JP2006507818A - 細胞溶解のための組成物、使用方法、装置およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
組換えDNA技術は、大量の所望の真核生物タンパク質(例えば、哺乳動物のホルモン、インターフェロンおよび酵素)を合成する価値ある手段を提供している。所望のタンパク質を産生するために生物を容易に操作することができるが、この宿主生物は通常、タンパク質産物を培養培地中に分泌しない。従って、生物(例えば、細菌)の溶解とその後の所望のタンパク質の単離とが通常必要である。
パク質分子およびペプチド分子を結合するための基材を使用して、1回または数回の手順で所望のタンパク質分子およびペプチド分子が宿主細胞から抽出および単離される、組成物、方法およびキットに関する。
ランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を含み得る。所望の場合、この組成物は水溶液である。この溶液は、濃縮物の形態であってもよい。このキットは任意選択で緩衝塩およびリゾチームなどの他の成分を含み得るが、該成分は組成物の一部として含まれてもよいし、組成物とは別に含まれてもよい。キットは、1種または複数の洗浄用バッファー、溶出用バッファー、タンパク質を結合するための基材もまた含み得る。
(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;および
(b)少なくとも1種の細胞膜改変化合物、
を含んでなる組成物が提供される。
本発明のこの実施形態の別の態様において、組成物は、消泡剤、親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤、またはリゾチームなどの他の物質をさらに含んでなる。
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;ならびに
細胞を、細胞を溶解させてその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなる。
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
タンパク質またはペプチドを結合するための基材を提供する工程;
細胞を、細胞を溶解してタンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程;
放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程;
基材に結合したタンパク質またはペプチドを洗浄する工程;ならびに
基材に結合したタンパク質またはペプチドを回収する工程からなる。
タンパク質またはペプチドを有する1つまたは複数のサンプルを入れるためのハウジング;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物;ならびに
このタンパク質またはペプチドを結合する基材からなる。
本発明のこの実施形態の別の態様において、基材は、クロマトグラフィー樹脂またはメ
ンブレンからなる。クロマトグラフィー樹脂は、磁性であることが好ましい。
本発明の別の実施形態において、
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;
少なくとも1種の細胞膜改変化合物;ならびに
キットを使用するための指示書、
からなるキットが提供される。
本発明のこの実施形態の別の態様において、キットは、1または複数の以下の成分、すなわち:緩衝剤、リゾチーム、1または複数の洗浄用バッファー、1または複数の溶出用バッファー、およびタンパク質またはペプチドを結合するための基材、をさらに含み得る。基材は、磁性または非磁性のクロマトグラフィー樹脂からなるものでよい。このキットは、サンプル中に存在するタンパク質またはペプチドを検出あるいは定量するための手段をさらに含み得る。キットは、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するため、標的タンパク質または標的ペプチドが存在するか否かについて検出するため、あるいは細胞抽出物を調製するために有用である。
所望のタンパク質またはペプチドを有する、1つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;ならびに
細胞の各供給源を、細胞を溶解してその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなる。
本発明の別の実施形態において、宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質またはペプチドを有する、1つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
タンパク質またはペプチドを結合するための1種または複数の基材を提供する工程;
細胞の各供給源を、細胞を溶解してその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と個別に接触させる工程;
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク
質の一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程;
基材に結合したタンパク質を洗浄する工程;ならびに
基材に結合したタンパク質を回収する工程からなる。
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる。
ライブラリーを構成するタンパク質またはペプチドをコードするベクターを有する宿主細胞の供給源から、タンパク質またはペプチドのライブラリーを提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
タンパク質またはペプチドを結合するための1または複数の基材を提供する工程;
細胞の各供給源を、細胞を溶解させてその後タンパク質またはペプチドを放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程;
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、この放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程;
基材に結合したタンパク質またはペプチドを洗浄する工程;ならびに
基材に結合したタンパク質またはペプチドを回収する工程からなる。
本発明のこの実施形態の別の態様において、この方法は、タンパク質またはペプチドの活性または結合特性を測定する工程からさらになる。
(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;および
(b)少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる。
本発明は、タンパク質および/またはペプチドを含む細胞から、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する際に使用可能な、組成物、方法およびキットを提供する。本発明によれば、任意の細胞、組織、器官、細胞集団などがタンパク質およびペプチ
ドの供給源として使用され得ることが、当業者には容易に理解されよう。
以下の説明において、分子生物学、生化学およびタンパク質化学の分野で使用される多数の用語が広範に利用される。このような用語が用いられる範囲を含む明細書および特許請求の範囲が明確かつ矛盾なく理解されるように、以下の定義が提供される。
入体を形成し得る)タンパク質またはペプチドが、異なるバッファー系(例えば、6M尿素)中で可溶性であることもある。
的に決定することも可能である。HLB値の規模は、1〜40である。HLBが増大するにつれて、その界面活性剤中の親水性基が増え、その界面活性剤はより水溶性となる。一般に、3〜6のHLBは油中水乳化剤を示し、7〜9のHLBは湿潤剤を示し、8〜18のHLBは水中油乳化剤を示し、13〜15のHLBは界面活性剤を示し、15〜22のHLBは可溶化剤を示す。以下の参考文献は、HLBについてのさらなる情報を提供している:グリフィン,ダブリューシー(Griffin, WC )、「非イオン性界面活性剤のHLB価の算出(Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants)」、ジャーナル・オブ・ザ・ソサイエティ・オブ・コスメティック・ケミスツ誌(Journal of the Society of Cosmetic Chemists )、第5巻(1954年)、249〜256ページ;グリフィン,ダブリューシー(Griffin, WC )、「HLBによる界面活性剤の分類(Classification of Surface-Active Agents by 'HLB')」、ジャーナル・オブ・ザ・ソサイエティ・オブ・コスメティック・ケミスツ誌、第1巻(1949年)、311〜326ページ;「アトラスのHLBシステム(The Atlas HLB System)」、第4刷、アトラスケミカルインダストリーズ社(Atlas Chemical Industries )[米国デラウエア州ウィルミントン(Wilmington)所在]、1963年;「エマルジョン(Emulsions )」、ウルマン工業化学百科事典(Ullmans's Encyclopedia of Industrial Chemistry)、第5版、1987年;フォックス,シー.(Fox, C. )、「乳化剤選択の論拠(Rationale for the Selection of Emulsifying Agents )」、コスメティクス・アンド・トイレタリーズ誌(Cosmetics & Toiletries)、第101.11巻(1986年)、25〜44ページ;ガルシア,エイ.(Garcia, A.)、ジェイ.ラシェーズ(J. Lachaise )およびジー.マリオン(G. Marion )、「乳化剤に求められる親水‐親油バランスの研究(A Study of the Required Hydrophile-Lipophile Balance for Emulsification )」、ラングミュア誌(Langmuir)、第5巻(1989年)、1215〜1318ページ;ならびにグリフィン,ダブリュー.シー.(Griffin, W.C. )「エマルジョン(Emulsions )」、カーク・オスマー化学大辞典(Kirk
Othmer Encyclopedia of Chemical Technology )、第3版、1979年。
本発明の方法、組成物およびキットは、任意の細胞性供給源(種々の細胞、組織、器官または生物体を含む)由来のタンパク質分子およびペプチド分子の単離に適切であり、細胞性供給源は、天然のものでもよいし、または様々な市販の供給源(米国メリーランド州ロックビル所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection: ATCC);米国メイン州バーハーバー(Bar Harbor)所在のジャクソンラボラトリーズ社(Jackson Laboratories);米国ワシントン州カークランド(Kirkland)所在のセルシステムズインコーポレーテッド社(Cell Systems,Inc. );米国カリフォルニア州ラホヤ(La Jolla)所在のアドバンストティシューサイエンシズ社(Advanced Tissue Sciences)など)を介して入手してもよい。細胞性のタンパク質およびペプチドの供給源として使用され得る細胞は、原核生物(エシェリキア属のメンバー(特に大腸菌)、セラチア属のメンバー、サルモネラ属のメンバー、スタフィロコッカス属のメンバー、ストレプトコッカス(Streptococcus )属のメンバー、クロストリジウム(Clostridium )属のメンバー、クラミジア(Chlamydia )属のメンバー、ナイセリア(Neisseria )属のメンバー、トレポネマ(Treponema )属のメンバー、マイコプラズマ(Mycoplasma)属のメンバー、ボレリア(Borrelia)属のメンバー、ボルデテラ(Bordetella)属のメンバー、レジオネラ(Legionella)属のメンバー、シュードモナス(Pseudomonas )属のメンバー、マイコバクテリウム(Mycobacterium )属のメンバー、ヘリコバクター(Helicobacter)属のメンバー、アグロバクテリウム(Agrobacterium )属のメンバー、コレクトトリチューム(Collectotrichum )属のメンバー、リゾビウム(Rhizobium )属のメンバーおよびス
トレプトマイセス(Streptomyces)属のメンバーを含む細菌)または真核生物(真菌もしくは酵母、植物、原生生物および他の寄生生物、ならびにヒトおよび他の哺乳動物を含む動物など)であり得る。哺乳動物の組織もしくは細胞(例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環系、リンパ系、胃腸および(例えば、内胚葉起源または外胚葉起源の)結合組織供給源由来の組織もしくは細胞、ならびに哺乳動物(ヒトを含む)の胚または胎仔由来の組織もしくは細胞)もまた、タンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用するのに適切である。タンパク質およびペプチドの適切な供給源はまた、所望のタンパク質およびペプチドを発現し得るプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、ファージまたは他のDNA分子を保有する上記の任意の細胞でもよい。これらの細胞、組織および器官は、正常な細胞株、初代細胞株、形質転換細胞株もしくは樹立された細胞株でもよいし、あるいは(細菌、真菌もしくは酵母、AIDSを含むウイルスによって引き起こされる)感染性疾患もしくは寄生生物、遺伝的もしくは生化学的な病変(例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、精神分裂病、筋ジストロフィーまたは多発性硬化症)、または癌および癌性プロセスに関与するものなど病理学的な細胞、組織および器官でもよい。本発明の方法、組成物およびキットは、小さい可溶性のタンパク質およびペプチド(例えば、1000kD以下、好ましくは約1〜100kD、最も好ましくは約1〜50kDのタンパク質またはペプチド)の単離に充分適している。より大きい分子量のタンパク質(例えば、1000kDより大きいタンパク質)については、これらのタンパク質の放出を補助するための添加物としてリゾチームが使用されてもよい。本発明の方法は、生物学的宿主において発現され、封入体を形成するタンパク質分子またはペプチド分子の単離のために特に充分適している。封入体からタンパク質分子またはペプチド分子を放出するために、尿素またはグアニジン−HClなどの試薬が、封入体と関連するタンパク質分子およびペプチド分子の放出を補助するための補助剤として使用されてもよい。
本発明は、1つまたは複数の細胞を破壊または溶解する細胞溶解組成物に関する。これらの細胞は、細胞培地中に存在していてもよいし、または凍結ペレットもしくは非凍結ペレットとして存在してもよい。本発明の1実施形態において、この細胞溶解組成物は、(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する、少なくとも1種の界面活性剤;および(b)少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる。この組成物は、水溶液でもよいし、または使用前に水もしくは緩衝溶液中に再構成される固体の形態でもよい。細胞溶解組成物の好ましい形態は、1×溶液または濃縮溶液(例えば、(特に好ましくは)10×)などの水溶液である。1×溶液が細胞ペレットに直接添加されてもよいし、濃縮物が細胞培地に直接添加されてもよい。10×濃縮溶液が使用される場合、1容量の10×溶液が9容量の細胞培地と混合されて、該細胞混合物中の細胞溶解試薬濃度を最終的に1×とすることが好ましい。
囲、好ましくは約0.01%(w/v)〜約10%(w/v)の範囲、最も好ましくは約1%(w/v)〜10%(w/v)の範囲の量で、同組成物中に存在する。10×濃縮物の形態の細胞溶解試薬を、本明細書中に記載される特定の適用において細胞培地に添加する場合、界面活性剤の好ましい終濃度は、約0.1%(w/v)〜約1%(w/v)の範囲である。界面活性剤は、約11〜約16の範囲の疎水性−親油性バランス値を有する非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択され得る。このような界面活性剤の商業的供給源は、これもまた本明細書中で参考として援用される、「マカッチャンの乳化剤と界面活性剤(McCutcheon's EMULSIFIERS AND DETERGENTS )」、北米版、2002年、エムシーパブリッシングカンパニー社マカッチャン部門(McCutcheon Division、MC Publishing Company )中に見出され得る。非イオン性界
面活性剤の適切な例(限定するものではない)には、アルキルアルコールエトキシレート、アルキルエステルエトキシレート、ポリプロピレンオキシド、ソルビトールアルキルエステル、グリセロールアルキルエステル、エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマー;ポリ(オキシエチレン)アルキルエーテル(例えば、米国デラウエア州ウィルミントン(Wilmington)所在のアイシーアイアメリカズ社(ICI Americas)から入手可能な商品名Brijとして販売されているもの)、商品名Tween(米国デラウエア州ウィルミントン所在のアイシーアイアメリカズ社)として販売されているポリ(オキシエチレン)ソルビタンエステルが挙げられる。好ましい非イオン性界面活性剤には、商品名Tergitol(R)NP(米国コネチカット州ダンバリー(Danbury )所在のユニオンカーバイド社(Union Carbide ))として販売されているエトキシ化ノニルフェノールまたは商品名Triton X(米国ペンシルバニア州フィラデルフィア所在のロームアンドハース社(Rohm & Haas ))として販売されているオクチルフェノキシポリエトキシエタノールなどの、エトキシ化アルキルフェノールが挙げられる。
本発明はまた、宿主細胞からタンパク質を単離するための方法に関する。本発明のこの態様に従う方法は、細胞を本明細書中に記載されるような細胞溶解組成物と接触させて、細胞を溶解させた後に所望のタンパク質の全てまたは一部分を放出させる工程からなる。放出されたタンパク質を、溶解物からさらに分離することも可能である。本発明の1実施形態において、宿主細胞からタンパク質を回収するための方法が提供され、この方法は、
所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;ならびに
細胞を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質の放出をもたらすのに充分な量の組成物と接触させる工程からなる。
所望のタンパク質を有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
タンパク質を結合するための基材を提供する工程;
細胞を、該細胞を溶解させてタンパク質を放出させるのに有効な量の組成物と接触させる工程;
放出されたタンパク質を、この放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で基材と接触させる工程;
基材に結合したタンパク質を洗浄する工程;ならびに
基材に結合したタンパク質を回収する工程からなる。
所望のリガンドまたは基材を含む試薬が96ウェル・プレートの各ウェルに添加され、次いで活性または結合の存在が、所望の活性または結合特性について適切であると考えられる任意の方法によって測定され得る。
本発明はまた、タンパク質を抽出および単離する際に使用するための装置に関する。従って、本発明の1実施形態において、この装置は、
(a)試験しようとするサンプルを入れることができるハウジング;
(b)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物;ならびに
(c)タンパク質を結合する少なくとも1種の基材からなる。
(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物;ならびに
(b)キットを使用するための指示書からなる。
本発明の別の実施形態において、サンプル中のタンパク質の存在について検出するための診断キットが提供される。このキットは、
(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物;
(b)サンプル中に存在するタンパク質を検出または定量するための手段;ならびに
(c)キットを使用するための指示書からなる。
この実施例では、幾つかの代表的な細胞溶解試薬について説明する。細胞ペレット用に、1×濃度の水性配合物の細胞溶解試薬を使用することが好ましい。細胞培地用には、10×濃度の細胞溶解試薬が好ましい。
この1×水性配合物は、細胞ペレット(凍結または非凍結)からタンパク質またはペプチドを抽出するのに有用である。ペレットに加える配合物の量は一般に、細胞の光学密度に基づく。例えば、200ulの1×配合物を、OD600が1.8/1mlの細胞を溶解するのに使用する。この配合物は、以下の成分を含む:
100mM HEPES、pH7.5、
1%TritonX−100(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ(Sigma )、カタログ番号T−9284)
1%MazuDF204(消泡剤、米国イリノイ州グルニー(Gurnee)所在のピーピージーインダストリーズ(PPG Industries)、カタログ番号213306−2)
0.4%Tomah(精製TomahE−18−15、米国イリノイ州ロスコー(Roscoe)所在のバイオアフィニティシステムズ(Bioaffinity systems )、カタログ番号016483)
10mMイミダゾール(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ;カタログ番号I−2399)
380U硫酸ポリミキシンB(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ;カタログ番号P−1004、ロット22K2517)
(b)リゾチームを含む1×細胞溶解試薬
この1×水性配合物は、細胞ペレット(凍結または非凍結)から比較的大きなタンパク質またはペプチド(>400kD)の抽出を改善するのに有用である。ペレットに加える配合物の量は一般に、細胞の光学密度に基づく。例えば、200ulの1×配合物を、OD600が1.8/1mlの細胞を溶解するのに使用する。この配合物は、以下の成分を含む:
100mM HEPES、pH7.5、
1%TritonX−100(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ、カタログ番号T−9284)
1% MazuDF204(消泡剤、米国イリノイ州グルニー所在のピーピージーインダストリーズ、カタログ番号213306−2)
0.4%Tomah(精製TomahE−18−15、米国イリノイ州ロスコー所在のバイオアフィニティシステムズ、カタログ番号016483)
10mMイミダゾール(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ;カタログ番号I−2399)
380U硫酸ポリミキシンB(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ;カタログ番号P−1004、ロット22K2517)
任意選択で、リゾチーム(米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ)を加えることが可能である。
界面活性剤およびポリミキシンBを含む溶液で細胞を処理すると、酵素(ウミシイタケ・ルシフェラーゼ)によって測定される細胞質タンパク質が、大腸菌細胞から放出される。驚くべきことに、この酵素の放出には、処理中の培養物の光学密度の観察によって測定されるような通常の細胞溶解を伴わない。
のシグマT9284、ロット118H0297]、2mlのTomah E−18−15[米国ウィスコンシン州トマー所在トマーケミカルカンパニー(Tomah Chemical Company)により供給されたもの]、25mgのポリミキシンB[シグマP−1004、ロット22K2517]を混合し、濾過処理したnanopure(R)水を加えて溶液を50mlに調整することによって作製した。
チューブ番号 OD600
チューブ1 0.3193
チューブ2 0.3266
チューブ3 0.3266
チューブ4 0.3264
チューブ5 0.3261
チューブ6 0.3033
チューブ7 0.1779
チューブ8 0.1789
チューブ9 0.1779
チューブ10 0.0020
チューブ11 0.0012
チューブ12 0.0013
これらのデータは、培養物について実施した希釈に関して吸光度測定値を調整した後、図1Aにグラフとして表されている。
0A、ロット13327801]を、30ulのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用基質[プロメガ コーポレイション、E289A、13358301]と混合して、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬を作製し、その試薬の100ulサンプルを24本の発光測定装置用チューブのそれぞれの中に入れた。次いで、取っておいた上清2マイクロリットルのサンプル、および再懸濁ペレットから2マイクロリットルを、そのそれぞれのチューブに加えた。3秒間渦流混合(vortex)することによってチューブを混合し、Turner TD20/20発光測定装置(米国カリフォルニア州サニーベール(Sunnyvale )所在のターナーデザインズ(Turner Designs)を使用して、発光を測定した。以下の相対光度単位(RLU)の測定値を観察した:
この実施例では、幾つかの界面活性剤について、単独およびポリミキシンBと組み合わ
せて、大腸菌細胞から細胞質タンパク質を放出させる能力に関して試験した。
2グラムのデオキシコール酸、ナトリウム塩[シグマ D6750、102H0811]を脱イオン水に溶かして、4%(v/v)のDOC溶液を作製した。
2グラムのTomah(R)E−14−5[トマーケミカルカンパニー、ロット71002−1]を脱イオン水に溶かして、4%(v/v)のTomah E−14−5溶液を作製した。
を脱イオン水と混合して、4%(v/v)のRhodameenPN溶液を作製した。
Company)、W−30、ロット18F0766]を脱イオン水と混合して、4%(v/v)のTritonW−30溶液を作製した。
itolNP−9溶液を作製した。
his−タグ付きウミシイタケ・ルシフェラーゼ融合タンパク質プラスミドを含む大腸菌細胞の一晩培養物1mlを、テトラサイクリンを含む新鮮なLブロス50mlに加えた。この新しい培養物を振とう培養器において37℃で4時間インキュベートした時点で、1MのIPTGを同培養物に加えて終濃度1mMとした。この培養物をさらに2.5時間振とう培養器でインキュベートした時点で、培養物を溶解実験で使用した。
A 500ulの4%TritonW30溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure(R)水
B 500ulの4%DOC溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
C 500ulの4%ドデシル硫酸ナトリウム溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
D 500ulの4%RhodameenVP−532/SPB溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
E 500ulの4%RhodameenPN−430溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
F 500ulの4%Tomah E−14−5溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
G 500ulの4%Tomah E−18−15溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
H 500ulの4%Tomah E−14−2溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
I 500ulの4%Trymeen6607溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
J 100ulの20%Tween20溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、650ulのnanopure水
K 100ulのポリミキシンB溶液(10,000U/ml)、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
L Aと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
M Bと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
N Cと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
O Dと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
P Eと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
Q Fと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
R Gと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
S Hと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
T Iと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
U Jと同じ。ただし、100ulのnanopure水を100ulの10,000U/mlポリミキシンBに置き換えた
B1 250ulの1M HEPES(pH7.5)、750ulのnanopure水
チューブを閉じ、5分間渦流混合した。実証的観察によれば、チューブCおよびNの溶液は、混合後濁っていたようであり、チューブH、LおよびSの溶液は、混合後わずかに乳濁していたようであった。
この実施例では、他の界面活性剤について、実施例3で使用した実験条件と同様の条件下で、活性を有するHis−タグ付きウミシイタケ・ルシフェラーゼを大腸菌から放出させる能力に関して試験する。
A 500ulのTomah E−18−15ストック溶液、250ulの1M
HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
B 500ulのRhodameenVP−532/SBPストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
C 500ulのTrymeen6607ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
D 100ulのTween20ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
E 100ulのBRIJ35ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
F 100ulのTergitolNP9ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
G 100ulのTritonX−100ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
H 100ulのポリミキシンBストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
I 500ulのTomah E−18−5ストック溶液、250ulの1M HEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
Con 250ulの1M HEPES(pH7.5)、750ulのnanopure水
A’ Aと同じ。ただし、nanopure水を100ul減らし、100ulのポリミキシンBストック溶液を加えた。
C’ Cと同じ。ただし、nanopure水を100ul減らし、100ulのポリミキシンBストック溶液を加えた。
E’ Eと同じ。ただし、nanopure水を100ul減らし、100ulのポリミキシンBストック溶液を加えた。
G’ Gと同じ。ただし、nanopure水を100ul減らし、100ulの
ポリミキシンBストック溶液を加えた。
36本の1.5mlのプラスチック製微量遠心分離チューブに1〜36とラベル付けし、100ulの溶液Aをチューブ1および2に加え、100ulの溶液Bを3および4に加えるなどして、最後に100ulのI’をチューブ35および36に加えた。次いで、400マイクロリットルの培養物をチューブ1〜36に加え、チューブを5回上下反転して混合し、次いでチューブを微量遠心分離機で室温において12,000RPMで4分間回転させた。チューブ内の上清10ulを、290ulの50mM Tris−HCl(pH7.5)に加え、混合した。この希釈した上清5マイクロリットルを、発光測定装置用チューブに入った100ulのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬[実施例2参照]に加え、TurnerTD20/20発光測定装置を使用して、発光を測定した。以下の測定値が記録された:
E−18−5、RhodameenVP532/SPB、Trymeen6607、およびTomah E−18−15[上記の表においてそれぞれチューブ17と18、3と4、5と6、および1と2で試験したもの]は、Tween20、ポリミキシンBおよびバッファーを含む配合物、またはバッファーのみの配合物[それぞれチューブ7と8、15と16、および19と20で試験したもの]に比べて大腸菌の細胞質物質を非常に多く放出させる(Hisウミシイタケ・ルシフェラーゼの放出により測定)。しかしながら、前述のように、一部の界面活性剤にポリミキシンBを加えることによって、界面活性剤のみあるいはポリミキシンBのみを使用するよりも効率よく活性タンパク質が放出される。例えば、Tomah E−18−5のみ(チューブ17および18)およびポリミキシンBのみ(チューブ15および16)と、Tomah E−18−5およびポリミキシンB(それぞれチューブ35および36)との相対光度単位を比較されたい。イオン性界面活
性剤(Tomah E−18−15など)および非イオン性界面活性剤(TritonX100など)のいずれも、ポリミキシンBなどの細胞膜改変化合物と組み合わせると、大腸菌から培地へとタンパク質を放出させる際に有効である可能性があることも、前述のデータから明らかである。このデータは、図2Aおよび図2Bにグラフによって表す。
この実施例では、よく知られているHLB指標を有するさまざまな界面活性剤溶液について、ポリミキシンBと組み合わせて、大腸菌細胞から耐熱性ホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質を放出させる能力に関して試験する。ヒスチジン・タグ付きの耐熱性ホタル・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、大腸菌株を作製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス(Maniatis)ら、「分子クローニング:実験の手引き(Molecular Cloning: Laboratory Manual )」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、1982年を参照のこと。HLB指標は、表面活性剤および界面活性剤を使用する分野の当業者によって用いられている尺度であり、マカッチャン(McCutcheon)の1996年第1巻「乳化剤と界面活性剤(Emulsifiers and Detergents)」(米国ニュージャージー州グレンロック(Glen Rock )ロックロード(Rock Road )175所在のマカッチャンパブリッシングカンパニー社マカッチャン部門(McCutcheon's division Mc Publishing Co. ))などの、よく知られている教本に界面活性剤およびそのHLB値のリストが載っている。前述の実施例3および4から、ポリミキシンBの存在下でタンパク質を放出させる際に有効であった界面活性剤のHLB値を調べると、これらの界面活性剤は11〜16のHLB値を有しており、一方タンパク質の放出に無効であったか、あるいはタンパク質を不活性化させた可能性がある界面活性剤は、11未満または16を超える値を有していたことが分かった。この試験では特に、米国コネチカット州ダンベリー(Danbury )所在のユニオン・カーバイド(Union Carbide )から入手可能なTergitolとして知られている一連の界面活性剤を使用して、有効なHLB範囲を決定した。なぜならこれらの界面活性剤は、広範囲のHLB指標を有しているからである。この一連の界面活性剤を使用して、これらの物質がタンパク質の放出に関して、他の界面活性剤で見られたのと同じHLB指標依存性を示すかどうかを決定することができた。タンパク質の放出に関するHLB指標依存性は、Tergitolシリーズの界面活性剤を使用することによって確認可能であると考えられた。なぜならこのシリーズの界面活性剤は、ほぼ同じ化学構造を有するからである。言い換えれば、11〜16のHLB値を有する界面活性剤から作製したTergitol溶液がポリミキシンBとの組み合わせでタンパク質を効果的に放出させ、11〜16の範囲外の溶液ではタンパク質を効果的に放出しないことを実証することができれば、その結果によって、HLBが11〜16の範囲内の界面活性剤は、活性を有するタンパク質またはペプチドを細胞から効果的に放出させるであろうことが証明されると思われる。
3mlのTergitolNP−4(シグマケミカルカンパニー NP−4 ロット52K1286)を、脱イオン水に溶かして30mlにした。
3mlのTergitolNP−9(シグマケミカルカンパニー NP−9 ロット41K0156)を、脱イオン水に溶かして30mlにした。
3グラムのTergitolNP−40(シグマケミカルカンパニー NP−40 ロット110K0225)を、脱イオン水に溶かして30mlにした。
3mlのTergitol15−S−12(シグマケミカルカンパニー 15−S−12 ロット81K0292)を、脱イオン水に溶かして30mlにした。
以下の溶液を作製した:
溶液 組成
T1 100ulのTergitolNP−4ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T2 100ulのTergitolNP−7ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T3 100ulのTergitolNP−9ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T4 100ulのTergitolNP−10ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T5 100ulのTergitolNP−40ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T6 100ulのTergitol15−S−5ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T7 100ulのTergitol15−S−12ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水
T8 100ulのTergitol15−S−30ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、400ulのnanopure水 TP1 T1と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
TP3 T3と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
TP5 T5と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
TP7 T7と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
Tcon 500ulのHEPES(pH7.5)、500ulのnanopure水
TO−1 250ulの実施例3のTomah E−18−15ストック溶液、500ulのHEPES(pH7.5)、250ulのnanopure水
TOP−1 TO−1と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
TOP−2 TO−2と同じ。ただし、実施例3のポリミキシンBストック溶液100ulを、100ulのnanopure水の代わりとする。
この実施例では、大腸菌β−ガラクトシダーゼ(タンパク質テトラマーであり活性テトラマーに関して約460,000ダルトンのみかけの分子量を有する)の放出を経時的に追跡する。
5mlのアッセイ用2×バッファー(プロメガ社のキットE2000 B)を5mlのnanopure水で希釈し、200ulを透明なマイクロタイター・プレートのウェル中に入れた。希釈サンプル5マイクロリットルを、マイクロタイター・プレートの2つの個別ウェルに加え、タイマーを始動させた。肉眼による観察で幾つかのウェルが黄色を示し始めたときに、420nmにおける溶液の吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーで読み取った。記録した値は以下の通りであった:
his−タグ付のタンパク質である、リボヌクレアーゼ阻害剤RNasin(R)、RNaseHI、メチオニルtRNA合成酵素、耐熱性ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、を別々に発現することが可能な大腸菌細胞(大腸菌JM109または大腸菌BL21(DE3)pLysS菌株、それぞれ米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ コーポレイションのL2001およびL1191)を、Lブロス+適切な抗生物質中で一晩インキュベートした。5マイクロリットルの一晩培養物を、50mlのLブロスおよび適切な抗生物質の入った250mlフラスコに移し、細菌細胞をOD600が0.4〜0.8になるまで増殖させ、終濃度1mMのIPTGによってタンパク質の発現を誘導した。細胞培養物を、誘導後一晩25℃で増殖させた。この二晩目のインキュベーションの後、細菌培養物のODは1.8〜3.4に達していた。それぞれの培養物1ミリリットルを、縦6列の深型ウェル細胞培養プレートのウェルに移した。各縦列に1種類ずつの細菌培養物を分配した;縦列1にはhis−RNaseHIを含む細胞、縦列2にはhis−ヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼを含む細胞、縦列3にはhis−RNasinを含む細胞、縦列4にはhis−耐熱性ホタル・ルシフェラーゼを含む細胞、縦列5にはhis−MGHを含む細胞、そして縦列6にはhis−β−ガラクトシダーゼを含む細胞を入れた。プレートを遠心分離にかけ、上清を除去した。横列Aのサンプルには200ulの細胞溶解試薬を加えて対照ウェルとし、横列Bのサンプルには200ulの細胞溶解試薬および1mg/mlのリゾチーム
を加えた。タンパク質精製は、Magne−His(商標)タンパク質精製システム(カタログ番号V8500、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ コーポレイション)を使用して、BioMek(R)2000で実施した。
この実施例では、大腸菌細胞からの約90,000ダルトンのグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)標識ホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質(GST−PPE−Luc)の放出を経時的に追跡する。GSTタグ付きのホタル・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、この大腸菌株を作製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス(Maniatis)ら、「分子クローニング:実験の手引き(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、1982年を参照のこと。細胞は実施例6と同様に増殖させた。ただし、GSTとPPEルシフェラーゼの融合体を発現する大腸菌の菌株を増殖させ、Lブロス+Tetを増殖培地として使用した。
この実施例では、約60,000ダルトンのタンパク質(GST−ウミシイタケ・ルシフェラーゼ)の大腸菌細胞からの放出を経時的に追跡する。GSTタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、大腸菌株を調製した。このベクターは従来の方法によって構築した。マニアティス(Maniatis)ら、「分子クローニング:実験の手引き(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第二版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー社、1982年を参照のこと。
この実施例では、ポリミキシンBの存在下で大腸菌細胞からHisタグ付きのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・タンパク質を放出させる、さまざまな界面活性剤の能力を、さまざまな界面活性剤濃度で測定する。大腸菌培養物は、実施例4に記載したのと同様に増殖させた。
溶液 組成
AH 100ulのTritonX−100ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、550ulのnanopure水;
AM 10ulのTritonX−100ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、640ulのnanopure水;
AL 1ulのTritonX−100ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、649ulのnanopure水;
BH 100ulのTergitolNP−9ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、550ulのnanopure水;
BM 10ulのTergitolNP−9ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、640ulのnanopure水;
BL 1ulのTergitolNP−9ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、649ulのnanopure水;
CH 500ulのTomah E−18−15ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、150ulのnanopure水;
CM 50ulのTomah E−18−15ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、600ulのnanopure水;
CL 5ulのTomah E−18−15ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、645ulのnanopure水;
DH 500ulのRhodameenVP−523/SPBストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、150ulのnanopure水;
DM 50ulのRhodameenVP−523/SPBストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、600ulのnanopure水;
DL 5ulのRhodameenVP−523/SPBストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、645ulのnanopure水;
EH 500ulのTrymeen6607ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、150ulのnanopure水;
EM 50ulのTrymeen6607ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、600ulのnanopure水;
EL 5ulのTrymeen6607ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、645ulのnanopure水;
FH 500ulのTomah E−18−5ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、[実施例3で調製した]100ulのポリミキシンBストック溶液、150ulのnanopure水;
FM 50ulのTomah E−18−5ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、600ulのnanopure水;
FL 5ulのTomah E−18−5ストック溶液、250ulのHEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンBストック溶液、645ulのnanop
ure水;
Con1 250ulのHEPES(pH7.5)、650ulのnanopure水、100ulのポリミキシンBストック溶液;
Con2 250ulのHEPES(pH7.5)、750ulのnanopure水。
ーブにキャップをし、5回の上下反転によって混合し、室温で5分間12,000RPMで回転させ、上清を取り出して新たなチューブに移した。ペレット・サンプルは、実施例2で調製した1×細胞溶解試薬に再懸濁させた。チューブ16〜18中にはペレットが見られなかったので、これらのチューブには1×細胞溶解試薬を加えず、したがって、これらのチューブからは細胞のペレット・サンプルは得られなかった。上清サンプルおよび再懸濁した細胞ペレット・サンプルを、1×細胞溶解試薬で1:30に希釈し、渦流混合処理によって混合し、この物質5ulを発光測定装置用チューブ中の100ulのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、TurnerTD20/20発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した。以下の相対光度単位の読み取り値が記録された:
この実施例では、2つの界面活性剤によって培養培地に放出されたタンパク質の精製を親和性樹脂で試みる。これらの結果は、さまざまな界面活性剤によって、培地にタンパク質を放出させることが可能であるが、すべての界面活性剤が下流の用途について等しく有利であるとは限らないかもしれないことを示す。
溶液T−5
5mlの1M HEPES(pH7.5)、100ulのポリミキシンB(10,000U/ml)[実施例3で調製したもの]、0.5mlの4%TomahE−18−5溶液[実施例3で調製したもの]、および3.5mlのnanopure水を合わせて混合した。
T−5と同様に作製した。ただし、0.5mlの4%TomahE−18−15溶液[実施例3で調製したもの]を、TomahE−18−5の代わりに使用した。
を磁力でペレット状にし、上清の10ulサンプルを、190ulの1×細胞溶解試薬で希釈し、次いでチューブを再度密封し、20分後に最終サンプルを得るまで約30秒毎に上下反転させることによって混合した。
この実施例では、一定範囲のHLB指標を有する界面活性剤溶液から放出されたHisタグ付きPPEホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質の精製を実証する。使用した物質は、実施例5に詳細に記載している。この実験は、実施例5に記載した界面活性剤とポリミキシンBの組合せから単離した上清サンプルを使用することから始める。
横列Dのサンプルを、1×細胞溶解試薬を用いて1:10に連続的に希釈した。希釈後、4ulの希釈サンプルを、発光測定装置用チューブに入った100ulのウミシイタケ・ルシフェラーゼ・アッセイ用溶液に加え、チューブを渦流混合し、Turner TD20/20発光測定装置を使用して発光を測定した。以下の読み取り値が得られた。
この実施例では、本願の根本となる物質のさまざまな異なる性質を実証する:同物質をカラム形式で樹脂と共に使用可能であること、およびさらなる実施時間が与えられれば、該タンパク質放出試薬によって、古い、保存培養物からタンパク質を放出させることが可能であることを実証する。
約800ミリリットルの大腸菌培養物を、ほぼ実施例5に記載したように増殖させた。ただし、一晩培養物の希釈を、非常に大量のLブロス+Tet[成分の割合は一定に保った]において行なった点が変更されている。IPTG添加後に6時間増殖させた後、培養物を4℃に18時間置いてから使用した。
活性を効率よく測定するというこの問題を克服するために、ペレットを1×細胞溶解試薬中に再懸濁させることが可能である。
多くの研究者は細胞培養物を長時間保存すると思われるので、さらなる試験を行なって、古い細胞培養物(言い換えれば、細胞培養物は少なくとも18時間置いたものとした)から、細胞溶解試薬による処理時間を増大させることによって、追加の酵素が放出され得るかどうかを測定した。91ミリリットルの前述の細胞培養物(ここでは約36時間置いたもの)をビーカーに入れ、1mlを取り出して「Pre」とラベル付けした1.5mlチューブに移し、10mlの10×細胞溶解試薬をビーカーに加え、ビーカーを約1分間攪拌し、次いで1mlのサンプルを取り出して「INIT」とラベル付けした1.5mlのプラスチック製微量遠心分離チューブ中に入れた。PreおよびINITチューブを、室温で4分間12,000RPMにて回転させ、上清を取り出して新たにラベル付けしたチューブに移した。ペレットは、1mlの希釈用試薬中に再懸濁させた。培養物と細胞溶解試薬との混合物を、細胞溶解試薬の添加後5、10、20、および120分の時点でサンプリングしたが、1mlのサンプルを取り出し、1.5mlの微量遠心分離チューブ中に入れ、室温において4分間12,000RPMでチューブを回転させ、上清を取り出してラベル付けした新しいチューブに移し、ペレットを1mlの希釈用試薬中に再懸濁させることによって行った。10マイクロリットルの上清および再懸濁細胞ペレットを、190ulの希釈用試薬で希釈し、1秒間渦流混合処理することによって溶液を混合し、次いで、得られた混合物の10ulサンプルを発光測定装置用チューブに入った100ulのLARに加え、1秒間渦流混合処理することによってチューブを混合し、Turner TD20/20発光測定装置を使用して、発光を直ちに読み取った。以下の読み取り値が記録された:
この項では、細胞溶解試薬溶液を樹脂カラムに直接注入して得られたタンパク質溶液は、酵素の可逆的結合および溶出用に使用可能であるという実証を示す。
とんどない条件下で注入することによって行なう。しかしながら一般には、注入されるタンパク質溶解物は、培養培地から細胞を単離し、これらの細胞を(しばしばフレンチプレスの使用などの物理的手段によって)溶解し、細胞残屑を除去し、次いでタンパク質溶液を樹脂カラムにかけることによって生成する。
of Separating Molecules)」(代理人事件番号B0174893)に従い調製した、ニッケルが固定化された2.5mlのシリカ樹脂をカラムに入れ、別の樹脂2.5mlを50mlの密封可能なチューブに入れた。His−PPE−ルシフェラーゼ細菌培養物/細胞溶解試薬の混合物の1.5mlサンプル8つを注入し、画分を回収した。8回目にサンプルを注入しているとき、カラム中の液体の流れが大幅に低下したことが示された。被験サンプル中の樹脂を再懸濁させると、カラム中の流速は元に戻った。次いでこのカラムを、100mMのHEPES(pH7.5)に溶かした10mMイミダゾール4mlで洗浄し、1ml画分を回収した。次いでカラムを、100mMのHEPES(pH7.5)に溶かした500mMイミダゾールを1mlサンプルずつ用いて複数回溶出し、1ml画分を回収した。培養物−細胞溶解試薬の混合物を注入したときに回収した画分は、希釈用試薬に1:25に希釈し、洗浄および溶出中に回収した画分は、1:20に希釈した。細胞溶解試薬の混合物を注入したときに回収した画分の希釈物および洗浄画分のサンプル10マイクロリットルを、発光測定装置用チューブに入った100ulのLARに加え、1秒間の渦流混合によってチューブを混合し、TurnerTD20/20発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した;溶出中に回収した画分の希釈物の2ulサンプルを、発光測定装置用チューブに入った100ulのLARに加え、1秒間の渦流混合によってチューブを混合し、TurnerTD20/20発光測定装置を使用して、発光を直ちに測定した。以下の読み取り値が記録された:
前項(c)に示したように、細胞溶解試薬溶液を樹脂に直接適用して目的の酵素を単離することが可能である。しかしながら、この方法は、細胞および細胞残屑でカラムを詰まらせる危険があり、樹脂粒子をカラム内で再懸濁させてカラムの流れを元に戻すことが必要である。目的の酵素が樹脂と結合し、かつ細胞および細胞残屑は樹脂から移し取られる条件下において、細胞溶解試薬の混合物を樹脂に直接加えることが可能であれば、上記の閉塞の影響は回避し得る。さらに、樹脂をまとめて洗浄してからカラム内に入れることが可能であれば、目的の酵素を精製するための非常に迅速な方法、すなわち、細胞溶解試薬の混合物を形成することと、目的の酵素は樹脂と結合するが大部分の他のタンパク質は非結合状態である条件下において、この混合物に樹脂粒子を直接適用することと、任意選択で、樹脂粒子間の溶液中に存在する微量の非結合タンパク質を除去するために樹脂を洗浄することと、樹脂からタンパク質を溶出させることと、を想定することが可能である。この項では、このような精製法を記載する。
きチューブ中に入れたが、このチューブは、米国特許出願第60/419,614号(2002年10月18日出願)、表題「分子を分離する組成物及び方法(Compositions and
Methods of Separating Molecules)」(代理人事件番号B0174893)に従い調製した2.5mlのニッケルでキレート化されたシリカ樹脂を含んでいた。樹脂添加の直後、50mlのプラスチック製チューブから樹脂粒子が取り出されないように注意しながら、10ulの溶液を取り出して別のチューブに入れた。チューブを閉じ、ゆっくり上下反転させることによって混合し、さらに10ulずつのサンプルを、樹脂添加の2、4、6、8、10、20および30分後に採取した。樹脂を沈殿させ、上清を捨て、樹脂を2回洗浄したが、樹脂の洗浄は、100mMのHEPES(pH7.5)に溶かした5mlの10mMイミダゾールを2分割したものに樹脂を再懸濁させ、5分間ゆっくり上下反転させることによって内容物を混合し、上清を捨てることによって実施した。
この実施例では、終濃度が1×未満の本発明の細胞溶解試薬でも、細菌培養物のいかなる機械的な予備処理も必要とせずに、細胞を溶解することが可能であることを実証するための実験を行なった。この実施例は、終濃度が1×未満の本発明の細胞溶解試薬を使用して、組換えタンパク質を細菌培養物から放出させ、高スループットの機能アッセイにおいて分析することが可能であることを実証する。
III(商品名)、タイプ65800(米国アイオワ州ドゥビューク(Dubuque )所在のサーモライン社、モデル番号M65825)を使用して室温で20分間軽く振とうさせた。細胞残屑は、スイング・バケット遠心分離装置(ベックマン(Beckman )GS−6R遠心分離装置、米国カリフォルニア州フラールトン(Fullerton )所在のベックマン・コールター(Beckman coulter ))中で、3000rpmで15分間、96ウェル・プレートを遠心分離することによってウェルから除去し、それぞれのウェルからの上清の10ul分割試料について、RNAse検出アッセイを使用してRNAse阻害活性を分析した。
レイション(Promega Corp. )、パーツ番号AB150)の変法である。簡単に述べると、RNAがRNAseによって加水分解されるにつれて溶液のpHが変化し、このpHがA650における吸光度の変化によって検出される。活性は、吸光度の変化の総量として測定される。この検出アッセイにおいては、リボヌクレアーゼ阻害活性は、RNAseが不活性であること、または吸光度の変化がないことによって測定される。サンプル(純化したクローンまたは溶解物など)を、添加した量のRNAseを阻害することが可能な量の野生型リボヌクレアーゼインヒビターの陽性対照、およびインヒビターを含まないRNAseの陰性対照サンプル(阻害が無いという意味で陰性である)と比較する。測定した吸光度の変化を、相対的活性に関して対照と比較する。
トルイジンブルーO[シグマ T−3260]
酵母菌の全RNA[ベーリンガー・マンハイム/ロシュ(Boehringer-Mannheim/Roche )109−223]
2MのTris−HClバッファー、pH7.3[プロメガ LSS1472]
2MのTris−HClバッファー、pH8.0[プロメガ LSS4227]
80%グリセロール[プロメガ LSS6208]
RNAseA[シグマ R−4642]
96ウェルのマイクロタイター・プレート、Immulon(R)、平底、ポリスチレン、[ダイネックス(Dynex )、3455]
アッセイ用溶液:
200mMのTris−HCl(pH7.3)、2mg/mLの酵母菌 全RNA、終濃度0.0075%(v/v)のトルイジンブルーO(0.5%(w/v)のストックをnanopure水で作製し、1.5%(v/v)を溶液に加える)。溶液は4℃で保存した。
サンプルを96ウェルのマイクロタイター・プレートのウェルに等分し、サンプル・ウェルあたり100ulのアッセイ用溶液を加えた。溶液とサンプルとを混合し、時間=0におけるサンプルの吸光度をA650で測定した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、時間=30におけるサンプルの吸光度をA650で測定した。650nmで吸光度を測定することが可能な測光フィルタを備えた、Lucy1マイクロプレート発光測定装置(オーストリア国バルツ/ザルツブルグ(Wals/Salzburg )所在のアントスラボテクインスツルメンツ(Anthos Labtec Instruments )、モデル番号16−800)によって、吸光度を測定した。時間=0と時間=30との間の全体的な吸光度の変化を計算しプロットした。対照の吸光度の変化と実験サンプルの吸光度の変化を比較することによって、あるいはリボヌクレアーゼインヒビターサンプルの吸光度の変化:RNAseAサンプルの吸光度の変化の比と、実験サンプルの吸光度の変化:RNAseAサンプルの吸光度の変化の比とを比較することによって、データを分析することが可能である。
この実施例では、本明細書に記載の発明の細胞溶解バッファーを、幾つかの異なるポリヒスチジン‐タグ付きのタンパク質;リボヌクレアーゼインヒビター、RNaseHI、メチオニルtRNA合成酵素、熱安定性ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、MGH、およびヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼの高スループット精製に使用した。これらのHis‐タグ付きタンパク質の細菌細胞からの精製は、ヒスチジン‐タグ付きタンパク質のアフィニティ精製用のキットを使用して行なった。MagneHis(商標)タンパク質精製システム(プロメガ コーポレイション、カタログ番号V8500)。このキットは、ニッケル結合磁気粒子、結合/洗浄用バッファー(100mMのHEPESバッファー(pH7.5)および10mMのイミダゾール)、溶出用バッファー(100mMのHEPESバッファー(pH7.5)および500mMのイミダゾール)、および実施例1に記載した本発明の細菌細胞溶解試薬を含む。
この実施例では、his‐メチオニルtRNA合成酵素を発現することができる大腸菌JM109細胞を使用した。実施例14に記載したようにして細胞を増殖させ誘導した。誘導後、1mlの細胞を2本の異なるチューブそれぞれに等分し、サンプルを遠心分離にかけ、細胞ペレットを回収した。細胞溶解試薬の200ul分割試料をそれぞれのペレットに加え、この混合物を室温で10分間インキュベートした。溶解後、サンプルの1つを遠心分離にかけて、細胞残屑および他の混入物を除去した。このチューブには「遠心分離サンプル」とラベル付けした。もう1つのサンプルは、全く遠心分離せずに処理した。このサンプルには「非遠心分離サンプル」とラベル付けした。
これらのサンプルをSDS−PAGEによって分析した。これらの結果を図8に示す。レーン番号1〜4は実験サンプル;1)遠心分離した粗溶解物5ul、2)遠心分離した溶解物由来の精製タンパク質20ul、3)遠心分離していない粗溶解物の5ulサンプル、4)遠心分離していない溶解物由来の精製タンパク質20ul、に対応する。レーン5は分子量マーカーを含む。
この実施例では、細菌細胞培養物中で発現された組換えタンパク質を、本発明の方法を使用した高スループットのタンパク質精製のためのマルチ−ウェル形式で精製した。3つの自動システム、すなわちBeckman FX、Beckman Biomek(R)2000、およびTecan Genesis(R)RSPについて、高スループットのタンパク質精製に関して評価した。
して、96ウェル・プレートのそれぞれのウェルから、タンパク質を均一に精製することが可能であることを示している。
この実施例では、さまざまな試薬配合物について、大腸菌細胞からタンパク質を放出させる能力に関して比較する。これらの配合物は、2つの異なる化学試薬、ポリミキシンBまたはオクチル‐β‐チオグルコピラノシドを使用するが、これらの試薬は単独で、互いに組み合わせて、タンパク質の活性を安定化させることが可能な界面活性剤[TritonX100およびToman E−18−15]と組み合わせて、大腸菌細胞を透過性にすることが知られている。
PRS#1 2%のTomah E−18−15、2%のTritonX100、100U/mlのポリミキシンB、500mMのHEPES(pH7.5)
PRS#2 PRS#1と同じ。ただし、6%(w/v)のオクチル‐β‐チオグルコピラノシドも含む
PRS#3 10%のTritonX100、3%のTomah E−18−15、100mMのイミダゾール、500mMのHEPES(pH7.5)、6%のオクチル‐β‐チオグルコピラノシド
PRS#4 PRS#3と同じ。ただし、Tomah E−18−15は含まない
PRS#5 2%のTomah E−18−15、2%のTritonX100、500mMのHEPES(pH7.5)、100mMのイミダゾール、6%(w/v)のオクチル‐β‐チオグルコピラノシド
PRS#6 PRS#5と同じ。ただし、6%(w/v)オクチル−β−チオグルコピラノシドは含まない
実施例5に記載したのと同様に調製した、Photinus pennsylvanica由来のhisタグ付き熱安定性ルシフェラーゼを発現する培養物を、振とうさせながら37℃で一晩、100ug/mlのアンピシリンも含むルリアブロス中で増殖させた。1mlの種菌ストックを調製し、−70℃で保存した。実験の日に、1mlの種菌ストックを使用して、100ug/mlのアンピシリンを含む50mlのルリアブロスに接種し、この培養物を0.4〜0.6のOD600に達するまで振とうさせながら25℃で増殖させた。この時点で、1MのIPTG(イソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド、プロメガカタログ番号V3951)を、終濃度1mMで培養物に加え、振とうさせながら室温で一晩、培養物を増殖させる。
清アルブミン)を含めたもの)に希釈し、希釈した溶液は氷上で保存した。ルシフェラーゼ・アッセイ用試薬(LAR)(1.07mMの炭酸マグネシウム、0.1mMのEDTA、2.67mMの硫酸マグネシウム、33.3mMのジチオスレイトール、0.27mMのコエンザイムA、0.53mMのATPおよび0.47mMのルシフェリン)の100ulサンプルを、Turner発光測定装置用チューブに入れた。5マイクロリットルの希釈サンプルを、LARの入った発光測定装置用チューブの1つに加え、このチューブを1〜2秒間混合させ、次いで、反応によって生成した光を、TurnerTD20/20発光測定装置を使用して読み取った。以下の値が記録された:
試験溶液#1 6%のオクチルβチオグルコピラノシドを、500mMのHEPES(pH7.5)に溶かした溶液
試験溶液#2 試験溶液#1と同じ。ただし、10%(v/v)のTritonX100も含む
試験溶液#3 前述の実施例17中のPRS#3と同じ
試験溶液#4 6%のオクチルβチオグルコピラノシド、2%のTritonX100(v/v)、2%のTOMAH E−18−15(vol/vol)を、500mMのHEPES(pH7.5)に溶かした溶液
前述の試験溶液40マイクロリットルを、2連のチューブ中に360ulの脱イオン水を用いて1:10に希釈した。1×細胞溶解試薬(25mMのTris−リン酸pH7.8、2mMのジチオスレイトール、2mMの1,2ジアミノシクロヘキサン−N,N,N,N−テトラ酢酸、10%グリセロール、1%のTriton x−100を含む1mg/mlのBSA(ウシ血清アルブミン、プロメガカタログ番号W3841))(1mg/mlのBSAも含む)の入った1つの最終組のチューブを、2連のチューブ中に置いた。1組のチューブを氷上に置き、もう一方は室温に保つ。Photinus pyralis由来の野生型ルシフェラーゼを含む溶液(4ulの25mMトリス酢酸pH7.5、1mMのEDTA、1mMのDTT、0.2M硫酸アンモニウム、15%のグリセロール、30%のエチレングリコール、14.6ug/ulのルシフェラーゼ;溶液は使用時まで−70℃で保存)を全チューブに加え、氷上あるいは室温で20分間インキュベートした。20分間のインキュベーションの後、全ての溶液を1×細胞溶解試薬(1mg/mlのBSAも含む)で1/100に希釈した。
Claims (121)
- (a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;および
(b)少なくとも1種の細胞膜改変化合物
を含んでなる組成物。 - 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、前記組成物の約0.001%(w/v)〜約10%(w/v)の範囲の量で該組成物中に存在する、請求項2に記載の組成物。
- 前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項2に記載の組成物。
- 前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項4に記載の組成物。
- 前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項2に記載の組成物。
- 前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、Tomah(R)E−18−5、Tomah(R)E−18−15、Rhodameen(R)VP532/SPB、Trymeen(R)6607、Triton X−100(R)からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で前記組成物中に存在する、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のCa+2依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、膜の透過性を変化させるかまたは膜を破壊する、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド(PMBN)、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第4級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼA2またはホスホリパーゼA2活性化ペプチド(PLAP)を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンBまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項13に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンB1とポリミキシンB2との混合物を含んでなる、請求項13に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項12に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項16に記載の組成物。
- 前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも0.4%(w/v)かつ1%(w/v)未満の終濃度で存在する、請求項17に記載の組成物。
- 前記オクチルチオグルコシドが、0.4%(w/v)〜0.6%(w/v)の終濃度で存在する、請求項18に記載の組成物。
- 緩衝塩をさらに含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記緩衝塩が、約6.5〜約9.0のpH範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項20に記載の組成物。
- 消泡剤をさらに含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- リゾチームをさらに含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が水溶液の形態である、請求項1に記載の組成物。
- 前記溶液が濃縮物である、請求項25に記載の組成物。
- 約6.5〜約9.0のpH範囲を維持するのに充分な量の緩衝塩をさらに含んでなる、請求項23に記載の組成物。
- Tomah E−18−15、Triton X100およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項27に記載の組成物。
- 500mM HEPES(pH7.5)中に2%のTomah E−18−15、2%のTriton X100および6%のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;ならびに
細胞を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の組成物と接触させる工程
からなる方法。 - 放出されたタンパク質またはペプチドを分離する工程からさらになる、請求項30に記載の方法。
- 放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドを結合する基材と接触させる工程からさらになる、請求項31に記載の方法。
- 前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項32に記載の方法。
- 前記組成物がリゾチームをさらに含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が原核細胞または真核細胞からなる、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる、請求項35に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞培養物またはペレットの形態である、請求項30に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、前記組成物の約0.001%(w/v)〜約10%(w/v)の範囲の量で存在する、請求項38に記載の方法。
- 前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項38に記載の方法。
- 前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項40に記載の方法。
- 前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項38に記載の方法。
- 前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、Tomah E−18−5、Tomah E−18−15、Rhodameen VP532/SPB、Trymeen 6607、Triton X−100からなる群より選択される1種または複数の化合物を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で存在する、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド(PMBN)、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第4級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼA2またはホスホリパーゼA2活性化ペプチド(PLAP)を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のCa+2依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンBまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンB1とポリミキシンB2との混合物を含んでなる、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項46に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項51に記載の方法。
- 前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも0.4%(w/v)かつ1%(w/v)未満の終濃度で存在する、請求項52に記載の方法。
- 前記オクチルチオグルコシドが、0.4%(w/v)〜0.6%(w/v)の終濃度で存在する、請求項53に記載の方法。
- 前記組成物が緩衝塩をさらに含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記緩衝塩が、約6.5〜約9.0のpH範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項55に記載の方法。
- 前記組成物が消泡剤をさらに含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記組成物が、親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる、請求項57に記載の方法。
- 前記組成物がリゾチームをさらに含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記組成物が、Tomah E−18−15、Triton X100およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記組成物が、500mM HEPES(pH7.5)中に2%のTomah E−18−15、2%のTriton X100および6%のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
該タンパク質またはペプチドを結合するための基材を提供する工程;
該細胞を、該細胞の溶解および該タンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と接触させる工程;
該放出されたタンパク質またはペプチドを、放出されたタンパク質が基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程;
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを洗浄する工程;ならびに
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを回収する工程
からなる方法。 - タンパク質またはペプチドを抽出および単離するための装置であって、
タンパク質またはペプチドを有する1つまたは複数のサンプルを入れるためのハウジング;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物;ならびに
該タンパク質またはペプチドを結合する基材
からなる装置。 - 前記ハウジングが、容器、カラムまたはマルチ・ウェル・プレートからなる、請求項63に記載の装置。
- 前記基材が、クロマトグラフィー樹脂またはメンブレンからなる、請求項63に記載の装置。
- 前記クロマトグラフィー樹脂が磁性である、請求項65に記載の装置。
- 請求項63に記載の装置を備えてなる、タンパク質またはペプチドを単離するためのキット。
- 約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;
少なくとも1種の細胞膜改変化合物;ならびに
キットを使用するための指示書
からなるキット。 - 前記界面活性剤および細胞膜改変化合物が1つの組成物中に存在する、請求項68に記載のキット。
- 前記組成物が水を含む、請求項69に記載のキット。
- 前記水性組成物が濃縮物の形態である、請求項70に記載のキット。
- バッファーをさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- リゾチームをさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- 1種または複数の洗浄用バッファーをさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- 1種または複数の溶出用バッファーをさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- タンパク質またはペプチドを結合するための基材をさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- 前記基材が磁性または非磁性のクロマトグラフィー樹脂からなる、請求項76に記載のキット。
- 宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するため、標的タンパク質または標的ペプチドが存在するか否かを検出するため、あるいは細胞抽出物を調製するために使用される、請求項68に記載のキット。
- サンプル中に存在するタンパク質またはペプチドを検出あるいは定量するための手段をさらに備えてなる、請求項68に記載のキット。
- 宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する1つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;ならびに
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と接触させる工程
からなる方法。 - 細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを分離する工程からさらになる、請求項80に記載の方法。
- 前記工程が、放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てに結合する基材と接触させることによって実施される、請求項81に記載の方法。
- 前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項82に記載の方法。
- 放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる、請求項81に記載の方法。
- 宿主細胞からタンパク質またはペプチドを回収するための高スループットの方法であって、
所望のタンパク質またはペプチドを有する、1つまたは複数の細胞の供給源を提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
該タンパク質またはペプチドを結合するための1種または複数の基材を提供する工程;
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の該組成物と個別に接触させる工程;
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質の一部または全てが基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程;
該基材に結合した該タンパク質を洗浄する工程;ならびに
該基材に結合した該タンパク質を回収する工程
からなる方法。 - 前記基材が磁性または非磁性の樹脂からなる、請求項85に記載の方法。
- 前記放出されたタンパク質またはペプチドの活性または結合を測定する工程からさらになる、請求項85に記載の方法。
- 宿主細胞の各供給源が有するベクターによってコードされるタンパク質またはペプチドを構成メンバーとする、宿主細胞の供給源由来のライブラリーをスクリーニングするための高スループットの方法であって、
ライブラリーを構成するタンパク質またはペプチドをコードするベクターを有する宿主細胞の供給源から、タンパク質またはペプチドのライブラリーを提供する工程;
約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤および少なくとも1種の細胞膜改変化合物を含んでなる組成物を提供する工程;
該タンパク質またはペプチドを結合するための1種または複数の基材を提供する工程;
細胞の各供給源を、該細胞の溶解およびその後のタンパク質またはペプチドの放出をもたらすのに有効な量の組成物と接触させる工程;
細胞の各供給源から放出されたタンパク質またはペプチドを、該放出されたタンパク質またはペプチドの一部または全てが該基材と結合するのに有効な条件下で該基材と接触させる工程;
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを洗浄する工程;ならびに
該基材に結合した該タンパク質またはペプチドを回収する工程
からなる方法。 - 前記タンパク質またはペプチドが、目的の特定のタンパク質またはペプチドの変異体である、請求項88に記載の方法。
- 前記タンパク質またはペプチドの活性または結合特性を測定する工程からさらになる、請求項89に記載の方法。
- 前記組成物が、Tomah E−18−15、Triton X100およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項80、85または88のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、500mM HEPES(pH7.5)中に2%のTomah E−18−15、2%のTriton X100および6%のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項80、85または88に記載の方法。
- 培養培地から細胞を収集する工程を伴わずに、培養された細胞から細胞抽出物を作製するための方法であって、該方法は、該細胞培地を、該細胞を溶解させるのに有効な量の組成物と接触させる工程からなり、該組成物は、
(a)約11〜約16の範囲内の疎水性−親油性バランス値を有する少なくとも1種の界面活性剤;および
(b)少なくとも1種の細胞膜改変化合物
を含んでなることを特徴とする方法。 - 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項93に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、前記組成物の約0.001%(w/v)〜約10%(w/v)の範囲の量で該組成物中に存在する、請求項94に記載の組成物。
- 前記非イオン性界面活性剤がエトキシ化アルキルフェノールを含んでなる、請求項94に記載の組成物。
- 前記エトキシ化アルキルフェノールが、エトキシ化ノニルフェノールまたはオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含んでなる、請求項96に記載の組成物。
- 前記カチオン性界面活性剤が、脂肪族アミンまたはエトキシ化獣脂アミンのエチレンオキシド縮合物を含んでなる、請求項94に記載の組成物。
- 前記界面活性剤がエトキシ化アミンを含んでなる、請求項93に記載の組成物。
- 前記界面活性剤が、Tomah E−18−5、Tomah E−18−15、Rhodameen VP532/SPB、Trymeen 6607、Triton X−100からなる群より選択される、請求項93に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、細胞膜もしくは細胞壁を実質的に溶解させるかまたは細胞膜もしくは細胞壁において孔形成を引き起こすのに有効な量で前記組成物中に存在する、請求項93に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、リン脂質感受性のCa+2依存性プロテイン・キナーゼを阻害し、かつ細胞膜を攻撃する、請求項93に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、膜の透過性を変化させるかまたは膜を破壊する、請求項93に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシン−β−ノナペプチド(PMBN)、アルキルグリコシドもしくはアルキルチオグリコシド、ベタイン界面活性剤、第4級アンモニウム塩、アミン、リジンポリマー、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼA2またはホスホリパーゼA2活性化ペプチド(PLAP)を含んでなる、請求項93に記載の方法。
- 前記細胞膜改変化合物が抗生物質である、請求項93に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、硫酸ポリミキシンBまたはバンコマイシンを含んでなる、請求項105に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、ポリミキシンB1とポリミキシンB2との混合物を含んでなる、請求項105に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物が、アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシドを含んでなる、請求項104に記載の組成物。
- 前記細胞膜改変化合物がオクチルチオグルコシドを含んでなる、請求項108に記載の組成物。
- 前記オクチルチオグルコシドが、少なくとも0.4%(w/v)かつ1%(w/v)未満の終濃度で存在する、請求項109に記載の組成物。
- 前記オクチルチオグルコシドが、0.4%(w/v)〜0.6%(w/v)の終濃度で存在する、請求項110に記載の組成物。
- 緩衝塩をさらに含んでなる、請求項93に記載の組成物。
- 前記緩衝塩が、約6.5〜約9.0のpH範囲を維持するのに充分な量で存在する、請求項112に記載の組成物。
- 消泡剤をさらに含んでなる、請求項93に記載の組成物。
- 親和性標識していないタンパク質の非特異的結合を低減させる薬剤をさらに含んでなる
、請求項93に記載の組成物。 - リゾチームをさらに含んでなる、請求項93に記載の組成物。
- 前記組成物が水溶液の形態である、請求項93に記載の組成物。
- 前記溶液が濃縮物である、請求項117に記載の組成物。
- 約6.5〜約9.0のpH範囲を維持するのに充分な量の前記緩衝塩をさらに含んでなる、請求項115に記載の組成物。
- Tomah E−18−15、Triton X100およびオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項119に記載の組成物。
- 500mM HEPES(pH7.5)中に2%のTomah E−18−15、2%のTriton X100および6%のオクチルβチオグルコピラノシドを含んでなる、請求項93に記載の組成物。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009247352A (ja) * | 2008-04-01 | 2009-10-29 | Millipore Corp | 膜上で生細胞を検出するための、nog、hmp、塩化ルビジウム及び/又は塩化リチウムを含む細胞透過処理のための組成物 |
KR101432277B1 (ko) | 2012-05-22 | 2014-08-21 | 한국과학기술원 | 양이온성 고분자를 이용한 미세조류로부터 지질의 추출방법 및 추출된 지질을 이용한 바이오디젤 제조방법 |
JP2014200200A (ja) * | 2013-04-05 | 2014-10-27 | 栄研化学株式会社 | β−ラクタマーゼ検出方法 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102005015005A1 (de) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe |
WO2007063691A1 (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | 溶菌剤 |
CA2652118C (en) * | 2006-05-11 | 2015-07-07 | Becton, Dickinson And Company | Method of protein extraction from cells |
CN1869704B (zh) * | 2006-06-14 | 2010-06-30 | 厦门大学 | 快速鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法 |
EP2197498A2 (en) * | 2007-08-31 | 2010-06-23 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Clustered magnetic particles as tracers for magnetic particle imaging |
US9207240B2 (en) * | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
EP2473596B1 (en) | 2009-09-03 | 2017-12-13 | Becton, Dickinson and Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
ES2682281T3 (es) | 2012-03-16 | 2018-09-19 | Stat-Diagnostica & Innovation, S.L. | Cartucho de prueba con módulo de transferencia integrado |
KR102350205B1 (ko) | 2013-03-15 | 2022-01-14 | 안선 바이오파르마, 아이엔씨. | 단백질 정제의 신규한 방법 |
US10436680B2 (en) | 2013-10-15 | 2019-10-08 | Kianoosh Peyvan | Capture, disruption, and extraction apparatus and method |
US11051532B2 (en) | 2017-09-22 | 2021-07-06 | Impossible Foods Inc. | Methods for purifying protein |
CN111505142B (zh) * | 2020-04-26 | 2022-09-27 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种多黏菌素b的氨基酸构型分析方法和n-多肽端序列测序方法 |
GB2596815A (en) * | 2020-07-06 | 2022-01-12 | Agile Life Sciences Ltd | Kit and method |
GB202010371D0 (en) * | 2020-07-06 | 2020-08-19 | Agile Life Sciences Ltd | Methods and uses relating to proteins |
US20220412951A1 (en) * | 2021-06-16 | 2022-12-29 | Instrumentation Laboratory Company | Blood cell lysis compositions and uses thereof |
CN113952944B (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-29 | 浙江湃肽生物有限公司深圳分公司 | 一种纯化九肽-1的方法 |
WO2024096505A1 (ko) * | 2022-10-31 | 2024-05-10 | 삼성바이오에피스 주식회사 | 친화성 크로마토그래피를 통해 불순물을 제거하는 방법 |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US54435A (en) * | 1866-05-01 | Improvement in hay-forks | ||
US12982A (en) * | 1855-05-29 | Machine fob making paper bags | ||
US34066A (en) * | 1862-01-07 | Improved automatic fan | ||
CA1231306A (en) * | 1983-03-03 | 1988-01-12 | Erich Hochuli | Purification of interferon |
EP0173937A2 (en) | 1984-09-07 | 1986-03-12 | Miles Laboratories, Inc. | Method of increasing the permeability of yeast cells |
BE903626A (fr) | 1985-11-13 | 1986-03-03 | Labofina Sa | Procede pour la recuperation de polypeptides localises dans l'espace periplasmique de la levure. |
US5124256A (en) * | 1985-11-13 | 1992-06-23 | Labofina, S.A. | Process for recovering polypeptides localized in the periplasmic space of yeast without breaking the cell wall by using an non-ionic detergent and a neutral salt |
AU597924B2 (en) * | 1985-12-11 | 1990-06-14 | Natinco Nv | Solubilization of protein aggregates |
US5183746A (en) * | 1986-10-27 | 1993-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- |
AU609824B2 (en) * | 1987-06-15 | 1991-05-09 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
US5489676A (en) * | 1990-03-30 | 1996-02-06 | Elsbach; Peter | Polypeptides that potentiate bactericidal/permeability-increasing protein and methods for treating bacterial infections |
US5593866A (en) * | 1992-08-21 | 1997-01-14 | The University Of British Columbia | Cationic peptides and method for production |
US5552294A (en) * | 1992-10-20 | 1996-09-03 | Children's Medical Center Corporation | Rapid detection of virulence-associated factors |
US6335160B1 (en) * | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
CA2184270C (en) | 1994-03-10 | 1999-08-17 | Daniel Louis Kacian | Method for suppressing inhibition of enzyme-mediated reactions by ionic detergents |
US5750357A (en) * | 1994-05-18 | 1998-05-12 | Microquest Diagnostics, Inc. | Method of rapid analyte detection |
US6093563A (en) * | 1994-07-08 | 2000-07-25 | Ibex Technologies R And D, Inc. | Chondroitin lyase enzymes |
DE69636935T2 (de) * | 1995-01-27 | 2007-11-22 | Genencor International, Inc., Palo Alto | Verfahren zur extraktion von enzymen unter verwendung von tensiden |
US5760189A (en) * | 1995-06-02 | 1998-06-02 | Genetics Institute, Inc. | Protein recovery & purification methods |
US5973137A (en) * | 1996-02-13 | 1999-10-26 | Gentra Systems, Inc. | Low pH RNA isolation reagents, method, and kit |
US6020307A (en) * | 1997-04-25 | 2000-02-01 | Ony, Inc. | Compositions and methods for isolating lung surfactant hydrophobic proteins SP-B and SP-C |
US5981235A (en) * | 1996-07-29 | 1999-11-09 | Promega Corporation | Methods for isolating nucleic acids using alkaline protease |
ES2383640T3 (es) * | 1996-11-20 | 2012-06-25 | Crucell Holland B.V. | Composiciones de adenovirus que pueden obtenerse mediante un método de producción y purificación mejorado |
DE69831522T2 (de) * | 1997-03-03 | 2006-06-14 | Amersham Biosciences Uk Ltd | In-situ Zellextraktion und Assay-Verfahren |
US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
US6875617B2 (en) | 1997-11-07 | 2005-04-05 | Geno Technology, Inc. | Agent for protein precipitation, a method of protein precipitation, a method of protein assay using protein precipitation agent, and a kit for protein assay |
WO1999033861A1 (en) * | 1997-12-31 | 1999-07-08 | University Of Texas Systems | Improved telomerase extraction method |
US6242235B1 (en) * | 1998-06-24 | 2001-06-05 | Promega Corp. | Polymerase stabilization by polyethoxylated amine surfactants |
US8187278B2 (en) * | 1998-08-25 | 2012-05-29 | Advanced Photodynamic Technologies, Inc. | Photodynamic cellular and acellular organism eradication utilizing a photosensitive material and benzalkonium chloride |
US6123966A (en) * | 1998-09-03 | 2000-09-26 | Alcide Corporation | Stabilized two-part disinfecting system and compositions and methods related thereto |
US6174704B1 (en) * | 1998-12-23 | 2001-01-16 | Pierce Chemical Company | Method for recovery of proteins prepared by recombinant DNA procedures |
ATE412007T1 (de) | 1999-06-25 | 2008-11-15 | Wyeth Corp | Extraktion von integralen membranproteinen |
AU2001236632A1 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-14 | Regeneration Technologies, Inc. | Extraction of growth factors from tissue |
SE0001132D0 (sv) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | Cavidi Tech Ab | Method of concentrating and recovering a viral enzyme activity from biological samples |
JP2004504330A (ja) | 2000-07-13 | 2004-02-12 | インヴィトロジェン コーポレーション | 溶解マトリクスを用いてタンパク質およびペプチドの迅速な抽出および単離のための方法および組成物 |
US7229789B1 (en) | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
US7320793B2 (en) * | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
AU2002330091A1 (en) * | 2001-09-10 | 2003-03-24 | Emd Biosciences, Inc. | Method for recovering and analyzing a cellular component of cultured cells without having to harvest the cells first |
WO2003066874A1 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Degradation of hydrophobic ester pesticides and toxins |
WO2004035809A1 (en) * | 2002-10-17 | 2004-04-29 | Conestoga-Rovers & Associated Limited. | Rapid coliform detection system |
CN101040054A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-09-19 | 普罗美加公司 | 微生物atp提取及检测系统 |
-
2003
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JP2014200200A (ja) * | 2013-04-05 | 2014-10-27 | 栄研化学株式会社 | β−ラクタマーゼ検出方法 |
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