CN103131666A - 鹅原代肝细胞的分离培养方法 - Google Patents

鹅原代肝细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鹅原代肝细胞的分离培养方法，涉及生物技术领域。操作步骤：鹅肝脏洗干净；肝灌流；用酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；肝脏剪碎；将剪碎的肝组织和胶原酶液水浴继续消化；加入胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；过滤，获得肝细胞悬液；离心肝细胞悬液，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；往肝细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释，接种到细胞培养皿中，培养，使之贴壁；肝细胞培养后，用PBS清洗，获得活的原代肝细胞；加入胎牛血清的DMEM培养基培养。本发明解决了目前尚未有完善的鹅原代肝细胞分离培养方法的问题。

Description

鹅原代肝细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及鹅原代肝细胞的分离培养方法。
背景技术
肝细胞是肝的唯一实质细胞，是肝内数量最多、体积密度最大的细胞群。原代培养的肝细胞不受体内神经内分泌系统的复杂影响，且能保持许多肝脏特异性功能，并维持对一些激素的反应性，能较好反映体内代谢情况，因此，原代培养的肝细胞是研究动物物质代谢及其调节机制的理想模型。鹅具有生产肥肝的优良性能，目前研究鹅肥肝生成机制是一个热点。分离鹅肝细胞，并进行原代培养，观察其细胞形态及其活性，为研究鹅肥肝生成的调控机制打下了良好基础。
肝细胞的分离始于20世纪60年代中期。早期主要用机械法，但该法对肝细胞损伤大，细胞存活率低。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，目前广泛应用的是胶原酶消化法。
目前，人和小鼠等的肝细胞原代培养模型都有报道，不同动物的分离方法存在差异。鹅原代肝细胞分离培养尚未有研究报道。
发明内容
本发明提供一种鹅原代肝细胞的分离培养方法，本发明解决了目前尚未有完善的鹅原代肝细胞分离培养方法的问题。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：鹅原代肝细胞的分离培养方法，其操作步骤是：
(1)将禁食11～13h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠，注射量是28～31mg/kg体重和肝素钠95～105IU/kg体重，待其麻醉，仰卧位固定，腹部被皮消毒；
(2)沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用38～40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；
(3)洗净的肝用38～40℃前灌流液灌流直至肝变为淡黄色；
(4)再换成38～40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；
(5)然后再用温度为38～40℃的0.04～0.06％酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；
(6)把肝脏放入一玻璃培养皿中，撕开被膜，将肝脏剪碎；
(7)将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，38～40℃水浴继续消化5～10min左右；
(8)加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；
(9)然后用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得肝细胞悬液；
(10)以900～1000r/min，38～40℃离心肝细胞悬液1.8～2.2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；
重复步骤(10)三次，直至肝细胞悬液清亮；
(11)然后往肝细胞悬液中加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；
(12)用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3～5×105个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养，使之贴壁；
(13)肝细胞培养2.8～3.2h后，用PBS清洗2～4次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片，获得活的原代肝细胞；
(14)然后，加入9～12％胎牛血清的DMEM培养基，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养。
上述步骤中所述的前灌流液制作步骤是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.151gNa2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.19g EDTA，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的清洗液是：在500ml去离子水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35gNaHCO3，0.14g CaCl2，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的酶灌流液是：在50ml超纯水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.56g CaCl2，2.142g HEPES，30mg胶原酶，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。
上述步骤中所述的PBS溶液是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na2HPO42H2O，0.2g KH2PO4，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的DMEM培养基是：在750ml去离子水中依次加入10g DMEM，3.7g NaHCO3，2.38g HEPES，10ml谷氨酰胺，10ml双抗，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明是针对鹅原代肝细胞分离培养而设计的方法。该分离培养方法具有以下优点：
(1)以普通的一次性输血器，通过旋扭控制输注速度，其调节方便，流量均匀。
(2)改原位灌注为半原位灌注，即在原位灌注含EDTA的Hanks液，肝脏离体后灌注IV型胶原酶液，采用本法时胶原酶的用量仅为Seglen法的1/4，而Seglen法在原位灌注，将消耗大量的胶原酶。
(3)流程短、操作简便及不需要特殊设备。
(4)鹅原代肝细胞形态完整、体外代谢活性高。
(5)杂质少，有效去除成纤维细胞、红细胞等细胞污染以及细胞碎片对肝细胞培养的影响。
附图说明
图1是本发明原代鹅肝细胞的显微照片(10×20)；
图中是鹅肝细胞刚分离出来及培养3h、24h、48h、72h、96h的显微照片。
图2是本发明鹅肝细胞活性曲线图。
具体实施方式
下面用最佳的实施例对本发明做详细的说明。
实施例一
鹅原代肝细胞的分离培养方法，其操作步骤是：
(1)将禁食12h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠，注射量是30mg/kg体重和肝素钠100IU/kg体重，待其麻醉，仰卧位固定，腹部被皮消毒；
(2)沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；
(3)洗净的肝用40℃前灌流液灌流直至肝变为淡黄色；
(4)再换成40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；
(5)然后再用温度为40℃的0.05％酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；
(6)把肝脏放入一玻璃培养皿中，撕开被膜，将肝脏剪碎；
(7)将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，40℃水浴继续消化5～10min左右；
(8)加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；DMEM加入量是步骤(7)中所得物质的0.5-1倍；
(9)然后用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得肝细胞悬液；
(10)以950r/min，40℃离心肝细胞悬液2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，PBS加入量是沉淀物的1-3倍；再次制成肝细胞悬液；重复步骤(10)三次，直至肝细胞悬液清亮；
(11)然后往肝细胞悬液中加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；DMEM加入量是肝细胞悬液的2～5倍；
(12)用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3～5×105个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于5％CO2、40℃培养箱中培养，使之贴壁；
(13)肝细胞培养3h后，用PBS清洗3次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片，获得活的原代肝细胞；
(14)然后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，于5％CO2、40℃培养箱中培养。DMEM加入量是原代肝细胞的2-10倍。
上述步骤中所述的前灌流液制作步骤是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.151gNa2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.19g EDTA，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的清洗液是：在500ml去离子水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35gNaHCO3，0.14g CaCl2，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的酶灌流液是：在50ml超纯水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.56g CaCl2，2.142g HEPES，30mg胶原酶，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。
上述步骤中所述的PBS溶液是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na2HPO42H2O，0.2g KH2PO4，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
上述步骤中所述的DMEM培养基是：在750ml去离子水中依次加入10g DMEM，3.7g NaHCO3，2.38g HEPES，10ml谷氨酰胺，10ml双抗，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，用0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例二
1、实验方法
鹅原代肝细胞的分离培养
(1)消毒麻醉：将禁食12h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg体重)和肝素钠(100IU/kg体重)，待其麻醉(15-30min)，仰卧位固定，腹部被皮消毒；
(2)取肝：沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；
(3)灌洗：洗净的肝用40℃前灌流液以30ml/min左右的速度快速灌注，直至肝变为淡黄色；再换成40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；
(4)消化：将肝脏转移到另一无菌平皿内，换用酶灌流液(40℃预热)反复灌流消化10～30min，灌流速度为20ml/min，至肝变软，出现明显的龟背状裂隙；
(5)收集细胞：停止灌注，撕开被膜，将肝脏剪碎，剔除大块纤维结缔组织，将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，40℃水浴继续消化5-10min左右；加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；
(6)过滤：用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得粗制肝细胞悬液；
(7)洗涤：以950r/min，离心肝细胞悬液2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；重复步骤(7)3次，直至肝细胞悬液清亮；
(8)细胞计数：往肝细胞悬液中加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；取200μl肝细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液1∶1混匀，在显微镜下计数，以血细胞计数板计算肝细胞的产率和活率；
(9)细胞培养：用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3*105个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于40℃、5％CO2和饱和湿度CO2培养箱中培养；肝细胞培养3h后，用PBS清洗3次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片；以后每隔24小时更换更换10％胎牛血清的DMEM培养基。
细胞的形态观察
在细胞接种后，每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态，并照相。每个时间段用显微镜详细观察、记录细胞形态及生长情况。
MTT比色法检测细胞活性
将细胞悬液按2×105个/孔接种干96孔培养板中(0d)，每孔容积200μL，培养板移入CO2培养箱中，40℃5％CO2及饱和湿度下培养，自第1d起，每隔2d，在同一时间取8孔，在每孔中加20μL MTT溶液，40℃继续培养4h后终止培养，吸去孔内溶液，每孔再加150μLDMSO，震荡10min，选择波长490nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录记录并绘制细胞活性曲线。
2、实验结果
原代培养的鹅肝细胞的形态学观察
在相差倒置显微镜下对鹅肝细胞进行观察发现，刚分离出来的肝细胞比较小，且细胞多呈单个游离态，活细胞形状规则，呈圆形，胞质明亮，细胞膜清晰(见图1-A)。培养3h后贴壁率达到70％～80％(见图1-B)，贴壁细胞大部分为短梭形或不规则的三角形，未贴壁细胞为球形。培养48～72h后，贴壁细胞形态发生明显改变，肝细胞呈典型的不规则多角形。此时贴壁的细胞变平伸展，体积变大，并互相连接。当细胞密度进一步增大时，甚至出现重叠生长，发生密度抑制，细胞大量汇合后生长停止，细胞表面开始出现颗粒状物质和空泡，细胞逐渐死亡并脱落。
MTT比色法检测细胞活率
用酶联检测仪在490nm波长处检测其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由图2可知，在第1～2d细胞活性变化较为缓慢，并在2～3d出现了一定的下降趋势，而第3～5d细胞活性变化速度较快，之后细胞活性再次降低。该曲线反映了鹅原代肝细胞连续培养七天的活性变化，与理论“S”型细胞生长曲线基本符合。
总之，由细胞形态和细胞活性都表明我们成功分离培养了鹅的原代肝细胞。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (6)

1.鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，其操作步骤是：
(1)将禁食11～13h的鹅腹腔注射戊巴比妥钠，注射量是28～31mg/kg体重和肝素钠95～105IU/kg体重，待其麻醉，仰卧位固定，腹部被皮消毒；
(2)沿鹅腹部正中线切开腹腔，快速取出完整的肝脏，用38～40℃生理盐水把肝脏表面洗干净；
(3)洗净的肝用38～40℃前灌流液灌流直至肝变为淡黄色；
(4)再换成38～40℃清洗液冲洗出肝中前灌流液；
(5)然后再用温度为38～40℃的0.04～0.06％酶灌流液反复灌流，直至肝被膜下组织呈龟背状裂隙；
(6)把肝脏放入一玻璃培养皿中，撕开被膜，将肝脏剪碎；
(7)将剪碎的肝组织和胶原酶液一起倒入一无菌锥形瓶中，38～40℃水浴继续消化5～10min左右；
(8)加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基终止其消化；
(9)然后用200目无菌纱网进行过滤，除去大的细胞团，获得肝细胞悬液；
(10)以900～1000r/min，38～40℃离心肝细胞悬液1.8～2.2min，弃上清，在沉淀中加入PBS，再次制成肝细胞悬液；
重复步骤(10)三次，直至肝细胞悬液清亮；
(11)然后往肝细胞悬液中加入含9～12％胎牛血清的DMEM培养基，并把细胞吹打均匀；
(12)用血细胞计数板对细胞进行计数后，用DMEM培养液稀释到3～5×105个cell/ml的密度，接种到细胞培养皿中，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养，使之贴壁；
(13)肝细胞培养2.8～3.2h后，用PBS清洗2～4次，以去掉未贴壁的血细胞和细胞碎片，获得活的原代肝细胞；
(14)然后，加入9～12％胎牛血清的DMEM培养基，于4～6％CO2、38～40℃培养箱中培养。
2.如权利要求1所述鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的前灌流液制作步骤是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.151gNa2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.19g EDTA，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
3.如权利要求1所述鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的清洗液是：在500ml去离子水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.14g CaCl2，2.38g HEPES，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
4.如权利要求1所述鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的酶灌流液是：在50ml超纯水中依次加入8gNaCl，0.078g NaH2PO42H2O，0.4g KCl，0.051g Na2HPO42H2O，0.35g NaHCO3，0.56g CaCl2，2.142g HEPES，30mg胶原酶，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至100ml，用0.22μm滤膜过滤除菌。
5.如权利要求1所述鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的PBS溶液是：在500ml去离子水中依次加入8g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na2HPO42H2O，0.2g KH2PO4，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，高温高压灭菌30min。
6.如权利要求1所述鹅原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的DMEM培养基是：在750ml去离子水中依次加入10g DMEM，3.7g NaHCO3，2.38g HEPES，10ml谷氨酰胺，10ml双抗，溶解后用1M NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，用0.22μm滤膜过滤除菌。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103881968A (zh) * 2014-04-11 2014-06-25 四川农业大学 一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法
CN105918308A (zh) * 2016-04-28 2016-09-07 上海市胸科医院 一种用于移植供肺灌流的肺灌流液及其制备方法
CN106834210A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 广州柏赛柯生物技术有限公司 一种肝原代细胞分离制备方法
CN106978388A (zh) * 2017-04-10 2017-07-25 安徽农业大学 一种犬肝细胞的分离与培养方法
CN109161518A (zh) * 2018-10-10 2019-01-08 郑州大学第附属医院 一种分离培养肝脏原代细胞的方法
CN113957035A (zh) * 2021-08-02 2022-01-21 中国农业科学院饲料研究所 鸭胚原代肝细胞分离培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩春春: "不同因素诱导鹅肝细胞脂肪变性的机理研究", 《中国博士学位论文全文数据库，农业科技辑》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103881968A (zh) * 2014-04-11 2014-06-25 四川农业大学 一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法
CN103881968B (zh) * 2014-04-11 2017-03-15 四川农业大学 一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法
CN105918308A (zh) * 2016-04-28 2016-09-07 上海市胸科医院 一种用于移植供肺灌流的肺灌流液及其制备方法
CN106834210A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 广州柏赛柯生物技术有限公司 一种肝原代细胞分离制备方法
CN106834210B (zh) * 2017-02-21 2021-01-26 广州柏赛柯生物技术有限公司 一种肝原代细胞分离制备方法
CN106978388A (zh) * 2017-04-10 2017-07-25 安徽农业大学 一种犬肝细胞的分离与培养方法
CN109161518A (zh) * 2018-10-10 2019-01-08 郑州大学第附属医院 一种分离培养肝脏原代细胞的方法
CN113957035A (zh) * 2021-08-02 2022-01-21 中国农业科学院饲料研究所 鸭胚原代肝细胞分离培养方法
CN113957035B (zh) * 2021-08-02 2023-08-04 中国农业科学院饲料研究所 鸭胚原代肝细胞分离培养方法

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