CN102220278A - 一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种分离原代成人肝细胞的方法，其包括以下步骤：(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液；(2)用针头注射器在组织表面再次进行多点穿刺注射IV型胶原酶溶液；(3)分离肝组织加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；(4)消化物经过滤后、用红细胞裂解液处理，然后离心、收集底层沉淀，再用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代成人肝细胞。本发明还公开了上述分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒。本发明利用一次性专用器械盒通过肝组织表面多点穿刺注射分离成人肝细胞，简化了操作，降低了成本，适合从肝切除回收的不规则小块离体成人肝组织中提取肝细胞。

Description

一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒
技术领域
本发明涉及一种分离原代细胞的方法，尤其是涉及一种分离原代成人肝细胞的方法，本发明还涉及用于分离原代成人肝细胞的专用无菌器械盒。
背景技术
肝细胞分离方法有多种，如机械分离法、鳌合法和酶消化法等。1956年Sorrentino第一次用机械的方法分离新鲜肝组织，但机械分离法获得的肝细胞，细胞数量少、活性差，逐渐被弃用。1967年Howard创建了胶原酶灌流法(Howard RB，Pesch LA.Preparation and partial characterization of intact isolated parenchymal cells from rat liver.Biol Chem，1968，243：3105-3114)，1972年Seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法(Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells.Method Cell Biol，1976，13：29-83)，使获得的肝细胞数量和活性都得到了显著提高，而且减少了肝细胞悬液中的杂质。该方法要求从门静脉置管，经肝脏血管进行灌流，目前已广泛应用于小鼠、大鼠、猪和犬等动物肝细胞的分离培养。对于成人原代肝细胞的分离，利用肝移植手术配型不合而丢弃供肝进行肝细胞分离仍然可以应用该方法，利用手术切除的大块肝脏组织进行细胞分离也可以通过残存的肝脏小血管置管进行肝脏灌流(Lecluyse EL，Alexandre E.Isolation and culture of primary hepatocytes from resected human liver tissue.Methods Mol Biol，2010，640：57-82)。但是，目前肝移植的供肝极为紧张，而因配型不合丢弃的供肝更是稀缺，完全无法满足基础研究中对人肝细胞的巨大需求。随着外科手术技术的发展，伴随病变切除的正常肝组织也逐渐变小，获得的正常肝组织块大多极不规则，很难找到合适的灌流血管，无法实施肝脏灌流，也就无法通过Seglen两步法进行细胞分离。因此，迫切需要一种简便、容易的获取成人肝细胞的方法，从而为应用成人肝细胞进行药物筛选、细胞移植等研究提供技术支持。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种简单、经济的针对小块离体不规则成人肝组织的分离原代成人肝细胞的方法。
本发明的第二个目的是提供一种上述分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒，该器械盒可以即拆即用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现：一种分离原代成人肝细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液，直至整块肝组织由暗红色变为灰白色，且流出的前灌流液变清亮；
(2)另取针头注射器在肝组织表面再次进行多点穿刺，注射IV型胶原酶溶液，直至整块肝组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；
(3)分离肝组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；
(4)将消化物吹打成为细胞悬液，在冰浴条件下过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，离心处理后去上清液，底层沉淀加入红细胞裂解液，室温静置2～3分钟后，再进行离心，收集底层沉淀，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；
(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代成人肝细胞。
本发明所述步骤(1)中所述的多点穿刺注射为用带针头的注射器在成人肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射前灌注液，穿刺注射总时间控制在10～15分钟的范围内，在实际操作中，注射前灌注液时所选取的穿刺点的个数应根据具体肝组织的大小来决定，并以使整块肝组织全部由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮为判断标准，一般来说，至少需要取20个穿刺点。整个穿刺灌注过程中成人肝组织均在放置于冰袋之上的培养皿中进行。
本发明所述步骤(1)中所述的前灌流液主要成分为NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na2HPO4·12H2O 0.12g/L、KH2PO4 0.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES2.38g/L、EDTA 0.74g/L。
本发明所述步骤(1)中所述的前灌注液的温度为4℃，且前灌注液只一次性使用。使用低温的前灌注液，可使肝细胞在酶消化前受到较小的侵害，从而保持细胞活性。
本发明所述步骤(2)中所述的多点穿刺注射为用带针头的注射器在肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射IV型胶原酶溶液，穿刺注射总时间控制在10～15分钟的范围内，在实际操作中，所选取的穿刺点的个数应根据具体肝组织的大小来决定，以使肝组织变疏松、失去弹性和表面呈龟背状裂隙为判断标准，一般来说，至少需要取20个穿刺点。所述步骤(2)的操作全过程中成人肝组织在放置于38℃热水袋之上的培养皿中进行。
本发明所述步骤(2)中在进行IV型胶原酶溶液多点注射处理时，所述的IV型胶原酶溶液的温度为38℃，且IV型胶原酶溶液循环使用。
本发明所述步骤(2)和步骤(3)中所述IV型胶原酶溶液是由IV型胶原酶溶于DMEM培养基配制而成，浓度为0.05％-0.1％。
本发明所述步骤(3)中所述的震荡消化条件为：在恒温摇床中在37℃下以120～150转/分钟的速度消化15～20分钟。
本发明所述步骤(4)中所述的红细胞裂解液的采用浓度为0.15M的氯化铵溶液。所述的红细胞裂解液的用量与肝细胞悬液的体积比为1∶3～1∶4。所述的消化物吹打成为的细胞悬液后优选采用100目滤网过滤，而肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞后优选用200目滤网过滤。
本发明所述步骤(4)中所述的肝细胞洗涤缓冲液采用含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液，所述含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液的主要成分为DNase I 0.15g/L、CaCl2 0.12g/L、MgSO4·7H2O 0.15g/L。所述的含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液的用量是为所述步骤(4)中IV型胶原酶溶液用量的2倍。
本发明中所述步骤(4)所述离心的条件为：在4℃下，800～1000转/分，离心5分钟。
本发明所述步骤(6)分离所得的原代成人肝细胞可采用细胞培养基重悬，调节细胞浓度为0.5～1×106/ml，置冰浴中保存，备用。
本发明的第二个目的通过以下技术方案来实现：一种上述分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒，其包括盒体和操作器械，所述的操作器械包括无菌培养皿、无菌烧杯、无菌血清瓶、无菌三角烧杯、两个无菌滤网、无菌注射器、15ml无菌离心管、无菌镊子和无菌剪刀；所述盒体内设置多个与所述各个操作器械的形状、体积吻合的凹槽，所述的各个操作器械对应嵌装在相应盒体内的凹槽中。
所述盒体为塑料一体注塑成型的一次性盒。
所述的两个滤网分别为100目滤网和200目滤网。
所述的滤网呈皿状，其底部为滤网，其采用硬质材料做成的上缘向外凸出，且上缘外径略大于三角烧杯口的外径，上缘内径略小于三角烧杯口的内径，方便所述的滤网安装于三角烧杯之上进行过滤操作。为节约成本，所述的滤网采用尼龙滤网，即其底部为尼龙滤网。
在所述盒体中对应各个操作器械位置处标注序号，并且所述的各个操作器械在所述盒体中的排列顺序也基本按照其使用的先后顺序，在使用过程中可以方便取用。
本发明的一次性无菌器械盒，所述盒体外轮廓上覆盖一层外包装袋，可保持盒体及操作器械的无菌状态，可以长期保存，并实现即拆即用。
所述的外包装袋采用塑料袋。
以下结合试验进行阐述本发明与现有技术相比的有益效果：
(1)本发明采用了在离体肝组织表面多点穿刺注射法分离原代成人肝细胞，无需寻找肝组织中血管进行灌注，简化了操作，适合从肝切除回收的不规则小块原代成人肝组织中提取肝细胞。
(2)本发明在分离肝细胞时，离体成人肝组织在体外热缺血时间在20分钟以内，而离体成人肝组织的冷缺血时间控制在30～60分钟内，可以保持肝细胞的活性，且分离效率高，所得的肝细胞质量好。
(3)本发明提供获取原代成人肝细胞的器械盒为无菌一次性用品，基本囊括利用本发明所述方法获取原代成人肝细胞所需的全部器械，减少了细胞分离前的繁琐准备工作，具有结构简单、便于加工生产、使用方便、成本低廉、储存期长等优点。
(3)本发明提供的方法和器械盒不需要肝脏灌注所需的特殊灌流装置，操作简单，单人即可完成，经济实用，易于在常规实验室普及。
附图说明
图1是本发明的一次性原代成人肝细胞分离器械包的结构示意图。
图2是应用本发明方法刚分离得到的原代成人肝细胞在100×倒置显微镜下的显微图。
图3是应用本发明方法刚分离得到的原代成人肝细胞在4200×投射电镜下的电镜图。
具体实施方式
实施例一一次性无菌器械盒的设置
图1所示的分离人原代肝细胞专用的一次性器械盒的一个实施例，其由外包装袋1、盒体4和操作器械构成，盒体4设置于外包装袋1内。操作器械包括10cm无菌培养皿2、100ml无菌烧杯7、20ml无菌烧杯8、25ml无菌血清瓶3、50ml无菌三角烧杯9和50ml无菌三角烧杯10、200目无菌尼龙滤网14和100目无菌尼龙滤网5、10ml无菌注射器15和20ml无菌注射器11、无菌镊子6和无菌剪刀13、两个15ml离心管12。在盒体4内设置有多个与上述各操作器械形状、体积吻合的凹槽，上述各个操作器械对应嵌装在相应盒体4内的凹槽中。
这些操作器械在盒体4中均标注有序号，操作器械在盒体4中基本按照其使用的先后顺序进行排列。盒体4左半区域的操作器械：无菌培养皿2标注①、100ml无菌烧杯标注②、20ml无菌烧杯标注③、25ml无菌血清瓶标注④、50ml无菌三角烧杯9和50ml无菌三角烧杯10分别标注为⑤和⑥、200目无菌尼龙滤网14和100目无菌尼龙滤网5分别标注为⑦，这些操作器械从盒体4内左上角的培养皿开始从上到下、从左到右依次取用。盒体4内右半区域的操作器械为多次使用的器械：无菌镊子6和无菌剪刀13标注A、两个离心管12标注B、10ml无菌注射器15和20ml无菌注射器11标注C。
实施例二原代成人肝细胞的分离培养
DMEM培养基：根据《细胞培养》(司徒镇强，吴军正主编.西安：世界图书出版公司，2007.第50～52页)中的配方配制。
前灌流液的成分包含NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na2HPO4·12H2O 0.12g/L、KH2PO40.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES 2.38g/L、EDTA 0.74g/L。
IV型胶原酶溶液是由IV型胶原酶溶于DMEM培养基配置而成，IV型胶原酶浓度为0.05～0.1％。IV型胶原酶溶液的用量可根据肝组织大小重量来确定，然而为节约资源，经实验证明肝组织的重量为1.0～3.0g时采用15ml IV型胶原酶溶液，3.1g～4.0g时采用20mlIV型胶原酶溶液，4.1-5.0g时采用25mlIV型胶原酶溶液。
红细胞裂解液为浓度为0.15M的氯化铵溶液。
肝细胞洗涤缓冲液采用含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液，该含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液的成分包含DNase I 0.15g/L、CaCl2 0.12g/L、MgSO4·7H2O 0.15g/L。
离体成人肝组织均指不规则的小块的成人肝组织，形状不规则，重量在1克至5克之间，且无法找到可供灌流血管的肝组织，而且离体成人肝组织在体外热缺血时间最好控制在20分钟以内，冷缺血时间最好控制在30～60分钟内。采集离体成人肝组织得到了广州南方医院伦理委员会的批准。
分离方法：
(1)先打开制冰机制冰，摇床调到38℃，将IV型胶原酶溶液预热至38℃，专用器械盒拆包后置于生物安全柜中备用。
(2)取无菌的离体不规则小块成人肝组织放置于冰袋之上的无菌培养皿2中，清洗血污，用无菌剪刀13去除不需要的结缔组织，并修剪组织块，之后称取肝组织重量，约为2g。在去除结缔组织、修剪组织块和冲洗组织块表面血液时，盛装离体成人肝组织的无菌培养皿2始终放置在冰袋之上。
(3)取100ml4℃冰箱保存的前灌流液至100ml烧杯7中，用20ml无菌注射器11吸取前灌注液，然后在肝组织表面取约20个穿刺点，依次穿刺注射4℃的前灌流液，灌注时间为15分钟，此时肝组织已由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮。灌注时压力、流速要恒定，不能有气泡，且前灌流液只一次性使用。
(4)用10ml无菌注射器15吸取38℃的IV型胶原酶溶液，然后在肝组织表面取约20个穿刺点，依次穿刺注射38℃的IV型胶原酶溶液，IV型胶原酶溶液循环使用，灌注时间为15分钟，使组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙。在本操作步骤中，为保持IV型胶原酶溶液的温度，将培养皿2置于热水袋之上。
(5)将消化后的肝组织转移至20ml无菌烧杯8中，用无菌剪刀13剪开组织块，用无菌镊子6钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，然后移入25ml血清瓶3中，加入IV型胶原酶溶液15ml，置于37℃的恒温摇床中以120转/分钟的速度震荡消化15分钟；
(6)用粗口吸管将消化物吹打成为细胞悬液，加入10ml含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化。在冰浴条件下，用三角烧杯收集经100目尼龙滤网5过滤后的肝细胞悬液，移至两只15ml离心管12中，4℃下，1000转/分钟，离心5分钟，然后去上清液，得到底层沉淀的肝细胞。
(7)在所得的肝细胞加入红细胞裂解液1.5ml室温静置3分钟后，加入6mlDMEM培养基混匀，4℃下，1000转/分钟，离心5分钟，收集底层沉淀，用30ml含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，用三角烧杯收集经200目尼龙滤网14过滤的肝细胞悬液，再移至两只15ml离心管12中，4℃下，1000转/分钟，离心5分钟，弃上清液，收获沉淀于底层的肝细胞。
(8)步骤(7)中得到的的肝细胞用10ml无血清DMEM培养基重悬，在4℃下，1000转/分钟，离心5分钟，重复3次，得到成人原代肝细胞。所得的原代成人肝细胞用细胞培养基重悬，调节细胞浓度为1×106/ml，置冰浴中备用。
取原代成人肝细胞置于倒置显微镜下观察，可见活细胞透亮、呈近似球形且边界清晰，多数呈单个均匀散在分布；而破损的肝细胞表现为细胞肿胀、出现空泡，胞膜有缺损(图2)。透射电镜下新鲜分离的肝细胞呈圆形、胞膜完整、细胞较核大、胞浆内可见大量的线粒体以及少量脂肪滴(图3)。
上述实施例只是本发明的其中优先实施方式，然而本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明做出其它多种形式的修改、替换或变更，均实现本发明的目的。

Claims (10)

1.一种分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液，直至整块肝组织由暗红色变为灰白色，且流出的前灌流液变清亮；
(2)另取针头注射器在肝组织表面再次进行多点穿刺注射IV型胶原酶溶液，直至整块肝组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；
(3)分离肝组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；
(4)将消化物吹打成为细胞悬液，在冰浴条件下过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，离心处理后去上清液，底层沉淀加入红细胞裂解液，室温静置2～3分钟后，再进行离心，收集底层沉淀，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；
(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代人肝细胞。
2.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤(1)所述的离体成人肝组织在体外热缺血时间控制在20分钟以内；而所述的离体人肝组织冷缺血时间控制在30～60分钟内。
3.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中多点穿刺注射为用带针头的注射器在肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射前灌注液，穿刺灌注总时间控制在10～15分钟的范围内；所述步骤(2)中的前灌流液成分包含NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na2HPO4·12H2O 0.12g/L、KH2PO40.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES 2.38g/L、EDTA 0.74g/L；所述步骤(2)中的前灌注液的温度为4℃，且前灌注液只一次性使用。
4.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的多点穿刺注射为用带针头的注射器在肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射IV型胶原酶溶液，穿刺注射总时间控制在10～15分钟的范围内；所述的IV型胶原酶溶液的温度为38℃，且IV型胶原酶溶液循环使用；所述步骤(2)的操作全过程在放置于38℃热水袋之上的培养皿中进行。
5.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中所述IV型胶原酶溶液是由IV型胶原酶溶于DMEM培养基配制而成，IV型胶原酶的重量百分比浓度为0.05％-0.1％；所述步骤(3)中所述的震荡消化条件为：在恒温摇床中在37℃下以120～150转/分钟的速度消化15～20分钟；所述步骤(3)中IV型胶原酶溶液的用量根据肝组织大小重量来确定。
6.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，；所述步骤(4)中所述的红细胞裂解液的采用浓度为0.15M的氯化铵溶液，所述的红细胞裂解液的用量与肝细胞悬液的体积比为1∶3～1∶4；所述的消化物吹打成为的细胞悬液后采用100目滤网过滤，而肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞后用200目滤网过滤。
7.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的肝细胞洗涤缓冲液采用含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液，所述含DNaseI的肝细胞洗涤缓冲液的成分包含DNase I 0.15g/L、CaCl2 0.12g/L、MgSO4·7H2O0.15g/L；所述的含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液的用量是为所述步骤(3)中IV型胶原酶溶液用量的2倍。
8.一种权利要求1～2任一权利要求所述的分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒，其特征在于，其包括盒体和操作器械，所述的操作器械包括培养皿、烧杯、血清瓶、三角烧杯、两个滤网、注射器、15ml离心管、镊子和剪刀；所述盒体内设置多个与所述各个操作器械的形状、体积吻合的凹槽，所述的各个操作器械对应嵌装在相应盒体内的凹槽中。
9.根据权利要求9所述的一次性无菌器械盒，其特征在于，所述的滤网呈皿状，其底部为滤网，其采用硬质材料做成的上缘向外凸出，且上缘外径略大于三角烧杯口的外径，上缘内径略小于三角烧杯口的内径，使滤网安装于三角烧杯之上进行过滤操作。
10.根据权利要求8或9所述的一次性无菌器械盒，其特征在于，所述的盒体外轮廓上覆盖一层保持盒体及操作器械的无菌状态的外包装袋。
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