CN104946528A - 一种原代肝组织细胞分离系统及分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原代肝组织细胞分离系统及分离方法，由控制面板、循环泵管路，细胞分离盒和细胞富集瓶组成，控制面板能启动操作系统，监控系统工作环境；循环泵管路是把储液罐中的含有胶原酶的细胞分离液注入肝组织中，提供持续灌注的稳定压力；细胞分离盒保证肝组织在封闭无菌的环境中接受滚压式泵入的细胞分离液的持续灌注作用，细胞逐渐分离，随着细胞分离液依次通过三层不同孔径的筛网逐步分离杂质以及筋膜，最后分离出原代细胞悬液，原代单细胞悬液流入细胞富集瓶，最终实现肝脏组织中原代细胞分离富集。本发明系统设计合理，整个分离过程封闭无菌，控制精确，含有胶原酶的灌注液能循环利用，降低成本，方便实用。

Description

一种原代肝组织细胞分离系统及分离方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种原代肝组织细胞分离系统及分离方法。

背景技术

原代肝细胞是肝脏疾病基础和临床研究的重要材料。特别是在临床中，肝衰竭患者内科保守治疗效果不佳，而肝源和高昂经费让肝移植治疗难以惠及大多数病人。人工肝，尤其是生物人工肝是目前肝衰竭有希望的疗法，但从肝组织中获得大量原代肝细胞的方法尚不完善。现有主流的分离方法是通过多种非专用的装置（如蠕动泵、金属盆、水浴温箱）对肝组织灌注含有胶原酶的细胞分离液，使得肝细胞从组织中分离出来。其操作过程繁复，操作条件要求无菌，操作器械多样，对操作者有较高的技术要求。此外，由于缺乏有效的过滤装置，即使胶原酶仍有活性，胶原酶也极少重复使用，因此操作过程消耗胶原酶较多，费用高。因此，一种简便、高效、经济的肝脏组织细胞分离系统亟待开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、高效、自动的原代肝组织细胞分离系统及分离方法，为满足肝病基础研究和临床实践中生物型人工肝、原代肝细胞的需求，可以持续大量获得原代肝细胞，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种原代肝组织细胞分离系统，由控制面板、循环泵管路、细胞分离盒和细胞富集瓶组成，

所述控制面板上分别设有显示屏以及控制储液管中的磁力搅拌旋钮、控制循泵旋钮、水浴锅温度控制旋钮、液压监测控制旋钮；

所述循环泵管路包括储液罐和滚压式泵，储液罐通过循环管路连接在滚压式泵的进口，滚压式泵出口上连接的循环管路上安装有液压温度监测器，储液罐内放置有磁力搅拌转子，储液罐放置在内恒温水浴锅，恒温水浴锅放置在磁力搅拌装置上；

所述细胞分离盒的两端分别设有第一螺旋接口和第二螺旋接口，第一螺旋接口与滚压式泵出口的循环管路连接，细胞分离盒的内部前端设有与第一螺旋接口连接的多项接头，所述细胞分离盒内设有孔径依次减小的第一筛网、第二筛网和第三筛网，所述第一筛网与多项接头之间设有组织灌注槽；

所述细胞富集瓶包括富集瓶体，富集瓶体顶端通过富集瓶导管接第二螺旋接口，富集瓶导管上安装有富集瓶上开关，富集瓶体内设有细胞筛，富集瓶体下端通过分离瓶下导管连接在储液罐内，分离瓶下导管上安装有富集瓶下开关。

作为本发明进一步的方案：所述细胞分离盒的构型为一个由窄至宽的立体梯形，且第一螺旋接口设置在细胞分离盒的窄端，第二螺旋接口设置在细胞分离盒的宽端。

作为本发明再进一步的方案：所述第一筛网的孔径为300目，第二筛网的孔径为200目，第三筛网的孔径为100目。

一种原代肝组织细胞分离系统的分离方法，具体步骤如下：

（1）通过控制面板掌控系统的运行，保证工作环境的调控及监测；

（2）将新鲜采集的无菌肝组织样本放入细胞分离盒内的组织灌注槽内，若组织块较大，则分割成小块后放入多个细胞分离盒中，多个细胞分离盒并联同时运行；

（3）根据组织情况，把多项接头连接上导管或者穿刺针，对肝组织样本进行门脉连接或者多点穿刺；

（4）在储液罐中加入无菌生理盐水，并调节控制面板上的温度控制旋钮调控储液罐中生理盐水的温度至37℃，打开循环泵控制旋钮控制滚压式泵启动，使生理盐水对肝组织进行初步灌注清洗2min，排除腔隙中的血细胞以及杂质；

（5）把第一筛网、第二筛网和第三筛网按顺序插入细胞分离盒的相应卡槽中，扣上盒盖，并将储液罐清洗干净，置换无菌细胞分离液；

（6）再次打开磁力搅拌旋钮、温控控制旋钮和循环泵控制旋钮，储液罐中的细胞分离液充分混匀，并加热至37℃，随循环泵管路进入细胞分离盒，通过细胞分离盒前部的多项接头，分别有三个导管或者穿刺针对肝细胞进行持续灌注，细胞分离液与肝组织充分接触同时伴有持续稳定的灌注压；

（7）分离下来的肝细胞及组织随循环液依次流经第一筛网、第二筛网和第三筛网，将单细胞悬液汇聚细胞富集瓶中，含有胶原酶的细胞分离液分离循环回储液罐中；

（8）待肝组织细胞分离完毕，先关闭循环泵控制旋钮，再关闭富集瓶上开关和富集瓶下开关，取下富集瓶体，完成原代细胞分离。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明系统将原代肝细胞分离过程集合在一整套系统中，保证整个分离过程的封闭无菌状态下进行，同时使分离条件因素能被精确的控制，保证稳定的灌注压，多点灌注位置，循环利用含有胶原酶的灌注液；同时分离盒、富集瓶及管路系统可以作为一次性无菌耗材制备，降低成本，方便实用；本发明有助于为科学研究及生物人工肝，提供大量优质的原代肝细胞。

附图说明

图1为原代肝组织细胞分离系统的结构示意图。

图2为原代肝组织细胞分离系统中细胞分离盒的内部结构图。

图中：1-显示屏；2-液压监测旋钮；3-温度控制旋钮；4-循环泵控制旋钮；5-磁力搅拌旋钮；6-恒温水浴锅；7-磁力搅拌装置；8-储液罐；9-滚压式泵泵；10-液压温度监测器；11-循环管路；12-前旋入接口；13-多项接头；14-组织灌注槽；15-第一网筛；16-第二网筛；17-第三网筛；18-后旋入接口；19-富集瓶导管；20-富集瓶上开关；21-富集瓶体；22-细胞筛；23-富集瓶下开关；24-分离瓶下导管；25-循环泵管路；26-控制面板；27-细胞富集瓶；28-细胞分离盒。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～2，本发明实施例中，一种原代肝组织细胞分离系统，由控制面板26、循环泵管路25、细胞分离盒28和细胞富集瓶27组成。

控制面板26上分别设有显示屏1以及控制储液管中的磁力搅拌旋钮5、控制循泵旋钮4、水浴锅温度控制旋钮3、液压监测控制旋钮2，显示屏1实时显示系统中的液压、温度及控制旋钮的设定参数。

循环泵管路25包括储液罐8和滚压式泵9，滚压式泵9是一个4cm正方形轴与4.2cm直径的圆周组成，其正方形四角挤压通过圆周的管路形成泵压；滚压式泵9通过调节泵头转动挤压循环管路11驱动储液罐8中的含有胶原酶的细胞分离液循环流动，并提供持续的肝组织灌注压力；储液罐8通过循环管路11连接在滚压式泵9的进口，循环管路11采用直径为0.5cm的透明软管，滚压式泵9出口上连接的循环管路11上安装有液压温度监测器10，储液罐8内放置有磁力搅拌转子7，储液罐8放置在内恒温水浴锅6，恒温水浴锅6放置在磁力搅拌装置上，储液罐中的磁力搅拌转子7工作时保证循环使用的胶原酶浓度，同时也能使恒温水浴锅对含有胶原酶的细胞分离液均匀恒温，使胶原酶发挥最佳效果。

在管路系统中的液压温度监测器10，可以对系统运行状态进行监测，其中温度监测保证细胞分离液的最佳工作温度；液压监测是明确管路通畅的重要指标，并且指示筛网是否阻塞严重，可暂停运行，置换筛网，继续工作。

细胞分离盒28的构型为一个由窄至宽的立体梯形，封闭无菌，运行过程避免环境的干扰，上底为3cm，下底为9cm，纵轴长11cm，细胞分离盒28的两端分别设有第一螺旋接口12和第二螺旋接口18，且第一螺旋接口12设置在细胞分离盒28的窄端，第二螺旋接口18设置在细胞分离盒28的宽端。

第一螺旋接口12与滚压式泵9出口的循环管路11连接，细胞分离盒28的内部前端设有与第一螺旋接口12连接的多项接头13，多项接头13可以根据不同组织需求连接不同数量的导管或者穿刺针，进行多点穿刺灌注，有利于细胞分离液在组织中充分浸润，发挥作用。

细胞分离盒28内设有孔径依次减小的第一筛网15、第二筛网16和第三筛网17，第一筛网15的孔径为300目，第一筛网15主要目的是阻截较大的组织块；第二筛网16的孔径为200目，用于阻截在组织分解过程中产生的血管、筋膜或细胞团；第三筛网17的孔径为100目，第三网筛17又称分选细胞筛，仅允许分离细胞通过；距细胞分离盒28上底4cm处为第一筛网15通过三维卡槽固定，紧接着距离第一筛网3cm处第二筛网16通过三维卡槽固定，第三网筛17距离第二网筛16为3cm，同样通过三维卡槽固定，第三网筛17距细胞分离盒的下端为1cm。

第一筛网17与多项接头15之间设有组织灌注槽14。细胞分离盒28的设计有利于盒内液体流动逐渐放慢，流经不同孔径的筛网时流速逐步下降，利于不同大小的组织细胞充分分离，组织灌注槽14的空间最为狭窄，单位面积的压强也最大，灌注压力大，更利于大块组织的继续分解；第二网筛16与第三网筛17之间的空间较前进一步拓宽，压强进一步降低，减轻持续压力对单个细胞的损害，有利于保证细胞存活数，经三层滤网过滤后，得到分离更加充分的原代细胞悬液。

细胞富集瓶27包括富集瓶体21，富集瓶体21顶端通过富集瓶导管19连接第二螺旋接口18，富集瓶导管19上安装有富集瓶上开关20，富集瓶体21内设有细胞筛22，富集瓶体21下端通过分离瓶下导管24连接在储液罐8内，分离瓶下导管24上安装有富集瓶下开关23。独立的细胞富集瓶27，保证收集原代细胞的过程独立、封闭，并达到无菌要求，可以作为一次性耗材装备；收集下来的原代细胞亦可在封闭条件下，便于运输或者储存，有利于原代肝细胞的后续使用。

一种代肝组织细胞分离系统的分离方法，具体步骤如下：

（1）通过控制面板掌控系统的运行，保证工作环境的调控及监测；

（2）将新鲜采集的无菌肝组织样本放入细胞分离盒内的组织灌注槽内，若组织块较大，则分割成小块后放入多个细胞分离盒中，多个细胞分离盒并联同时运行；

（3）根据组织情况，把多项接头连接上导管或者穿刺针，对肝组织样本进行门脉连接或者多点穿刺；

（4）在储液罐中加入无菌生理盐水，并调节控制面板上的温度控制旋钮调控储液罐中生理盐水的温度至37℃，打开循环泵控制旋钮控制滚压式泵启动，使生理盐水对肝组织进行初步灌注清洗2min，排除腔隙中的血细胞以及杂质；

（5）把第一筛网、第二筛网和第三筛网按顺序插入细胞分离盒的相应卡槽中，扣上盒盖，并将储液罐清洗干净，置换无菌细胞分离液；

（6）再次打开磁力搅拌旋钮、温控控制旋钮和循环泵控制旋钮，储液罐中的细胞分离液充分混匀，并加热至37℃，随循环泵管路进入细胞分离盒，通过细胞分离盒前部的多项接头，分别有三个导管或者穿刺针对肝细胞进行持续灌注，细胞分离液与肝组织充分接触同时伴有持续稳定的灌注压；

（7）分离下来的肝细胞及组织随循环液依次流经第一筛网、第二筛网和第三筛网，将单细胞悬液汇聚细胞富集瓶中，含有胶原酶的细胞分离液分离循环回储液罐中；

（8）待肝组织细胞分离完毕，先关闭循环泵控制旋钮，再关闭富集瓶上开关和富集瓶下开关，取下富集瓶体，完成原代细胞分离。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (4)

1.一种原代肝组织细胞分离系统，由控制面板（26）、循环泵管路（25）、细胞分离盒（28）和细胞富集瓶（27）组成，其特征在于，

所述控制面板（26）上分别设有显示屏（1）以及控制储液管中的磁力搅拌旋钮（5）、控制循泵旋钮（4）、水浴锅温度控制旋钮（3）、液压监测控制旋钮（2）；

所述循环泵管路（25）包括储液罐（8）和滚压式泵（9），储液罐（8）通过循环管路（11）连接在滚压式泵（9）的进口，滚压式泵（9）出口上连接的循环管路（11）上安装有液压温度监测器（10），储液罐（8）内放置有磁力搅拌转子（7），储液罐（8）放置在内恒温水浴锅（6），恒温水浴锅（6）放置在磁力搅拌装置上；

所述细胞分离盒（28）的两端分别设有第一螺旋接口（12）和第二螺旋接口（18），第一螺旋接口（12）与滚压式泵（9）出口的循环管路（11）连接，细胞分离盒（28）的内部前端设有与第一螺旋接口（12）连接的多项接头（13），所述细胞分离盒（28）内设有孔径依次减小的第一筛网（15）、第二筛网（16）和第三筛网（17），所述第一筛网（17）与多项接头（15）之间设有组织灌注槽（14）；

所述细胞富集瓶（27）包括富集瓶体（21），富集瓶体（21）顶端通过富集瓶导管（19）连接第二螺旋接口（18），富集瓶导管（19）上安装有富集瓶上开关（20），富集瓶体（21）内设有细胞筛（22），富集瓶体（21）下端通过分离瓶下导管（24）连接在储液罐（8）内，分离瓶下导管（24）上安装有富集瓶下开关（23）。

2.根据权利要求1所述的原代肝组织细胞分离系统，其特征在于，所述细胞分离盒（28）的构型为一个由窄至宽的立体梯形，且第一螺旋接口（12）设置在细胞分离盒（28）的窄端，第二螺旋接口（18）设置在细胞分离盒（28）的宽端。

3.根据权利要求1所述的原代肝组织细胞分离系统，其特征在于，所述第一筛网（15）的孔径为300目，第二筛网（16）的孔径为200目，第三筛网（17）的孔径为100目。

4.一种如任一权利要求1～3所述的原代肝组织细胞分离系统的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）通过控制面板掌控系统的运行，保证工作环境的调控及监测；

（2）将新鲜采集的无菌肝组织样本放入细胞分离盒内的组织灌注槽内，若组织块较大，则分割成小块后放入多个细胞分离盒中，多个细胞分离盒并联同时运行；

（3）根据组织情况，把多项接头连接上导管或者穿刺针，对肝组织样本进行门脉连接或者多点穿刺；

（4）在储液罐中加入无菌生理盐水，并调节控制面板上的温度控制旋钮调控储液罐中生理盐水的温度至37℃，打开循环泵控制旋钮控制滚压式泵启动，使生理盐水对肝组织进行初步灌注清洗2min，排除腔隙中的血细胞以及杂质；

（5）把第一筛网、第二筛网和第三筛网按顺序插入细胞分离盒的相应卡槽中，扣上盒盖，并将储液罐清洗干净，置换无菌细胞分离液；

（6）再次打开磁力搅拌旋钮、温控控制旋钮和循环泵控制旋钮，储液罐中的细胞分离液充分混匀，并加热至37℃，随循环泵管路进入细胞分离盒，通过细胞分离盒前部的多项接头，分别有三个导管或者穿刺针对肝细胞进行持续灌注，细胞分离液与肝组织充分接触同时伴有持续稳定的灌注压；

（7）分离下来的肝细胞及组织随循环液依次流经第一筛网、第二筛网和第三筛网，将单细胞悬液汇聚细胞富集瓶中，含有胶原酶的细胞分离液分离循环回储液罐中；

（8）待肝组织细胞分离完毕，先关闭循环泵控制旋钮，再关闭富集瓶上开关和富集瓶下开关，取下富集瓶体，完成原代细胞分离。