JP2004504330A - 溶解マトリクスを用いてタンパク質およびペプチドの迅速な抽出および単離のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は一般的に、タンパク質分子またはペプチド分子の抽出および単離において使用するための組成物、方法、およびキットに関する。より具体的には、本発明は、溶解および１つまたは複数の追加的な単離手順（例えば、１回または複数の濾過および／またはクロマトグラフィー手順）を介した、細胞（例えば、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞、ウイルス、酵母細胞、または植物細胞）からのタンパク質分子またはペプチド分子の単離において有用な、組成物、方法、およびキットに関する。特に本発明は、１つまたは複数の支持体（例えば、ポリオレフィン、焼結ポリエチレン、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、酢酸セルロース、シリカなど）を含みうる、内蔵型の溶解マトリクス／濾過マトリクスを用いてタンパク質分子またはペプチド分子が単離される、組成物、方法、およびキットに関する。本発明の組成物、方法、およびキットは、様々な形態のタンパク質分子またはペプチド分子を細胞から単離するのに適している。本発明の組成物、方法、およびキットは、特に、細菌細胞において可溶性タンパク質または封入体のいずれかとして発現された組換えタンパク質分子またはペプチド分子を迅速に単離するのに非常に適している。本発明は、特に、多数の供給源からのタンパク質および／またはペプチドの迅速な単離および／または分析を可能にするハイスループット適用において有用である。

Description

【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、分子生物学およびタンパク質生化学の分野内である。本発明は、一般的に、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための組成物、方法、およびキットに関する。さらに詳細には、本発明は、溶解および１つまたは複数の追加的な単離手順（例えば、１つまたは複数のクロマトグラフィー／濾過分離）を介した、細胞からのタンパク質分子およびペプチド分子の単離において有用な、このような組成物、方法、およびキットに関する。本発明の組成物、方法、およびキットは、様々な形態のタンパク質分子およびペプチド分子を細胞から単離するのに適している。
【０００２】
背景技術
天然のタンパク質および組換えタンパク質の精製における第１の段階は、これらのタンパク質を産生する細胞を溶解して、細胞成分を遊離させる段階である。典型的な物理的細胞溶解法として超音波処理およびフレンチプレス用セル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ）の使用が挙げられ、これらは、溶解を助ける化学薬品または酵素剤と併用されることが多い。物理的な方法による溶解を用いると、膜断片および、染色体ＤＮＡの剪断よりもたらされる小さなＤＮＡ分子が生じ、これらはいずれも、その後の所望のタンパク質の分析を妨げることがある。これらの汚染物質の除去は、費用と時間のかかる追加的な精製段階を必要とする。
【０００３】
細胞からタンパク質を迅速に抽出するために、いくつかの市販キットが入手可能である。最も人気のあるものの２つが、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＢ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ）である。これらのキットは両方とも、細胞膜を破壊し、それによってタンパク質を含む細胞成分を放出させるために界面活性剤溶液を使用する。これらの方法は両方とも精製段階と抽出法を一緒に行わない。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）法は、溶解後の試料中に存在する多量の染色体ＤＮＡによる溶解産物中の粘性を減らすために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを使用する。しかし、この製品は、ヌクレアーゼ消化によって必ず生じる小さなＤＮＡ断片を除去する方法を全く含んでいない。Ｂ−ＰＥＲ製品は単に、抽出システムを意図したものである。このシステムは一部の不溶性破片を除去する遠心分離段階を含んでいるが、その後精製は行われない。Ｂ−ＰＥＲ製品を用いて生じた溶解産物の汚染物質は全て、別の精製法を用いて除去しなければならない。
【０００４】
典型的なタンパク質精製法として、沈殿（例えば、ＰＥＩ、ＰＥＧ、および硫酸アンモニウム）、濾過、調製用電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）などが挙げられる。これらの方法は、細菌溶解産物または部分的に精製されたタンパク質調製物に対して行われることが多い。クロマトグラフィーに基づく追加的な方法として、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらの方法のいずれかおよび全てが、適切な収率を確実なものにするために効率的な溶解手順に依存している。
【０００５】
当技術分野には細胞を溶解する方法が存在するが、穏やかな細胞溶解と、汚染ＤＮＡ、膜断片、および細胞破片からの関心対象のタンパク質およびペプチドの分離と、追加的な精製法とを組み合わせて１つの手順または少数の手順にした迅速な方法が当技術分野において必要とされる。本発明は、このような組成物、方法、およびキットを提供する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、一般的に、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための組成物、方法、およびキットに関する。さらに詳細には、本発明は、溶解手順および１つまたは複数の追加的な単離手順（例えば、１つまたは複数の濾過手順）を介した、細胞（例えば、細菌細胞、動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または植物細胞）からのタンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において有用な、このような組成物、方法、およびキットに関する。特に本発明は、溶解マトリクス／フィルターマトリクスを用いた１つの手順または少数の手順において所望のタンパク質分子およびペプチド分子が抽出および単離される、組成物、方法、およびキットに関する。
【０００７】
さらに詳細には、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させる段階；
（ｂ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源からタンパク質分子またはペプチド分子が放出されるように、１つまたは複数の細胞または細胞供給源を溶解または破壊する段階（例えば、細胞膜および／または細胞壁の完全性を破壊する段階）；ならびに
（ｃ）タンパク質分子およびペプチド分子を収集する段階。
【０００８】
別の態様において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源からタンパク質分子またはペプチド分子が放出されるように、１つまたは複数の細胞または細胞供給源を溶解または破壊する段階（例えば、細胞膜および／または細胞壁の完全性を破壊する段階）；
（ｂ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させる段階；ならびに
（ｃ）タンパク質分子およびペプチド分子を収集する段階。
【０００９】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させる段階；
（ｂ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源からタンパク質分子またはペプチド分子が放出されるように、１つまたは複数の細胞または細胞供給源を溶解または破壊する段階（例えば、細胞膜および／または細胞壁の完全性を破壊する段階）；
（ｃ）フィルターと、タンパク質凝集物および封入体を破壊および／または可溶化する溶出／破壊組成物を接触させる段階；ならびに
（ｄ）タンパク質分子またはペプチド分子を収集する段階。
【００１０】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子を抽出および単離する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源からタンパク質分子またはペプチド分子が放出されるように、１つまたは複数の細胞または細胞供給源を溶解または破壊する段階（例えば、細胞膜および／または細胞壁の完全性を破壊する段階）；
（ｂ）１つまたは複数の細胞または細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させる段階；
（ｃ）フィルターと、タンパク質凝集物および封入体を破壊および／または可溶化する溶出／破壊組成物を接触させる段階；ならびに
（ｄ）タンパク質分子またはペプチド分子を収集する段階。
【００１１】
本発明によると、細胞とマトリクスを接触させる前に、細胞を溶解または破壊してもよいが、好ましくは、細胞の溶解または破壊は、細胞とマトリクスを接触させた後に行われ、より好ましくは、細胞とマトリクスを接触させるのと同じ時に、またはほぼ同じ時に（例えば、同時にまたは実質的に同時に）行われる。別の局面において、細胞は、好ましくは、細胞溶解もしくは破壊の前に、または細胞溶解もしくは破壊の間に、マトリクス内またはマトリクス上に捕捉される。さらに別の局面において、細胞は、細胞溶解もしくは破壊を引き起こすか、または細胞溶解もしくは破壊を助ける組成物または化合物と接触させることによって溶解／破壊されるが、機械的な力または物理的な力（例えば、圧力、超音波処理、温度（加熱、凍結）、および／または凍結融解など）が本発明に従って用いられてもよい。細胞を破壊／溶解するために、機械的な力、物理的な力、または溶解組成物／化合物の任意の組み合わせを使用することができる。好ましくは、天然のコンフォメーションの可溶性タンパク質が機能解析または構造解析に望ましい場合、細胞は、所望のタンパク質またはペプチドの天然のコンフォメーションまたは機能を実質的に乱さない薬剤を用いて溶解または破壊される。
【００１２】
１つまたは複数の細胞が本発明に従って溶解／破壊／透過化された後に、大きな分子量の分子、構造、および凝集物から可溶性タンパク質分子およびペプチド分子が実質的に分離される。このような分離は、好ましくは、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを遅らせ、低分子量分子の流れを実質的に遅らせないマトリクスによって達成される。例えば、ゲル電気泳動によって溶出液試料を分析した（例えば、アガロースを臭化エチジウムで染色した）時に、１つまたは複数の高分子量バンドがほとんど、または全く観察されなければ、染色体ＤＮＡはマトリクスに実質的に捕捉／結合されたとみなされる。このような結合／捕捉作用はこのような分子の物理的分離を可能にし、この場合、関心対象の小さな分子（例えば、可溶性タンパク質およびペプチド）はマトリクスを実質的に通過するのに対して、大きな分子（例えば、染色体ＤＮＡ、膜断片、および封入体）はマトリクスに捕捉または結合される。
【００１３】
本発明の別の好ましい局面において、１つまたは複数の細胞が本発明に従って溶解／破壊／透過化された後に、可溶性タンパク質およびペプチドは本発明のフィルターを自由に通過するのに対して、タンパク質およびペプチドの凝集物および封入体は本発明のフィルター上／フィルター内に保持される。次いで、フィルターと、タンパク質またはペプチドの凝集物または封入体を破壊し、構成タンパク質が本発明のフィルターを通って自由に流れるようにする溶出組成物（例えば、６Ｍ尿素）が接触される。
【００１４】
本発明によると、マトリクスは、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを遅らせ、および／または低分子量分子の流れを実質的に遅らせない任意の多孔質材料でよい。このようなマトリクスとして、ポリエステルマトリクス、ポリオレフィンマトリクス、焼結ポリエチレンマトリクス、ニトロセルロースマトリクス、酢酸セルロースマトリクス、セルロースマトリクス、多孔質セラミックマトリクス、シリカマトリクス、多糖マトリクス（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、アガロース、ＳＥＰＨＡＤＥＸなど）、ポリマーマトリクス（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、ＢＩＯ−ＧＥＬ等）などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。好ましい局面において、マトリクスは固体マトリクスであるが、マトリクスは半固体マトリクスでもよい。適切なマトリクス材料は、例えば、フィルトロナリッチモンド（Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ゲントラシステムズ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、トソハース（Ｔｏｓｏｈａａｓ）（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）、バイオスペラ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）社（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）、およびポレックステクノロジーズ（Ｐｏｒｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（Ｆａｉｒｂｕｒｎ、ＧＡ）から市販されている。関連した局面において、マトリクスは、平板、ウェハー、円柱、長方形、ビーズ、ゲル、正方形、カートリッジ、スワブチップ（ｓｗａｂ ｃｈｉｐ）、プラグ、フリット、膜などを含む様々なサイズ、形状、および形態で調製されてもよく、チューブ、瓶、バイアル、アンプル、マイクロスピンチューブ（ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ ｔｕｂｅ）、ウェル、マイクロウェルプレート、バックなどの様々な容器に入れられてもよい。好ましい局面において、本発明は、高分子量の分子、構造、および凝集物から可溶性タンパク質分子およびペプチド分子を分離または実質的に分離するために、サイズ分離クロマトグラフィーおよび／または濾過の使用を伴う。従って、望ましいサイズ分離をもたらす任意のマトリクス（例えば、フィルター、クロマトグラフィー支持体など）を本発明において使用することができる。当業者は、所望のタンパク質分子およびペプチド分子ならびに細胞の種類または細胞供給源の種類およびサイズを考慮に入れて、適切なマトリクス、マトリクスの孔径、マトリクスのサイズ、形状、および寸法を容易に決定することができる。別の局面において、本発明は、このようなサイズ分離／濾過と細胞溶解／破壊を組み合わせる（好ましくは、細胞供給源が濾過マトリクスと接触している時に、もしくは接触するのとほぼ同じ時に、または細胞供給源が濾過マトリクスと接触した後に、このような溶解／破壊が行われる）。マトリクス内の孔または通路は、一般的に、大きな分子、構造、および凝集物の通過を妨げるのに十分に小さいが、関心対象の可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の通過を可能にするのに十分に大きい。可能性のある孔径は、直径約０．１ミクロン〜約１０，０００ミクロン、直径約０．１ミクロン〜約５，０００ミクロン、直径約０．１ミクロン〜約１，０００ミクロン、直径約１ミクロン〜約５００ミクロン、直径約１０ミクロン〜約５００ミクロン、または直径約２５ミクロン〜約４００ミクロンでもよい。
【００１５】
好ましい態様において、孔含有マトリクスに加えて、追加的な複数の（例えば、１個、２個、３個、またはそれ以上の）マトリクスを本発明の実施において使用することができる。１つの態様において、追加的な孔含有マトリクスは、残存する細胞破片を濾過して除去する、溶解マトリクス下の多孔質フィルターである。このような多孔質フィルターとして、ガラスフィルター膜（ＧＦ／Ｆ）、酢酸セルロース、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、およびポリエーテルスルホンが挙げられる。このような多孔質膜は、例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、３Ｍ、ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）、およびミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から市販されている。孔径は、約０．１ミクロン〜１０ミクロン、より好ましくは約０．５ミクロン〜１．５ミクロン、最も好ましくは約０．７ミクロン〜１ミクロンでもよい。好ましいフィルターは、孔径が０．７ミクロンのワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｆガラス繊維フィルターである。使用することができる追加的なマトリクスは、必要に応じて、機械的な支えをもたらす、１つまたは複数の他のマトリクスの下に配置されるフリットである。
【００１６】
別の好ましい態様において、細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する組成物または化合物は、１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。非イオン性界面活性剤として、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３．１４、デオキシコレート；ｎ−ドデカノイルスクロース；ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−デカノイルスクロース；ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド；ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−オクタノイルスクロース；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド；ＡＰＯ−１０；ＡＰＯ−１２；Ｂｉｇ ＣＨＡＰ；Ｂｉｇ ＣＨＡＰ，Ｄｅｏｘｙ；ＢＲＩＪ（登録商標）３５；Ｃ_１２Ｅ_５；Ｃ_１２Ｅ_６；Ｃ_１２Ｅ_８；Ｃ_１２Ｅ_９；シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシド；ジギトニン；ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｃ−１００；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−０８０；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−１００；ＨＥＣＡＭＥＧ；ＭＥＧＡ−１０；ＭＥＧＡ−８；ＭＥＧＡ−９；ＮＯＧＡ；ＮＰ−４０；ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−１２７；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４；ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０；またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、本発明の方法と共にイオン性界面活性剤を使用することができる。イオン性界面活性剤として、ＢＡＴＣ、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコリソコール酸（ｇｌｙｃｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ラウロイルサルコシン、タウロケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデヒドロコール酸、タウロリソコール酸（ｔａｕｒｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、タウロウルソデオキシコール酸、およびＴＯＰＰＡが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。両性イオン界面活性剤もまた本発明の組成物および方法と共に使用することができる。両性イオン界面活性剤として、アミドスルホベタイン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、カルボキシベタイン、およびメチルベタインが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、１つもしくは複数の酵素（例えば、ザイモリエース、リチケース（ｌｙｔｉｃａｓｅ）、リゾチーム、もしくはリソスタフィン）；１つもしくは複数の無機酸塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、もしくは塩化リチウム）；１つもしくは複数の酸および／もしくは塩基もしくは緩衝剤（例えば、ｐＨを上昇または低下させる緩衝剤）；あるいは細胞膜および／もしくは細胞壁の完全性の破壊を助けることができる（すなわち、細胞膜および／もしくは細胞壁を溶解するか、または細胞膜および／もしくは細胞壁に孔を形成する）他の任意の化合物もしくは酵素（例えば、ポリミキシンＢ）を使用することができる。別の局面において、組成物は、不要な成分または汚染物質を分解、破壊、または除去する１つまたは複数の化合物または酵素（例えば、細胞供給源から放出される所望でない核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を除去または破壊または分解する、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ、およびヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）を含んでもよい。天然のコンフォメーションの可溶性タンパク質が望ましい場合、非変性界面活性剤を使用すべきである。１つの特に好ましい局面において、１つまたは複数の細胞または細胞供給源をマトリクスに適用する前に、細胞溶解／破壊組成物をマトリクスに吸着させてもよく、マトリクスと複合体化させてもよく、マトリクスと会合させてもよい。好ましい局面において、組成物をマトリクス内で、またはマトリクス上で乾燥させる。従って、好ましい局面において、マトリクスは細胞溶解／破壊化合物または組成物を含む。この局面において、細胞が組成物含有マトリクスと接触している時に、もしくは接触するのとほぼ同じ時に、細胞の破壊／溶解が行われてもよい。別の局面において、細胞をマトリクスに添加した後に（例えば、マトリクスに結合させた後またはマトリクスと会合させた後に）、組成物が添加される。さらに別の局面において、細胞をマトリクスに添加する前に、組成物が細胞に添加される。この局面では、細胞がマトリクスと接触している時に実質的に破壊／溶解されるように細胞膜／細胞壁を弱めるように、組成物を配合することができる。または、組成物はマトリクスに添加される前に、細胞を実質的に溶解／破壊する。
【００１７】
本発明によると、関心対象のタンパク質分子およびペプチド分子は、水溶液（例えば、緩衝化塩溶液または溶出緩衝液）を用いた溶出によってマトリクスから除去することができる。不溶性分子（例えば、染色体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、膜断片、タンパク質凝集物および封入体）はマトリクス内またはマトリクス上に実質的に保持され、このため、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子はマトリクスから溶出されるか、または実質的に除去される。水溶液の添加を伴う、または水溶液の添加を伴わない、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子のこのような溶出または除去は、マトリクスから所望のタンパク質またはペプチド試料を流出させる遠心分離、重力、真空、圧力などによって容易にすることができる。次いで、関心対象の可溶性タンパク質分子およびペプチド分子を、標準的なタンパク質精製法によってさらに精製することができる。
【００１８】
本発明の別の好ましい態様において、マトリクスから可溶性タンパク質分子およびペプチド分子が溶出または除去された後に、不溶性材料（例えば、膜断片および／または封入体）を含むマトリクスと、不溶性材料（膜断片および／または封入体）を破壊し、構成タンパク質を可溶化する第２の溶出／破壊試薬（例えば、６Ｍ尿素）が接触される。次いで、これらの遊離されたタンパク質分子またはペプチド分子をマトリクスから溶出または実質的に除去することができる。水溶液の添加を伴う、または水溶液の添加を伴わない、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子のこのような溶出または除去は、マトリクスから所望のタンパク質またはペプチド試料を流出させる遠心分離、重力、真空、圧力などによって容易にすることができる。第２の溶出緩衝液に含まれる適切な組成物として、適切に、封入体または膜断片に存在するタンパク質分子またはペプチド分子を破壊および可溶化することができる組成物が挙げられる。適切な組成物として、尿素、塩化グアナジニウム（ｇｕａｎａｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、界面活性剤、カオトロピック剤（ｃｈａｅｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、塩などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明の別の局面において、細胞の溶解／破壊または不溶性材料の破壊／可溶化は、好ましくは、両方の機能を果たす１個の組成物または試薬を用いて、一段階で達成することができる。このような組成物は尿素、塩化グアナジニウム、イオン性または非イオン性界面活性剤を含んでもよいが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
本発明による方法は、任意の細胞または細胞供給源からタンパク質分子およびペプチド分子を単離するのに適している。細胞または細胞供給源として、細菌細胞（特に、大腸菌細胞）、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞（特に、昆虫細胞および哺乳動物細胞（ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨｅｐＧ２細胞などを含む））、ならびに植物細胞が挙げられる。これらの細胞はいずれも、形質転換細胞、樹立細胞系、癌細胞、初代細胞、または正常細胞でもよい。特に、本発明の方法は、可溶性タンパク質およびペプチドを単離するのに非常に適している。可溶性タンパク質およびペプチドとして、ｃＤＮＡ発現ライブラリーから発現されたタンパク質およびペプチドまたは原核生物宿主もしくは真核生物宿主内のプラスミドから発現された組換えタンパク質およびペプチドが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法によって産生された、単離されたタンパク質分子およびペプチド分子に関する。本発明はまた、標準的な生化学的技法またはクロマトグラフィー技法（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、沈殿など）による、本発明の単離されたタンパク質分子およびペプチド分子の追加的な操作に関する。
【００２１】
本発明は、さらに、ハイスループットスクリーニングのために、本発明のタンパク質分子またはペプチド分子を固体支持層の上に固定化することに関する。このような固体支持層の例として、マルチウェルプレート、チップ、スライド、ウエハー、フィルター、シート、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。次いで、適切な支持層の上に固定化されたタンパク質またはペプチドは、当技術分野において周知の任意の方法によってスクリーニングすることができる。このような方法として、抗体とのハイブリダイゼーション、基質との接触、リガンドとの接触、生物学的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド等）との接触などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。支持層の上に固定化されたタンパク質またはペプチドは、適切なシグナルが存在するかどうかについて分析することができる。シグナルとして、蛍光、化学発光、生物発光、光の特定の波長の吸収、特定の基質の結合、色の変化、または望ましい情報を得るのに適していると考えられる他の任意の方法を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。本発明はまた、本発明の単離されたタンパク質またはペプチドの追加的な特徴付けまたは利用に関する。
【００２２】
関連した局面において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子の単離において使用するための組成物ならびに本発明の実施によって作成された組成物に関する。本発明のこのような組成物は、好ましくは、以下のような１つまたは複数の成分を含む：
（ａ）関心対象のタンパク質分子またはペプチド分子の１つまたは複数の細胞供給源；
（ｂ）高分子量の分子、構造、または凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；および
（ｃ）細胞供給源と接触している時に細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する少なくとも１つの化合物を含む、細胞破壊部分または細胞溶解部分。
【００２３】
選択的に、本発明の組成物は、不溶性材料（特に、膜断片および／または封入体）を可溶化することができる可溶化試薬をさらに含む。
【００２４】
本発明の組成物において使用するのに好ましい細胞供給源、固体マトリクス、および溶解／破壊／透過化化合物として、本発明の方法において説明および使用されるものが挙げられる。本発明の好ましい組成物において、例えば、マトリクス材料への細胞膜／細胞壁破壊化合物のイオン結合、疎水結合、または共有結合もしくは非共有結合によって、細胞膜および／または細胞壁の完全性を破壊する有効量の化合物がマトリクスに吸着されるか、マトリクスと複合体化されるか、マトリクスと会合される。１つの態様において、このような化合物はマトリクス内で、またはマトリクス上で乾燥される。一部の市販マトリクスは、製造のために少量のＴＲＩＴＯＮ界面活性剤が繊維内に取り込まれているが、界面活性剤は、細胞の実質的な溶解／破壊／透過化を引き起こすのに十分な量で存在していない。従って、本発明によると、一般的に、少なくとも１つの追加的な細胞溶解／破壊／透過化組成物が本発明の方法に従って添加または使用される。本発明の組成物は、様々なタンパク質分子およびペプチド分子（特に、本発明に記載のタンパク質分子およびペプチド分子）の単離において有用である。
【００２５】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための成分の１つもしくは複数または本発明の組成物の１つまたは複数を含む、タンパク質分子およびペプチド分子の単離において使用するためのキットに関する。このような本発明のキットは１つまたは複数の成分を含んでもよく、この成分は、ボックス、カートン、チューブ、バイアル、アンプル、バックなどの１つまたは複数の容器に入っていてもよい。このような１つの局面において、本発明のキットは、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない（好ましくは、細胞供給源のタンパク質またはペプチドをマトリクス内またはマトリクス上に捕捉する）少なくとも１つの孔含有マトリクスを含んでもよい。
【００２６】
このようなキットは、細胞供給源からタンパク質分子およびペプチド分子が放出されるように、細胞供給源と接触している時に細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する少なくとも１つの化合物を含む細胞溶解／破壊／透過化組成物；および不溶性材料（膜断片および封入体が挙げられるが、これらに限定されるわけではない）を可溶化することができる可溶化試薬からなる群より選択される、追加的な試薬を含んでもよい。
【００２７】
少なくとも１つの孔含有マトリクスおよび細胞溶解／破壊／透過化組成物は１個の容器に入れて提供されてもよい。
【００２８】
１つのこのようなキットにおいて、マトリクスは、細胞溶解／破壊／透過化組成物または化合物を含む。有効量のこのような細胞溶解／破壊／透過化組成物または化合物を、例えば、マトリクス材料へのイオン結合、疎水結合、非共有結合または共有結合によって、マトリクスに吸着させてもよく、マトリクスと複合体化させてもよく、マトリクスと会合させてもよい。このような細胞溶解／破壊／透過化組成物はマトリクス内またはマトリクス上で乾燥されてもよく、乾燥されなくてもよい。本発明のキットにおいて使用するのに好ましい固体マトリクス材料、細胞溶解／破壊／透過化組成物および化合物、ならびに洗浄組成物および溶出組成物として、本発明の方法での使用について本明細書で説明されるものが挙げられる。本発明のキットは、本発明の単離されたタンパク質分子およびペプチド分子の追加的な精製、処理、および分析に関連して有用であり得る１つまたは複数の成分または試薬などの、１つまたは複数の追加的な試薬（例えば、クロマトグラフィー樹脂）をさらに含む。さらに、キットは、固体支持体または樹脂と複合体化させてもさせなくてもよい、１つまたは複数の組成物（例えば、抗体；タンパク質およびペプチドを改変する試薬（例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、またはホスファターゼ）；核酸；タンパク質またはペプチドに共有結合することができる組成物（例えば、蛍光標識、放射能標識、および保護基）；タンパク質およびペプチドの基質またはリガンド；あるいは試料中に存在するタンパク質およびペプチド、核酸、または１つもしくは複数の他の分子の量を検出もしくは定量するのに使用することができる任意の組成物）を含んでもよい。好ましい態様において、追加的な試薬はアフィニティクロマトグラフィー樹脂である。このような樹脂として、ＧＳＴ樹脂、ニッケル錯体樹脂、抗体が結合している樹脂、イオン交換樹脂、疎水相互作用樹脂などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。追加的な試薬は、少なくとも１つの孔含有マトリクスおよび細胞溶解／破壊／透過化組成物と同じ容器内にあってもよく（図１）、別個の容器内にあってもよい（図３、図４、および図５）。本発明のこのようなキットはまた、収集用チューブまたはレシーバプレートおよび本発明の方法を実施するためのプロトコールまたは説明書を含んでもよい。
【００２９】
本発明はまた、以下のような１つまたは複数の組成物を含む容器を含む、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための装置に関する：
（ａ）容器内で、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；ならびに
（ｂ）タンパク質またはペプチドと結合するクロマトグラフィー樹脂、不純物と結合するクロマトグラフィー樹脂、タンパク質改変試薬が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素が結合しているクロマトグラフィー樹脂、核酸が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素基質が結合しているクロマトグラフィー樹脂、フィルター、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される、少なくとも１つの組成物。
【００３０】
別の好ましい態様において、本発明は、以下のような１つまたは複数の組成物を含む容器を含む、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための装置に関する：
（ａ）容器内で、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；ならびに
（ｂ）本発明のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、タンパク質またはペプチドの基質、タンパク質またはペプチドのリガンド、タンパク質またはペプチドの補因子、タンパク質またはペプチドに結合する核酸分子、タンパク質またはペプチドの阻害剤、タンパク質またはペプチドを改変する酵素、タンパク質またはペプチドを改変する組成物、タンパク質またはペプチドと結合する組成物、タンパク質またはペプチドによって結合される組成物、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される、少なくとも１つの組成物。
【００３１】
本発明のキット、組成物、装置、および方法はまた、本発明の成分、組成物、または装置のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに詳細には、本発明のキットは、本発明の１つまたは複数の装置および本明細書に記載の１つまたは複数の他の組成物を含んでもよい。
【００３２】
本発明の他の好ましい態様は、当技術分野において周知のもの、以下の図面および本発明の説明、ならびに特許請求の範囲を考慮すれば、当業者には明らかであると考えられる。
【００３３】
本発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質および／またはペプチドを含む細胞からのタンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用することができる組成物、方法、およびキットを提供する。本発明に従って、任意の細胞、組織、器官、細胞集団などをタンパク質およびペプチドの供給源として使用できることが当業者に容易に理解されると考えられる。
【００３４】
以下の説明において、分子生物学、生化学、およびタンパク質化学の分野において用いられる多数の用語が広範に使用される。このような用語に与えられる範囲を含めて、明細書および特許請求の範囲を明確かつ首尾一貫して理解できるようにするために、以下の定義が設けられる。
【００３５】
孔
本明細書において使用される「孔」という用語は、マトリクス内の１個の小さな空間または開口部を意味する。孔は、球形、円錐形、長円形、円筒形、または不定形でもよい。好ましい態様において、孔は、流路に沿って一直線に並んだ、またはほぼ一直線に並んだ３本以上の繊維が交差することによって形成される。本発明のマトリクスの孔の平均直径は、直径約０．１〜約１０，０００ミクロン、直径約０．１〜約５，０００ミクロン、直径約０．１〜約１，０００ミクロン、直径約１〜約５００ミクロン、直径約１０〜約５００ミクロン、または直径約２５〜約４００ミクロンの範囲内であり得る。
【００３６】
高分子量の分子または構造
本明細書において使用されるこの用語は、大きすぎて選択されたマトリクスの孔を自由に通過できない任意の分子または構造を指す任意の名称である。分子または構造を「高分子量」と呼ぶことは、選択されたマトリクスに依存して変化しうることに留意すべきである。一般に「高分子量」とみなされている分子および構造の例として、染色体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、膜断片、リポソーム、ミトコンドリア、葉緑体、リボソーム、または封入体（分子の凝集物）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
宿主
関心対象のタンパク質および／またはペプチドを産生する任意の原核細胞または真核細胞
「宿主」または「宿主細胞」という用語は本明細書で同義に使用することができる。このような宿主の例については、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。好ましい原核生物宿主として、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、アグロバクター属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ａ．ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、カリオファノン属（Ｃａｒｙｏｐｈａｎｏｎ）などの細菌が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌である。本発明において特に関心対象となる細菌宿主として、大腸菌Ｋ１２、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、およびＨＢ１０１株が挙げられる。好ましい真核生物宿主として、菌類、魚類細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特に好ましい動物細胞は、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、Ｓｆ２１細胞、およびトリコプルサ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）；線虫細胞（例えば、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）；ならびに哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞）である。本発明によると、宿主または宿主細胞は、単離しようとする所望のタンパク質および／またはペプチド分子の細胞供給源として役立つことがある。
【００３８】
天然のコンフォメーション
（天然のコンフォメーションおよび機能においてなど）本明細書において使用される「天然のコンフォメーション」という用語は、生物宿主において存在することが知られているような、アミノ酸鎖の三次構造もしくは四次構造（または三次構造もしくは四次構造の範囲）と定義され、ここで、タンパク質またはペプチドは介入されることなく天然のまま翻訳される。一般的に、天然のコンフォメーションのタンパク質またはペプチドはまた全ての天然の機能および活性も有すると当技術分野において考えられている。天然のコンフォメーションの混乱は天然の機能または活性の混乱につながることが多いが、必ずしも天然の機能または活性の混乱につながるとは限らず、このようなタンパク質およびペプチドは変性したタンパク質およびペプチドともいうことができる。大規模な操作（例えば、リモルディング法）なしでは天然の構造を取り戻すことができない場合、タンパク質またはペプチドの構造は、この用途のために、混乱しているとみなされる。天然のコンフォメーションを実質的に維持しているタンパク質およびペプチドは、実質的に全ての天然の機能および機能を有する。
【００３９】
可溶性タンパク質
（小さな可溶性タンパク質分子においてなど）本明細書において使用される「可溶性タンパク質」という用語は、その現行のコンフォメーションにおいて、非特異的な方法（例えば、沈殿、凝集など）で他のタンパク質分子と大きな凝集物を形成しないように溶媒分子に適切に取り囲まれているタンパク質分子と定義される。対照的な用語は、膜貫通タンパク質、変性したタンパク質、および封入体を形成するタンパク質を含む、不溶性タンパク質である。ある溶媒（例えば、水性溶媒）中で不溶性になり得る（封入体を形成し得る）タンパク質またはペプチドは、異なる緩衝液系（例えば、６Ｍ尿素）において可溶性になることがある。
【００４０】
単離された
（「単離されたタンパク質分子」または「単離されたペプチド分子」においてなど）本明細書において使用される「単離された」という用語は、単離された材料、成分、または組成物が、単離された材料、成分、または組成物の一部でない他の材料、汚染物質などから少なくとも部分的に精製されていることを意味する。例えば、「単離されたタンパク質分子」は、細胞、組織、器官、または生物において会合している可能性のある汚染物質（例えば、膜断片または核酸）の少なくとも一部を除去するように処理されているタンパク質分子である。しかし、当業者に理解されるように、単離されたタンパク質および／またはペプチド分子を含む溶液が、１つまたは複数の緩衝塩、溶媒（例えば、水）、ならびに／または他のタンパク質分子およびペプチド分子を含んでもよく、それでもなお、所望のタンパク質分子およびペプチド分子は、その出発材料に関して「単離された」タンパク質分子およびペプチド分子とみなされ得る。
【００４１】
可溶化試薬、化合物、または組成物
本明細書において使用される可溶化試薬、化合物、または組成物とは、不溶性材料（例えば、膜断片、封入体など）を効果的に可溶化する試薬、化合物、または組成物を意味する。さらに詳細に述べると、この用語は、膜断片および／または封入体を可溶化できることを意味する。可溶化とは、組成物が、生物学的高分子（例えば、タンパク質）の凝集物、凝塊、または複合体を（好ましくは、非特異的な方法（例えば、沈殿、凝集など）で分子が他のタンパク質分子と凝集物を形成しないように十分な溶媒分子で分子を効果的に取り囲むことによって）破壊できることを意味する。好ましくは、可溶化組成物、化合物、または試薬は、関心対象の不溶性分子全体の少なくとも約２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上を可溶化する。
【００４２】
細胞溶解／破壊／透過化化合物または組成物
本明細書において使用される「細胞破壊」または「細胞溶解」とは、細胞、組織、または生物供給源に含まれる可溶性タンパク質分子およびペプチド分子（またはその一部）が細胞、組織、または生物から放出されるように、単離しようとするタンパク質分子およびペプチド分子の供給源として用いられる細胞、組織、または生物の溶解、破裂、または穿孔をもたらす組成物または組成物の成分を意味する。本発明によると、細胞、組織、または生物は、完全に溶解／破壊／透過化される必要はなく、細胞、組織、または生物供給源に含まれるタンパク質分子およびペプチド分子の全てが放出される必要はない。好ましくは、細胞破壊または細胞溶解をする化合物または組成物は、細胞、組織、または生物に含まれる関心対象の（可溶性および不溶性）タンパク質分子またはペプチド分子全体の少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上を放出する。
【００４３】
本明細書で用いられるような、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、分子生物学、および細胞生物学の分野において用いられるその他の用語は、当業者によって一般的に理解されると考えられる。
【００４４】
タンパク質およびペプチドの供給源
本発明の方法、組成物、およびキットは、様々な細胞、組織、器官、または生物を含む任意の細胞供給源からタンパク質分子およびペプチド分子を単離するのに適している。細胞供給源は天然のものでもよく、多くの商業的供給元（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ；Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを含む）を通じて入手してもよい。細胞タンパク質およびペプチド供給源として使用することができる細胞は、原核細胞（エシェリキア属（特に、大腸菌）、セラチア属、サルモネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コレクトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびストレプトマイセス属の一員を含む細菌）でもよく、真核細胞（菌類または酵母、植物、原生動物および他の寄生生物、ならびにヒトおよび他の哺乳動物を含む動物を含む）でもよい。哺乳動物の組織または細胞（例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環器、リンパ、胃腸管、および結合組織の供給源から得られたもの（例えば、内胚葉または外胚葉起源のもの）ならびに（ヒトを含む）哺乳動物の胚または胎児から得られたもの）も、タンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用するのに適している。適切なタンパク質およびペプチド供給源はまた、所望のタンパク質およびペプチドを発現することができるプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または他のＤＮＡ分子を有する前記細胞のいずれでもよい。これらの細胞、組織、および器官は、正常なものでも、初代のものでも、形質転換されていても、または樹立細胞系でもよく、異常なものでもよい（例えば、（細菌、真菌もしくは酵母、ウイルス（ＡＩＤＳを含む）もしくは寄生生物により引き起こされる）感染症、遺伝的もしくは生化学的な病理（例えば、嚢胞性繊維症、血友病、アルツハイマー病、統合失調症、筋ジストロフィー、もしくは多発性硬化症）、または癌および癌過程に関与するもの）。本発明の方法、組成物、およびキットは、小さな可溶性タンパク質およびペプチド（例えば、１０００ｋｄ以下、好ましくは約１ｋｄ〜１００ｋｄ、最も好ましくは約１ｋｄ〜５０ｋｄの可溶性タンパク質およびペプチド）の単離に非常によく適している。当業者は、日常的な実験の域を出ない実験を用いて任意の特定の分子量のタンパク質およびペプチドの単離を可能にする特定の孔含有マトリクスを選択することができる。特に、本発明の方法は、生物学的宿主において発現された、封入体を形成するタンパク質分子またはペプチド分子の単離によく適している。
【００４５】
特に好ましい局面において、本発明の方法は、組換えタンパク質およびペプチドを発現することができる宿主に組み込まれたＤＮＡから発現された組換えタンパク質分子およびペプチド分子の単離において有用である。特に好ましいタンパク質分子およびペプチド分子は、タンパク質ライブラリーまたはペプチドライブラリーの一部である。このようなライブラリーとして、ランダムなポリヌクレオチド配列によってコードされる完全に新規のアミノ酸配列の集団（例えば、米国特許第５，７６３，１９２号、米国特許第５，９７６，８６２号、米国特許第５，８２４，５１４号、米国特許第５，８１７，４８３号、米国特許第５，８１４，４７６号、および米国特許第５，８３０，７２１号に従って作成することができる集団）が挙げられるが、これに限定されず、ランダムに作成された変異体タンパク質およびペプチドのライブラリーまたはグループ（例えば、ＵＶ照射によって作成されたｒｈｏ転写終結タンパク質のものなど）でもよい（Ｚｗｅｉｆｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：３５６４−７０（１９９３）を参照のこと）。当業者によく知られている他の細胞、組織、ウイルス、器官、および生物もまた、本発明に従って、単離されたタンパク質分子およびペプチド分子を抽出および調製するためのタンパク質分子およびペプチド分子の供給源として使用することができる。
【００４６】
方法
１つの局面において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子（特に、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子）を単離する方法に関する。本発明のこの局面に従う方法は、タンパク質分子およびペプチド分子が見出される天然環境から（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーから）１つまたは複数のタンパク質分子およびペプチド分子またはタンパク質分子およびペプチド分子の集団の単離をもたらす１つまたは複数の手順を含んでもよい。
【００４７】
１つの好ましいこのような局面において、本発明の方法は、以下の段階を含んでもよい：
（ａ）タンパク質分子またはペプチド分子の１つまたは複数の細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させ、細胞供給源から所望の可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の全てまたは一部を放出させる段階；ならびに
（ｂ）高分子量の分子、構造、および凝集物からタンパク質分子またはペプチド分子を分離する、または実質的に分離する段階。
【００４８】
別の本発明の局面において、本発明は、１つまたは複数のタンパク質およびペプチドを入手する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）１つまたは複数のタンパク質またはペプチドの細胞供給源と、少なくとも１つの孔含有マトリクスを接触させ、細胞供給源から１つまたは複数のタンパク質分子またはペプチド分子の全てまたは一部を放出させる段階；および
（ｂ）細胞供給源から得られた所望でない分子から、１つまたは複数の所望のタンパク質またはペプチドを分離する、または実質的に分離する段階。
【００４９】
本発明によると、マトリクスは、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを（可逆的または不可逆的に）実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない任意の多孔質マトリクスでよい。本発明のこの局面において用いられる固体マトリクスを調製するのに適した材料として、ポリエステル、焼結ポリエチレン、ニトロセルロース、ポリオレフィン、酢酸セルロース、ナイロン、セルロース、シリカなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。この固体マトリクスは、タンパク質分子およびペプチド分子の単離において使用するのに便利な任意の形式で、例えば、インサート（例えば、フリットもしくはプラグもしくはスワブもしくはカートリッジ）として、膜として、フィルターとして、または密に詰められた多孔質マトリクス（例えば、ビーズもしくはゲル）として設けることができる。１つの局面において、例えば、チューブまたはカラムに挿入し、マトリクスによってチューブまたはカラムの上部チャンバおよび下部チャンバを分けるのに適したフリットもしくはカートリッジとしてまたは膜として、マトリクスを設けることができる。本発明のこのような局面を図１に示す。マトリクスはまた、複数試料の濾過において一般的に用いられるマルチウェルプレート（例えば、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどを含む）にはめ込むのに適した、または他のプレートサイズ（例えば、３５ｍｍプレート、６０ｍｍプレート、１００ｍｍプレート、１５０ｍｍプレートなど）にはめ込むのに適した、他の便利な形（例えば、シート、フリット、プラグ、カートリッジ、またはインサート）で設けることができる。特に好ましい態様において、固体マトリクスは、微量遠心チューブ、マイクロスピンチューブ、またはスピンカートリッジにはめ込むのに適したフリットまたはインサートまたはカートリッジまたはスワブとして設けられる。一例において、フリット／インサート／カートリッジ／スワブのサイズは、直径８ｍｍ×長さ１ｃｍである。このようなチューブは、ＮＮＩ／リダマニュファクチュアリング（ＮＮＩ／Ｌｉｄａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬから入手することができる。
【００５０】
分離マトリクス内の孔は、一般的に、大きな分子、構造、および凝集物の流れを遅らせるのに十分に小さいが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の通過を許容するのに十分に大きく、直径約０．１〜約１０，０００ミクロン、直径約０．１〜約５，０００ミクロン、直径約０．１〜約１，０００ミクロン、直径約１〜約５００ミクロン、直径約１０〜約５００ミクロン、好ましくは直径約２５〜約４００ミクロンでもよい。より大きな孔径またはより小さな孔径も使用することができる（但し、マトリクスは、「曲がりくねった通路（ｔｏｒｔｕｏｕｓ ｐａｔｈ）」（この用語はクロマトグラフィー分野での当業者に一般的に用いられる）を形成するように十分に高密度である）。「曲がりくねった通路」によって大きな分子量の分子および構造は直接流出しないが、依然として可溶性タンパク質分子およびペプチド分子は流出することができる。
【００５１】
好ましい用途において、細胞供給源は、（好ましくは、水溶液に溶解して）マトリクスに適用され、次いで、単位重力インキュベーション（ｕｎｉｔ ｇｒａｖｉｔｙ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によって、好ましくは遠心分離または真空によってマトリクス中にまたはマトリクス上に導入される。タンパク質分子およびペプチド分子を放出するための調製の際に、細胞供給源は、選択的に、マトリクス内でまたはマトリクス上で捕捉される。タンパク質分子およびペプチド分子の細胞供給源の細胞膜／細胞壁の完全性を破壊するために、溶解／破壊／透過化組成物、物理的な力、および／もしくは機械的な力（またはそれらの組み合わせ）を使用してもよい。本発明よれば、細胞供給源から所望のタンパク質分子およびペプチド分子の放出を引き起こしるために、任意の物理的な力または機械的な力（凍結、加熱、凍結融解、圧力、超音波処理など）を溶解／破壊／透過化化合物または組成物とは別々にまたは組み合わせて使用することができる。好ましくは、マトリクスは、このような溶解／破壊化合物または組成物を含む。本発明によると、溶解／破壊組成物または化合物を、細胞供給源を含むマトリクスに適用してもよく、好ましくは、細胞供給源をマトリクスに適用する前に、例えば、マトリクスを溶解／破壊／透過化組成物に浸漬するか、または溶解／破壊／透過化組成物に染み込ませ、次いで、選択的に、空気、真空、および／または熱によってマトリクスを乾燥させることによって、（例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合または非共有結合によって）マトリクスに吸着させてもよく、マトリクスと複合体化させてもよく、マトリクスと会合させてもよい。または、マトリクス材料を使用する直前またはマトリクス材料からマトリクスプラグ、フリット、インサート、膜などを調製する直前に、組成物をマトリクス材料に適用してもよい。孔含有マトリクスを前処理するどの方法を用いても、溶解／破壊／透過化組成物が含浸したマトリクスが形成される。従って、好ましい局面において、マトリクスは溶解／破壊／透過化組成物または化合物を含む。本発明のこの好ましい局面において、本発明の細胞供給源の接触および溶解／破壊／透過化は同時にまたはほぼ同時に達成され、それによって、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出に必要とされる時間および操作の量が少なくなる。
【００５２】
１つの好ましい態様において、マトリクスに適用された、またはマトリクス中に予め吸着された、細胞膜／細胞壁の完全性を破壊する有効量の組成物は、１つまたは複数の界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤は非イオン性界面活性剤でもよく、非イオン性界面活性剤として、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｓｉｄｅ）；Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３．１４、デオキシコレート；ｎ−ドデカノイルスクロース；ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−デカノイルスクロース；ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド；ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−オクタノイルスクロース；ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド；ＡＰＯ−１０；ＡＰＯ−１２；Ｂｉｇ ＣＨＡＰ；Ｂｉｇ ＣＨＡＰ，Ｄｅｏｘｙ；ＢＲＩＪ（登録商標）３５； Ｃ_１２Ｅ_５； Ｃ_１２Ｅ_６； Ｃ_１２Ｅ_８； Ｃ_１２Ｅ_９；シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシド；ジギトニン；ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｃ−１００；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−０８０；ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｘ−１００；ＨＥＣＡＭＥＧ；ＭＥＧＡ−１０；ＭＥＧＡ−８；ＭＥＧＡ−９；ＮＯＧＡ；ＮＰ−４０；ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−１２７；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４；ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０；またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、界面活性剤はイオン性界面活性剤でもよく、イオン性界面活性剤として、ＢＡＴＣ、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコリソコール酸、ラウロイルサルコシン、タウロケノデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデヒドロコール酸、タウロリソコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、およびＴＯＰＰＡが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。両性イオン界面活性剤もまた本発明の組成物および方法と共に使用することができ、アミドスルホベタイン、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、カルボキシベタイン、およびメチルベタインが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
界面活性剤の濃度は、約０．０１重量％〜１０重量％、０．０１重量％〜５重量％、０．０１重量％〜４重量％、０．０１重量％〜３重量％、０．０１重量％〜２．５重量％、０．１重量％〜１０重量％、０．１重量％〜５重量％、０．１重量％〜４重量％、０．１重量％〜３重量％、０．１重量％〜２．５重量％、０．５重量％〜１０重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜４重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜２．５重量％、１．０重量％〜１０重量％、１．０重量％〜５重量％、１．０重量％〜４重量％、１．０重量％〜３重量％、または１．０重量％〜２．５重量％でもよい。最も好ましくは、界面活性剤の濃度は２．５％である。さらに、１つまたは複数の酵素（例えば、リゾチーム、リチケース、ザイモリエース、ノイラミニダーゼ、ストレプトリジン、セルリジン（ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ）、ムタノリジン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、キチナーゼ、グルカラーゼ（ｇｌｕｃａｌａｓｅ）、またはリソスタフィン）を約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用してもよく、１つまたは複数の無機酸塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化リチウム、または塩化プラセオジム）を約１ｍＭ〜５Ｍの濃度で使用してもよく、タンパク質分子およびペプチド分子の細胞供給源の膜および／もしくは細胞壁の完全性を破壊する（すなわち、タンパク質分子およびペプチド分子の細胞供給源の膜および／もしくは細胞壁を溶解するか、もしくはそこに孔を形成する）他の任意の化合物（例えば、ポリミキシンＢ）または前述の組み合わせを使用してもよい。組成物はまた、プロテアーゼ阻害剤（例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル、トリプシン阻害剤、アプロチニン、ペプスタチンＡ）、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の還元試薬（例えば、２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｉｌ））、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ、最も好ましくは約１ｍＭ以下の濃度）、ならびに／または１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度の１つもしくは複数のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＡ、Ｔ１、Ｔ２など）、あるいは前述の任意の組み合わせなどの他の成分を含んでもよい。ＤＮａｓｅＩ濃度は１単位〜１００単位（１０，０００単位／ｍｇ）でもよい。１つの好ましい態様において、組成物は、所望のタンパク質およびペプチドの天然のコンフォメーションまたは機能を実質的に混乱させることなく細胞膜または細胞壁の完全性を破壊し、その結果、天然のコンフォメーションを有する、または天然のコンフォメーションを実質的に有するタンパク質またはペプチドを収集することができる。しかし、タンパク質またはペプチドの天然の構造が必要とされない場合、溶解／破壊試薬の制限は必要とされない。溶解／破壊組成物は、好ましくは、１０％未満の細胞溶解／破壊／透過化組成物、より好ましくは、５％未満の細胞溶解／破壊／透過化組成物、最も好ましくは、３％未満の細胞溶解／破壊／透過化組成物を含む。最も好ましい組成物は、２．５％ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）、カルバイオケムコーポレーション（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。他の本発明の態様において、ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）の濃度は、約０．０１重量％〜１０重量％、０．０１重量％〜５重量％、０．０１重量％〜４重量％、０．０１重量％〜３重量％、０．０１重量％〜２．５重量％、０．１重量％〜１０重量％、０．１重量％〜５重量％、０．１重量％〜４重量％、０．１重量％〜３重量％、０．１重量％〜２．５重量％、０．５重量％〜１０重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜４重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜２．５重量％、１．０重量％〜１０重量％、１．０重量％〜５重量％、１．０重量％〜４重量％、１．０重量％〜３重量％、または１．０重量％〜２．５重量％でもよい。溶解／破壊組成物の活性成分の所望の濃度および組み合わせは当業者によって容易に決定することができる。本発明の別の局面において、不溶性材料の細胞溶解／破壊および破壊／可溶化は、両方の機能を果たす１個の組成物または試薬を用いて達成することができる。
【００５４】
タンパク質分子およびペプチド分子の細胞供給源とマトリクスが接触され、細胞が溶解／破壊／透過化されると、細胞供給源に含まれるタンパク質分子およびペプチド分子は細胞から放出され、高分子量の分子、構造、および凝集物はマトリクス材料内またはマトリクス材料上に結合または捕捉されるのに対して、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子は、マトリクス材料に実質的に結合も捕捉もされずにマトリクス材料を実質的に通過する。例えば、マトリクスを通して可溶性タンパク質分子およびペプチド分子を洗浄または溶出するのには十分であるが、大きな分子および構造が結合しているか、捕捉されているマトリクスから大きな分子および構造を除去するのには不十分な水溶液を用いてマトリクスを洗浄することによって、これらの可溶性タンパク質分子およびペプチド分子を流出液と共に収集することができる。本発明の別の局面において、本発明の溶解マトリクス／フィルターマトリクスに接触させる前または接触させた後に、細胞または細胞供給源を溶解することができる。
【００５５】
別の好ましい態様において、細胞の溶解または破壊の後に、不溶性材料（例えば、膜断片および／または封入体）を本発明のマトリクス内に捕捉することができる。このような不溶性材料は、可溶性タンパク質がマトリクスから溶出された後に、マトリクスと会合していてもよい。次いで、マトリクスと、膜断片または封入体を破壊し、膜断片または封入体に含まれるタンパク質を可溶化することができる第２の溶出試薬を接触させることができる。次いで、例えば、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子を、マトリクスを通って洗浄または溶出するのに十分な量の溶液を用いてマトリクスを洗浄することによって、これらのタンパク質分子およびペプチド分子を流出液と共に収集することができる。
【００５６】
本発明によると、得られた所望のタンパク質分子およびペプチド分子は、周知のタンパク質およびペプチド精製またはクロマトグラフィー技法によってさらに精製することができる。好ましい態様において、このような追加的な精製手順は、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、ニッケル樹脂またはＧＳＴ樹脂）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、沈殿（例えば、ＰＥＩ、ＰＥＧ、または硫酸アンモニウムを用いた沈殿）などを伴ってもよい。従って、本発明は、当技術分野において利用可能な任意の周知の技法によって所望のタンパク質分子およびペプチド分子を精製する段階をさらに含む。本発明の特に好ましい態様において、追加的な精製手順において用いられる組成物（例えば、樹脂、抗体など）は、本発明の方法によって単離されるタンパク質またはペプチドがマトリクスから溶出された後に、追加的な精製のためにこれらの組成物を含む収集容器に入るか、添加されるように、本発明の収集容器に存在する。このような追加的な精製は、核酸、他のタンパク質およびペプチド、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質分子およびペプチド分子の活性もしくは追加的な操作（例えば、標識、タンパク質分解を介した切断、酵素活性の検出および定量など）を阻害する可能性のある化合物または組成物などの必要でない汚染物質の除去を容易にすることができる。いずれにしても、このような追加的な精製を行う必要はなく、従って、本発明の方法によって得られたタンパク質分子およびペプチド分子は、直接、標準的な生化学およびタンパク質化学技法によって操作することができる。本発明の好ましい局面において、１つまたは複数の追加的な精製組成物（例えば、イオン交換樹脂、アフィニティ樹脂、磁気ビーズ、抗体、ニッケル樹脂、ＧＳＴ樹脂など）が本発明による分離マトリクスと共に使用される。このような追加的な精製は別々の手順において達成されてもよいが、好ましい局面において、追加的な精製は、本発明の分離法と同時に、または本発明の分離方法と一緒に達成される。１つの局面において、所望のタンパク質分子およびペプチド分子を含む試料が、あるマトリクスから別のマトリクスを通過できるように、１つまたは複数の分離マトリクスおよび１つまたは複数のタンパク質およびペプチド精製組成物が流路内で連続して結合している。この局面において、流体接続において様々なマトリクスと結合する流路を形成するように、分離マトリクスおよび精製組成物の組み合わせを任意の形式（例えば、カラム形式、チューブ形式、ウェル形式、マルチウェルプレート形式など）で設けることができる。この態様において、分離マトリクスを通過する所望のタンパク質分子およびペプチド分子は、後に、タンパク質またはペプチド精製組成物と接触する。本発明の１つの態様において、不必要な材料（例えば、脂質、核酸、溶解／破壊組成物、ならびにタンパク質分子およびペプチド分子の追加的な操作または分析を阻害する可能性のある成分）は、所望のタンパク質分子およびペプチド分子が固定化精製組成物に保持されるのを可能にする洗浄緩衝液または洗浄溶液を用いて除去される。次いで、精製されたタンパク質分子およびペプチド分子を単離するために、固定化精製組成物から所望のタンパク質分子およびペプチド分子を除去する溶出緩衝液または溶出溶液を使用することができる。
【００５７】
非常に好ましい態様において、本発明は、ハイスループット形式でタンパク質分子およびペプチド分子のライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。例えば、ランダムなポリヌクレオチド配列または変異ポリヌクレオチド配列のライブラリー（例えば、米国特許第５，７６３，１９２号において作成されたライブラリー）を、説明された本発明を用いて、９６ウェルプレートにおいて酵素活性または結合特性についてスクリーニングすることができる。それぞれがライブラリーメンバーをコードするプラスミドを含む細菌コロニーを、タンパク質またはペプチド合成の誘導後にマトリクスに適用することができる。次いで、タンパク質またはペプチドを含む細胞が溶解／破壊／透過化される。次いで、タンパク質分子およびペプチド分子は、緩衝化水溶液および／または遠心分離を用いてマトリクスから溶出され、９６ウェルプレートのウェルに集められる。所望のリガンドまたは基質を含む試薬も９６ウェルプレートに存在してよく、次いで、活性または結合の存在を、所望の活性または結合特性に適していると思われる任意の方法によって測定することができる。
【００５８】
別の好ましい態様において、本発明は、関心対象の特定のタンパク質またはペプチドのランダムにまたは系統的に作成された変異体のライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。予備的な証拠から、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを用いて、逆転写酵素変異体ライブラリーを相対的な酵素活性について効率的にスクリーニングできることが証明された。さらに、スクリーニングは、本発明のタンパク質またはペプチドを支持層（例えば、マルチウェルプレート、チップ、スライド、ウエハー、フィルター、シート、チューブなど）の上に固定化することによって達成することができる。これらの支持層は、固定化された本発明のタンパク質またはペプチドを含み、タンパク質分子もしくはペプチド分子に結合する組成物（例えば、抗体）、タンパク質分子もしくはペプチド分子によって結合される組成物（例えば、リガンド）、または測定可能なパラメータ（例えば、発光、色の変化、蛍光、化学発光など）の変化を引き起こす組成物と接触させることができる。
【００５９】
組成物
関連した局面において、本発明は、タンパク質および／またはペプチド分子の単離において使用するための組成物に関する。本発明のこの局面に従う組成物は、以下のような１つまたは複数の成分または部分を含んでもよい：
（ａ）所望のタンパク質分子またはペプチド分子の１つまたは複数の細胞供給源；
（ｂ）高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；ならびに選択的に、
（ｃ）細胞供給源の１つまたは複数の細胞を破壊または溶解する少なくとも１つの化合物または組成物。
【００６０】
本発明の組成物において使用するのに好ましいこのような細胞供給源、マトリクス、ならびに化合物および組成物として、本発明の方法において説明および使用されるものが挙げられる。本発明の好ましい組成物において、マトリクスは、細胞膜または細胞壁の完全性を破壊する化合物を含む。有効量のこのような化合物は、好ましくは、例えば、マトリクス材料への溶解／破壊化合物または組成物のイオン結合、疎水結合、非共有結合または共有結合によって、マトリクスの上に吸着されるか、マトリクスと複合体化されるか、マトリクスと会合される。本発明の組成物は、様々なタンパク質分子およびペプチド分子、詳細には、本明細書に記載のもの、最も詳細には、細菌細胞から可溶性タンパク質として、または封入体に入って発現された組換えタンパク質およびペプチドの単離において有用である。
【００６１】
本発明はまた、以下のような１つまたは複数の組成物を含むハウジングを含む、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための装置に関する：
（ａ）容器内で、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；ならびに
（ｂ）タンパク質またはペプチドと結合するクロマトグラフィー樹脂、不純物と結合するクロマトグラフィー樹脂、タンパク質改変試薬が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素が結合しているクロマトグラフィー樹脂、核酸が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素基質が結合しているクロマトグラフィー樹脂、フィルター、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される、少なくとも１つの組成物。
【００６２】
タンパク質またはペプチドと結合するクロマトグラフィー樹脂の例として、抗体、タンパク質リガンド、タンパク質またはペプチドに共有結合することができる組成物などが結合している樹脂が挙げられる。
【００６３】
別の好ましい態様において、本発明は、以下のような１つまたは複数の組成物を含むハウジングを含む、タンパク質分子およびペプチド分子の抽出および単離において使用するための装置に関する：
（ａ）容器内で、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス；ならびに
（ｂ）本発明のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、タンパク質またはペプチドの基質、タンパク質またはペプチドのリガンド、タンパク質またはペプチドの補因子、タンパク質またはペプチドに結合する核酸分子、タンパク質またはペプチドの阻害剤、タンパク質またはペプチドを改変する酵素、タンパク質またはペプチドを改変する組成物、タンパク質またはペプチドと結合する組成物、タンパク質またはペプチドによって結合される組成物、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される、少なくとも１つの組成物。
【００６４】
本発明の装置は、以下をさらに含んでもよい：
（ｃ）少なくとも１つの孔含有マトリクスと任意の追加的な組成物との間に配置された、多孔質固体支持体；および／または
（ｄ）孔含有マトリクスによって分けられた、試料適用部および試料収集部。
【００６５】
キット
別の態様において、本発明は、タンパク質分子およびペプチド分子の単離において使用するためのキットに関する。本発明のこのようなキットは１つまたは複数の成分を含んでもよく、成分は、ボックス、カートン、チューブ、マイクロスピンチューブ、微量遠心チューブ、スピンカートリッジ、マルチウェルプレート、バイアル、アンプル、バックなどの１つまたは複数の容器に入っていてもよく、１つまたは複数の容器を含んでもよい。１つのこのような局面において、本発明のキットは、本明細書で詳細に述べられた本発明の組成物の１つまたは複数を含んでもよい。別の局面において、本発明のキットは以下を含んでもよい：
（ａ）高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質および／またはペプチド分子の流れを実質的に遅らせない（好ましくは、チューブ、カラム、カートリッジ、ウェルなどに入っている）少なくとも１つのマトリクス；ならびに
（ｂ）細胞溶解／破壊／透過化組成物または化合物。
【００６６】
１つのこのようなキットにおいて、マトリクスは有効量の細胞溶解／破壊／透過化組成物または化合物を含む。有効量の細胞溶解／破壊／透過化組成物または化合物は、例えば、マトリクス材料への組成物または化合物のイオン結合、疎水結合、非共有結合または共有結合によって、マトリクスに吸着されてもよく、マトリクスと複合体化されてもよく、マトリクスと会合されてもよい。別の局面において、キットは、追加的なタンパク質および／またはペプチド精製組成物、洗浄緩衝液、溶出緩衝液などを含む。本発明のキットにおいて使用するのに好ましいマトリクス材料、細胞溶解／破壊／透過化組成物および化合物、ならびに溶出組成物および洗浄組成物として、本発明の方法および組成物での使用について本明細書で述べられるものが挙げられる。
【００６７】
本発明のキットは、本発明によって単離または精製されたタンパク質分子およびペプチド分子の追加的な処理、分析、または使用において有用であり得る１つまたは複数の追加的な成分または試薬（例えば、タンパク質およびペプチドの精製、標識、または検出において有用な成分または試薬）をさらに含んでもよい。このような試薬または成分は、例えば、精製を助けるためにアミノ酸配列と結合する１つもしくは複数の樹脂（例えば、ニッケル樹脂およびＧＳＴ結合樹脂）、または当業者によく知られている他の試薬を含んでもよい。
【００６８】
単離されたタンパク質分子およびペプチド分子
本発明はまた、本発明の方法に従って調製された、単離されたタンパク質分子およびペプチド分子に関する。１つの好ましい態様において、本発明の単離されたタンパク質分子およびペプチド分子は、組換えタンパク質およびペプチド（特に、細菌細胞において発現されたものおよび細菌細胞から単離されたもの）である。
【００６９】
関連した局面において、本発明は、組換え技術（例えば、クローニングおよび発現）によって調製された組換えタンパク質およびペプチドの迅速なスクリーニングおよび評価を可能にする。従って、本発明は、このような組換えタンパク質およびペプチドを迅速に単離するのに使用することができ、これによって、（例えば、酵素活性の分析、結合特性の分析、特定の抗体に結合される能力などによって）このような評価またはスクリーニングを行うための、すぐに利用できる組換えタンパク質およびペプチド供給源が得られる。さらに、本発明は、ハイスループットスクリーニングのために、本発明のタンパク質分子またはペプチド分子を固体支持層の上に固定化することに関する。このような固体支持層の例として、マルチウェルプレート、チップ、スライド、ウエハー、フィルター、シート、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。次いで、適切な支持層の上に固定化されたタンパク質またはペプチドを、当技術分野において周知の任意の方法によってスクリーニングすることができる。このような方法として、抗体とのハイブリダイゼーション、基質との接触、リガンドとの接触、生物学的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド等）との接触などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。支持層の上に固定化されたタンパク質またはペプチドは、適切なシグナルが存在するかどうかについて分析することができる。シグナルとして、蛍光、化学発光、生物発光、光の特定の波長の吸収、特定の基質の結合、色の変化、または望ましい情報を得るのに適していると考えられる他の任意の方法を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
本発明はまた、関心対象の単離されたタンパク質分子およびペプチド分子を含む組換え宿主細胞の使用、本発明に従って産生されたこのようなタンパク質およびペプチドを単離するためのこのような細胞の使用、および本発明の組換えタンパク質分子およびペプチド分子に関する。本発明に従って使用することができる代表的な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）として、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このような適切な宿主細胞は、例えば、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社の一部門（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、および当業者によく知られている他の商業的供給元から市販されている。本発明のタンパク質およびペプチド、組換えタンパク質およびペプチド、または単離されたタンパク質分子およびペプチド分子を含む宿主細胞は、当業者によく知られている周知の形質転換、エレクトロポレーション、感染、またはトランスフェクション法を用いて、関心対象のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子またはベクターを宿主細胞に挿入することによって調製することができる。本発明のこの局面によれば、挿入されたＤＮＡから所望のタンパク質またはペプチドを産生することができる宿主細胞へのＤＮＡ分子の導入は、核酸分子を宿主細胞に導入する任意の周知の方法によって達成することができる。この方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、カチオン性脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換（例えば、コンピテント細胞（特に、大腸菌細胞）の形質転換）、感染、または他の方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このような方法は、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら「分子生物学における基本法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８６）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。形質転換宿主細胞またはトランスフェクトされた宿主細胞に適した培地および培養条件が当技術分野において知られている。適切な宿主に導入された組換えＤＮＡ分子からタンパク質およびペプチドを発現させる方法は当業者に周知である。
【００７１】
単離されたタンパク質分子およびペプチド分子の使用
本発明の組成物、方法、およびキットによって単離されたタンパク質分子およびペプチド分子は、例えば、標識、プロテアーゼ消化、酵素活性または結合活性の分析などによってさらに特徴付けするか、または操作することができる。
【００７２】
または、本発明に従って単離されたタンパク質分子およびペプチド分子は、当技術分野において周知の方法に従って産業工程における様々な材料を製造するのに使用することができる。このような材料として、医薬品（医薬品前駆体の酵素触媒作用）；タンパク質およびペプチドの分子量標準；酵素触媒作用によってタンパク質およびペプチド、ＤＮＡ、脂質、または炭水化物を修飾したものなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、発現されたタンパク質分子およびペプチド分子のライブラリーを、望ましい特徴または活性が存在するかどうかについて、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェル、３８４ウェルなど）を用いてハイスループット形式でスクリーニングすることができる。本明細書で述べられた方法および用途に対する他の適切な変更および適応が容易に明らかであり、本発明の範囲または本発明の任意の態様から逸脱することなく加えることができることが、関連する技術分野の当業者に理解されると考えられる。ここまでで、本発明が詳細に説明されたが、例示の目的でのみ本発明に含まれかつ本発明を限定することを意図していない、以下の実施例を参照することで、本発明はさらに明確に理解されると考えられる。
【００７３】
実施例
実施例１
細菌細胞からのタンパク質およびペプチドの単離
この計画の目標は、細菌細胞からタンパク質を抽出する過程を改善することにあった。詳細に述べると、目的は、第１に、操作数が少なく、かつ操作が寛大な、より迅速な溶解手順を開発すること、第２に、膜断片および細胞破片を除去するための、別々の遠心分離または濾過手順を無くすことにあった。本発明によると、これらの目的は、溶解および濾過過程を１つの操作にまとめることによって達成される。この操作による産出物は、追加的な精製（必要に応じて、マトリクスクロマトグラフィーによる精製）に使用できる可溶性タンパク質である。全てのタンパク質調製法の一単位操作を行うために、本発明によって、マトリクスクロマトグラフィー手順と溶解および沈殿除去手順を組み合わせることがさらに可能である。
【００７４】
材料および方法
特に指示のない限り、全ての手順を室温で行い、全ての試薬を、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社の一部門、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した。
【００７５】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクス
接着ポリエステル繊維からなる１９．２ｍｍ円周×１０．０ｍｍ長のフィルタープラグ１個を、ガラス繊維膜（ＧＦ／Ｆ）（カタログ番号７７００−２８１０、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ／Ｗｈａｔｍａｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）を含む９６ウェルフィルタープレートの１個のウェルに入れた。プラグフィルターがウェルの底のすぐ近く、ＧＦ／Ｆ膜の真上（０ ｍｍ〜１ ｍｍ）にあるように、プラグフィルターをウェルに圧力嵌めした。全ての液体がプラグフィルターに押し込まれ、ウェル側とプラグフィルター側との間に押し込まれないように、ウェルにぴったりとフィットすることが重要であった。同様に、９６ウェルフィルタープレートの残りのウェルにプラグフィルターを取り付けた。
【００７６】
細胞増殖
プラスミドｐｔｒｃＮｓｉＩ２１５およびｐＳＵＲｐｓｌＮｓｉＩ１９１を有する大腸菌ＤＨ５ａ ｍｃｒ ｒｅｃ^＋（醗酵種（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｅｅｄ）＃６５７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＣｉｒｃｌｅ Ｇｒｏｗ培地（カタログ番号３０００−１２２、Ｂｉｏ １０１社、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）中で２５０ｒｐｍ、３７℃で１６時間増殖させた。一晩培養物１ミリリットルを使用して、抗生物質を含む同じ培地の新鮮な３０ｍｌアリコートに接種した。２５０ｒｐｍで振盪しながら、希釈培養物の増殖を３７℃で続けた。６００ｎｍでの濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）によって細胞増殖をモニターした。培養物のＯ．Ｄ．_６００測定値が０．７０４になったら、１００ｍＭ ＩＰＴＧ ３００μｌを培地に添加することによってタンパク質過剰発現を誘導した。２５０ｒｐｍでさらに２時間３７℃で増殖を続けた。最終的な細胞密度はＯ．Ｄ．_６００＝１．３であった。
【００７７】
９６ウェル溶解マトリクス／溶解マトリクスによるタンパク質抽出
誘導培養物の２００μｌアリコートを、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのプラグフィルター表面に直接適用した。同じ試料を、もう１つのフィルターに適用した。１０分後、透過化緩衝液（０．３Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、６％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸）１００μｌを両フィルターに添加した。インキュベーションを１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、９６ウェル８００μｌレシーバプレート（カタログ番号７７０１−１８００、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ／Ｗｈａｔｍａｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の上に揃えて置き、自在（ｓｗｉｎｇｉｎｇ）バケットローターに入れて３０００×ｇで５分間、遠心分離した。集められた体積を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００７８】
透過化緩衝液の効力についての対照として、前と同じように、誘導培養物の２つの２００μｌアリコートを、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスの別個のプラグフィルターに適用した。しかし、この場合、透過化緩衝液を添加しなかった。２０分後、前と同じように、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを遠心分離した。回収された体積を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００７９】
緩衝液のみを用いたタンパク質抽出
誘導培養物の２つの２００μｌアリコートを１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。各試料に透過化緩衝液１００μｌを添加し、２秒間ボルテックスし、次いで、１０分間放置した。チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００８０】
超音波処理によるタンパク質抽出
誘導培養物の２つの２００μｌアリコートを別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を収集するために、両チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットをそれぞれ、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ３００μｌに懸濁した。細胞懸濁液をそれぞれ、設定「３」で、液体に沈めたマイクロチップを用いて、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（モデル５５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から３回の１０秒パルスに供した。破片を集めるために、両チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００８１】
酵素活性アッセイ
ＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を、λＤＮＡを用いた標準的なアッセイによって検出した。試験しようとする各試料の１つのアリコート（１μｌ）を、０．６μｇのλＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）および１×Ｒｅａｃｔ３ Ｂｕｆｆｅｒに総体積２０μｌとなるように添加した。陽性酵素対照として、精製ＮｓｉＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）１μｌ（１０単位）を試料の代わりに使用した。陰性酵素対照として、水１μｌを、反応物への試料添加の代わりに使用した。全ての反応混合物を短時間で混合し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。１／１０体積のＥｎｄｏ−Ｒ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１％ＳＤＳ、および５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を添加することで、反応を止めた。
【００８２】
アガロースゲル電気泳動
アリコートを、１００ＶＤＣで、ＴＡＥ緩衝液中での１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルによる電気泳動に供した。１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）を分子サイズ標準として同時に移動させた。ＤＮＡを臭化エチジウム染色によって検出し、その後、ＵＶ透過照明下で写真撮影を行った。
【００８３】
結果および考察
溶解マトリクス／フィルターマトリクスが、細菌細胞からタンパク質を抽出するための容易な過程の根幹をなすことができるかどうかを確かめるために、いくつかの手順を行った。回収されたタンパク質が天然のコンフォメーションを維持すれば、その手順が最も有用な可能性がある。技法の穏やかさ（ｇｅｎｔｌｅｎｅｓｓ）はモデル酵素の活性を測定することによって示すことができる。溶解マトリクス／フィルターマトリクスを同時に使用した試料の抽出によって、容易な精製手順が得られれば、追加的な利点が得られる。
【００８４】
プラスミドＤＮＡを単離するために溶解マトリクスを用いた初期の研究において（米国特許出願番号第０９／４７８，４５６号を参照のこと）、細胞溶解において用いられる緩衝液は強力なタンパク質変性剤を含んでいた。このような抽出緩衝液は、この場合、特に、天然の活性タンパク質が求められる場合では適切でない。従って、より穏やかな緩衝液条件を使用すべきである。さらに処理することなく、回収された酵素の速やかなアッセイを可能にするために、非変性界面活性剤を含む緩衝液が本明細書に記載の方法に用いられた。
【００８５】
ＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドを有する細菌細胞を、タンパク質の過剰産生を誘導する条件下で、液体培地中で培養した。いくつかの培養試料を、比較のために、異なるタンパク質抽出法に並行して供した。第１の方法として、細胞を培養試料から採取し、緩衝液に懸濁した。細胞膜を物理的に破壊し、関心対象のタンパク質を含む細胞の内容物を放出させるために、懸濁液を超音波処理した。ＭＭＬＶ−ＲＴについて引用された手順に似た第２の方法では、培養試料と透過化緩衝液を混合し、インキュベートし、次いで、大部分の不溶性破片を除去するために遠心分離した。第３の方法では、細胞培養物からの試料を、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートのプラグフィルター表面に適用した。細胞がプラグフィルターに入ったら、１／２体積の透過化緩衝液をプラグフィルター表面に添加した。プラグフィルターの内部でタンパク質抽出が行われる。溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを遠心分離することによって、可溶性材料はプラグフィルターおよび小孔（平均０．７μ）ガラス繊維膜を通過し、レシーバプレートのウェルに入った。
【００８６】
活性タンパク質が抽出されたかどうかを確かめるために、まず最初に、ＮｓｉＩ活性を特異的に測定するように設計されたアッセイを使用する。制限エンドヌクレアーゼ活性はλＤＮＡを異なるサイズの多数の断片に分解し、独特のパターンまたはフィンガープリントを引き起こす。図２に、いくつかの方法によって抽出された試料に対して行った制限エンドヌクレアーゼアッセイのアガロースゲルを示す。基準のために、本物の断片化パターンをレーン１に示す。レーン６およびレーン７には著しいＮｓｉＩ活性が示され、これは、透過化緩衝液が活性タンパク質を抽出したことを証明している。溶解マトリクス／フィルターマトリクスと透過化緩衝液（レーン４およびレーン５）を使用しても活性な酵素が抽出された。他方で、溶解マトリクス／フィルターマトリクス（透過化緩衝液なし）（レーン８およびレーン９）によって処理された試料はＮｓｉＩエンドヌクレアーゼをほとんど示さなかった。観察された少量の活性は、恐らく、操作中に溶解／破壊／透過化された一部の細胞によるものである。レーン２およびレーン３は、従来の超音波処理法を使用した時に著しい活性ＮｓｉＩエンドヌクレアーゼが得られることを裏付けている。
【００８７】
図２における断片化パターンの注意深い観察によって、いくつかの方法によって抽出された酵素の量が定量的に測定される。レーン８およびレーン９の場合のように、酵素がほとんど回収されなかった場合、λＤＮＡの大部分が無傷のままであり、酵素なしの対照（レーン１０）と移動度が似た、よく目立つバンドとして現れる。超音波処理された試料において最大の活性が示される。この場合、２ｋｂ〜１０ｋｂのサイズ範囲で最もよく観察される無傷のλＤＮＡまたは部分的に消化された断片は存在しない。透過化緩衝液を用いて抽出された試料において、最大とは言えないが著しい活性が示される。
【００８８】
本発明の９６ウェル態様を用いて同様の手順を行った。ＮｓｉＩを発現する細胞をＯＤ_６００ ２．０まで培養した。培養物２００μｌをマトリクスに添加し、その後に、溶解緩衝液１００μｌを添加した。細胞のもう１つのアリコートを超音波処理に供した。超音波処理された抽出物および本発明の方法によって溶解された抽出物のアリコートをλＤＮＡとインキュベートし、次いで、試料を１％アガロースゲル上で移動させた。図９に示されるように、超音波処理された試料（レーン２）ならびに本発明の方法によって調製された試料（レーン３およびレーン４）は両方とも著しいＮｓｉＩ活性の証拠を示した。しかし、超音波処理された試料（レーン２）は、調製物中の多量の核酸汚染物質を示唆している（恐らく、超音波処理中のゲノムＤＮＡ剪断が原因である）。
【００８９】
図２および図９において、溶解マトリクス／フィルターマトリクスはタンパク質を抽出し、酵素活性を維持することが示される。処理された試料の直接観察から、試料が溶解マトリクス／フィルターマトリクスによって処理された時に破片ペレットは得られなかったが、超音波処理法からは著しいペレットが回収された。溶解マトリクス／フィルターマトリクスなしで透過化緩衝液を使用しても、かなりのペレットが示された。精製手順をさらに調べるために、各抽出法からの試料を、直接、アガロースゲル上で電気泳動した（図６に示す）。ゲルの臭化エチジウム染色によって試料中の核酸汚染が評価される。超音波処理された試料（レーン２およびレーン３）において多量の蛍光スメアが示され、これは、ゲノムＤＮＡおよびｒＲＮＡがランダムに剪断されたこと、および抽出されたタンパク質から核酸を分離できなかったことを示している。レーン４〜レーン９には、ｔＲＮＡおよび小さなＲＮＡ断片を示す１つだけの明るい低分子量バンドが示される。レーン４〜レーン７およびレーン１０の中間点の辺りにある、ぼやけた明るい領域は、透過化緩衝液中の成分によるものであり、全く重要でない。従って、溶解マトリクス／フィルターマトリクスを用いてタンパク質を抽出すると、破片および大部分の核酸がかなり精製および除去される一方で、処理手順の数が少なくなるという追加的な利益が得られる。
【００９０】
溶解マトリクス／フィルターマトリクスは、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）およびＢ−ＰＥＲなどの市販製品より容易かつ強力なタンパク質抽出手順である。溶解マトリクス／フィルターマトリクスからの試料中にはゲノムＤＮＡが現れないので、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）の場合のようにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを用いた別個の消化によって克服すべき試料粘性問題がない。さらに、透過化緩衝液を使用した時での細胞内の核酸の大部分の維持は、分子生物学的手順において用いられる酵素の低いバックグラウンドをもたらす。さらに、溶解マトリクス／フィルターマトリクスの使用は細胞膜を保持し、これによって、抽出された可溶性タンパク質から細胞膜および多くの生体分子が分離される。
【００９１】
実施例２
細菌細胞からのタンパク質の単離およびその後のアフィニティタグ精製
確立された１つだけの溶解−濾過段階を用いてタンパク質を単離する方法を用いて、（アフィニティタグ精製のような）後の精製をさらに取り入れるために、この方法が開発された。本実施例において、アフィニティマトリクスへの精製タンパク質の充填は二次過程として行われたが、溶解および濾過と一緒の１つの手順において行うことができる。タンパク質収率を最大にし、処理段階を簡素化するために、方法および緩衝液系に追加的な変更が加えられた。
【００９２】
材料および方法
特に指示のない限り、全ての手順を室温で行い、全ての試薬を、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社の一部門、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した。
【００９３】
細胞増殖
Ｎｉ−ＮＴＡ法用のプラスミドｐＥＸＰ１５−ＧＵＳ（Ｇａｔｅｗａｙクローン６Ｈｉｓ−Ｇｕｓ）またはＧＳＴ法用のｐＥｎｔｅｒＧＵＳ（ＧａｔｅｗａｙクローンＧＳＴ−ＧＵＳ）を有する大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢＯＮ培地中で、２５０ｒｐｍ、３０℃で１６時間増殖させた。一晩培養物３ミリリットルを使用して、抗生物質を含む同じ培地の新鮮な３０ｍｌアリコートに接種した。２５０ｒｐｍで振盪しながら、希釈培養物の増殖を３０℃で続けた。６００ｎｍでの濁度によって細胞増殖をモニターした。培養物のＯ．Ｄ．_６００測定値が０．６００〜０．８００になったら、５Ｍ ＮａＣｌ １．８ミリリットルを培地に添加することによってタンパク質過剰発現を誘導した。２５０ｒｐｍでさらに３時間３０℃で増殖を続けた。最終的な細胞密度はＯ．Ｄ．_６００＝１．３〜２．１であった。
【００９４】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスによるタンパク質抽出
誘導培養物の２つの１．３ｍｌアリコートを別個の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を集めるために、両チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを、再懸濁緩衝液（５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）２００μｌに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした（このインキュベーション段階によって最も高い収率が得られるが、絶対必要ではない）。氷上で１０分間のインキュベーション後、再懸濁液２００μｌを、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのプラグフィルター表面に適用した。同じ試料をもう１つのフィルターに適用した。溶解緩衝液（１５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＫＣｌ、１．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μｌを両フィルターに添加した。インキュベーションを１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置き、自在バケットローターに入れて７００〜１０００×ｇで５分間、遠心分離した。集められた体積を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００９５】
超音波処理によるタンパク質抽出
誘導培養物の２つの１．３ｍｌアリコートを別々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を収集するために、両チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットをそれぞれ、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ ３００μｌに懸濁した。細胞懸濁液をそれぞれ、設定「３」で、液体に沈めたマイクロチップを用いて、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（モデル５５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から３回の１０秒パルスに供した。破片を集めるために、両チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を個々の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。
【００９６】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３１３１４）によるアフィニティ精製　ＮＴＡ−Ｎｉアガロースビーズを、５０％スラリーとして、５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｐ、０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と平衡状態にした。１．５ｍｌ微量遠心チューブ内で、フィルタープレート法および超音波処理法によって抽出された２つの総タンパク質２５０μｌを、５０％スラリーＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ１００μｌとインキュベートした。試料をアガロースビーズと１０分間インキュベートし、次いで、７００×ｇで２分間遠心分離した。（７００×ｇで２分間遠心分離した）５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、０．５％グリセロール１ｍｌで２回、ビーズを洗浄した。（７００×ｇで２分間遠心分離した）５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール２００μｌと１０分間インキュベートすることによって、ポリＨｉｓタグ化タンパク質をビーズから溶出し、溶出液を１．５ｍｌ微量遠心チューブに収集し、＋４℃に置いた。
【００９７】
ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号２７−４５６７０−０３）を用いたアフィニティ精製
フィルタープレート法および超音波処理法によって抽出された２つの総タンパク質２５０μｌを、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに充填し、穏やかに混合し、１０分間インキュベートした。カラムを７００×ｇで１分間遠心分離し、流出液を捨てた。カラムを、１×ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）で２回洗浄し、７００×ｇで１分間遠心分離した。１０ｍＭグルタチオン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μｌと１０分間インキュベートすることによって、ＧＳＴタグ化タンパク質をカラムから溶出した。７００×ｇで２分間の遠心分離によって、溶出液を１．５ｍｌ微量遠心チューブに収集した。
【００９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
各試料の総タンパク質および溶出液の１５マイクロリットルアリコートを、１×ＴＧＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１５５５６−０２０）中で４％〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（Ｎｏｖｅｘ）による電気泳動に供した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質マーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１０７４７−０１２）を分子サイズ標準として同時に移動させた。タンパク質は、Ｇｅｌ ＣｏｄｅＢｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２４５９２）を用いた染色によって検出された。
【００９９】
結果および考察
二次精製段階（例えば、アフィニティ樹脂に基づく捕捉）からの量的な回収を可能にするのに十分なタンパク質収率のために、リゾチームまたは他の細胞破壊法の使用が有用であることが分かった。これらの種類の細胞破壊法はまた、丈夫な膜を有する細胞を使用する場合に有用である。二次精製方式（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡまたはＧＳＴマトリクス）への直接充填との併用性を可能にするために、緩衝液系も変更した。図７は、本発明の方法（レーン３およびレーン４）を用いたプラスミドｐＥＺ１５９７４からの総タンパク質の精製が、超音波処理（レーン１およびレーン２）によって得られた総タンパク質と少なくとも同等であることを示す。レーン３およびレーン４においてゲルの底部近くの追加的なバンドはリゾチームタンパク質によるものである。同一の総タンパク質試料を、再度、市販のシステムを用いてＨｉｓ６アフィニティタグによってさらに精製すると、本発明によって精製された試料の結果（レーン７およびレーン８）は、超音波処理された試料から精製された試料の結果（レーン５およびレーン６）と収率がほぼ等しかった。
【０１００】
図８Ａおよび図８Ｂは、プラスミドｐＥｎｔｅｒＧＵＳから精製された、ＧＳＴ融合を含むタンパク質からのほぼ同じ結果を示す。図８Ａは、一次精製法として超音波処理によって得られたタンパク質を示す。レーン１およびレーン２は総タンパク質を含み、レーン３およびレーン４はＧＳＴ精製後の同じ試料を示す。図８Ｂにおいて、ほぼ同じ結果が示される。図８Ｂでは、本発明の方法を用いて精製された総タンパク質をレーン１およびレーン２に示すのに対して、追加的なＧＳＴ精製後の試料をレーン３およびレーン４に示す。
【０１０１】
実施例３
細菌細胞からのタンパク質の並行した溶解−捕捉およびアフィニティタグ精製
前記のように、後の精製段階は、溶解−捕捉手順とは別個に、または溶解−捕捉手順と並行して行うことができる。このアプローチの実現可能性を証明するために、この手順では、ヘキサヒスチジンタグ化タンパク質が、並行した溶解−捕捉／アフィニティタグ精製手順において精製された。
【０１０２】
材料および方法
特に指示のない限り、全ての手順を室温で行い、全ての試薬を、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社の一部門、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した。
【０１０３】
細胞増殖
細胞培養条件は実施例２に記載の条件と同じであった。
【０１０４】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスによるタンパク質抽出
誘導培養物１ミリリットルを別個の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを、再懸濁緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）２００μｌに再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした（この段階は必須ではない）。氷上で１０分間のインキュベーション後、再懸濁液２００μｌを、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのフィルタープレート表面に適用した。溶解緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＫＣｌ、１．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μｌをフィルターに添加した。インキュベーションを１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスを、ＳｗｅｌｌＧｅｌ（商標）Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｄｉｓｃ、９６−Ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７５８２４）の上に揃えて置いた。積み重ねたものを、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に置き、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。流出液を収集し、１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。遠心分離後、ビーズを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール２５０μｌで１回洗浄し、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール１００μｌと５分間インキュベートすることによって、ポリｈｉｓタグ化融合タンパク質をビーズから溶出し、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。溶出段階を２回繰り返した。
【０１０５】
超音波処理によるタンパク質抽出
誘導培養物１ミリリットルを別個の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ ３００μｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、設定「３」で、液体に沈めたマイクロチップを用いて、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（モデル５５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から３回の１０秒パルスに供した。破片を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【０１０６】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズによるアフィニティ精製
上清を、９６ウェルのＳｗｅｌｌＧｅｌ（商標）Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｄｉｓｃ、９６−Ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７５８２４）に移し、次いで、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に置き、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。流出液を収集し、１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、＋４℃に置いた。遠心分離後、ビーズを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール２５０μｌで１回洗浄し、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール１００μｌと５分間インキュベートすることによって、ポリｈｉｓタグ化融合タンパク質をビーズから溶出し、自在バケットローターに入れて５００×ｇで１０分間、遠心分離した。溶出段階を２回繰り返し、ＰＡＧＥ分析のために、各溶出液の１５μｌアリコートを４％〜２０％ＳＤＳゲルにロードした（図１０）。
【０１０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
各試料の流出液、洗浄液、および溶出液１５マイクロリットルを、１×ＴＧＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１５５５６−０２０）中で４％〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カタログ番号ＥＣ６０２５２）による電気泳動に供した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質マーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１０７４７−０１２）を分子サイズ標準として同時に移動させた。タンパク質は、Ｇｅｌ ＣｏｄｅＢｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５９２）を用いた染色によって検出された。
【０１０８】
結果および考察
図１０に示されるように、並行した溶解−捕捉およびアフィニティタグ精製は、高度に精製された融合タンパク質調製物をもたらした。溶出を連続して行うごとに、融合タンパク質の純度が増加した（レーンＥ１〜レーンＥ３）。
【０１０９】
実施例４
不溶性タンパク質の精製
本発明の組成物および方法は、可溶性タンパク質および不溶性タンパク質の精製と適合している。以下の手順は、不溶性タンパク質（例えば、発現された時に、封入体を形成するタンパク質）の単離における本発明の有用性を証明するために開発された。
【０１１０】
材料および方法
特に指示のない限り、全ての手順を室温で行い、全ての試薬を、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社の一部門、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した。
【０１１１】
細胞増殖
プラスミドｐＴＲＸＦＵＳＰＲＬ２０Ｂ（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質クローン２０ｋＤａ）を有する大腸菌ＤＨ１０ＢならびにプラスミドｐＴＲＸＦＵＳＰＲＬ６０ＢおよびｐＴＲＸＦＵＳＰＲＬ１２０Ｂ（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質クローン６０ｋＤａおよび１２０ｋＤａ）を有する大腸菌ＳＴＢＬ−２株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＣｉｒｃｌｅ Ｇｒｏｗ培地中で、２５０ｒｐｍ、３０℃で１６時間増殖させた。一晩培養物０．５ミリリットルを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＣｉｒｃｌｅ Ｇｒｏｗ培地３０ｍｌに接種した。希釈された混合物の増殖を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で続けた。６００ｎｍでの濁度によって細胞増殖をモニターした。培養物のＯ．Ｄ．_６００測定値が１．０〜１．２になったら、インキュベーション温度を４２℃に上げてタンパク質過剰発現を誘導した。４２℃で３０分間、次いで、３７℃で１．５時間、増殖を続けた。最終的な細胞密度はＯ．Ｄ．_６００＝２．０であった。
【０１１２】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスによるタンパク質抽出
誘導培養物１ミリリットルを別個の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを、再懸濁緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５％（ｖ／ｖ）ＮＯＧ）２００μｌに再懸濁した。再懸濁液２００μｌを、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのフィルタープレート表面に適用し、室温で１０分間インキュベートした。溶解緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μｌをフィルタープレートに添加した。インキュベーションを１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスを、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置き、自在バケットローターに入れて１０００×ｇで１０分間、遠心分離した。レシーバプレートに可溶性タンパク質を集め、封入体をマトリクス内に捕捉した。次いで、マトリクスをｄｄＨ_２Ｏ ５００μｌで洗浄し、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。洗浄液は捨てた。９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、別の９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置いた。
【０１１３】
超音波処理によるタンパク質抽出
誘導培養物１ミリリットルを別個の１．５ｍｌ微量遠心チューブに入れた。細胞を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清を除去した後、細胞ペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ ３００μｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、設定「３」で、液体に沈めたマイクロチップを用いて、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（モデル５５０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から３回の１０秒パルスに供した。破片を集めるために、チューブを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、ｄｄＨ_２Ｏ １ミリリットルで３回洗浄した。次いで、封入体ペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ ３００μｌで可溶化した。
【０１１４】
第２の溶出／破壊試薬の添加
不溶性緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ）３００μｌをフィルターに添加し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートを自在バケットローターに入れて１０００×ｇで５分間、遠心分離し、可溶化されたタンパク質を収集用プレートに集めた。
【０１１５】
結果
図１１は、３つのサイズ２０ｋＤ、６０ｋＤ、および１２０ｋＤの不溶性タンパク質の単離を示す。レーン１、レーン４、およびレーン７は、本発明のフィルターから溶出した可溶性画分（それぞれ、２０ｋＤ、６０ｋＤ、および１２０ｋＤ）を示す。これらのレーンから、可溶性画分にはタンパク質はほとんど存在しないことがはっきり分かる。２０ｋＤタンパク質の可溶性画分におけるタンパク質の量は、このタンパク質の偏った溶解度のために多い。レーン２、レーン５、およびレーン８は、第２の溶出／破壊試薬添加後の溶出液（それぞれ、２０ｋＤ、６０ｋＤ、および１２０ｋＤ）を示す。これらのレーンは、超音波処理（レーン３、レーン６、およびレーン９）を用いた同様の手順を上回る、タンパク質収率の著しい増加を示す。従って、本発明の方法および組成物は、発現された時に、封入体を形成するタンパク質の単離において非常に有用である。この方法は、超音波処理を用いた同様の方法より高い収率を生じるように思われる。
【０１１６】
実施例５
直接充填法による不溶性タンパク質の精製
方法
細胞増殖
細胞培養条件は実施例２と同じであった。
【０１１７】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスによるタンパク質抽出
培養物の２つの２００μｌアリコートを、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのフィルター表面に適用した。溶解緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２％（ｖ／ｖ）ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）、１．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μｌを両フィルターに添加した。インキュベーションを室温で１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置き、自在バケットローターに入れて１０００×ｇで５分間、遠心分離した。レシーバプレートに可溶性タンパク質を集め、封入体をマトリクス内に捕捉した。次いで、マトリクスをｄｄＨ_２Ｏ ５００μｌで洗浄し、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。洗浄液は捨てた。９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、別の９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置いた。不溶性緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ）３００μｌをフィルターに添加し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートを自在バケットローターに入れて１０００×ｇで５分間、遠心分離し、可溶化されたタンパク質を収集用プレートに集めた。
【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：
可溶性画分１５マイクロリットルおよび不溶性画分１５マイクロリットルを、１×ＴＧＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１５５５６−０２０）中で４％〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＥＣ６０２５２）による電気泳動に供した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質マーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１０７４７−０１２）を分子サイズ標準として同時に移動させた。タンパク質は、Ｇｅｌ ＣｏｄｅＢｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５９２）を用いた染色によって検出された。
【０１１９】
結果
図１２は、３５ｋＤａの不溶性タンパク質の単離を示す。レーン２およびレーン３は可溶性画分を示し、レーン４およびレーン５は不溶性画分を示す。これらのレーンから、可溶性画分には３５ｋＤａタンパク質はほとんど存在しないことがはっきり分かる。レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質ラダーである。
【０１２０】
実施例６
直接充填法による細菌細胞からのタンパク質の単離およびその後のアフィニティタグ精製
方法
細胞増殖
細胞培養条件は実施例２と同じであった。
【０１２１】
９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスによるタンパク質抽出
誘導培養物の２つの２００μｌアリコートを、直接、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスのフィルター表面に適用した。溶解緩衝液（１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２％（ｖ／ｖ）ＥＬＵＧＥＮＴ（商標）、１．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０２５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μｌを両フィルターに添加した。インキュベーションを室温で１０分間続け、次いで、９６ウェル溶解マトリクス／フィルターマトリクスプレートを、９６ウェル６５０μｌレシーバプレート（カタログ番号ｐ９６０５、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の上に揃えて置き、自在バケットローターに入れて１０００×ｇで５分間、遠心分離した。レシーバプレートに可溶性タンパク質を集めた。
【０１２２】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号３１３１４）によるアフィニティ精製
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズを、５０％スラリーとして、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と平衡状態にした。１．５ｍｌ微量遠心チューブ内で、フィルタープレート法によって抽出された２つの総タンパク質２５０μｌを、５０％スラリーＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ５０μｌとインキュベートした。試料を１０分間インキュベートし、次いで、７００×ｇで２分間遠心分離した。（７００×ｇで遠心分離した）５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール１ｍｌで３回、ビーズを洗浄した。（７００×ｇで２分間遠心分離した）５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール５０μｌと１０分間インキュベートすることによって、ポリｈｉｓタグ化タンパク質をビーズから溶出し、溶出液を１．５ｍｌ微量遠心チューブに収集し、＋４℃に置いた。
【０１２３】
ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号２７−４５６７０−０３）を用いたアフィニティ精製
フィルタープレート法によって抽出された２つの総タンパク質２５０μｌを、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに充填し、穏やかに混合し、１０分間インキュベートした。カラムを７００×ｇで１分間遠心分離し、流出液を捨てた。カラムを、１×ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）で３回洗浄し、７００×ｇで１分間遠心分離した。１０ｍＭグルタチオン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０μｌと１０分間インキュベートすることによって、ＧＳＴタグ化タンパク質をカラムから溶出した。７００×ｇで２分間の遠心分離によって、溶出液を１．５ｍｌ微量遠心チューブに収集し、＋４℃に置いた。
【０１２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
各試料の総タンパク質および溶出液１５マイクロリットルを、１×ＴＧＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１５５５６−０２０）中で４％〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＥＣ６０２５２）による電気泳動に供した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋタンパク質マーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門、カタログ番号１０７４７−０１２）を分子サイズ標準として同時に移動させた。タンパク質は、Ｇｅｌ ＣｏｄｅＢｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５９２）を用いた染色によって検出された。
【０１２５】
結果
図１３において、レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質ラダーを示す。レーン２およびレーン３は、３０ｋＤａポリｈｉｓタグ化融合タンパク質の総タンパク質である。レーン４およびレーン５は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズによって精製された３０ｋＤａポリｈｉｓタグ化融合タンパク質である。
【０１２６】
図１４において、レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋタンパク質ラダーを示す。レーン２およびレーン３は、５８ｋＤａポリｈｉｓタグ化融合タンパク質の総タンパク質である。レーン４およびレーン５は、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ精製によって精製された５８ｋＤａ ＧＳＴタグ化融合タンパク質である。
【０１２７】
本明細書で述べられた全ての刊行物、特許、および特許出願は本発明が属する当業者の技術レベルを示すものであり、個々のそれぞれの刊行物、特許、または特許出願が参照として組み入れられるように詳細かつ個別に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２８】
ここまでで、明確な理解を目的とした例示および実例として、本発明がある程度詳しく十分に説明されたが、本発明の範囲にも本発明のどの態様にも影響を及ぼすことなく、条件、配合、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲内で本発明を変更または修正することによって本発明を実施することができ、このような変更または修正が添付の特許請求の範囲内に含まれると意図されることが、当業者には明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】チューブ内の空間を上部試料適用部３と、下部試料収集部または下部試料溶出部４に分ける、フリットまたはプラグまたはカートリッジまたはスワブチップの形状の多孔質マトリクス材料２を含む薄い壁のチューブ（好ましくは、任意のサイズの微量遠心チューブ）１を示す、本発明の一局面の図である。本発明の一局面によれば、マトリクス材料２は、１つまたは複数の細胞溶解／破壊／透過化化合物または組成物を含んでもよい。別の局面において、マトリクス材料は、ビーズまたはゲルまたは他の半固体マトリクスの形状であってよく、この場合、マトリクスは、好ましくは、上部試料適用部３および下部試料収集部４を維持するために、フリットまたは多孔質フィルターなどの固体支持体材料２ａ内に入れられているか、固体支持体材料２ａと会合されているか、または固体支持体材料２ａによって支持されている。好ましくは、マトリクス材料（固体または半固体）は、試料収集を容易にするために、チューブ１から容易に取り外すことができるカートリッジまたはプラグまたはスワブチップの形状である。別の局面において、所望のタンパク質分子およびペプチド分子の単離または精製をさらに容易にするために、１つまたは複数の追加的なマトリクスまたは樹脂を、上部試料適用部３および／または試料収集部４に含ませてもよい。例えば、所望でない成分（脂質、核酸、細胞供給源を溶解／破壊するのに用いられた溶解／破壊組成物、溶媒、界面活性剤などを含む）から所望のタンパク質分子およびペプチド分子をさらに精製するために、周知のタンパク質およびペプチドと結合するマトリクス（例えば、イオン交換樹脂、疎水相互作用樹脂、およびアフィニティ樹脂）を本発明のサイズ分離マトリクスの下に含ませてもよい。または、このような所望でない成分と結合するが、所望のタンパク質分子およびペプチド分子を実質的に結合しない追加的な組成物を使用してもよい。別の態様において、このようなタンパク質およびペプチドと結合するマトリクスと汚染物質と結合するマトリクスの組み合わせを使用してもよい。選択的なタンパク質およびペプチドと結合する樹脂ならびに／または汚染物質と結合する樹脂５が示される。このような追加的なマトリクスは、カートリッジまたはプラグまたはスワブチップの形状であってよい。選択的なタンパク質およびペプチドと結合する樹脂または汚染物質と結合する樹脂５は、フリットまたは多孔質フィルターなどの固体支持体材料５ａに入れられてもよく、固体支持体材料５ａと会合されてもよく、固体支持体材料５ａによって支持されてもよい。別の局面において、試料収集部４は、１つまたは複数のマトリクスの取り出しを必要とせずに試料を収集するために開口部または出入口（必要に応じて閉じることができる）を含んでもよい。サイズ分離マトリクスおよびタンパク質またはペプチドと結合するマトリクスが設けられている１つの例では、所望のタンパク質分子およびペプチド分子はサイズ分離マトリクスを通過し、結合マトリクスに結合する。次いで、不要な材料を試料収集部４内の出入口または開口部を通して除去するために、吸引を行うことができる。必要に応じて、洗浄緩衝液を添加する前に、サイズ分離マトリクスをチューブ１から取り外すことができる。次いで、溶出緩衝液を加えると、所望の単離されたタンパク質分子およびペプチド分子を出入口／開口部から取り出すことができる。または、試料収集部４にアクセスするための１つまたは複数のマトリクスを取り出すことで、所望のタンパク質分子およびペプチド分子が取り出される。
【図２】いくつかの細胞抽出法によって回収されたＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を比較した、臭化エチジウム染色１％アガロースゲルの写真である。各試料の２つの１μｌアリコートを０．６μｇλＤＮＡとインキュベートした。レーン１、精製ＮｓｉＩ対照；レーン２〜レーン３、超音波処理された試料；レーン４〜レーン５、溶解マトリクス／フィルターマトリクス；レーン６〜レーン７、透過化緩衝液のみの試料；レーン８〜レーン９、透過化緩衝液を用いなかった溶解マトリクス／フィルターマトリクスの試料；レーン１０、未消化λＤＮＡ対照；およびレーンＭ、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ。
【図３】溶解マトリクス／フィルターマトリクス２を含む、薄い壁のチューブまたはカラム（好ましくは、任意のサイズのマイクロスピンまたはスピンカートリッジ）１、ならびにより小さな分子量のタンパク質分子およびペプチド分子をさらに精製するための、追加的な組成物５を含む第２のチューブまたはカラムを示す、本発明の一局面の図である。好ましくは、追加的な組成物５は、タンパク質もしくはペプチドと結合するマトリクス、または汚染物質と結合するマトリクス、あるいはそれらの組み合わせである。溶解マトリクス／フィルターマトリクス２および追加的な組成物５はきわめて近接していてもよく、フリットまたは多孔質フィルターなどの固体支持体材料２ａによって隔てられてもよいが、このようなマトリクスは、好ましくは、別個のチューブまたはカラム１に入れられる。チューブまたはカラム１は、試料適用部３および、試料を収集するための開口部または出入口６（必要に応じて閉じることができる）を含む。開口部または出入口６を通過した試料を収集するために、選択的な収集用チューブ、ウェル、または容器７が設けられる。好ましい局面において、サイズ分離マトリクス２は細胞溶解／破壊化合物または組成物を含む。このような好ましい態様の適用において、タンパク質および／またはペプチド分子の細胞供給源を含む試料は、試料適用部３ａに、好ましくは、マトリクス２の上面に、適用される。細胞溶解／破壊組成物または化合物は、サイズ分離マトリクス２のサイズに従って分離する低分子量および／または高分子量のタンパク質分子およびペプチド分子の放出を引き起こし、タンパク質分子およびペプチド分子がマトリクス２を通過することが可能になるが、その一方で、大きな分子量の分子および構造のかなりの部分がマトリクス２内またはマトリクス２上に保持される。サイズ分離マトリクス２を通過したタンパク質分子およびペプチド分子は開口部または出入口を通り、タンパク質またはペプチドと結合するマトリクス５を含む第２のチューブまたはカラムの試料適用部３ｂに流される。次いで、溶出されたタンパク質分子およびペプチド分子は、タンパク質またはペプチドと結合するマトリクス５に結合する。大きな分子量の分子および構造が、後の洗浄および溶出の間にサイズ分離マトリクス２を通過するのを最小限にするために、サイズ分離マトリクス２は、（洗浄前または洗浄後に）カラムまたはチューブ１から選択的に取り外すことができる。次いで、不要な材料を除去するために、洗浄緩衝液または洗浄溶液を適用することができる。次いで、タンパク質またはペプチドと結合するマトリクスから開口部または出入口６を通して所望のタンパク質分子およびペプチド分子を溶出するために、溶出緩衝液または溶出溶液を適用することができる。洗浄中、溶出の際に所望のタンパク質分子およびペプチド分子を収集するために、（不要な材料を含む）収集用チューブ７と、第２のまたは新しい収集用チューブ７を交換することができる。
【図４】固体支持体材料２ａの上部に溶解マトリクス／フィルターマトリクス２を含む薄い壁のチューブまたはカラム１を示す、本発明の別の局面の図である。チューブまたはカラム１は試料適用部３および開口部または出入口６を含む。開口部または出入口６を通過した試料を収集するために、タンパク質と結合するマトリクス５などの組成物を含む収集用チューブ、ウェル、または容器７が設けられる。組成物５は固体支持体材料５ａによって支持されている。この態様は、溶解マトリクス／フィルターマトリクス２を含むチューブまたはカラム１の容易な物理的分離を可能にする。
【図５】固体支持体材料２ａの上部に溶解マトリクス／フィルターマトリクス２を含む薄い壁のチューブまたはカラム１を示す、本発明の別の局面の図である。チューブまたはカラム１は試料適用部３および開口部または出入口６を含む。開口部または出入口６を通過した試料を収集するために、ビーズの形状のタンパク質と結合するマトリクス５などの組成物を含む収集用チューブ、ウェル、または容器７が設けられる。
【図６】いくつかの細胞抽出法により回収された画分中の核酸汚染を比較した、臭化エチジウム染色１％アガロースゲルの写真である。各試料の２つの２０μｌアリコートをアガロースゲル電気泳動で分析した。レーン１、ＣｌｏｎｅＣｈｅｃｋｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）を用いて細胞から抽出されたＤＮＡ；レーン２〜レーン３、超音波処理された試料；レーン４〜５、溶解マトリクス／フィルターマトリクス；レーン６〜レーン７、透過化緩衝液のみの試料；レーン８〜レーン９、透過化緩衝液を用いなかった孔含有マトリクスの試料；レーン１０、透過化緩衝液のみの対照；およびレーンＭ、１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ。
【図７】超音波処理された試料および溶解マトリクス／フィルターマトリクスを用いて単離された試料の総タンパク質回収率ならびに二次アフィニティタグ精製後のタンパク質回収率を比較した、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査（ｓｃａｎｎｅｄ）画像である。各試料の２つの１５μｌアリコートを分析した。レーンＭ、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）；レーン１〜レーン２、超音波処理された試料からの総タンパク質；レーン３〜レーン４、溶解マトリクス／フィルターマトリクス試料からの総タンパク質；レーン５〜レーン６、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＨｉｓ−６精製後の、超音波処理された試料；レーン７〜レーン８、二次精製後の、溶解マトリクス／フィルターマトリクス試料。
【図８】超音波処理された試料および溶解マトリクス／フィルターマトリクスを用いて単離された試料の総タンパク質回収率ならびに二次アフィニティタグ精製後のタンパク質回収率を比較した、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査画像である。各試料の２つの１５μｌアリコートを分析した。図８Ａは、超音波処理を用いて単離された試料である：レーンＭ、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の一部門）；レーン１〜レーン２、総タンパク質；レーン３〜レーン４、ＧＳＴ精製（アマシャムバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いた二次精製後の試料。図８Ｂは、溶解マトリクス／フィルターマトリクスを用いて単離された試料である：レーンＭ、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ；レーン１〜レーン２、総タンパク質；レーン３〜レーン４、二次精製後の試料。
【図９】１％ＴＡＥアガロースゲルの走査画像である。レーンＭは１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒである。λＤＮＡをＮｓｉＩで制限酵素処理し、反応産物を対照としてレーン１において移動させた。λＤＮＡを、超音波処理（レーン２）および本発明の方法（レーン３およびレーン４）によって調製された細胞抽出物とインキュベートし、反応産物を１％ＴＡＢゲル上で移動させた。
【図１０】４％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査画像である。試料添加からの流出液を「流出」レーンにおいて移動させ、カラム洗浄段階由来の溶出された緩衝液を「洗浄」レーンにおいて移動させた。レーンＥ１〜レーンＥ３は、本発明のフィルターの３回の連続した１００μｌ溶出の溶出液を示す。各試料１５μｌをゲルの各ウェルに添加した。
【図１１】４％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査画像である。レーン１〜レーン３は、可溶性方法（レーン１）、不溶性方法（レーン２）、および超音波処理／尿素方法（レーン３）によって単離された２０ｋＤ不溶性タンパク質の純度および収率を示す。レーン４〜レーン６は、可溶性方法（レーン４）、不溶性方法（レーン５）、および超音波処理／尿素方法（レーン６）によって単離された６０ｋＤ不溶性タンパク質の純度および収率を示す。レーン７〜レーン９は、可溶性方法（レーン７）、不溶性方法（レーン８）、および超音波処理／尿素方法（レーン９）によって単離された１２０ｋＤ不溶性タンパク質の純度および収率を示す。
【図１２】３５ｋＤａ不溶性タンパク質の単離を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン２およびレーン３は可溶性画分を示し、レーン４およびレーン５は不溶性画分を示す。レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒである。
【図１３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒを示す。レーン２およびレーン３は、３０ｋＤａポリｈｉｓタグ化融合タンパク質の総タンパク質である。レーン４およびレーン５は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズによって精製された３０ｋＤａポリｈｉｓタグ化融合タンパク質である。
【図１４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１はＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒを示す。レーン２およびレーン３は、５８ｋＤａ ＧＳＴタグ化融合タンパク質の総タンパク質である。レーン４およびレーン５は、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＧＳＴ精製によって精製された５８ｋＤａ ＧＳＴタグ化融合タンパク質である。

Claims (37)

1. １つのタンパク質分子またはタンパク質分子もしくはペプチド分子の集団を単離する方法であり、以下の段階を含む方法：
   （ａ）タンパク質分子またはペプチド分子の１つまたは複数の細胞供給源と、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、少なくとも１つの孔含有マトリクス（ｍａｔｒｉｘ）を接触させる段階；
   （ｂ）該高分子量の分子および構造から該分子を分離する、または実質的に分離する段階。
2. 細胞供給源からのタンパク質分子またはペプチド分子の全てまたは一部の放出を引き起こす段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
3. マトリクスが、ポリエステルマトリクス、ポリオレフィンマトリクス、焼結ポリエチレンマトリクス、ニトロセルロースマトリクス、酢酸セルロースマトリクス、ナイロンマトリクス、セルロースマトリクス、およびシリカマトリクスからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
4. マトリクス内の孔の平均サイズが直径約１，０００ミクロンから約０．１ミクロンである、請求項１記載の方法。
5. 孔が直径約５００から約１ミクロンである、請求項４記載の方法。
6. 孔が直径約４００から約２５ミクロンである、請求項５記載の方法。
7. タンパク質分子またはペプチド分子の放出が溶解／破壊／透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）組成物または化合物によって達成される、請求項１記載の方法。
8. 溶解／破壊／透過化組成物が１つまたは複数の界面活性剤を含む、請求項７記載の方法。
9. 溶解／破壊／透過化組成物が１つまたは複数の酵素を含む、請求項７記載の方法。
10. 酵素が、リゾチーム、リソスタフィン、またはザイモリエースである、請求項９記載の方法。
11. マトリクスが１つまたは複数の溶解／破壊／透過化組成物または化合物を含む、請求項１記載の方法。
12. 請求項１記載の方法であり、以下の段階をさらに含む方法：
    フィルターと、タンパク質凝集物および／または膜断片を破壊および／または可溶化する組成物を接触させる段階；
    可溶化または破壊されたタンパク質分子またはペプチド分子を収集する段階。
13. 組成物が界面活性剤、カオトロピック剤（ｃｈａｅｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、または塩を含む、請求項１２記載の方法。
14. カオトロピック剤が尿素である、請求項１３記載の方法。
15. タンパク質分子またはペプチド分子を収集する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
16. 細胞供給源が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞、ウイルスに感染した細胞、および植物細胞からなる群より選択される細胞である、請求項１記載の方法。
17. 細菌細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１６記載の方法。
18. 酵母細胞がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ）細胞である、請求項１６記載の方法。
19. 請求項１記載の方法によって産生された、単離されたタンパク質分子またはペプチド分子。
20. １つのタンパク質分子もしくはペプチド分子またはタンパク質分子もしくはペプチド分子の集団の単離において使用するための組成物であり、以下を含む組成物：
    （ａ）該タンパク質分子またはペプチド分子の１つまたは複数の細胞供給源；
    （ｂ）高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、可溶性タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、１つまたは複数の孔含有マトリクス；ならびに選択的に、
    （ｃ）該細胞供給源を溶解／破壊／透過化する少なくとも１つの化合物または組成物。
21. タンパク質分子またはペプチド分子を抽出および単離するための装置であり、以下を含む装置：
    （ａ）ハウジング（ｈｏｕｓｉｎｇ）；ならびに
    （ｂ）容器内で、高分子量の分子、構造、および凝集物の流れを実質的に遅らせるが、該タンパク質分子およびペプチド分子の流れを実質的に遅らせない、１つまたは複数の孔含有マトリクス；ならびに
    タンパク質またはペプチドと結合するクロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ）樹脂、不純物と結合するクロマトグラフィー樹脂、タンパク質改変試薬が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素が結合しているクロマトグラフィー樹脂、核酸が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素基質が結合しているクロマトグラフィー樹脂、フィルター、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される、少なくとも１つの組成物。
22. 多孔質固体支持体をさらに含む、請求項２１記載の装置。
23. 孔含有マトリクスがチューブを試料適用部と試料収集部に分ける、請求項２１記載の装置。
24. 孔含有マトリクスが、フリット、プラグ、カートリッジ、またはスワブチップからなる群より選択される、請求項２１記載の装置。
25. 孔含有マトリクスが、ポリエステル、ポリオレフィン、焼結ポリエチレン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、セルロース、多孔質セラミック、シリカ、多糖、およびポリマーからなる群より選択される、請求項２１記載の装置。
26. 孔含有マトリクスが固体マトリクスである、請求項２１記載の装置。
27. 孔含有マトリクスが半固体マトリクスである、請求項２１記載の装置。
28. マトリクス内の孔の平均サイズが直径約０．１から約１０，０００ミクロンの範囲内である、請求項２１記載の装置。
29. 試料収集部の内部に出入口（ａｃｃｅｓｓ ｐｏｒｔ）が形成されている、請求項２３記載の装置。
30. 孔含有マトリクスが細胞溶解／破壊／透過化組成物を含む、請求項２１記載の装置。
31. 細胞溶解／破壊／透過化組成物が、界面活性剤、酵素、無機酸塩、酸、塩基、および緩衝剤からなる群より選択される、請求項３０記載の装置。
32. ハウジングが、チューブ、瓶、バイアル、アンプル、マイクロスピンチューブ、ウェル、カラム、ミニカラム、マルチウェルプレート、バック、ボックス、またはカートンである、請求項２１記載の装置。
33. 請求項２１記載の装置を含む、１つのタンパク質分子もしくはペプチド分子またはタンパク質分子もしくはペプチド分子の集団の単離において使用するためのキット。
34. タンパク質またはペプチドと結合するクロマトグラフィー樹脂、不純物と結合するクロマトグラフィー樹脂、タンパク質改変試薬が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素が結合しているクロマトグラフィー樹脂、核酸が結合しているクロマトグラフィー樹脂、酵素基質が結合しているクロマトグラフィー樹脂、フィルター、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される少なくとも１つの組成物をさらに含む、請求項３３記載のキット。
35. 本発明のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、該タンパク質またはペプチドの基質、該タンパク質またはペプチドのリガンド、該タンパク質またはペプチドの補因子、該タンパク質またはペプチドに結合する核酸分子、該タンパク質またはペプチドの阻害剤、該タンパク質またはペプチドを改変する酵素、該タンパク質またはペプチドを改変する組成物、該タンパク質またはペプチドと結合する組成物、該タンパク質またはペプチドによって結合される組成物、および試料中に存在するタンパク質または核酸の量を検出または定量するのに使用することができる組成物からなる群より選択される少なくとも１つの組成物をさらに含む、請求項３３記載のキット。
36. 試料の取り出しおよび再適用を必要とせずに、試料が少なくとも１つの孔含有マトリクスを通過して、請求項３４または３５記載の少なくとも１つの組成物と直接接触できるように、全ての組成物が１つまたは複数の流路（ｆｌｕｉｄ ｃｈａｎｎｅｌ）に含まれる、請求項３３記載のキット。
37. 試料が少なくとも１つの孔含有マトリクスを通過した後、請求項３４または３５記載の少なくとも１つの組成物に直接適用され得るように、全ての組成物が２つ以上の流路または容器に含まれる、請求項３３記載のキット。

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