CN102228719B - 一种组织工程化淋巴结模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于组织工程与再生医学技术领域的一种组织工程化淋巴结模型及其构建方法。这种组织工程化淋巴结模型包含淋巴组织中分离获得淋巴细胞以及胶原-Matrigel支架。本发明组织工程化淋巴结模型构建方法：首先制备淋巴细胞悬液和原代小鼠成纤维细胞细胞悬液，然后将混合细胞悬液与胶原-Matrigel支架材料复合后在施加静态拉伸的模具中培养，获得组织工程化淋巴结模型。本发明支架体系在施加静态拉伸后能够更好地模拟体内环境，支持淋巴细胞的生长、增殖、细胞因子的分泌以及表面标志的表达，对未来应用组织工程化淋巴结模型进行生物材料免疫毒性评价及免疫药物筛选等具有重要意义。本发明的构建方法操作工艺简单、实施条件温和。
Description
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种组织工程化淋巴结模型及其构建方法。
背景技术
淋巴系统对人体的重要性日趋显现，淋巴组织生物学研究发展的需要推动了构建适合模型的研究。组织工程淋巴器官(淋巴结、脾脏、淋巴管和淋巴细胞)不仅可以作为体外研究模型，还具有移植治疗疾病或损伤引起的淋巴缺陷的潜在应用价值。Chistoph Giese等(Chistoph Giese等，Artifical Organs，2006，30，803)在体外通过生物反应器培养外周血单核细胞来源的树状突细胞取得成功，Sachiko Suematsu等(Sachiko Suematsu等，Nuture Biotechnology，2004，22，1539)将接种了胸腺基质细胞(TEL-2-LTα)的“海绵样”胶原支架移植到小鼠体内，能够产生“淋巴组织样类器官”，其结构类似于次级淋巴器官并能够在宿主中产生抗体。然而，目前为止，未见基于胶原-Mstrigel支架材料构建的组织工程化淋巴结模型的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程化淋巴结模型，该模型包含添加了淋巴细胞刺激物的淋巴组织分离的淋巴细胞以及胶原-Matirgel支架材料。
本发明的目的还在于提供一种组织工程化淋巴结模型的构建方法。
一种组织工程化淋巴结模型，该模型包含淋巴组织中分离获得的淋巴细胞以及胶原-Matrigel支架。
所述淋巴细胞来源于胸腺组织、脾脏组织或外周血；所述胶原为I型鼠尾胶原；所述胶原-Matirgel支架中胶原与Matirgel的质量比为(0.1-9)∶1。
一种组织工程化淋巴结模型的构建方法，按照如下操作步骤进行：
(1)制备淋巴细胞悬液
用2×RMPI 1640培养液重悬淋巴细胞制备细胞密度为5×104～5×107/mL的淋巴细胞悬液；
(2)制备原代小鼠成纤维细胞悬液
用2×H-DMEM培养液重悬小鼠成纤维细胞制备细胞密度为5×104～5×107/mL的MEF细胞悬液；
(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养
将步骤(1)制得的细胞悬液和步骤(2)制得的细胞悬液按细胞数量比为(5-1)∶1混合，然后在细胞混合悬液中加入浓度为0.5-4.0mg/mL的胶原与Matrigel，其中胶原与Matrigel的质量比为(0.1-9)∶1，混匀后，用0.1M的NaOH溶液调节其pH值至7.2-7.4；
(4)静态拉伸模具制备
将细胞培养板的每孔注入1ml的质量浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30min；
(5)将步骤(3)获得的细胞-支架复合物加至步骤(4)制得的静态拉伸模具中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清和淋巴细胞刺激物的RMPI 1640培养基，培养3-14天，即得到组织工程化淋巴结模型。
4、根据权利要求3所述一种组织工程化淋巴结模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)所用淋巴细胞刺激物为刀豆蛋白A，其浓度为10-40μg/ml，或者植物凝激素A，其浓度为10-40μg/ml。
本发明的有益效果：本发明采用I型鼠尾胶原和Matrigel基质胶作为组织工程化淋巴结模型的支架，该支架体系在施加静态拉伸力后能够更好地模拟体内环境，支持淋巴细胞的生长、增殖、细胞因子的分泌以及表面标志的表达，对未来应用组织工程淋巴结模型进行生物材料免疫毒性评价及免疫药物筛选等具有重要意义。本发明的构建方法操作工艺简单、实施条件温和。
附图说明
图1为培养3d后的组织工程淋巴结模型宏观观察图。
图2为培养7d后的组织工程淋巴结模型宏观观察图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。以下实施例中未详细说明的部分请参阅RobertLanza，Robert Langer and Joseph Vacanti编写的《Principles of TissueEngineering》第三版和Anthony Atala，Robert P.Lanza编写的《Methods of tissueengineering》(2006)。
以下实施例组织工程化淋巴结模型构建方法中使用的细胞分离、培养及组织鉴定所需试剂：
(1)RMPI 1640细胞培养基：RMPI 1640干粉培养基一袋，2.2g NaHCO3，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)和淋巴细胞刺激物，用于淋巴细胞、淋巴结模型的培养。
(2)H-DMEM细胞培养基：H-DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO3，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)，用于原代小鼠成纤维细胞(MEF)的培养。
(3)浓缩培养基(2×RMPI 1640)：RMPI 1640干粉培养基一袋，2.2gNaHCO3，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于500ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
(4)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
实施例1以人外周血单核细胞为种子细胞构建组织工程化淋巴结模型
(1)采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞
取肝素抗凝血用Hanks液稀释一倍，将其轻铺在Ficoll分离液(比重为1.077g/mL)上，然后2000rpm，水平离心30min。单个核细胞悬于分离液上层，呈白色膜状。用吸管小心吸取单个核细胞层，加入Hanks液后洗涤3遍。加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，常规培养。
(2)原代小鼠成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取已死亡孕小鼠的胚胎组织，转移到培养瓶中，加PBS清洗。倒掉PBS，加入适量胰酶溶液消化，反复吹打振荡后，静置片刻，将上清转入血清中终止消化。重复上述步骤，直至组织块消化完全。收集所有消化上清，200目细胞筛网过滤后，移入离心管中1000rpm离心5min。收集细胞。
(3)用2×RPMI 1640重悬人外周血单核细胞，细胞密度为1×106/mL；用2×RPMI 1640重悬原代小鼠成纤维细胞(MEF)，细胞密度为5×105/mL。
(4)I型液态鼠尾胶原的制备
取已死亡大鼠的尾根部，置于75％的酒精中浸泡30min；无菌条件下取出尾腱；剪碎，浸入0.1％的醋酸中；置于4℃冰箱；并用磁力搅拌机间断进行搅拌。48h后，4℃离心，收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液浓度为2.0mg/ml。
(5)静态拉伸模具的制备
将12孔细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30min，获得静态拉伸模具。
(6)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养
将步骤(1)制得的细胞悬液和步骤(2)制得的细胞悬液按细胞数量为2∶1混合。然后在细胞混合悬液中加入浓度为2.0mg/mL的胶原与Matrigel，其中胶原-Matrigel的比例为2∶1，混匀后，用0.1M的NaOH溶液调节其pH值至7.2-7.4。
(7)然后将步骤(5)获得的细胞-支架复合物加至由细胞培养板制得的静态拉伸模具中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清和淋巴细胞刺激物的RMPI 1640培养基，培养3天(如图1a所示)，即得到组织工程化淋巴结模型。
实施例2以小鼠骨髓单核细胞为种子细胞构建组织工程化淋巴结模型
(1)采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓单核细胞
取已死亡小鼠股骨，将股骨放入无菌的冷PBS中；用1mL注射器冲出小鼠股骨中的细胞，直到股骨腔呈白色；充分混匀细胞，使用200目的滤网过滤，收集过滤液于10mL离心管中，1500rpm。离心5min；弃上清，加入8mLNH4Cl-Tris溶液，将细胞悬起，溶解红细胞约6min，1500rpm，离心5min。弃上清，在离心管中加入5mL无菌冷PBS，重悬细胞；将上述细胞悬液轻轻加到5mL Ficoll-paqul(1.086g/mL)，1500rpm，离心30min；小心取出离心管，溶液分为三层：从上往下依次是透明的PBS层、单核细胞层、RBS层；用口径较大的细吸管吸出单个核细胞到50mL的离心管中，加入30mLPBS混匀清洗细胞，1500rpm，离心5min。10mLPBS，1500rpm，离心5min再洗涤1次；重悬细胞，接种于含有10％FBS的RMPI1640培养液中，常规培养。
(2)原代小鼠成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取已死亡孕小鼠的胚胎组织，剪成1mm3左右的组织块，然后转移到培养瓶中，再加PBS清洗。倒掉PBS，加入适量胰酶溶液消化，反复吹打振荡后，静置片刻，将上清转入血清中终止消化。重复上述步骤，直至组织块消化完全。收集所有消化上清，200目细胞筛网过滤后，移入离心管中1000rpm离心5min。收集细胞。
(3)用2×RPMI 1640重悬小鼠骨髓单核细胞，细胞密度为5×106/mL；用2×RPMI 1640重悬原代小鼠成纤维细胞(MEF)，细胞密度为5×106/mL。
(4)I型液态鼠尾胶原的制备
取已死亡大鼠的尾根部，置于75％的酒精中浸泡30min；无菌条件下取出尾腱；剪碎，浸入0.1％的醋酸中；置于4℃冰箱；并用磁力搅拌机间断进行搅拌。48h后，4℃离心，收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液浓度为3.5mg/ml。
(5)静态拉伸模具的制备
将12孔细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30min，获得静态拉伸模具。
(6)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养
将步骤(1)制得的细胞悬液和步骤(2)制得的细胞悬液按细胞数量为1∶1混合。然后在细胞混合悬液中加入浓度为3.5mg/mL的胶原与Matrigel，其中胶原-Matrigel的比例为1∶2，混匀后，用0.1M的NaOH溶液调节其pH值至7.2-7.4。
(7)然后将步骤(5)获得的细胞-支架复合物加至由细胞培养板制得的静态拉伸模具中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清和淋巴细胞刺激物的RMPI 1640培养基，培养10天，即得到组织工程化淋巴结模型。
实施例3以小鼠脾淋巴细胞为种子细胞构建组织工程化淋巴结模型
(1)采用密度梯度离心法分离小鼠脾淋巴细胞
取已死亡小鼠的脾脏组织，置于盛有无菌的冷PBS中，然后将脾脏剪碎，使用200目的滤网过滤，收集过滤液于10mL离心管中，1500rpm。离心5min；弃上清，加入8mLNH4Cl-Tris溶液，将细胞悬起，溶解红细胞约8min，1500rpm，离心5min。弃上清，在离心管中加入5mL无菌冷PBS，重悬细胞；将上述细胞悬液轻轻加到5mL Ficoll(1.086g/mL)，2000rpm，离心15min；小心取出离心管，溶液分为三层：从上往下依次是透明的PBS层、单核细胞层、RBS层；用口径较大的细吸管吸出淋巴细胞到10mL的离心管中，加入5mLPBS混匀清洗细胞2次，1500rpm，离心5min。重悬细胞，接种于含有10％FBS的RMPI1640培养液中，常规培养。
(2)原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取已死亡孕小鼠的胚胎组织，剪成1mm3左右的组织块，然后转移到培养瓶中，再加PBS清洗。倒掉PBS，加入适量胰酶溶液消化，反复吹打振荡后，静置片刻，将上清转入血清中终止消化。重复上述步骤，直至组织块消化完全。收集所有消化上清，200目细胞筛网过滤后，移入离心管中1000rpm离心5min。收集细胞。
(3)用2×RPMI 1640重悬小鼠骨髓单核细胞，细胞密度为5×106/mL；用2×RPMI 1640重悬原代小鼠成纤维细胞(MEF)，细胞密度为1×106/mL。
(4)I型液态鼠尾胶原的制备
取已死亡大鼠的尾根部，置于75％的酒精中浸泡30min；无菌条件下取出尾腱；剪碎，浸入0.1％的醋酸中；置于4℃冰箱；并用磁力搅拌机间断进行搅拌。48h后，4℃离心，收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液浓度为3.0mg/ml。
(5)静态拉伸模具的制备
将12孔细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30min，获得静态拉伸模具。
(6)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养
将步骤(1)制得的细胞悬液和步骤(2)制得的细胞悬液按细胞数量为5∶1混合。然后在细胞混合悬液中加入浓度为3.0mg/mL的胶原与Matrigel，其中胶原-Matrigel的比例为4∶1，混匀后，用0.1M的NaOH溶液调节其pH值至7.2-7.4。
(7)然后将步骤(5)获得的细胞-支架复合物加至由细胞培养板制得的静态拉伸模具中，置于5％CO2、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清和淋巴细胞刺激物的RMPI 1640培养基，培养7天(如图1b所示)，即得到组织工程化淋巴结模型。
Claims (3)
1.一种组织工程化淋巴结模型，其特征在于，该模型包含淋巴组织中分离获得的淋巴细胞以及胶原-Matrigel支架；所述淋巴细胞来源于胸腺组织、脾脏组织或外周血；所述胶原为Ⅰ型鼠尾胶原；所述胶原-Matrigel支架中胶原与Matrigel的质量比为（0.1-9）：1。
2.一种组织工程化淋巴结模型的构建方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
（1）制备淋巴细胞悬液
用2×RMPI 1640培养液重悬淋巴细胞制备细胞密度为5×104 ~5×107/mL的淋巴细胞悬液；
（2）制备原代小鼠成纤维细胞悬液
用2×H-DMEM培养液重悬小鼠成纤维细胞制备细胞密度为5×104 ~5×107/mL的MEF细胞悬液；
（3）细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养
将步骤（1）制得的细胞悬液和步骤（2）制得的细胞悬液按细胞数量比为（5-1）：1混合，然后在细胞混合悬液中加入浓度为0.5-4.0mg/mL的胶原与Matrigel，其中胶原与Matrigel的质量比为（0.1-9）：1，混匀后，用0.1M的NaOH溶液调节其pH值至7.2-7.4；
（4）静态拉伸模具制备
将细胞培养板的每孔注入1mL的质量浓度为2%的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30 min；
（5）将步骤（3）获得的细胞-支架复合物加至步骤（4）制得的静态拉伸模具中，置于5%CO2、37℃的培养箱中培养30 min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10%胎牛血清和淋巴细胞刺激物的RMPI 1640培养基，培养3-14天，即得到组织工程化淋巴结模型。
3.根据权利要求2所述一种组织工程化淋巴结模型的构建方法，其特征在于，步骤（5）所用淋巴细胞刺激物为刀豆蛋白A，其浓度为10-40μg/mL。
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