JPH09510099A

JPH09510099A - イオン性界面活性剤による、酵素により媒介される反応に対する阻害の抑制方法

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Publication number: JPH09510099A
Application number: JP7523607A
Authority: JP
Inventors: カシアン，ダニエル・ルイス; マカリスター，ダイアン・リサ
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1994-03-10
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 1997-10-14
Anticipated expiration: 2015-07-10
Also published as: EP0671473B1; CA2184270A1; US5846701A; CA2184270C; WO1995024499A1; DE69522978D1; US5871975A; KR970701787A; KR100238833B1; ATE206465T1; AU2097895A; EP0671473A1; AU699232B2; DK0671473T3; DE69522978T2; JP3062250B2; ES2162875T3; US5766890A

Abstract

(57)【要約】阻害性イオン性界面活性剤の存在による反応溶液中の酵素阻害を抑制するための非イオン性界面活性剤の使用方法およびキット。反応の前に、反応混合物に有効量の非イオン性界面活性剤を添加し、撹拌する。次いで、酵素を添加し、次いで、酵素反応を進行させる。本発明の好ましい具体例、およびイオン性界面活性剤の存在下での生物学的試料の核酸の増幅のためのキットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】イオン性界面活性剤による、酵素により媒介される反応に対する阻害の抑制方法発明の技術分野本発明は、診断および臨床試料中に可溶化および蛋白変性剤としてしばしば存在するイオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で酵素反応を行うことに関するものである。それゆえ、本発明は、所望反応を開始する前に分析物または酵素基質から界面活性剤を分離するための時間と労力を要する手順の必要性をなくす。さらに本発明は、界面活性剤除去工程を必要とせずにＬＬＳのごときアニオン性界面活性剤の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき酵素により媒介される核酸増幅反応または制限酵素消化を行う方法に関する。発明の背景本発明は、インビトロで行われる酵素により媒介される化学反応、および界面活性剤存在下で該反応の阻害を防止する方法に関する。界面活性剤は、主として、水溶液のみに不溶性または不完全に溶解する種々の蛋白、細胞壁および膜成分、並びに他の細胞オルガネラ、下位構造および成分を可溶化させる能力により、医学および生物学の研究室においてありふれた道具となっている。よって、界面活性剤は、しばしば、抽出液または溶解バッファーの成分であり、溶解剤および所望でない酵素活性、例えば、粗細胞溶解物中に通常存在するプロテアーゼおよびヌクレアーゼにより関与される反応の効果的な阻害剤の両方として用いられる。さらに、かかる界面活性剤は、しばしば、核酸の精製において同じ目的に使用される。応用分子化学および生化学において道具として使用される大部分の酵素は界面活性剤、特に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）のごとき強イオン性界面活性剤に対して非常に感受性がある。かかるイオン性界面活性剤は蛋白に強力に結合でき、しばしば蛋白の不可逆的変性を引き起こす（アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー，マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・ジェネラル・バクテリオロジー（American Soc iety for Microbiology,Manual of Methods for General Bacteriology）５７〜７８頁（１９８１年）参照）。しかしながら、正確にはこのようなわけで、ＬＬＳのごときイオン性界面活性剤は、しばしば、非常に貴重で安価な溶液中の核酸の短期間〜中期間用保存料である。よって、かかる剤は、微生物を用いる核酸ハイブリダイゼーションアッセイの第１段階；微生物細胞または粒子からの核酸の抽出を行うことにおける有用な助けとなっている。イオン性界面活性剤は細胞壁および細胞膜を可溶化し、同時にヌクレアーゼによる核酸の分解を防止することを助ける（上記文献参照）。そのうえ、ＳＤＳまたはＬＬＳのごとき強イオン性界面活性剤は、しばしば、溶解、透過の際に添加され、あるいは分析のために臨床標本が研究室に運搬される場合の輸送媒体に添加される。しばしば、生物学的試料から得られた核酸は、その後、制限エンドヌクレアーゼまたはＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的なエキソヌクレアーゼでの消化のごとき酵素的処理に供される。さらに、かかる試料から得られた核酸は、しばしば、核酸ハイブリダイゼーション法により直接的に検出および／または定量されるに十分な量で存在しない。よって、通常には、かかる試料中の目的核酸配列を酵素的に増幅して検出しなければならない。１ラウンドまたはそれ以上のラウンドの核酸増幅または別の酵素により媒介される反応に供される生物学的または臨床試料において、酵素を反応混合物に添加する前に界面活性剤を溶液中の核酸から分離しなければならない。通常は溶液からうまく低分子を除去する透析または限界濾過は、界面活性剤分子の凝集により形成されるミセルのサイズ並びにより大型の溶質への界面活性剤のイオン結合もしくは疎水結合により、大部分の界面活性剤を効果的に除去しないであろう。そのうえ、透析も限界濾過も、市販診断キットにおける使用に容易には適合しない。分析のために生物学的試料を研究室に運搬するのに用いられるのと同じ試験管または収集容器中、すなわち、ＳＤＳまたはＬＬＳ中での核酸増幅または制限的消化のごとき酵素により媒介される反応を行うことは便利で経費的にも効果的であろう。これとは別に、さらなる界面活性剤除去工程に試料を供するよりはむしろ、即時に反応を開始できる材料を用いた反応を行うことが望ましいであろう。ＳＤＳをアセトンのごとき溶媒とともに沈殿させることができるが、アセトンはいくつかの酵素を変性または沈殿させる可能性がある。そのうえ、痕跡量のアセトンまたは他の沈殿剤により、所望反応が阻害されるかもしれない。現在、一般的には粗試料中の核酸は、増幅を行う前に、フェノール／クロロホルム抽出、次いで、エタノール沈殿により精製される。本発明方法は、イオン性および非イオン性界面活性剤双方を利用してかかる工程の必要性をなくし、それにより、通常は反応を阻害する一定量の界面活性剤を試料が含有している場合でさえも生物学的試料中の核酸を用いて酵素により媒介される反応を行うことを可能にする。好ましくは、本発明は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）のごときアニオン性界面活性剤の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または転写に基づく増幅系のごとき核酸増幅反応を行う方法である。しかしながら、本発明は、制限的消化、エンド−ならびにエキソヌクレアーゼ消化、およびキナーゼならびにトランスフェラーゼ反応に対するイオン性界面活性剤による阻害をも同様に防止できるはずである。また、出願人は、本願が核酸を用いる酵素反応に限定されると考えていない。よって、本明細書中の本発明の具体例は増幅反応における本発明の利用を説明するのであるが、かかる具体例は例示のためだけであり、本発明の範囲は本明細書末尾の請求の範囲によってのみ定義される。理論により拘束されることを望まないが、出願人は、非イオン性およびイオン性界面活性剤分子の不均一ミセルからなるミセルコロイド状凝集物の生成により、イオン性界面活性剤分子が溶液から効果的に除去され、かくして、それらは次いで添加される酵素に結合することあるいは変性させることには用いられないと考える。いくつかの酵素の活性を促進または保持する界面活性剤の能力が報告されている（サイトー・エム（Saito,M.）ら、アクション・オブ・アルスロバクター・ウレアファシエンス・シアリダーゼ・オン・シアログリコリピッド・サブストレイツ（Action of Arthrobacter ureafaciens Sialidase on Sialoglycolipid Subs trates）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５４巻、７８４５〜７８５４頁（１９７９年））。界面活性剤により阻害された蛋白の再活性化のための方法としてのイオン性および非イオン性界面活性剤の不均一ミセルの使用も報告されている（エイ・ピー・エル（Ey,P.L.）およびファーバー・イー（Ferber,E.）、カーフ・シマス・アルカライン・ホスファターゼ II.インターラクション・ウィズ・ディタージェンツ（Calf Thymus Alkali ne Phosphatase II．Interaction with Detergents）、ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第４８０巻、１６３〜１７７頁（１９７７年）；バージ，アール・ケイ（Berge,R.K.）ら、バリエイションズ・イン・ザ・アクティビティー・オブ・ミクロソーマル・パルミトイル−ＣｏＡ・ヒドロラーゼ・イン・ミックスト・ミセル・ソリューションズ・オブ・パルミトイル−ＣｏＡ・アンド・ノン−イオニック・ディタージェンツ・オブ・ザ・トリトンＸシリーズ（Variations in the Activity of Microsomal Palmitoyl-CoA Hrdrola se in Mixed Micelle Solutions of Palmitoyl-CoA and Non-Ionic Detergents of the Triton X Series）、ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ第６６６巻、２５〜３５頁（１９８１年）；タンドン，エス（Tandon,S.）およびホロビッツ，ピー・エム（Horowitz,P.M.）、ディタージェント−アシステッド・リフォールディング・オブ・グアニジニウム・クロライド−デナチュアド・ロダナーゼ（De tergent-assisted Refolding of Guanidinium Chloride-denatured Rhodanase）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ−第２６２巻、４４８６〜４４９１頁（１９８７年））。さらに、イオン性および非イオン性界面活性剤の不均一ミセルの生成が、可溶化酵素標品からの非イオン性界面活性剤の阻害性濃縮物の除去方法として報告されている（ストラルフォース，ピー（Stralfors,P.）ら、リムーバル・オブ・ノンイオニック・ディタージェント・フロム・プロテインズ・フラクショネイテッド・バイ・エレクトロフォーカシング（Removal of Nonionic Detergent from Proteins Fractionated by Electrof ocusing）、ビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ第５３３巻、９０〜９７頁（１９７８年））。上記刊行物に述べられたすべての方法は、界面活性剤溶液中での酵素の活性化または再活性化に関する。これらの方法は、活性酵素の添加前の酵素基質含有溶液中の不均一ミセルの生成を教示または示唆するものではない。さらに、これらすべての場合において、酵素の可溶化、精製、または活性化を行うために界面活性剤が用いられた。酵素自体というよりもむしろ酵素基質を可溶化し、安定化するために先ず界面活性剤が添加される場合はない。定義本願において、特記しない限り、以下の用語は下記の意味を有する。「実質的な阻害」および「実質的に阻害する」は、酵素活性についての信頼でき、高感度な、しかも再現性のあるアッセイに関して得られる酵素活性よりも酵素活性が減少していることを意味する。「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」は、特定の核酸配列、またはそれに相補的な核酸配列を意味する。「不均一ミセル」は、液体媒体中のイオン性および非イオン性界面活性剤のモノマーからなる疎水性凝集物を意味する。「混合ミセル」は、この開示において定義される「不均一ミセル」を意味する。「相補的」は、分別核酸ハイブリダイゼーションに適した条件下で１の核酸鎖のある領域と、もう１本の核酸鎖の領域との核酸塩基間に安定な水素結合が形成される核酸配列を有することを意味する。すなわち、最も通常には、水素結合は、一方の鎖上のアデノシン（Ａ）残基ともう一方の鎖上のチミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）残基との間、および一方の鎖上のグアニン（Ｇ）残基ともう一方の鎖上のシトシン（Ｃ）残基との間に形成される。一般的には、かかる相補的領域は、各核酸鎖の１２個ないし１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含んでいる。「十分に相補的」は、非相補的核酸を標的核酸にハイブリダイゼーションさせないでおくのに適した条件下で標的核酸と２本鎖水素結合領域を形成しうることを意味する。特定の連続対応領域にわたり１００％の相補性を有する場合には２本の核酸鎖が十分に相補的であるが、１００％未満の相補性の領域を有する２本の１本鎖核酸が選択的ハイブリダイゼーション条件下で２本鎖領域を形成できることが当業者に知られている。ゆえに、１００％の相補性はないがこれらのハイブリダイゼーション条件下で安定な２本鎖領域を形成することのできるかかる領域を、十分に相補的であると見なす。「類似」は、１の１本鎖核酸領域が、比較される第２の１本鎖核酸の領域と同じであるかまたは同様であることを意味する。例えば、この語は、該領域において第２の核酸中に存在するチミジンのかわりに第１の核酸がウラシルを含んでいる核酸、および機能的に同様もしくは同一の生物学的剤またはその一部分をコードあるいは含有する核酸領域を包含する。「十分に類似」は、第１の１本鎖核酸と比較すると、第２の１本鎖核酸が核酸ハイブリダイゼーション条件下で第３の核酸と安定な水素結合２本鎖領域を形成することを可能にする核酸配列を有することを意味する。ここに、第３の核酸は第１の核酸に対して十分に相補的であるとする。「ＲＮＡｓｅ阻害剤」は、ＲＮＡｓｅ活性を有する酵素によるＲＮＡの分解を妨げることのできるすべての剤を意味する。該用語は、プロテアーゼのごとき酵素、架橋試薬、抗体、およびＲＮＡｓｅ分子の活性部位をブロックする化合物を包含するが、これらに限定しない。「核酸」は、少なくとも２個、好ましくは１０個またはそれ以上のヌクレオチドの長さのポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドを意味する。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、オリヌクレオチド、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包含する。「核酸」は、１本鎖または２本鎖いずれかのポリヌクレオチド、あるいはその両方をいうことができる。「標的核酸」は、標的核酸配列からなる核酸を意味する。「生物学的試料」または「試験試料」は、いずれかの時点で核酸を含む生きた生物から得られた物質を含有するすべての標本または試料を意味する。かかる試料は、食品または農業試料；環境試料；尿、血液、乳、脊髄液、痰、唾液、大便、肺からの吸引物、涙、リンパ液もしくは精液のような体液、分泌物もしくは排泄物含有試料；咽頭もしくは性器の綿棒かきとり物；および細菌、ウイルス、植物もしくは動物細胞培養物、懸濁液または溶解物を包含するが、これらに限定しない。「増幅」または「標的の増幅」は、標的核酸配列を有する標的核酸分子の数を増加させることを意味する。核酸検出方法は当該分野においてよく知られており、一般的には、プローブが標的核酸の配列に十分に相補的な配列を有し、その存在を知る必要がある標的核酸が特別な配列を有する場合に、ハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも１種の標識１本鎖核酸プローブを１本鎖標的核酸と接触させることからなる。かかる方法は、マニアティス，ティー（Maniatis,T.）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Man ual）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８２年）に記載されている。２本鎖ハイブリッド分子の検出は使用標識の性質に左右される。一般的には、プローブは、³²Ｐ、³Ｈ、または¹ ⁴ Ｃのごとき放射活性同位体を含んでいるか、あるいは蛍光部分、ハプテン、または別の非放射活性リポーター基に結合している。例えば、マニアティス、上記、およびアーノルド（Arnold）ら、ＰＣＴＵＳ８８／０２７４６参照（両方とも、参照により本開示の一部とみなす）。多くの酵素により媒介される増幅系を用いて標的核酸のコピー数を増加させることにより、診断での核酸ハイブリダイゼーションの感度および信頼性を改善することができる。一般的には、かかる方法は標的核酸を少なくとも１種の核酸ポリメラーゼの鋳型として用い、繰り返しサイクルにおいてポリメラーゼを２種またはそれ以上の核酸プライマーと協奏的に使用して標的核酸を指数的に増加させてもよい。当業者によく知られた増幅系の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ムリス（Mullis）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第１５５巻、３３５〜３５０頁（１９８７年））、および複数の１本鎖ＲＮＡ転写物を作るための鋳型としての２本鎖ＰＣＲ生成物の使用（ムラカワ（Murakawa）ら、ＤＮＡ第７巻、２８７〜２９５頁（１９８８年））を包含する。他の増幅系は、標的核酸を増幅するためのＲＮＡ鋳型および転写に基づく別のラウンドのＤＮＡ合成を包含する。バーグ（Burg）ら、ＷＯ８９／１０５０；ギンゲラス（Gingeras）ら、ＷＯ８８／１０３１５；カシアン（Kacian）およびフルツ（Fultz）、ＥＰＯ出願第８９３１３号参照（いずれも参照により本開示の一部とみなす）。上記リストは種々の増幅方法の全部のリストではなく、核酸増幅系での使用に適した他の核酸ポリメラーゼが当業者に知られている。増幅後、得られた増幅核酸を上記検出系を用いて同定することができる。よって、第１の態様において、本発明方法は、イオン性界面活性剤に変性を起こさせない、あるいは核酸増幅反応系に使用する酵素の活性を実質的に阻害させない方法に関し、該核酸増幅系は、１）標的核酸、２）１種またはそれ以上の核酸プライマー（それぞれが共通の標的核酸に対して十分に相補的であり、適当な選択的ハイブリダイゼーション条件下で標的と２本鎖水素結合領域を形成する）、３）必要なヌクレオシドトリホスフェート、塩、ならびに増幅を行うために必要な他の成分、および４）一定量のイオン性界面活性剤からなる。本発明方法は、透析またはクロマトグラフィーのごとき界面活性剤除去工程を必要としない。該方法は、非イオン性界面活性剤の試料への添加およびイオン性ならびに非イオン性界面活性剤分子の混合ミセルを形成させるための試料の撹拌を包含する。不均一ミセルの形成後、核酸ポリメラーゼおよび増幅を行うために必要な他の酵素を試料に添加し、通常どおり核酸増幅反応を行うことができる。本発明の第２の態様において、微生物または核酸を含有する生物学的試料を溶解もしくは抽出バッファーと接触させ、引き続き行う増幅および核酸検出アッセイにおける使用のために、ＬＬＳまたはＳＤＳのごときイオン性界面活性剤を含有するバッファー中に遊離した核酸を貯蔵する。増幅工程に先立って、抽出した核酸混合物に一定量の非イオン性界面活性剤を添加するが、この添加は、有効量のリボ−もしくはデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、一般的には２種またはそれ以上の核酸プライマー、および酵素反応に必要ないずれかのコファクターもしくは金属イオンの添加と同時または前のいずれかに行う。次いで、溶液を激しく撹拌し、その後、核酸ポリメラーゼを混合物に添加する。使用増幅方法、例えば、サーモサイクリングまたはイソサーマル増幅プロトコールに適するように反応混合物をインキュベーションする。例えば、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー、ダイアグノスティック・モレキュラー・マイクロバイオロジー：プリンシプルズ・アンド・アプリケイションズ（American S ociety for Microbiology,Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications）、５６〜７０頁（１９９３年）参照（参照により本明細書に記載されているものと見なす）。次いで、増幅標的核酸を上記ハイブリダイゼーション法により検出する。もう１つの態様において、本発明方法を用いて、工業、医療、研究室および商業的処方に通常使用する他の酵素に対する阻害を防止してもよい。例えば、本発明方法を用いて、溶液から最初にアニオン性界面活性剤を除去する必要なく、アニオン性界面活性剤含有試料中の核酸の制限酵素消化に対する阻害を防止してもよい。上記開示は本発明および溶液に対するその一般的手段により解決される課題を説明するが、上記開示は本発明またはその適用を何ら限定せず、本開示の後に続く請求の範囲によってのみ定義されるということが理解されよう。発明の概要本発明は、通常は酵素活性を阻害するに十分な濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）のごときイオン性界面活性剤を含有する溶液中で酵素反応を行う方法に関する。１の具体例において、本発明は、核酸標的増幅反応における少なくとも１種の酵素の阻害を防止する方法に関する。該方法は、アニオン性界面活性剤（好ましくは、ＳＤＳまたはＬＬＳ）および分析すべき核酸を含有する溶液に、一般的には２種またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプライマー（１のプライマーは標的核酸配列に十分に相補的な配列を有し、他のプライマーは標的核酸配列に十分に類似の配列を有する）；４種の異なるヌクレオチド；ＭｇＣｌ₂またはＮａＣｌのごとき必要な塩およびコファクター；および一定量、好ましくは、８〜２０％（ｖ／ｖ）の非イオン性界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノアルキレート（ツインシリーズの界面活性剤）またはポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール誘導体（トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−１０２）を添加することに関する。これらの構成成分を混合し、核酸ポリメラーゼ、好ましくは細菌サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）のごとき耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に添加し、混合物を核酸増幅工程、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する。もう１つの好ましい具体例において、２種の酵素：ＭＭＬＶＲＴのごときＲＮＡｓｅＨ活性を有する逆転写酵素、およびＴ７ポリメラーゼのごときＲＮＡポリメラーゼを増幅反応に用いる。もう１つの好ましい具体例において、本発明方法を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下での制限酵素に対する阻害を防止する。プラスミドｐＵＣ１９（メリーランド洲ゲイサースバーグ（Gaithersburg）のベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories））を、単一ＥｃｏＲ１部位において制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１で消化した。直鎖状にした後、該プラスミドＤＮＡを、イー・コリ（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて［α］−³²ＰｄＡＴＰで放射性標識した。放射性標識プローブを沈殿させ、異なる量のＳＤＳおよびツイン２０を含有する溶液中に再懸濁した。次いで、ＤＮＡに過剰の制限エンドヌクレアーゼＰｖｕIIを作用させ、３７℃で１時間インキュベーションした。得られた試料を非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲルで分析した。おそらく酵素阻害性イオン性界面活性剤を溶液から除去することにより、疎水性相互作用が酵素反応の脱阻害において重要な役割を果たすであろうが、ミセル生成のみが本明細書記載の方法における特別な非イオン性界面活性剤の適性に関する唯一の決定因子であるとはいえない。よって、出願人により混合ミセルの生成は本発明の実施において重要であると考えられるが、出願人は、イオン性界面活性剤の存在下において酵素活性を保持する正確な機構についてははっきりわからないままである。通常は阻害量または変性量のＬＬＳまたはＳＤＳのごときイオン性界面活性剤の存在下で標的増幅反応を行う方法を提供することが本発明の１の目的である。核酸およびＬＬＳまたはＳＤＳのごときイオン性界面活性剤を含有する生物学的または臨床的試料の訂正および／または定量分析を行う方法を提供することも本発明の目的であって、かかる分析は、特定の核酸配列の増幅または制限的消化のごとき少なくとも１の酵素により媒介される反応を用いるものである方法であり、反応を行う前にイオン性界面活性剤から核酸分析対象を分離する必要はない。試験試料における核酸増幅反応の阻害を防止する方法を提供することが本発明のもう１つの目的であって、該試料は、１）特定の配列の存在または不存在について試験される核酸；および２）約０.１〜１.５％のイオン性界面活性剤、好ましくは約０.３〜０.７％ＳＤＳまたはＬＬＳを含み、核酸増幅反応に用いる酵素または酵素（複数）は、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはレトロウイルスのＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼである。該方法は、非イオン性界面活性剤、好ましくは約８〜２０％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイン−２０）またはポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔ−オクチルフェノール（トリトンＸ−１００）を核酸およびイオン性界面活性剤に添加し、溶液を激しく撹拌して不均一界面活性剤ミセルを生成させ、有効量の核酸ポリメラーゼ、好ましくは約２〜８ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、次いで、反応混合物をＰＣＲのごとき核酸増幅手順に供する工程からなる。核酸または核酸を含む微生物を含有する生物学的試料の適性分析または定量分析、あるいはその両方するためのキットを提供することが本発明のさらなる目的である。試料が微生物を含有している場合、かかるキットは、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ活性を阻害し細胞壁および膜の溶解を促進するために、約０.１％〜１.５％のイオン性界面活性剤、好ましくはＳＤＳまたはＬＬＳを含む溶解、透過、または試料輸送用試薬を提供すべきである。かかる試薬中において、遊離した核酸は、イオン性界面活性剤によってヌクレアーゼ分解から保護される。該キットは第２の試薬を提供すべきであり、該第２の試薬は、１）一般的には、標的核酸配列の配列に十分に相補的な核酸配列を有し、ハイブリダイゼーション条件下でかかる標的配列を有する送付的核酸鎖の一方または両方と水素結合領域を形成する２種またはそれ以上の核酸プライマー；２）０.５〜１０ｍＭＭｇＣｌ₂またはＭｎＣｌ₂；３）有効量のジスルフィド開裂剤、好ましくは０.５〜１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）；および４）８〜２０％（ｖ／ｖ）の非イオン性界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイン−２０）またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイン−８０）を含有している。溶解、透過または輸送用媒体中の遊離核酸を含有する試料溶液の一部を第２の溶液に添加し、激しく撹拌する。次いで、約２〜８ユニットの少なくとも１種の核酸ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に添加し、ポリメラーゼ連鎖反応の通常の手順により混合物をを処理する。この後、核酸ハイブリダイゼーション法および標識核酸プローブを用いて少なくとも１つの特定の核酸配列の存在または不存在について試料を試験する。イオン性界面活性剤、好ましくは０.３ないし０.７％ＬＬＳの存在下での核酸の増幅方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。この方法において、出発溶液の最終組成は以下のものを含有する：１）約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１７.５ｍＭＭｇＣｌ₂、２５ｍＭＫＣｌおよび２ｍＭスペルミジン、２）それぞれ約２５ｍＭの４種の異なるリボヌクレオチドトリホスフェート（Ａ、ＵＮＧおよびＣ）および４種の異なるデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）、３）約１ｍＭのＤＴＴ、４）約２０ピコモルの一般的には２種またはそれ以上の１本鎖核酸プライマーであって、標的核酸配列の配列に十分に相補的な核酸配列を有し、ハイブリダイゼーション条件下で、かかる標的核酸配列を有するポジティブまたはネガティブセンス核酸鎖のいずれかあるいはその両方と２本鎖水素結合領域を形成するプライマー、５）少なくとも１コピーの特定の標的核酸配列約を有する６ｘ１０^-3ないし６ｘ１０^-9ピコモルの核酸。好ましい具体例の詳細な説明請求の範囲の方法およびキットは、イオン性界面活性剤の存在下での標的増幅反応を行うための一連の工程、ならびにかかる工程を行うための試薬の組み合わせに関する。１の好ましい具体例において、本発明は、分析すべき試料がイオン性界面活性剤を含有している場合に核酸増幅反応を行うための方法および手段を提供する。該方法は、一定量の非イオン性界面活性剤を試料溶液に添加し、酵素または酵素（複数）を添加して増幅反応を開始する前にイオン性および非イオン性界面活性剤を一緒にして激しく混合することを包含する。出願人はその具体例のいくつかにおいて精製核酸を用いたが、標的核酸を含んでいるがまたは含む可能性がある限り、精製または未精製のいずれの核酸源であっても使用可能である。この配列はＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在してもよく、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。前の増幅反応から得られる核酸によっては、これらの核酸の混合物を用いてもよい。それゆえ、本発明は、一般的には、分析すべき核酸を含む試料における界面活性剤の阻害効果を克服する有用な方法である。材料非イオン性界面活性剤ツイン−２０、ツイン−４０、ツイン−８０、トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−１０２を、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社から購入した。標準的ホスホラミダイト化学を用いて核酸プライマーを合成した。種々のかかる方法は当該分野において知られており、例えば、カルサーズ（Carruthers）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー第１５４巻、２８７頁（１９８７年）；バット（Bhatt）ら、Ｕ.Ｓ.第０７／３１９，５７０号（１９８９年６月３日出願）、およびクレム（Klem）ら、ＰＣＴＷＯ９２／０７８６４参照（参照によりこれらを本開示の一部とみなす）。出願人は３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置（カリフォルニア州フォスター・シティー（Foster City）のアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems,Inc.）社製）を用いてプローブを調製する。検出方法標的配列にハイブリダイゼーションする検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識核酸プローブを用いて増幅生成物を定量した。詳細には、増幅した試料を特定のハイブリダイゼーション条件下で標識プローブと接触させ、ハイブリダイゼーションしないプローブに結合したアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、次いで、残存しているアクリジニウムエステルの化学発光をルミノメーターで測定することにより２本鎖ハイブリッド分子を検出する。例えば、アーノルド（Arnold）ら、ＰＣＴＵＳ８８／０２７４６およびネルソン（Nelson）ら、ノンアイソトーピック・ＤＮＡ・プローブ・テクニックス（Nonisotopic DN A Probe Techniques）２７５頁（アカデミック・プレス（Academic Press）、サン・ディエゴ（San Diego）、１９９２年）参照（参照によりこれらを本明細書に記載されているものとみなす）。下記実施例は、必ずしも、本発明の利用の最適条件を示すものではなく、それらは説明だけのものであって、本発明の目下好ましい具体例を示すものである。これらの実施例は、請求の範囲の方法の可能な具体例の範囲について限定するものでなく、かかる具体例は、本開示を参照すれば当業者に即座に明らかなものとなる。実施例１この実施例は、転写に基づく増幅系（カシアン（Kacian）およびフルツ（Fult z）、上記文献参照）における本発明方法の使用の有効性を示すものである。この実施例用の標的核酸は、３０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.７）、１.０ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、１ｍＭＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、および１１０ｍＭ（３.０％ｗ／ｖ）ＬＬＳを含有するバッファー中の、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma ure alyticum）から精製された全リボゾームＲＮＡの溶液であった。脱イオン水中の２５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１０２の溶液を調製した。反応体積は１００μｌであり、微量遠心チューブ内で反応を行った。各チューブに、５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１７５ｍＭＭｇＣｌ₂、１５０ｍＭＫＣｌおよび２０ｍＭスペルミジンを含有するバッファー１０μｌ、および１ＭＤＴＴ０.５μｌ、２５ｍＭｒＣＴＰならびにｒＵＴＰおよび６５ｍＭｒＡＴＰならびにｒＧＴＰ含有するリボヌクレオチド溶液１０μｌ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰならびにｄＧＴＰ各１００ｍＭを含有する溶液２μ ｌ、３０ｐＭの第１プライマー（８１（−）；配列番号：１）溶液８.６μｌ、３０ｐＭの第２プライマー（ｕｕｒＣ１（＋）；配列番号：２）溶液３.４ μｌ、上記のごとく調製した標的ｒＲＮＡの未希釈、１：１０希釈、もしくは１：１００希釈物１０μｌ、種々の量の２５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１０２溶液、および水を添加して体積９３.６μｌとした。これらのプライマーの配列は下記のごとし：ボルテックスミキサーを用いて各反応チューブを激しく混合し、次いで、試料を９５℃で２分間加熱し、室温まで冷却した。モロニー・ミュリン白血病ウイルスのＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＭＬＶ逆転写酵素、３００ユニット）および４００ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを全体積６.４４μｌとして各試験管に別々に添加した。次いで、試料を３７℃で４時間インキュベーションした。チューブを４℃まで冷却し、検出工程に移行した。上記ＨＰＡ化学発光法（参照により本開示の一部と見なす）により増幅標的配列の定量を行った。アーノルド（Arnold）ら、上記文献参照。標的配列に特異的な２種の標識プローブのうちの１つをハイブリダイゼーションアッセイに用いた。それらの配列は以下のごとし：実施例２この実施例は、ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔ−オクチルフェノール誘導体（トリトンＸ−１０２）が本発明方法において非極性界面活性剤として作用する能力を示す。ＬＬＳ濃度は０.３％（ｗ／ｖ）であった。トリトンＸ−１０２濃度は９％、１０％、および１１％（ｖ／ｖ）であった。各条件につき２系の実験を行い、各実験につき２系のＨＰＡ検出を行った。得られた値を平均した。増幅量は検出標識量に比例する。この量はＲＬＵまたは相対的光単位で示される。かっこ内の値は対照実験であった。増幅実験の結果を下表１に示す。実施例３下記実験は、本発明方法による核酸増幅の感度を示す。本実施例を実施例１と同様にして行ったが以下の点は例外である。ツイン−２０をトリトンＸ−１０２の代わりに用い、添加標的ＲＮＡ量は、６ｘ１０^-3、６ｘ１０^-5、６ｘ１０^-7および６ｘ１０^-9ピコモルとした。ツイン−２０最終濃度は１３、１５および２０％（ｖ／ｖ）であった。結果を表２に示す。実施例４この実施例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる核酸増幅とともに使用する本発明方法の有効性を示す。この実施例に関しては、標的核酸は、ヒト・乳頭腫ウイルスのＥ６遺伝子を含むプラスミドから得た既知ＤＮＡ配列を有する制限フラグメントであった。２種のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：４および配列番号：５）は、２本鎖標的核酸の対向鎖に相補的であるように設計された。これらのプライマーの配列は下記のごとし：各試料の最終反応体積は１００μｌであった。この実験において、各チューブに２滴の鉱油を添加し、次いで、前以て計算された量の水を添加した。次いで、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１０ｍＭＥＤＴＡ中の標的ＤＮＡ１マイクロリットル（標的配列１ｘ１０⁴コピー）を添加した。３０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６.７）、１.０ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム、１ｍＭＥＧＴＡ、および１１０ｍＭ（３.０％ｗ／ｖ）ＬＬＳを含有するバッファーをいくつかのチューブに添加して最終ＬＬＳ濃度を０.３％とした。異なる体積の５０％（ｖ／ｖ）ツイン−２０溶液もいくつかのチューブに添加して反応濃度を１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、または２４％とした。界面活性剤添加後、試料をボルテックスミキサーで混合した。各チューブにつき、ＰＣＲプライマープレミックスを別々に作成した。該プレミックスは、１０ＸＰＣＲバッファー１０μｌ、各デオキシリボヌクレオチド２０ナノモル、各核酸プライマー１００ピコモルおよび２.５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有していた。試料チューブを氷上に置き、ＰＣＲプレミックスを各試料に添加し、混合した。各試料を９４℃で３分間加熱し、次いで、下記サーモサイクルを３５回行った：５１℃で３０秒のインキュベーション、次いで、７２℃で２分間のインキュベーション、最後に９４℃で１分間。最終の９４℃のインキュベーション後、試料を７２℃で５分間インキュベーションし、次いで、検出のために４℃で一晩４℃で貯蔵した。標的核酸配列の相補的なプローブを用いて、実施例１と同様にして検出を行った。プローブの配列を以下に示す：結果を表３に示す。実施例５この実験は、異なる濃度のＬＬＳおよびツイン２０の場合の、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより媒介されるＰＣＲに対する阻害を防止するツイン−２０の有効性を示す。ＬＬＳ濃度を０％、０.３％、０.５％、および０.７％（ｗ／ｖ）としたこと以外は実験を実施例３と同様に行った。。ツイン−２０濃度はさまざまで、０％、１０％、１４％、１８％、および２０％（ｖ／ｖ）であった。結果を表４に示す。実施例６ツイン−２０に代えてツイン−４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）を用いたこと以外は実施例４と同様にしてこの実験を行った。結果を表５に示す。実施例７ツイン−２０に代えてツイン−８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を用いたこと以外は実施例４と同様にしてこの実験を行った。試験しなかった実験については「ＮＤ」で示す。結果を表６に示す。実施例８この実験は、核酸または核酸を含む微生物を含有する可能性のある生物学的試料に関して用いられる本発明の有効性を示す。試料は、３０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、１.０ｍＭＥＤＴＡ２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、１ｍＭＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、および１１０ｍＭ（３.０％ｗ／ｖ）ＬＬＳを含有するバッファー中の、頸管内綿棒かきとり標本のプールであって、以前の増幅を行わない直接核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてクラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）について陽性であると試験されたものである。試料を、各試料８００μｌにつき４０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（０.１ユニット／μｌ）で処理し、６０℃で２０分間インキュベーションした。４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）、および２ｍＭＥＤＴＡを含有する試料希釈バッファーにツイン−８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を添加した。増幅中の最終ツイン濃度が６.４％、６.８％、７.２％、７.６％、８％、１０％および１２％となるような量のツイン−８０を、このバッファーに添加した。１０マイクロリットルの標本試料を、希釈バッファー中の各濃度の非イオン性界面活性剤４０μｌと一緒にし、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌し、次いで、３〜４日間４℃で貯蔵した。２０％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、それぞれ１６ｍＭのｒＣＴＰ、ｒＡＴＰおよびｒＵＴＰならびに２０ｍＭのｒＧＴＰ、６ｍＭデオキシリボヌクレオチド、１６０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）、９２ｍＭＭｇＣｌ₂、９２ｍＭＫＣｌ、３.０ピコモルの第１プライマー（Ｔ７ＡｐｒｏＣｔｒＢ（−）１５１９；配列番号：７）および２５.０ピコモルの第２プライマー（ＣｔｒＢ（＋）１４８２ｂ；配列番号：８）を含有する２５μｌの増幅バッファーをピペットで各実験用の別個のチューブに入れ、次いで、２００μｌの鉱油を各チューブに重層した。オリゴヌクレオチドプライマーの１つは、クラミジア・トラコマティスのリボゾームＲＮＡの領域に対して類似の核酸配列を有していた。他方のオリゴヌクレオチドプライマーは、クラミジア・トラコマティスのリボゾームＲＮＡの領域に相補的な核酸配列を有していた。これらのプライマーの配列は以下のとおり：各試料および界面活性剤を含有する５０μｌを鉱油層を通してピペットで取り増幅バッファー中に入れた。各試験管をヒーティングブロック中９５℃で５分加熱し、次いで、さらに別のヒーティングブロックに移して４２℃でさらに５分間置き、次いで、酵素を添加した。９００ユニットのモロニーミュリン白血病ウイルスの逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴ）および４００ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する酵素溶液２５マイクロリットルを各チューブに添加し、混合して溶液とした。次いで、各チューブを４２℃で１時間インキュベーションし、次いで、５０ユニットの本質的にＲＮａｓｅ不含であるがエタノール中０.１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有する溶液２０μｌで処理した。試料を４２℃でさらに１０分間インキュベーションし、標的クラミジア・トラコマティスのリボゾームＲＮＡに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＨＰＡ検出を上記のごとく行った。該プローブの配列は以下のごとし：陽性対照をカッコ内に示し、それらは、生物学的試料中に含有されていないが、最終濃度０.３％ＬＬＳ中に含有されている示された量のＲＮＡが増幅手順に供される試料であった。各実験試料は２系作成した。結果を表７に示す。実施例９この実施例は、核酸増幅反応以外の系におけるイオン性界面活性剤による酵素により媒介される反応の阻害を防止する、本発明方法の有効性を説明する。５μ ｌの１０Ｘ高塩濃度バッファー（１０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂および１ｍＭＤＴＴ）を含む反応混合物（最終体積５０μｌ）中で、５マイクログラムのプラスミドｐＵＣ１９（メリーランド洲ゲイサースバーグのベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Resea rch Laboratories））を、単一のＥｃｏＲＩ部位において制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、３００μｌのエタノール、５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、および１μｌのグリコーゲンを含有する溶液とともに試料を沈殿させ、次いで、１６ μｌの水に再溶解した。環状プラスミドの直線化の後、下記のごとくイー・コリ（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてプラスミドを［α］−³²ＰｄＡＴＰで標識した。溶解したＤＮＡに２μｌのハイサルト（High Salt）バッファー、１μｌの［α］−³²ＰｄＡＴＰ、および１μｌのクレノウフラグメント（５ユニット／μｌ）（カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Stratagene ））を添加した。反応混合物を室温で２０分インキュベーションし、次いで、２ μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２００μｌのエタノールを添加することにより沈殿させ、微量遠心でペレット化した。ＤＮＡを１００μｌの水に再溶解した。ＳＤＳおよび放射標識ＤＮＡ含有溶液へのツイン−２０の添加が、制限エンドヌクレアーセＰｖｕIIによる直鎖状ＤＮＡの消化に対する阻害を防止するかどうかを試験するために、下に示すように異なる反応混合物を種々の量の２種の界面活性剤を用いて調製した。各反応系は全体積５０μｌであった。放射標識ＤＮＡを添加する前にＳＤＳおよびツイン−２０を反応混合物に添加した。さらに、５マイクロリットルの１０ＸＲＥＡＣＴバッファー（５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７.４）、６０ｍＭＭｇＣｌ₂、５００ｍＭＮａＣｌ、および５００ｍＭＫＣｌ）を反応混合物に添加した。次いで、１０ユニットのＰｖｕII （１０ユニット／μｌ）を、１μｌ（５０ｎｇ）の放射標識ＤＮＡとともに各チューブに添加した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。５マイクロリットルの各消化混合物を、１０μｌの非変性ゲルローディングバッファーおよび５μｌの水に添加し、各試料の一部を７％ポリアクリルアミドゲル非変性ゲルで分析した。分子量マーカーは、ＨｉｎｆＩ消化した放射標識φＸ１７４ＤＮＡであった。泳動している色素がゲルの最下部に到達するまでゲルでの泳動を行い、そのゲルを用いてＸ線フィルムに４時間または一晩さらした。Ｘ線フィルムを現像し（図１）、結果を分析した。ゲルレーンは左から右へと番号づけした。２本の左端のレーンは分子量マーカーであり、それらのサイズ（塩基数）を一晩露出バンドの横に示し、その横にＰｖｕII未消化であってＥｃｏＲ１で直鎖状にしたｐＵＣ１９ＤＮＡの陰性対照を示す。右端のレーンも分子量マーカーを含む。２６８６ｂｐのｐＵＣ１９プラスミド沖のＥｃｏＲ１部位はマップポジション３９６にある。ｐＵＣ１９中のＰｖｕII部位はマップポジション３０６および６２８にある。よって、ｐＵＣ１９ＤＮＡの完全消化は、長さ９０、２３２および２３６４ｂｐの予想フラグメントを生じるであろう。図１に示す結果は、ＰｖｕII消化が０.０１％（ｖ／ｖ）程度の低濃度のＳＤＳにより阻害されることを示す。しかしながら、酵素添加前の該反応混合物への１０〜２０％ツイン−２０の添加は制限消化の生起を可能にする。上記実施例は目下のところ好ましい本発明の具体例を示す。しかしながら、酵素、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤の他の組み合わせを本発明方法に用いてもよいことが、本開示を参照すれば当業者に容易に理解されるであろう。標準的な酵素アッセイ法と本開示方法を組み合わせて用いて、負担となる実験を行わずに、本発明に使用するために他のかかる組み合わせをスクリーニングすることができる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年４月４日【補正内容】補正した請求の範囲１．イオン性界面活性剤および少なくとも１種の酵素基質を含有する液体における酵素活性を増強する方法であって、下記工程：ａ．該液体における該イオン性界面活性剤による少なくとも１種の酵素活性に対する阻害を抑制するに十分量の非イオン性界面活性剤を該液体に添加し；ｂ．イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および酵素基質からなる該液体を混合し；ｃ．該活性を有する少なくとも１種の酵素を混合物に添加し；次いで、ｄ．該酵素活性に好ましい反応条件下で該混合物をインキュベーションするからなる方法。２．液体が生物学的試料からなる請求項１の方法。３．酵素基質が核酸からなる請求項１の方法。４．酵素が、ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ加水分解酵素、制限酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される請求項１、２または３の方法。５．酵素が、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するレトロウイルス由来の酵素、サーマス・アクイティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される請求項１、２または３の方法。６．イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項４の方法。７．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される請求項４の方法。８．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項４または５の方法。９．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ− アルキレート誘導体からなる群より選択される請求項４の方法。１０．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約６〜２０％の間である請求項４または９の方法。１１．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートからなる群より選択される成分よりなる請求項４の方法。１２．イオン性界面活性剤の存在下で核酸含有生物学的試料の核酸増幅反応を行う方法であって、下記工程：ａ．イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、標的核酸配列に十分に相補的な核酸配列からなる少なくとも１の核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、および必要なコファクターまたは塩類に生物学的試料を接触させ、そのことにより第１の液体を得て；ｂ．核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１の酵素を該第１の液体に加えて第２の液体を得て；ｃ．少なくとも１の標的核酸配列の増幅を引き起こすに十分な条件下で該第２の液体をインキュベーションし；次いで、ｄ．増幅された核酸配列を検出するからなる方法。１３．イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項１２の方法。１４．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される請求項１２の方法。１５．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項１３または１４の方法。１６．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ −アルキレート誘導体からなる群より選択される成分からなる請求項１２の方法。１７．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートからなる群より選択される成分からなる請求項１２の方法。１８．非イオン性界面活性剤が約６〜２０％の間の最終濃度を有する請求項１６または１７の方法。１９．標的核酸配列が、リボゾームＲＮＡまたはリボゾームＤＮＡに対して特異的な少なくとも１の配列からなる請求項１２の方法。２０．リボゾームＲＮＡ配列が、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia tr achomatis）、ウレアプラズマ・ウレアファシエンス（Ureaplasma ureafaciens ）からなる群より選択される微生物、およびヒト・乳頭腫ウィルスに感染したヒト・細胞に特異的である請求項１９の方法。２１．第１の液体がさらに金属キレート剤からなる請求項１２の方法。２２．さらに下記工程：ａ．ＲＮＡｓｅ阻害剤を第１の液体に添加し、次いで、ｂ．所望により、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１の酵素の添加前にＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させるからなる請求項１２、１９または２０の方法。２３．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテアーゼからなる請求項２２の方法。２４．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテイナーゼＫからなる請求項２２の方法。２５．ＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させる工程が、約９０ないし１００℃で１ないし５分間加熱することからなる請求項２２の方法。２６．生物学的試料中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、ａ．核酸ポリメラーゼ活性を阻害するに十分な量のイオン性界面活性剤を含有する第１の試薬、ｂ．該核酸ポリメラーゼ活性を阻害する該イオン性界面活性剤の能力を抑制するに十分な量の非イオン性界面活性剤を含有する第２の試薬、ｃ．標的核酸配列に対して十分に相補的な少なくとも１の核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、コファクターおよび塩類を含有する増幅試薬、ｄ．該核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１の酵素、およびｅ．増幅された標的核酸配列を検出するための手段からなるキット。２７．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項２６のキット。２８．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される請求項２６のキット。２９．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項２７または２８のキット。３０．第１の試薬がさらに非イオン性界面活性剤および金属キレート剤からなる請求項２６、２７または２８のキット。３１．イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートからなる群より選択される成分からなる請求項２６のキット。３２．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項３０のキット。３３．さらに、不均一界面活性剤ミセルの形成後に反応混合物に添加されるＲＮＡｓｅ阻害剤からなる請求項２６のキット。３４．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテアーゼである請求項３３のキット。３５．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテイナーゼＫである請求項３４のキット。３６．標的核酸配列が、リボゾームＲＮＡに対して特異的な少なくとも１の配列からなる請求項２６のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．イオン性界面活性剤および少なくとも１種の酵素基質を含有する液体における酵素活性を増強する方法であって、下記工程：ａ．該液体における該イオン性界面活性剤による少なくとも１種の酵素活性に対する阻害を抑制するに十分量の非イオン性界面活性剤を該液体に添加し；ｂ．イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および酵素基質からなる該液体を混合し；ｃ．該活性を有する少なくとも１種の酵素を混合物に添加し；次いで、ｄ．該酵素活性に好ましい反応条件下で該混合物をインキュベーションするからなる方法。２．液体が生物学的試料からなる請求項１の方法。３．酵素基質が核酸からなる請求項１の方法。４．酵素が、ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ加水分解酵素、制限酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される請求項１の方法。５．酵素が、ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ加水分解酵素、制限酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される請求項２の方法。６．酵素が、ＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ加水分解酵素、制限酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される請求項３の方法。７．酵素が、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するレトロウイルス由来の酵素、サーマス・アクイティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される請求項１の方法。８．酵素が、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するレトロウイルス由来の酵素、サーマス・アクイティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される請求項２の方法。９．酵素が、ＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するレトロウイルス由来の酵素、サーマス・アクイティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィラス（Bacillus sterothermophilus）由来のＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択される請求項３の方法。１０．イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項５の方法。１１．イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項６の方法。１２．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項５の方法。１３．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項６の方法。１４．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される請求項５の方法。１５．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される請求項６の方法。１６．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項８の方法。１７．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ −アルキレート誘導体からなる群より選択される請求項５の方法。１８．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約６〜２０％の間である請求項１７の方法。１９．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートからなる群より選択される成分よりなる請求項５の方法。２０．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートからなる群より選択される成分よりなる請求項６の方法。２１．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約６〜２０％の間である請求項５の方法。２２．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約６〜２０％の間である請求項６の方法。２３．イオン性界面活性剤の存在下で核酸を含有する生物学的試料の核酸増幅反応を行う方法であって、下記工程：ａ．イオン性界面活性剤からなる第１の液体と生物学的試料を接触させ；ｂ．非イオン性界面活性剤からなる第２の液体と第１の液体とを混合し、それにより第３の液体を得て；ｃ．標的核酸配列に対して十分に相補的な核酸配列を有する少なくとも１種の核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、必要なコファクターまたは塩、および核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素を第３の液体に添加し；ｄ．少なくとも１の標的核酸配列の増幅を引き起こすに十分な条件下で混合物をインキュベーションし；次いで、ｅ．増幅された核酸配列を検出するからなる方法。２４．イオン性界面活性剤が、水溶性ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項２３の方法。２５．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項２４の方法。２６．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される請求項２３の方法。２７．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項２６の方法。２８．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ −アルキレート誘導体からなる群より選択される成分からなる請求項２３の方法。２９．非イオン性界面活性剤が約６〜２０％の間の最終濃度を有する請求項２８の方法。３０．非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートからなる群より選択される成分からなる請求項２３の方法。３１．非イオン性界面活性剤が約６〜２０％の間の最終濃度を有する請求項３０の方法。３２．標的核酸配列が、リボゾームＲＮＡまたはリボゾームＤＮＡに対して特異的な少なくとも１の配列からなる請求項２３の方法。３３．リボゾームＲＮＡ配列が、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia tr achomatis）、ウレアプラズマ・ウレアファシエンス（Ureaplasma ureafaciens ）からなる群より選択される微生物、およびヒト・乳頭腫ウイルスに感染したヒト・細胞に特異的である請求項３２の方法。３４．第１の液体がさらに非イオン性界面活性剤および金属キレート剤からなる請求項２３の方法。３５．さらに下記工程：ａ．ＲＮＡｓｅ阻害剤を第３の液体に添加し、次いで、ｂ．所望により、核酸ポリメラーゼの添加前にＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させるからなる請求項２３の方法。３６．さらに下記工程：ａ．ＲＮＡｓｅ阻害剤を第３の液体に添加し、次いで、ｂ．所望により、核酸ポリメラーゼの添加前にＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させるからなる請求項３２の方法。３７．さらに下記工程：ａ．ＲＮＡｓｅ阻害剤を第３の液体に添加し、次いで、ｂ．所望により、核酸ポリメラーゼの添加前にＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させるからなる請求項３３の方法。３８．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテアーゼからなる請求項３７の方法。３９．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテイナーゼＫからなる請求項３７の方法。４０．ＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させる工程が、ａ．約９０〜１００℃に約１〜５分間反応混合物を加熱することからなる請求項３５の方法。４１．ＲＮＡｓｅ阻害剤を不活性化させる工程が、ａ．約９０〜１００℃に約１〜５分間反応混合物を加熱することからなる請求項３５の方法。４２．生物学的試料中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、ａ．イオン性界面活性剤を含有する試料を収集および輸送するための第１の試薬、ｂ．第１の試薬と混合するための非イオン性界面活性剤を含有する第２の試薬、ｃ．標的核酸配列に対して十分に相補的な核酸配列を有する少なくとも１種の核酸プライマー、ヌクレオシド三リン酸、コファクターまたは塩を含有する増幅試薬、ｄ．核酸増幅反応を開始するための核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素、およびｅ．増幅された標的核酸配列を検出するための手段からなるキット。４３．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸塩からなる群より選択される成分からなる請求項４２のキット。４４．イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸リチウムおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される請求項４２のキット。４５．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項４３のキット。４６．イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項４４のキット。４７．第１の試薬がさらに非イオン性界面活性剤および金属キレート剤からなる請求項４２のキット。４８．第１の試薬がさらに非イオン性界面活性剤および金属キレート剤からなる請求項４３のキット。４９．第１の試薬がさらに非イオン性界面活性剤および金属キレート剤からなる請求項４４のキット。５０．イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレートからなる群より選択される成分からなる請求項４２のキット。５１．非イオン性界面活性剤の最終濃度が約０.１〜０.７％の間である請求項４７のキット。５２．さらに、不均一界面活性剤ミセルの形成後に反応混合物に添加されるＲＮＡｓｅ阻害剤からなる請求項４２のキット。５３．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテアーゼである請求項５２のキット。５４．ＲＮＡｓｅ阻害剤がプロテイナーゼＫである請求項５３のキット。５５．標的核酸配列が、リボゾームＲＮＡに対して特異的な少なくとも１の配列からなる請求項４２のキット。