CN106834210B - 一种肝原代细胞分离制备方法 - Google Patents

一种肝原代细胞分离制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝原代细胞分离制备方法，所述肝原代细胞分离制备方法中采用复合酶对肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞。本发明属于医学生物技术领域，本发明的肝原代细胞分离制备方法能够有效分离肝原代细胞，复合酶的共同作用使得每种细胞的不同表面生长基质都能够得到充分的酶解，从而得到单个的细胞悬液。缓冲体系的配合为复合酶的作用提供了适宜的环境，使得酶解更为完全，从而提高分离肝原代细胞的得率。复合酶的催化特性及缓冲体系为细胞生活提供了必要环境，使得分离得到的肝原代细胞具有较高的存活率。

Description

一种肝原代细胞分离制备方法
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，尤其涉及一种肝原代细胞分离制备方法。
背景技术
肝脏作为机体的重要器官，在代谢、消化、解毒、凝血、免疫、调节等方面均起着非常重要的作用。肝脏由肝细胞组成，肝细胞行使了肝脏主要的功能，如清除毒素、参与生物合成和生物转化、代谢多种营养物质、储存葡萄糖、分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等。从机体分离得到肝细胞有助于药理毒理学、免疫学、细胞生物学等体外研究，而且随着生物人工肝在治疗肝衰竭领域的应用，越来越需要大量、高活性的原代肝细胞作为生物材料。因此，如何分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的原代肝细胞受到研究者的广泛关注。
自1953年Anderson创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进。在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法。其中，非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求。1969年，Berry和Friend引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。自从引入灌流法分离肝细胞以来,许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良。其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法。两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法。许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率。
然而，尽管两步灌流法在实际应用中也经过了无数次改良，但始终没有摆脱采用单一胶原酶进行灌注的观念。而肝脏是由实质细胞（肝原代细胞）和非实质细胞构成，其比例为3：2。肝脏的复杂性在于非实质细胞包括：星状细胞，窦内皮，胆管上皮和免疫细胞（淋巴细胞和粒细胞），而整个肝脏组是由60%实质细包和40%非实质细胞交错分布组成一个大的网络结构，单一酶解达不到很好的效果，因此，有必要对现有技术中的肝原代细胞分离制备方法进行改进。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足，提供一种的肝原代细胞分离制备方法，分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的肝原代细胞。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种肝原代细胞分离制备方法，采用复合酶对哺乳动物肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞。
本发明摆脱原有使用单一酶灌注分离肝原代细胞的思维，根据不同肝细胞的表面特性使用复合酶进行灌注，解决分离肝原代细胞中血液干扰和组织特异性问题，得到可传代培养的肝原代细胞。肝脏是由肝细胞组成，并有丰富的血管网，呈红褐色，质软而脆，易受暴力打击而破裂，导致传统机械法分离肝原代细胞得率和存活率十分低下而极少人使用。一般酶解法由于血管网丰富而导致酶的合力低下，另外，肝脏组织中各类细胞交错分布，单一酶解达不到很好的效果。复合酶的共同作用使得结构复杂、每种细胞表面生长基质不同的肝脏能够被充分酶解而得到单个细胞，而且该过程不会破坏周围的血管网，使得复合酶酶解得到的肝原代细胞具有较高存活率和较高得率。复合酶的用量根据动物肝脏的大小来确定，一般每克动物肝脏用30~60mg复合酶进行酶解。
进一步地，所述复合酶包括下述重量份的各组分：胶原酶A 20~30份、胶原酶D 20~30份、胶原酶H 5~15份。三种酶除了对胶原有一定分离能力，胶原酶A对纤维素也有一定分离能力，胶原酶D对血管组织有很好分离能力，胶原酶H对脂肪组织有一定分离能力。因为肝脏组的结构复杂与特异，故采用复合酶分解。肝原代细胞与肝星状细胞和肝胆管上皮细胞交错分布，星状细胞需要有纤维分离能力的酶分解，肝胆管上皮需要有血管组织分离能力的酶分解，而肝原代细胞表面的脂质层与需要有脂肪分离能力的酶分解，最后才能很好的释放肝原代细胞，得到单个细胞悬液。
优选地，所述复合酶包括下述重量份的各组分：胶原酶A 25份、胶原酶D 25份、胶原酶H 10份。
肝原代细胞分离制备方法，包括如下步骤：
S1.灌注：取哺乳动物肝脏，先后用灌注液I、灌注液II进行灌注；
其中，所述灌注液I包括缓冲液I，所述灌注液II包括缓冲液II和复合酶；灌注液的用量根据动物肝脏的大小确定，每克动物肝脏用25~50ml灌注液I、50~100ml灌注液II进行灌注；
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000~9000 mg，KCl 350~450mg，NaH2PO4·H2O 80~100 mg，Na2HPO4 100~140 mg，HEPES 2200~2600 mg，NaHCO3 300~400mg，EGTA 150~250 mg，Glucose 800~1000 mg，其余为H2O；
所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000~9000 mg，KCl 350~450mg，NaH2PO4·H2O 80~100 mg，Na2HPO4 100~140 mg，HEPES 2200~2600 mg，NaHCO3 300~400mg，CaCl2·2H2O 500~620 mg，其余为H2O；
S2.剥离：将步骤S1处理后的肝脏剪碎，得到肝细胞悬液；
S3.过滤：将步骤S2得到的肝细胞悬液过滤、离心，即得肝原代细胞。
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
EGTA：乙二醇二乙醚二胺四乙酸；
Glucose：葡萄糖。
本发明中，复合酶的共同作用对肝原代细胞的分离起到着至关重要的作用，缓冲体系给复合酶提供了一个弱碱性环境，提高复合酶的催化效率，而NaH2PO4·H2O 和Na2HPO4作为一对缓冲盐可以保持缓冲体系的弱碱性，Glucose为细胞生活提供了必要能量来源，为分离过程赢得时间。
进一步地，步骤S1中，所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7500~8500 mg，KCl 380~420 mg，NaH2PO4·H2O 85~95 mg，Na2HPO4 110~130 mg，HEPES 2300~2500mg，NaHCO3 320~380 mg，EGTA170~220 mg，Glucose 850~950mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7500~8500 mg，KCl 380~420 mg，NaH2PO4·H2O 85~95mg，Na2HPO4 110~130 mg，HEPES 2300~2500 mg，NaHCO3 320~380 mg，CaCl2·2H2O 520~600mg，其余为H2O。
更进一步地，步骤S1中，所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O 88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380 mg，NaHCO3 350mg，EGTA 190 mg，Glucose 900 mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000 mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O 88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380mg，NaHCO3 350 mg，CaCl2·2H2O 560 mg，其余为H2O。
步骤S1中，灌注灌注液I前先灌注清洗液，洗去肝脏上的代谢废物及坏死细胞，提高分离肝原代细胞的纯度，所述清洗液包括缓冲液II。
步骤S2中，将步骤S1处理后的肝脏在15~25ml清洗液中剪碎，得到肝细胞悬液；其中，所述清洗液包括缓冲液II。
步骤S3中，将步骤S2得到的肝细胞悬液过滤得滤液，加入预冷的清洗液至40~60ml，离心取沉淀，即得肝原代细胞。加入预冷的清洗液，防止操作过程中的升程破坏细胞，导致细胞活性降低。
步骤S3中，在4℃温度下离心，防止离心过程中的升程破坏细胞，导致细胞活性降低。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的肝原代细胞分离制备方法能够有效分离肝原代细胞，复合酶的共同作用使得每种细胞的不同表面生长基质都能够得到充分的酶解，从而得到单个的细胞悬液。缓冲体系的配合为复合酶的作用提供了适宜的环境，使得酶解更为完全，从而提高分离肝原代细胞的得率。复合酶的催化特性及缓冲体系为细胞生活提供了必要环境，使得分离得到的肝原代细胞具有较高的存活率。
具体实施方式
为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
选取90只大小相当、种类形同、肝脏大小约1~2g的健康小鼠作为实验对象，将90只健康小鼠随机分为9个试验组，试验组1采用实施例1进行试验，试验组2采用实施例2进行试验，以此类推。
实施例1
一种肝原代细胞分离制备方法，采用复合酶对肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞。所述复合酶包括下述重量份的各组分：胶原酶A 25份、胶原酶D 25份、胶原酶H 10份。
本实施例的肝原代细胞分离制备方法，包括如下步骤：
一、配制实验试剂
灌注液I：取50ml缓冲液I备用；
灌注液II：取100ml缓冲液II加入60mg复合酶备用；
清洗液：取50ml缓冲液II备用；另取50ml缓冲液II预冷备用。
其中，缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000 mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O 88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380 mg，NaHCO3 350 mg，EGTA 190mg，Glucose 900 mg，其余为H2O；缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000 mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O 88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380 mg，NaHCO3 350 mg，CaCl2·2H2O 560 mg，其余为H2O。
二、分离制备肝原代细胞
获取重量为正常小鼠分离制备肝原代细胞。
S1.灌注：用25G留置针插入下腔静脉，灌注清洗液后结扎下腔动脉，剪断肝门静脉，由肝门静脉用备好的灌注液I灌注5min，再在10min内用备好的灌注液II灌注；
S2.剥离：将步骤S1处理后的肝脏置于20ml清洗液中剪碎，得到肝细胞悬液；
S3.过滤：将步骤S2得到的肝细胞悬液用70um的无菌筛过滤得沉淀置于50ml离心管，加入预冷的清洗液至50ml，在4℃温度下以200rpm的速率离心1min，即得肝原代细胞。
S4.培养：用20ml含10%FBS的M199培养基重悬肝原代细胞，用台胎蓝染色计数后接种于预包被板。
实施例2
本实施例除了复合酶各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述复合酶包括下述重量份的各组分：胶原酶A 20份、胶原酶D 20份、胶原酶H 5份。
实施例3
本实施例除了复合酶各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述复合酶包括下述重量份的各组分：胶原酶A 30份、胶原酶D 30份、胶原酶H 15份。
实施例4
本实施例除了缓冲液I和缓冲液II各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7500 mg，KCl 380mg，NaH2PO4·H2O 85mg，Na2HPO4 110mg，HEPES 2300mg，NaHCO3 320mg，EGTA 170mg，Glucose 850mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7500mg，KCl 380mg，NaH2PO4·H2O 85mg，Na2HPO4 110mg，HEPES 2300mg，NaHCO3 320mg，CaCl2·2H2O 520mg，其余为H2O。
实施例5
本实施例除了缓冲液I和缓冲液II各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8500mg，KCl 420mg，NaH2PO4·H2O 95mg，Na2HPO4 130mg，HEPES 2500mg，NaHCO3 380mg，EGTA 220mg，Glucose 850mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8500mg，KCl 420mg，NaH2PO4·H2O 95mg，Na2HPO4 130mg，HEPES 2500mg，NaHCO3 380mg，CaCl2·2H2O 600mg，其余为H2O。
实施例6
本实施例除了缓冲液I和缓冲液II各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000mg，KCl 350mg，NaH2PO4·H2O 80mg，Na2HPO4 100mg，HEPES 2200mg，NaHCO3 300mg，EGTA 150mg，Glucose 800mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 7000mg，KCl 350mg，NaH2PO4·H2O 80mg，Na2HPO4 100mg，HEPES 2200mg，NaHCO3 300mg，CaCl2·2H2O 500mg，其余为H2O；
实施例7
本实施例除了缓冲液I和缓冲液II各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 9000mg，KCl 450mg，NaH2PO4·H2O 100mg，Na2HPO4 140mg，HEPES 2600mg，NaHCO3 400mg，EGTA 250mg，Glucose 1000mg，其余为H2O；所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 9000mg，KCl 450mg，NaH2PO4·H2O 100mg，Na2HPO4 140mg，HEPES 2600mg，NaHCO3 400mg，CaCl2·2H2O 620mg，其余为H2O；
实施例8
本实施例与实施例1除了实验试剂的配置不同外，其他同实施例1。
灌注液I：取25ml缓冲液I备用；
灌注液II：取50ml缓冲液II加入30mg复合酶备用；
清洗液：取50ml缓冲液II备用；另取50ml缓冲液II预冷备用。
实施例9
本实施例与实施例1除了实验试剂的配置不同外，其他同实施例1。
灌注液I：取100ml缓冲液I备用；
灌注液II：取200ml缓冲液II加入120mg复合酶备用；
清洗液：取50ml缓冲液II备用；另取50ml缓冲液II预冷备用。
实验结果：
项目 细胞得率（%） 细胞存活率（%） 细胞纯度（%）
试验组1 92.80% 95.60% 96.70%
试验组2 85.30% 92.10% 90.10%
试验组3 81.30% 84.20% 84.50%
试验组4 89.70% 88.90% 91.50%
试验组5 81.60% 91.20% 86.50%
试验组6 91.20% 84.30% 81.50%
试验组7 84.30% 83.60% 80.90%
试验组8 83.60% 90.10% 82.50%
试验组9 81.40% 89.30% 81.70%
由以上检测数据可以看出，采用本发明的肝原代细胞分离制备方法制得的肝原代细胞普遍具有较高的细胞得率、细胞存活率和细胞纯度，其中，采用实施例1制得的肝原代细胞的细胞得率、细胞存活率、细胞纯度均达到90%以上，尤其是其细胞存活率和细胞纯度均达到95%以上，具有明显的优越性。

Claims (1)

1.一种肝原代细胞分离制备方法，其特征在于，采用复合酶对哺乳动物肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞，包括如下步骤：
S1.灌注：取哺乳动物动物肝脏，先后用清洗液、灌注液I、灌注液II进行灌注；
S2.剥离：将步骤S1处理后的肝脏在清洗液中剪碎溶解，得到肝细胞悬液；
S3.过滤：将步骤S2得到的肝细胞悬液过滤得滤液，加入预冷的清洗液，在4℃温度下离心取沉淀，即得肝原代细胞；
其中，所述清洗液为缓冲液II，所述灌注液I为缓冲液I，所述灌注液II为缓冲液II和复合酶；
所述缓冲液I每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000 mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380 mg，NaHCO3 350 mg，EGTA 190 mg，Glucose 900mg，其余为H2O；
所述缓冲液II每升包括下述重量份的各组分：NaCl 8000 mg，KCl 400 mg，NaH2PO4·H2O 88.17 mg，Na2HPO4 120.45 mg，HEPES 2380 mg，NaHCO3 350 mg，CaCl2·2H2O 560 mg，其余为H2O；
所述复合酶为下述重量份的各组分：胶原酶A 25份、胶原酶D 25份、胶原酶H 10份。
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