CN101701208B - 一种组织工程化肺脏组织及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于组织工程与再生医学领域的一种组织工程化肺脏组织及其构建方法。该组织工程化肺脏组织通过如下构建方法获得，(1)制备肺细胞悬液；(2)制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊；(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养。本发明采用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊，联合液态I型胶原和Matrigel基质胶作为组织工程化肺脏的支架，该支架体系能够有效地促使肺泡样结构的形成，实现气体以及营养物质的交换，对未来临床应用组织工程化肺脏组织治疗肺部疾患具有重要意义。本发明的构建方法操作工艺简单、实施条件温和。

Description

一种组织工程化肺脏组织及其构建方法

技术领域

本发明属于组织工程与再生医学领域，特别涉及一种组织工程化肺脏组织及其构建方法。

背景技术

组织工程学是20世纪80年代末发展起来的一门新兴交叉学科，近年来，随着生命科学、材料科学和工程科学的发展，科研人员相继在骨骼、软骨、皮肤、乳腺以及神经等多种组织、器官体外再造研究方面取得突破性进展，其中，些组织工程产品如软骨、皮肤已实现商品化。由于肺脏本身具有复杂的组织结构，再加上组织工程化肺脏的研究起步较晚，目前在体外构建的组织工程化肺脏组织还远不能实现商品化，但是在体外构建组织工程化肺脏组织是研究多种细胞因子、生长因子与肺脏组织关系的基础，也是动物模型建立、肺脏疾病机理研究或治疗肺脏疾病药物筛选等方面的基础。Mondrinos.M.J等(Mondrinos，M.J.等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293，L639)应用体外构建的肺脏组织研究成纤维细胞生长因子FGF10、FGF7和FGF2的作用机制，AndradeCF等(Andrade CF等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007，292：L510-L518)应用体外构建的三维组织进行体内移植。总之，构建的组织工程化肺脏组织有利于寻找肺脏疾病方面新的诊断技术和治疗药物。

组织工程需要使用种子细胞来生成并维持组织特异性生物功能，同时使用合成的或天然的基质材料支持和引导组织发育。肺脏的组织学结构较为复杂，若实现工程化组织模拟正常组织有较大的困难，其中支架材料的选择尤为重要。

多种材料单独作为支架进行肺脏的研究已有报道。Patty Chen(Chen P等，Tissue engineering，2005，11：9-10)、Mondrinos，M.J(Mondrinos，M.J.等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293，L639)、Faraj KA(Faraj KA等，Tissue Eng.2007，13(10)：2387-94)、Tomei AA(Tomei AA等，BiotechnolBioeng，2009，103(1)：217-25)等人先后将胶原应用到肺脏组织工程研究中。Blau，H(Blau，H等，Cell Physiol，1988，136，203)、Mondrinos.M J(Mondrinos.M J等，Ti ssue Eng.，2006，12，717；Tissue Eng Part A，2008，14(3)：361-8)还将Matrigel基质胶也引入到肺脏组织的工程化构建中。在其它材料方面，Mondrinos.M.J(Mondrinos.MJ等，Tissue Eng.，2006，12，717)也采用PLLA和PLGA作为支架材料体外构建三维肺脏组织，也有研究者(Douglas，W.H.等，In Vitro，1976 12，373；Am.Rev.Respir.Dis.，1976，113，17；TCA Manual，1978，4，749；In Vitro，1980，16，306)采用胶原海绵球(Gelfoam)进行研究。

尽管作为肺脏组织工程的支架材料已有许多报道，但是这些材料都不能满足肺脏组织的囊性结构，对肺泡样结构的形成不能在一定程度上进行控制。

微囊技术(Encapsulation)是指用半透膜包被生物活性物质以形成微囊的技术，形成的微囊可以阻遏免疫细胞以及大分子抗体通过半透膜，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入。微囊的物理参数如大小、膜通透性、机械强度等是可控的。微囊目前主要用于微囊化细胞技术，主要应用在如糖尿病治疗，嗜铬细胞的镇痛的治疗方面；微囊化细胞技术是目前细胞治疗、组织和器官替代治疗的主要方法之一。然而，将微囊应用于肺脏组织工程，尤其是将海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊/海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸钠(BPA)微囊作为组织工程化肺脏的支架尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织工程化肺脏组织的构建方法。

本发明的目的还在于提供一种利用上述方法获得的组织工程化肺脏组织，该方法构建的组织工程化肺脏组织具有肺泡样结构，肺泡样结构由APA或BPA微囊提供。

一种组织工程化肺脏组织的构建方法，按照如下操作步骤进行：

(1)制备肺细胞悬液

从肺脏组织中分离或诱导胚胎干细胞获得肺脏细胞，然后用2×H-DMEM培养液重悬细胞制备细胞密度为5×10⁵～5×10⁶/mL的肺细胞悬液；

(2)微囊的制备

将1.5-2.0％海藻酸钠溶液，在4-9kV/cm的电场作用下，通过静电微囊制作仪以5-35mL/h的速度推入到1.1-1.5％的氯化钙/2％的氯化钡溶液中，反应8-12min，形成海藻酸钙/钡胶珠，然后依次用0.55％氯化钙液、0.28％氯化钙液、生理盐水、0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸(CHES)和1.1-1.5％的氯化钙/2％氯化钡溶液冲洗；冲洗后加入0.05％多聚赖氨酸(PLL)，反应6min后依次用0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸(CHES)、1.1-1.5％的氯化钙/2％氯化钡溶液和生理盐水冲洗；再加入0.05％的海藻酸钠溶液反应4min后用生理盐水冲洗；再加入1.5％柠檬酸钠溶液反应2min后用生理盐水冲洗3-5遍，得到海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊/海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸钠(BPA)微囊；

(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养

将步骤(1)制得的细胞悬液与步骤(2)制得的微囊混合，再添加浓度为1.5-2.5mg/mL的胶原与Matrigel基质胶，混匀后，调节pH值至7.2-7.4，其中细胞悬液、胶原和Matr igel基质胶的体积比为5∶(4-3)∶(2-1)；然后将获得的细胞-支架复合物加至由细胞培养板制得的静态拉伸模具中，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基，培养3-14天，即得到组织工程化肺脏组织。

步骤(3)所用APA和BPA微囊的直径为100-400μm。

所述肺脏组织来源于小鼠胚胎期肺脏。

所述胚胎干细胞来源于小鼠。

所述胶原为I型鼠尾胶原。

所述细胞培养板制得的静态拉伸模具是将细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30分钟，获得静态拉伸模具。

一种利用上述方法获得的组织工程化肺脏组织。

本发明的有益效果：本发明采用APA或BPA微囊，联合胶原、Matrigel基质胶作为组织工程化肺脏的支架，同现有用于肺脏的支架材料相比，该支架体系能够有效地促使肺泡样结构的形成，能够实现气体以及营养物质的交换，其中，APA或BPA微囊为肺泡样结构的基本材料，液态胶原能够为细胞生长提供三维的生长环境，Matrigel基质胶为体外构建三维的组织工程化肺脏组织提供各种必需的生长因子。本方法操作简单、可实施性强，能够较好地控制肺泡样结构的形成，对推进组织工程化肺脏发展具有重要意义。

附图说明

图1.小鼠胎肺细胞组织学检测和免疫组织化学检测结果图；

a.HE染色，×20；b.免疫组织化学Vimentin，×40；c.免疫组织化学SpC，×40

图2.APA空微囊图×50；

图3.肺脏组织片层宏观观察图；

a.培养10h后肺脏组织生长情况图；b.培养7d后肺脏组织生长情况图

图4.本发明肺脏组织片层组织学检测(HE染色)结果图；×10

图5.本发明肺脏组织片层免疫组织化学检测结果图。

a.Vimentin，×10；b.SpC，×10

具体实施方式

通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。以下实施例中未详细说明的部分请参阅RobertLanza，Robert Langer and Joseph Vacanti编写的《Pr inciples of TissueEngineering》第三版和Anthony Atala，Robert P.Lanza编写的《Methods of tissueengineering》(2006)。

本发明构建方法中使用的细胞分离、培养及组织鉴定所需试剂：

1)H-DMEM细胞培养基：H-DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO₃，2.383gHEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)，用于肺脏细胞、组织工程化肺脏组织及滋养层细胞的培养。

2)浓缩培养基(2×H-DMEM)：H-DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO₃，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于500ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

3)胚胎干诱导培养基：商品化液体培养基(knock-out serum replacement，KSR)1000ml，添加10³U/ml白血病抑制因子，50μM的PD98059。

4)胚胎干细胞生长培养基：H-DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO₃，2.383g HEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，1％非必需氨基酸，10³U/ml白血病抑制因子，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。

使用时添加15％FBS，用于胚胎干细胞及组织工程化肺脏组织的培养。

5)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

6)0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液：称取0.25g胰蛋白酶，0.04gEDTA，充分溶解于100ml PBS中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于-20℃保存。

7)4％多聚甲醛固定液：加热0.1M的PB溶液至沸腾，加入20g多聚甲醛，搅拌溶解，调节pH值为7.2-7.4，过滤除杂质，4℃保存。

制备微囊所需试剂：

1)海藻酸钠溶液：称取1.3g，1.5g，1.8g和2.0g海藻酸钠粉末分别溶于100mL D-Hank’s溶液中，充分搅拌3h后，采用抽滤法分别通过0.45μm和0.22μm的滤膜除菌，即配置成1.3％，1.5％，1.8％和2.0％的海藻酸钠溶液，用于液滴的形成。

2)1.5％CaCl₂溶液和2％BaCl₂溶液：分别称取1.5g的CaCl₂和2g的BaCl₂溶于生理盐水中，待充分溶解后，经0.22μm滤膜除菌，即配置成1.5％CaCl₂和2％BaCl₂溶液，作为微囊形成第一步的固化液，使海藻酸钠液滴形成海藻酸钙和海藻酸钡胶珠。

3)多聚赖氨酸溶液(PLL)：称取0.01g，0.03g，0.05g，0.07g和0.10gPLL溶于100mlD-Hank’s溶液中，待充分溶解后经0.22μm滤膜除菌，即配置成0.01％，0.03％，0.05％，0.07％和0.1％的多聚赖氨酸溶液，用于三层微囊结构的第二层的形成。

4)0.05％的海藻酸钠溶液：称取0.05g海藻酸钠粉末溶于100mLD-Hank’s溶液中，待充分溶解后经0.22μm滤膜除菌，即配置成的海藻酸钠溶液，用于三层微囊结构的第三层的形成。

5)1.5％柠檬酸钠溶液：称取1.47g柠檬酸钠粉末溶于100mL D-Hank’s溶液中，待充分溶解后经0.22μm滤膜除菌，即配置成1.5％的柠檬酸钠溶液，用于微囊制备时核芯的液化。

6)CHES溶液：称取1g CHES溶于1000ml三蒸水中，待充分溶解后经0.22μm滤膜除菌，即配置成0.1％的CHES溶液，作为微囊制备过程中的洗液。

7)0.28％、0.55％CaCl₂溶液：分别称取0.28g和0.55g CaCl₂溶于生理盐水中，待充分溶解后，经0.22μm滤膜过滤除菌，即配置成0.28％和0.55％CaCl₂溶液，作为微囊制备过程中的洗液。

实施例1以小鼠胎肺细胞为种子细胞构建组织工程化肺脏组织

(1)小鼠胎肺细胞的分离、培养和鉴定

胎肺来源于胚胎期为18天的昆明白小鼠的胎鼠。按常规方法分离胎肺，然后在1×PBS中冲洗，剪碎并于室温下，在0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液中消化20-25分钟。然后加入2倍体积的含10％FBS的H-DMEM培养基终止酶活性，接着用吸管吹打研磨。组织匀浆用70μm的尼龙滤网过滤，800rpm离心5分钟。细胞沉淀物用900μl的蒸馏水重悬30-45秒，低渗除去红细胞，然后添加100μl的10×PBS。细胞再次离心沉淀，用一定体积的含10％FBS的H-DMEM培养基重悬，并用血细胞计数器计数；用组织学HE染色表明细胞活性良好，如图1(a)所示，通过免疫组织化学方法鉴定Vimentin和SpC均有阳性表达，见图1(b)和(c)。

用2×H-DMEM重悬再次沉淀后的小鼠胎肺细胞，制得细胞密度为5×10⁶/mL的细胞悬液。

(2)APA/BPA微囊的制备

将2.0％海藻酸钠溶液，在6kV/cm的电场作用下，通过静电微囊制作仪以15ml/h的速度匀速推入1.1％的氯化钙/2％的氯化钡溶液中，反应10min，形成海藻酸钙/钡胶珠。依次用0.55％氯化钙溶液、0.28％氯化钙溶液、生理盐水、0.1％CHES和1.1％的氯化钙溶液冲洗；再加入0.05％PLL反应6min，依次用0.1％CHES、1.1％的氯化钙/2％的氯化钡溶液和生理盐水冲洗；再加入0.05％的海藻酸钠溶液反应4min，生理盐水冲洗；再加入1.5％柠檬酸钠溶液反应2min，生理盐水冲洗3遍，再加入生理盐水，置4℃保存待用。通过上述方法制得的微囊粒径为200-300μm，制得的APA空微囊表面光滑、大小均一，见图2。

(3)I型液态鼠尾胶原的制备

从大鼠尾根部切断鼠尾，置于75％的酒精中浸泡30min；无菌条件下取出尾腱；剪碎，浸入0.1％的醋酸中；置于4℃冰箱；并用磁力搅拌机间断进行搅拌。48h后，4℃离心，收集上清即得胶原溶液。制备的胶原溶液浓度约为2.0mg/ml。

(4)静态拉伸模具的制备

将12孔细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30分钟，获得静态拉伸模具。

(5)细胞与支架材料的复合及其复合物的培养

将0.5ml步骤(1)制得的细胞悬液与步骤(2)制得的0.5ml APA微囊(粒径为200-300μm)混合，再添加0.4ml液态I型鼠尾胶原(2mg/ml)和100μlMatrigel基质胶，混匀，使用0.1mol/LNaOH调pH值为7.2-7，4，得到细胞与支架的复合物；将细胞与支架的复合物加入至上述12孔静态拉伸模具中，每孔注入复合物1.5ml，以上操作在冰盒上进行。构建的组织置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，30min后，待细胞-支架复合物凝固，加入含10％FBS的H-DMEM培养基培养3-14天，从图3(a)和(b)可见其生长情况，在静态拉伸模具中可以构建形成肺脏组织，并且能够较好地生长。

实施例2以诱导小鼠胚胎干细胞获得的肺脏祖细胞为种子细胞构建组织工程化肺脏组织

(1)小鼠胚胎干细胞的分离、培养及诱导分化肺脏祖细胞

(a)滋养层细胞，即原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养：昆明白孕小鼠处死，75％酒精浸泡消毒30s，取出子宫，放在盛有PBS的100-mm组织培养皿中，取出胚胎，去胚胎外组织，PBS冲洗去血。用无菌的镊子去胚胎头和内脏，将胚胎转移到60-mm组织培养皿中，剪成1mm³左右的组织块，然后转移到培养瓶中，再加PBS清洗。倒掉PBS，加入适量胰酶溶液消化，反复吹打振荡后，静置片刻，将上清转入血清中终止消化。重复上述步骤，直至组织块消化完全。收集所有消化上清，200目细胞筛网过滤后，移入离心管中1000rpm离心5min。收集细胞，H-DMEM培养基洗一次后重悬，血细胞计数板计数，以5×10⁵个/ml细胞密度接种于100-mm组织培养皿中，24小时后更换新鲜的含10％FBS的H-DMEM培养基。

(b)MEF滋养层的制备：MEF传至二代并等细胞长满后，吸掉H-DMEM培养基，加入丝裂霉素C，37℃孵育3h。孵育的同时准备明胶处理的60-mm组织培养皿，明胶溶液覆盖空的组织培养皿底，室温放置15min后，倒掉明胶溶液，晾干平放待用。上述丝裂霉素C处理的MEF去掉H-DMEM培养基，PBS冲洗三次，完全去除丝裂霉素C，加入适量胰酶溶液消化，血清终止消化后吹打分散细胞，转移至离心管中，1000rpm离心5min。收集细胞，重悬于含10％FBS的H-DMEM培养基，细胞计数，以8×10⁵个/皿的细胞密度接种于明胶包被的60-mm组织培养皿中。

(c)小鼠胚胎干细胞的分离、培养：参考M.J.Evans(M.J.Evans等，Nature，1981，292：154-156)从C57BL/6×DBA/2小鼠体内分离胚泡，用链霉蛋白酶处理扩增的胚泡，去除透明带，将无透明带的胚泡转移到上述MEF滋养层上，用胚胎干诱导培养基培养，5天后，将衍生物机械分离成碎片，继续转移到包被有滋养层细胞的96孔培养板中培养。所得细胞即为小鼠胚胎干细胞(ESC)。

吸掉MEF滋养层中的H-DMEM培养基，将上述分离的ESC加入5ml胚胎干细胞生长培养基重悬。ESC的接种密度通常是2×10⁶/60-mm培养皿(接种有滋养层细胞)。细胞生长两天后即需传代。

(d)小鼠胚胎干细胞诱导分化肺脏祖细胞：收集未分化ESC，离心，在明胶包被的培养皿中差速贴壁1小时。吸取细胞悬液，将细胞悬液置于细菌培养皿中，即将一个T25瓶的ESC接种于一个90mm培养皿中。于悬浮培养第2.5天，开始加入100ng/ml activinA，继续培养4天。于悬浮培养第6.5天，更换为胚胎干细胞生长培养基+10％KOSR(KnockOut Serum Replacement)，继续培养3.5天，收集拟胚体，后全部被置于涂有明胶的6孔板中(每个90mm培养皿可置于两个6孔板)，加入胚胎干细胞生长培养基+10％KOSR，用于进一步贴壁培养分化。贴壁培养10天后，将培养基更换为小气道基础培养基(SABM)中分化培养15-25天。得到的祖细胞用2×H-DMEM重悬，制得细胞密度为5×10⁶/ml的细胞悬液。

(2)细胞与支架材料的复合及其复合物的培养

将0.5ml本实施例步骤(1)制得的细胞悬液与实施例1步骤(2)制得的0.5mlBPA微囊(粒径为200-300μm)混合，再添加实施例1制得的液态I型鼠尾胶原(2mg/ml)0.3ml和200μl Matrigel基质胶，混匀，使用0.1mol/LNaOH调pH值为7.2-7.4，得到细胞与支架的复合物；将细胞与支架的复合物加入至实施例1制得的12孔静态拉伸模具中，每孔注入复合物1.5ml，以上操作在冰盒上进行。构建的组织置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，30min后，待细胞-支架复合物凝固，加入含10％FBS的H-DMEM培养基培养3-14天，可见肺脏组织片层能够较好地生长。

实施例3体外构建的组织工程化肺脏组织的组织学和免疫组织化学检测

HE染色：使用4％的多聚甲醛溶液固定采用实施例1方法体外培养7天的细胞-支架复合物，浓度梯度酒精脱水，石蜡包埋，制备4μm厚度的切片。常规HE染色，光镜观察，从图4中可见细胞活性良好，并能够形成肺泡样的组织结构。

免疫组织化学染色：取采用实施例1方法体外培养7天的细胞-支架复合物进行石蜡包埋，切片，厚度为4μm，脱蜡。切片微波修复后用PBS漂洗5min×3次，在H₂O₂孵育10min，PBS漂洗5min×3次，山羊封闭血清作用20min。分别使用Vimentin抗体(1∶1000)和SpC(1∶1200)作为一抗，阴性对照组使用PBS代替一抗，置于4℃，过夜孵育。PBS漂洗3min×3次，加入二抗，即生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，PBS漂洗3min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min，PBS漂洗3min×3次。DAB显色5～10min，苏木素复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察Vimentin和SpC均有阳性表达，可见图5(a)和(b)。

参考文献

[1].Chen P，Marsilio E，Goldstein RH，Yannas IV，Spector M.Formation of lung alveolar-likestructures in collagen-glycosaminoglycan scaffolds in vitro，Tissue engineering，2005，11：9-10.

[2].Mondrinos，M.J.，Koutzaki，S.，Lelkes，P.I.，and Finck，C.M.A tissue engineered model offetal distal lung tissue，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，293，2007，L639.

[3].Faraj KA，van Kuppevelt TH，Daamen WF.Construction of colla gen scaffolds that mimic thethree-dimensional architecture of specific tissues，Tissue Eng.，2007，13(10)：2387-94.

[4].Tomei AA，Boschetti F，Gervaso F.3D collagen cultures under well-defined dynamic strain：anovel strain device with a porous elastomeric support，Biotechnol Bioeng，2009，103(1)：217-25.

[5].Blau，H.，Guzowski，D.E.，Siddiqi，Z.A.，Scarpelli，E.M.，and Bienkowski，R.S.Fetal type 2pneumocytes form alveolar-like structures and maintain long-term differentiation on extracellularmatrix.J.Cell Physiol.，136，203，1988.

[6].Mondrinos，M.J.，Koutzaki，S.，Jiwanmall，E.，Li，M.，Dechadarevian，J.P.，Lelkes，P.I.，andFinck，C.M.Engineering three-dimensional pulmonary tissue constructs，Tissue Eng.，2006，12，717.

[7].Mondrinos MJ，Koutzaki SH.In Vivo Pulmonary Tissue Engineering：Contribution ofDonor-Derived Endothelial Cells to Construct Vascularization，Tissue Eng Part A，2008，14(3)：361-8.

[8].Douglas，W.H.，Moorman，G.W.，and Teel，R.W.The formation of histotypic structures frommonodisperse fetal rat lung cells cultured on a three-dimensional substrate.In Vitro，1976，12，373.

[9].Douglas，W.H.，and Teel，R.W.An organotyPic in vitro model system for studying pulmonarysurfactant production by type II alveolar pneumonocytes.Am.Rev.Respir.Dis.，1976，113，17.

[10].Douglas，W.H.，McAteer，J.A.，and Cavanagh，T.Organotypic culture of dissociated fetal ratlung cells on a collagen sponge matrix.TCA Manual，1978，4，749.

[11].Douglas，W.H.，McAteer，J.A.，Dell’orco，R.T.，and Phelps，D.Visualization of cellularaggregates cultured on a three dimensional collagen sponge matrix.In Vitro，1980，16，306.

[12].Andrade CF，Wong AP，Waddell TK，Keshavjee S，Liu M.Cell-based tissue engineering forlung regeneration.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.，2007，292：L510-L518.

[13].M.J.Evans，M.H.Kaufman，Establishment in culture of pluripotential cells from mouseembryos，Nature，1981，292：154-156.

Claims (4)

1.一种组织工程化肺脏组织的构建方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

(1)制备肺细胞悬液

诱导小鼠胚胎干细胞获得肺脏细胞，然后用2×H-DMEM培养液重悬细胞制备细胞密度为5×10⁵～5×10⁶/mL的肺细胞悬液；

(2)微囊的制备

将2.0％海藻酸钠溶液，在6kV/cm的电场作用下，通过静电微囊制作仪以15mL/h的速度推入到1.1％的氯化钙溶液中，反应8-12min，形成海藻酸钙胶珠，然后依次用0.55％氯化钙液、0.28％氯化钙液、生理盐水、0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸溶液、1.1％的氯化钙溶液冲洗；冲洗后加入0.05％多聚赖氨酸，反应6min后，依次用0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸溶液、1.1％的氯化钙溶液、生理盐水冲洗；加入0.05％的海藻酸钠溶液，反应4min后用生理盐水冲洗；加入1.5％柠檬酸钠溶液反应2min后用生理盐水冲洗3-5遍，得到海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊；

或者，将2.0％海藻酸钠溶液，在6kV/cm的电场作用下，通过静电微囊制作仪以15mL/h的速度推入到2％的氯化钡溶液中，反应8-12min，形成海藻酸钡胶珠，然后依次用0.55％氯化钙液、0.28％氯化钙液、生理盐水、0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸溶液、2％氯化钡溶液冲洗；冲洗后加入0.05％多聚赖氨酸，反应6min后，依次用0.1％(2-环己烷)-1-乙磺酸溶液、2％氯化钡溶液、生理盐水冲洗；加入0.05％的海藻酸钠溶液，反应4min后用生理盐水冲洗；加入1.5％柠檬酸钠溶液反应2min后用生理盐水冲洗3-5遍，得到海藻酸钡-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊；

(3)细胞与支架材料的复合及细胞-支架复合物的培养

将步骤(1)制得的细胞悬液与步骤(2)制得的微囊混合，再添加浓度为1.5-2.5mg/mL的胶原与Matrigel基质胶，混匀后，调节pH值至7.2-7.4，得到细胞与支架的复合物，其中细胞悬液、胶原和Matrigel基质胶的体积比为5∶(4-3)∶(2-1)；将12孔细胞培养板的每孔注入1ml的浓度为2％的无菌琼脂，琼脂凝固后，均匀插入4根长约1cm的无菌玻璃毛吸管，紫外灯照射30分钟，获得静态拉伸模具；然后将获得的细胞与支架的复合物加至由细胞培养板制得的静态拉伸模具中，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养30min，待细胞-支架复合物凝胶化后再加入含有10％胎牛血清的H-DMEM培养基，培养3-14天，即得到组织工程化肺脏组织。

2.根据权利要求1所述的组织工程化肺脏组织的构建方法，其特征在于，步骤(3)所用微囊的直径为100-400μm。

3.根据权利要求1所述的组织工程化肺脏组织的构建方法，其特征在于，所述胶原为I型鼠尾胶原。

4.一种利用权利要求1-3任一所述组织工程化肺脏组织的构建方法获得的组织工程化小鼠肺脏组织。

Images