の範囲に
ついて限定するものでなく、かかる具体例は、本開示を
参照すれば当業者に即座に明らかなものとなる。
実施例１ この実施例は、転写に基づく増幅系（カシアン（Kaci
an）およびフルツ（Fultz）、上記文献参照）における
本発明方法の使用の有効性を示すものである。この実施
例用の標的核酸は、30mM リン酸ナトリウム（pH6.
7）、0mM EDTA二ナトリウム（エチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム）、1mM EGTA（エチレングリコール−ビ
ス（β−アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′−四酢
酸）、および110mM（3.0％ w/v）LLSを含有するバッフ
ァー中の、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureapl
asma urealyticum）から精製された全リボゾームRNAの
溶液であった。
脱イオン水中の25％（v/v）トリトンＸ−102の溶液を
調製した。反応体積は100μｌであり、微量遠心チュー
ブ内で反応を行った。各チューブに、500mM Tris−HCl
（pH7.6）、175mM MgCl2、150mM KClおよび20mM ス
ペルミジンを含有するバッファー10μｌ、および1M DT
T 0.5μｌ、25mM rCTPならびにrUTPおよび65mM rATP
ならびにrGTP含有するリボヌクレオチド溶液10μｌ、dA
TP、dTTP、dCTPならびにdGTP各100mMを含有する溶液２
μｌ、30pMの第１プライマー（81（−）；配列番号:1）
溶液8.6μｌ、30pMの第２プライマー（uur Ｃ １
（＋）；配列番号:2）溶液3.4μｌ、上記のごとく調製
した標的rRNAの未希釈、1:10希釈、もしくは1:100希釈
物10μｌ、種々の量の25％（v/v）トリトンＸ−102溶
液、および水を添加して体積93.6μｌとした。これらの
プライマー配列は下記のごとし 配列番号:1: 配列番号:2: ボルテックスミキサーを用いて各反応チューブを激し
く混合し、次いで、試料を95℃で２分間加熱し、室温ま
で冷却した。モロニー・ミュリン白血病ウイルスのRNA
指向DNAポリメラーゼ（MMLV逆転写酵素、300ユニット）
および400ユニットのT7 RNAポリメラーゼを全体積6.44
μｌとして各試験管に別々に添加した。次いで、試料を
37℃で４時間インキュベーションした。チューブを４℃
まで冷却し、検出工程を移行した。
上記HPA化学発光法（参照により本開示の一部と見な
す）により増幅標的配列の定量を行った。アーノルド
（Arnold）ら、上記文献参照。標的配列に特異的な２種
の標識プローブのうちの１つをハイブリダイゼーション
アッセイに用いた。それらの配列は以下のごとし： 配列番号:3 配列番号:4 実施例２ この実施例は、ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔ−オ
クチルフェノール誘導体（トリトンＸ−102）が本発明
方法において非極性界面活性剤として作用する能力を示
す。LLS濃度は0.3％（w/v）であった。トリトンＸ−102
濃度は９％、10％、および11％（v/v）であった。各条
件につき２系の実験を行い、各実験につき２系のHPA検
出を行った。得られた値を平均した。増幅量は検出標識
量に比例する。この量はRLUまたは相対的光単位で示さ
れる。かっこ内の値は対照実現であった。増幅実験の結
果を下表１に示す。
実施例３ 下記実験は、本発明方法による核酸増幅の感度を示
す。本実施例と実施例１と同様にして行ったが以下の点
は例外である。ツイン−20をトリトンＸ−102の代わり
に用い、添加標的RNA量は、6x10-3、6x10-5、6x10-7お
よび6x10-9ピコモルとした。ツイン−20最終濃度は13、
15および20％（v/v）であった。結果を表２に示す。
実施例４ この実施例は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用い
る核酸増幅とともに使用する本発明方法の有効性を示
す。この実施例に関しては、標的核酸は、ヒト・乳頭腫
ウイルスのE6遺伝子を含むプラスミドから得た既知DNA
配列を有する制限フラグメントであった。２種のオリゴ
ヌクレオチドプライマー（配列番号:4および配列番号:
5）は、２本鎖標的核酸の対向鎖に相補的であるように
設計された。これらのプライマーの配列は下記のごと
し： 配列番号:5 配列番号:6 各試料の最終反応体積は100μｌであった。この実験
において、各チューブに２滴の鉱油を添加し、次いで、
前以て計算された量の水を添加した。次いで、100mM T
ris−HCl（pH7.6）、10mM EDTA中の標的DNA1マイクロ
リットル（標的配列1x104コピー）を添加した。30mMリ
ン酸ナトリウムバッファー（pH6.7）、1.0mM EDTA二ナ
トリウム、1mM EGTA、および110mM（3.0％ w/v）LLSを
含有するバッファーをいくつかのチューブに添加して最
終LLS濃度を0.3％とした。異なる体積の50％（v/v）ツ
イン−20溶液もいくつかのチューブに添加して反応濃度
を10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、または
24％とした。界面活性剤添加後、試料をボルテックスミ
キサーで混合した。
各チューブにつき、PCRプライマープレミックスを別
々に作成した。該プレミックスは、10XPCRバッファー10
μｌ、各デオキシリボヌクレオチド20ナノモル、各核酸
プライマー100ピコモルおよび2.5ユニットのTaq DNAポ
リメラーゼを含有していた。試料チューブを氷上に置
き、PCRプレミックスを各試料に添加し、混合した。各
試料を94℃で３分間加熱し、次いで、下記サーモサイク
ルを35回行った:51℃で30秒のインキュベーション、次
いで、72℃で２分間のインキュベーション、最後に94℃
で１分間。最終の94℃のインキュベーション後、試料を
72℃で５分間インキュベーションし、次いで、検出のた
めに４℃で一晩４℃で貯蔵した。
標的核酸配列の相補的なプローブを用いて、実施例１
と同様にして検出を行った。プローブの配列を以下に示
す： 配列番号:7 結果を表３に示す。
実施例５ この実験は、異なる濃度のLLSおよびツイン20の場合
の、Taq DNAポリメラーゼにより媒介されるPCRに対す
る阻害を防止するツイン−20の有効性を示す。LLS濃度
を０％、0.3％、0.5％、および0.7％（w/v）としたこと
以外は実験を実施例３と同様に行った。ツイン−20濃度
はさまざまで、０％、10％、14％、18％、および20％
（v/v）であった。結果を表４に示す。
実施例６ ツイン−20に代えてツイン−40（ポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノパルミテート）を用いたこと以外
は実施例４と同様にしてこの実験を行った。結果を表５
に示す。
実施例７ ツイン−20に代えてツイン−80（ポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノオレエート）を用いたこと以外は
実施例４と同様にしてこの実験を行った。試験しなかっ
た実験については「ND」で示す。結果を表６に示す。
実施例８ この実験は、核酸または核酸を含む微生物を含有する
可能性のある生物学的試料に関し用いられる本発明の有
効性を示す。試料は、30mM リン酸ナトリウム（pH6.
8）、10mM EDTA2Na（エチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム）、1mM EGTA（エチレングリコール−ビス（β−
アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′−四酢酸）、およ
び110mM（3.0％ w/v）LLSを含有するバッファー中の、
頚管内綿棒かきとり標本のプールであって、以前の増幅
を行ない直接核酸ハイブリダイゼーションアッセイにお
いてクラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachoma
tis）について陽性であると試験されたものである。
試料を、各試料800μｌにつき40μｌのプロテイナー
ゼＫ溶液（0.1ユニット／μｌ）で処理し、60℃で20分
間インキュベーションした。40mM Tris−HCl（pH8.
0）、10mM Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（NALC）、
および2mM EDTAを含有する試料希釈バッファーにツイ
ン−80（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレ
エート）を添加した。増幅中の最終ツイン濃度が6.4
％、6.8％、7.2％.7.6％、８％、10％および12％となる
ような量のツイン−80を、このバッファーに添加した。
10マイクロリットルの標本試料を、希釈バッファー中の
各濃度の非イオン性界面活性剤40μｌと一緒にし、ボル
テックスミキサーを用いて激しく撹拌し、次いで、３〜
４日間４℃で貯蔵した。
20％（w/v）ポリビニルピロリドン、それぞれ16mMのr
CTP、rATPおよびrUTPならびに20mMのrGTP、6mMデオキシ
リボヌクレオチド、160mM Tris（pH7.5）、92mM MgCl
2、92mM KCl、3.0ピコモルの第１プライマー（T7 Apr
oCtrB（−）1519;配列番号:7）および25.0ピコモルの第
２プライマー（CtrB（＋）1482b;配列番号:8）を含有す
る25μｌの増幅バッファーをピペットで各実験用の別個
のチューブに入れ、次いで、200μｌの鉱油を各チュー
ブに重層した。オリゴヌクレオチドプライマーの１つ
は、クラジミア・トラコマティスのリボソームRNAの領
域に対して類似の核酸配列を有していた。他方のオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、クラミジア・トラコマティ
スのリボソームRNAの領域に相補的な核酸配列を有して
いた。これらのプライマーの配列は以下のとおり： 配列番号:8: 配列番号:9: 各試料および界面活性剤を含有する50μｌを鉱油層を
通してピペットで取り増幅バッファー中に入れた。各試
験管をヒーティングブロック中95℃で５分加熱し、次い
で、さらに別のヒーティングブロックに移して42℃でさ
らに５分間置き、次いで、酵素を添加した。900ユニッ
トのモロニーミュリン白血病ウイルスの逆転写酵素（MM
LV RT）および400ユニットのT7 RNAポリメラーゼを含
有する酵素溶液25マイクロリットルを各チューブに添加
し、混合して溶液とした。次いで、各チューブを42℃で
１時間インキュベーションし、次いで、50ユニットの本
質的にRNase不含であるがエタノール中0.1mMフェニルメ
チルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する溶液20μ
ｌで処理した。試料を42℃でさらに10分間インキュベー
ションし、標的クラミジア・トラコマティスのリボゾー
ムRNAに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブを用
いて、HPA検出を上記のごとく行った。該プローブの配
列は以下のごとし： 配列番号:10 陽性対照をカッコ内に示し、それらは、生物学的試料
中に含有されていないが、最終濃度0.3％LLS中に含有さ
れている示された量のRNAが増幅手順に供される試料で
あった。各実験試料は２系作成した。結果を表７に示
す。
実施例９ この実施例は、核酸増幅反応以外の系におけるイオン
性界面活性剤による酵素により媒介される反応の阻害を
防止する、本発明方法の有効性を説明する。５μｌの10
X高塩濃度バッファー（10mM NaCl、50mM Tris（pH7.
5）、10mM MgCl2および1mM DTT）を含む反応混合物
（最終体積50μｌ）中で、５マイクログラムのプラスミ
ドpUC19（メリーランド州ゲイサースバーグのベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories））を、単一のEcoR I部位において制限エンド
ヌクレアーゼEcoR Iで消化した。反応混合物を37℃で１
時間インキュベーションした。次いで、300μｌのエタ
ノール、５μｌの3M酢酸ナトリウム、および１μｌのグ
リコーゲンを含有する溶液とともに試料を沈殿させ、次
いで、16μｌの水に再溶解した。
環状プラスミドの直線化の後、下記のごとくイー・コ
リ（E.coli）DNAあポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ントを用いてプラスミド［α］−32P dATPで標識し
た。溶解したDNAに２μｌのハイサルト（High Salt）バ
ッファー、１μｌの［α］−32P dATP、および１μｌ
のクレノウフラグメント（５ユニット／μｌ）（カリフ
ォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Stratagen
e））を添加した。反応混合物を室温で20分インキュベ
ーションし、次いで、２μｌの3M酢酸ナトリウムおよび
200μｌのエタノールを添加することにより沈殿させ、
微量遠心でペレット化した。DNAを100μｌの水に再溶解
した。
SDSおよび放射標識DNA含有溶液へのツイン−20の添加
が、制限エンドヌクレアーゼPvu IIによる直鎖状DNAの
消化に対する阻害を防止するかどうかを試験するため
に、下に示すように異なる反応混合物を種々の量の２種
の界面活性剤を用いて調製した。各反応系は全体積50μ
ｌであった。放射標識DNAを添加する前にSDSおよびツイ
ン−20を反応混合物に添加した。さらに、５マイクロリ
ットルの10X REACTバッファー（500mM Tris−HCl）
（pH7.4）、60mM MgCl2、500mM NaCl、および500mM
KCl）を反応混合物に添加した。次いで、10ユニットのP
vu II（10ユニット／μｌ）を、１μｌ（50ng）の放射
標識DNAとともに各チューブに添加した。反応混合物を3
7℃で１時間インキュベーションした。５マイクロリッ
トルの各消化混合物を、10μｌの非変性ゲルローディン
グバッファーおよび５μｌの水に添加し、各試料の一部
を７％ポリアクリルアミドゲル非変性ゲルで分析した。
分子量マーカーは、Hinf I消化した放射標識φX174DNA
であった。泳動している色素がゲルの最下部に到達する
までゲルでの泳動を行い、そのゲルを用いてＸ線フィル
ムに４時間または一晩さらした。Ｘ線フィルムを現像し
（図１）、結果を分析した。
ゲルレーンは左から右へと番号づけした。２本の左端
のレーンは分子量マーカーであり、それらのサイズ（塩
基数）を一晩露出バンドの横に示し、その横にPvu II未
消化であってEcoR1で直鎖状にしたpUC19 DNAの陰性対
照を示す。右端のレーンも分子量マーカーを含む。
2686bpのpUC19プラスミド中のEco R1部位はマップポ
ジション396にある。pUC19中のPvu II部位はマップポジ
ション306および628におる。よって、pUC19 DNAの完全
消化は、長さ90、232および2364bpの予想フラグメント
を生じるであろう。
図１に示す結果は、Pvu II消化が0.01％（v/v）程度
の低濃度のSDSにより阻害されることを示す。しかしな
がら、酵素添加前の該反応混合物への10〜20％ツイン−
20の添加は制限消化の生起を可能にする。
上記実施例は目下のところ好ましい本発明の具体例を
示す。しかしながら、酵素、イオン性界面活性剤および
非イオン性界面活性剤の他の組み合わせを本発明方法に
用いてもよいことが、本開示を参照すれば当業者に容易
に理解されるであろう。標準的な酵素アッセイ法と本開
示方法を組み合わせて用いて、負担となる実験を行わず
に、本発明に使用するために他のかかる組み合わせをス
クリーニングすることができる。
フロントページの続き (72)発明者 マカリスター，ダイアン・リサ アメリカ合衆国92124カリフォルニア州 サン・ディエゴ、アンロール・アベニ ュー8664番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (32)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イオン性界面活性剤および少なくとも１種
    の酵素基質を含有する液体における酵素活性を増強する
    方法であって、下記工程： a.該液体における該イオン性界面活性剤による少なくと
    も１種の酵素活性に対する阻害を抑制する約６ないし20
    ％の間の最終濃度の非イオン性界面活性剤を該液体に添
    加し； b.イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および酵
    素基質からなる該液体を混合し； c.DNA指向DNAポリメラーゼ活性、RNA指向DNAポリメラー
    ゼ活性、DNA指向RNAポリメラーゼ活性、RNA加水分解酵
    素活性からなる群より選択される活性を有する少なくと
    も１種の酵素を混合物に添加し；次いで、 d.該酵素活性に好ましい反応条件下で該混合物をインキ
    ュベーションする からなる方法。
  2. 【請求項２】液体が生物学的試料からなる請求項１の方
    法。
  3. 【請求項３】酵素基質が核酸からなる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】酵素が、RNA指向DNAポリメラーゼ活性を有
    するレトロウイルス由来の酵素、サーマス・アクイティ
    カス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ、バ
    チルス・ステロサーモフィラス（Bacillus sterothermo
    philus）由来のDNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレア
    ーゼおよびT7RNAポリメラーゼからなる群より選択され
    る請求項１、２または３の方法。
  5. 【請求項５】イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫
    酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項１、
    ２または３の方法。
  6. 【請求項６】イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチ
    ウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択
    される請求項１、２または３の方法。
  7. 【請求項７】イオン性界面活性剤の最終濃度が約0.1〜
    0.7％の間である請求項１〜４のいずれかに記載の方
    法。
  8. 【請求項８】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノ−アルキレート誘導体からな
    る群より選択される請求項１、２または３の方法。
  9. 【請求項９】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノステアレートおよびポリオ
    キシエチレン（20）ソルビタンモノオレエートからなる
    群より選択される成分よりなる請求項１、２または３の
    方法。
  10. 【請求項１０】イオン性界面活性剤の存在下で核酸含有
    生物学的試料の核酸増幅反応を行う方法であって、下記
    工程： a.イオン性界面活性剤、約６ないし20％の間の最終濃度
    の非イオン性界面活性剤、標的核酸配列に十分に相補的
    な核酸配列からなる少なくとも１の核酸プライマー、ヌ
    クレオシド三リン酸、および必要なコファクターまたは
    塩類に生物学的試料を接触させ、そのことにより第１の
    液体を得て； b.核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１の酵素を
    該第１の液体に加えて第２の液体を得て； c.少なくとも１の標的核酸配列の増幅を引き起こすに十
    分な条件下で該第２の液体をインキュベーションし；次
    いで、 d.増幅された核酸配列を検出する からなる方法。
  11. 【請求項１１】イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル
    硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項10
    の方法。
  12. 【請求項１２】イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リ
    チウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選
    択される請求項10の方法。
  13. 【請求項１３】イオン性界面活性剤の最終濃度が約0.1
    〜0.7％の間である請求項11または12の方法。
  14. 【請求項１４】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノ−アルキレート誘導体から
    なる群より選択される成分からなる請求項10の方法。
  15. 【請求項１５】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノパルミテート、およびポリ
    オキシエチレン（20）ソルビタンモノステアレートから
    なる群より選択される成分からなる請求項10の方法。
  16. 【請求項１６】標的核酸配列が、リボゾームRNAまたは
    リボゾームDNAに対して特異的な少なくとも１の配列か
    らなる請求項10の方法。
  17. 【請求項１７】リボゾームRNA配列が、クラミジア・ト
    ラコマティス（Chlamydia trachomatis）、ウレアプラ
    ズマ・ウレアファシエンス（Ureaplasma ureafaciens）
    からなる群より選択される微生物、およびヒト・乳頭腫
    ウイルスに感染したヒト・細胞に特異的である請求項16
    の方法。
  18. 【請求項１８】第１の液体がさらに金属キレート剤から
    なる請求項10の方法。
  19. 【請求項１９】さらに下記工程： a.RNAse阻害剤を第１の液体に添加し、次いで、 b.所望により、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくと
    も１の酵素の添加前にRNAse阻害剤を不活性化させる からなる請求項10、16または17の方法。
  20. 【請求項２０】RNAse阻害剤がプロテアーゼからなる請
    求項19の方法。
  21. 【請求項２１】RNAse阻害剤がプロテイナーゼＫからな
    る請求項19の方法。
  22. 【請求項２２】RNAse阻害剤を不活性化させる工程が、
    約90ないし100℃で１ないし５分間加熱することからな
    る請求項19の方法。
  23. 【請求項２３】生物学的試料中の標的核酸配列を増幅す
    るためのキットであって、 a.核酸ポリメラーゼ活性を阻害するに十分な量のイオン
    性界面活性剤を含有する第１の試薬、 b.該核酸ポリメラーゼ活性を阻害する該イオン性界面活
    性剤の能力を抑制する約６ないし20％の間の非イオン性
    界面活性剤最終濃度を有する溶液を生成する量の非イオ
    ン性界面活性剤を含有する第２の試薬、 c.標的核酸配列に対して十分に相補的な少なくとも１の
    核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、コファクター
    および塩類を含有する増幅試薬、 d.該核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１の酵
    素、および e.増幅された標的核酸配列を検出するための手段 からなるキット。
  24. 【請求項２４】イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸塩
    からなる群より選択される成分からなる請求項23のキッ
    ト。
  25. 【請求項２５】イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リ
    チウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選
    択される請求項23のキット。
  26. 【請求項２６】イオン性界面活性剤の最終濃度が約0.1
    〜0.7％の間である請求項24または25のキット。
  27. 【請求項２７】第１の試薬がさらに金属キレート剤から
    なる請求項23、24、25または26のキット。
  28. 【請求項２８】イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチ
    レン（20）ソルビタンモノパルミテート、およびポリオ
    キシエチレン（20）ソルビタンモノステアレートからな
    る群より選択される成分からなる請求項23のキット。
  29. 【請求項２９】さらに、不均一界面活性剤ミセルの形成
    後に反応混合物に添加されるRNAse阻害剤からなる請求
    項23のキット。
  30. 【請求項３０】RNAse阻害剤がプロテアーゼである請求
    項29のキット。
  31. 【請求項３１】RNAse阻害剤がプロテイナーゼＫである
    請求項の30のキット。
  32. 【請求項３２】標的核酸配列が、リボゾームRNAに対し
    て特異的な少なくとも１の配列からなる請求項23のキッ
    ト。
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