CN103320385B - 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人源性高分化肝癌细胞株HL1017，其保藏号为CCTCC？NO：C201357，具有肝脏最重要的合成、代谢、解毒功能。同时，本发明还公开人源性高分化肝癌细胞株HL1017的构建方法。

Description

人源性高分化肝癌细胞株HL1017及其构建方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及人源性高分化肝癌细胞株HL1017，本发明还涉及该细胞株的构建方法。

背景技术

肝衰竭（hepaticfailure）是一种严重的临床综合症，常规内科治疗效果不佳，病死率高达70%左右。肝移植是治疗进展期肝衰竭唯一有效的治疗手段，但是目前肝源严重不足，能够接受肝移植的患者比例不足1%。生物人工肝（bioartificialliver，BAL）的出现为肝衰竭的治疗提供了一丝希望，它可以暂时辅助并部分替代病变肝脏的功能，帮助肝衰竭患者自身肝脏功能恢复或使其等到肝移植。

但是，生物人工肝支持系统缺乏理想的肝细胞源和高效的生物反应器，严重制约着这一新兴治疗技术的发展。目前，进入临床试验阶段的生物人工肝的细胞材料主要包括是猪肝细胞和肝癌细胞株C3A，但是前者为异种细胞，进入人体易导致排斥反应及引起动物源性传染病，后者为肝脏高度恶性肿瘤，具有潜在的致瘤性危险。以上生物材料均存在种种不足，国内外尚无获得官方批准认可的生物人工肝细胞产品，没有任何一种细胞能够完全符合人工肝理想生物材料的要求，生物人工肝的发展也渐入低谷。因此，探寻合适的细胞源，使其在人工肝中充分发挥合成、代谢、解毒等肝脏功能成为生物人工肝继续发展的重要前提和难点所在。

近年来，各国学者也从不同方面入手，探索新的细胞材料来源。如利用病毒载体将SV40LT或hTERT基因导入肝细胞而构建得到永生化肝细胞株；构建新型的肿瘤来源的肝细胞株；模仿肝细胞生长的微环境，从而提高肝细胞的功能活性。但是，这些技术和产品都存在一些不足和缺陷，而且部分产品国外公司对其享有专利保护。因此，生物人工肝新型细胞材料的研究一直是国家重点支持的方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源性高分化肝癌细胞株HL1017，该细胞株具有肝脏的合成、代谢和解毒功能，符合人工肝理想生物材料的要求。

本发明进一步目的在于提供人源性高分化肝癌细胞株HL1017的构建方法。

本发明的第一个目的提供的人源性高分化肝癌细胞株HL1017，其保藏号为CCTCCNO：C201357，该细胞株HL1017具有肝脏最重要的合成、代谢、解毒功能，其各肝功能相关指标从基因、蛋白等不同水平均具有有一定水平的表达，符合人工肝理想生物材料的要求。

本发明的人源性高分化肝癌细胞株HL1017来源于人的原代肝癌组织，它具有典型的肝癌细胞生物学特性，能在体外连续长期传代，在体外制备已传代100以上，细胞生长状况良好，增殖活跃，具有以下生物学特性：

1.形态学特性

在光学显微镜下观察，细胞形态为不规则多角形，接近于正常肝细胞，但体积小于原代肝细胞，细胞核较大，细胞浆丰富。

2.细胞生长特性

所述细胞株贴壁后72小时进入对数生长期，细胞倍增时间大约为27小时。

3.遗传学特性

该细胞株为多倍体，部分染色体发生突变及异位，具有肝癌细胞染色体的特征。

4.功能特性

该细胞株具有合成白蛋白、尿素氮、细胞色素P450的功能及合成、储存糖原的功能。利用水凝胶三维培养可不同程度提高该细胞株各肝脏功能指标在基因水平的表达。

5.安全性

该细胞株的培养上清中乙肝表面抗原(HBs-Ag)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)及丙肝病毒DNA(HCV-DNA)的含量均在安全值范围内。

本发明第二个目的通过以下技术方案来实现：一种人源性高分化肝癌细胞株HL1017的构建方法，包括以下步骤：

(1)对已去除结缔组织的离体成人肝癌组织用针头注射器吸取HBSS平衡盐溶液进行多点穿刺灌流，直至整块肝癌组织由暗红色变为灰白色，且流出的HBSS平衡盐溶液变清亮；

(2)另取针头注射器用37℃预热的Ⅳ型胶原酶在肝癌组织表面再次进行多点穿刺灌流，直至肝癌组织变柔软无弹性；

(3)分离肝癌组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化，获得消化液；

(4)在消化液中加入培养基中和胶原酶，并处理成细胞悬液，过滤，收集细胞，细胞接种培养，获得存活细胞；

(5)对步骤(4)中得到的存活细胞连续培养并传代50代以上，至其细胞形态及功能水平不再发生明显变化，则获得细胞株HL1017。

作为本发明的一个实施方式，具体的制备方法如下：

(1)对已去除结缔组织的离体成人肝癌组织用针头注射器吸取HBSS平衡盐溶液进行多点穿刺灌流，直至整块肝癌组织由暗红色变为灰白色，且流出的HBSS平衡盐溶液变清亮；

(2)无菌注射器吸取37℃预热的Ⅳ型胶原酶对肝癌组织进行第二次多点穿刺灌流，直至肝癌组织变柔软无弹性；

(3)将肝癌组织剪切成1mm³组织块，去除残存的包膜和纤维结缔组织，加入Ⅳ型胶原酶在37℃下震荡消化半小时，获得消化液；

(4)在消化液中加入等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液中和胶原酶，并处理成细胞悬液，过滤，收集细胞，再以PBS缓冲液重悬后，收集细胞，取含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接种培养，获得存活细胞；

(5)对步骤(4)中得到的存活细胞连续培养并传代50代以上，至其细胞形态及功能水平不再发生明显变化，则获得细胞株HL1017。

所述步骤(2)和(3)中型胶原酶溶液是由型胶原酶溶于DMEM培养基配制而成，型胶原酶的浓度为0.01~0.1%。所述步骤(3)中加入的Ⅳ型胶原酶量为7~8mg。

所述步骤(4)中PBS缓冲液的用量为8~10ml，所述用于重悬细胞的含10%胎牛血清的DMEM培养液的用量为3ml。

所述步骤(5)中，在37℃，气体环境为5%CO₂/95%空气，湿度为饱和湿度的条件下，对步骤(4)中得到的存活细胞进行连续培养，每2天更换一次培养液，每天传代一次，前5代生长较慢，约1~2周传代一次，之后生长速度加快，约3~4天传代一次。

本发明可做以下改进：利用水凝胶三维培养系统对HL1017细胞株肝脏功能进行优化。水凝胶的成分里含有细胞外基质相关蛋白，如胶原质、纤维蛋白等，对细胞的生长和功能具有调节作用。水凝胶的三维支架更接近于细胞在体内的生长微环境，有利于细胞生长及功能的维持，而且细胞可在不同层面生长，在相同体积细胞容器中较普通单层培养细胞数明显增加，更容易满足生物人工肝对肝细胞数量的要求。

具体地，本发明利用水凝胶三维培养系统对HL1017细胞株肝脏功能进行优化包括以下步骤：

1)取Matrigel均匀地预包埋24孔板底部，置于37℃中至其凝固；

2)HL1017细胞消化，并将细胞液与Matrigel按1:1混合，转入24孔板；

3)置于37℃中至其凝固后，在胶上层加入完全培养基；

4)在37℃，5%CO₂静置培养，每2天换液一次，培养一周。

所述步骤1)中Matrigel用量为20μL。所述步骤2)中采用胰酶消化液对HL1017细胞进行消化，胰酶消化液的用量为1ml，胰酶消化液中包括0.25%胰酶和0.02%EDTA，消化时间为2.5min。

本发明的优点：

(1)本发明的人源性高分化肝癌细胞株HL1017为人源性、低度恶性的肝癌组织来源的肝细胞株，该细胞株生长状况良好，体外培养可传代100代以上，其各肝功能相关指标从基因、蛋白等不同水平均具有有一定水平的表达，无乙肝、丙肝病毒污染，很大程度上降低了应用于生物人工肝中存在的安全性顾虑，符合人工肝理想生物材料的要求，在临床应用中具有广阔的应用价值，造福广大肝病患者。

(2)本发明利用水凝胶三维培养系统对HL1017细胞株的肝脏功能进行优化，使HL1017细胞的肝功能相关指标较接种于水凝胶三维培养系统之前均有不同程度的提高。

附图说明

图1是本发明细胞株HL1017的细胞传代过程中光镜下不同生长时期的形态学观察。

图2是本发明细胞株HL1017的细胞的生长曲线。

图3是本发明细胞株HL1017肝脏功能相关基因检测。

图4是本发明细胞免疫荧光检测HL1017细胞相关功能蛋白的表达。

图5是本发明糖原染色检测HL1017细胞糖原的合成及储存功能。

图6-1是本发明HL1017细胞染色体核型分析图。

图6-2是本发明HL1017细胞染色体核型分析图。

图7是本发明HL1017细胞在水凝胶三维培养过程中光镜下连续拍照观察。

图8是本发明HL1017细胞在水凝胶三维培养系统中肝脏功能相关基因表达水平的改变。

本发明的人源性高分化肝癌细胞株HL1017已经于2013年4月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，并收到保藏登记号CCTCCNO：C201357，分类命名为人肝癌细胞株HL1017。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步的说明：

实施例1

一、人原代肝脏细胞的分离及培养

手术切除的肝癌边缘组织，采用本实验室建立的小块肝组织的胶原酶二步灌流法分离原代肝脏细胞，具体步骤如下：

(1)标本来源于南方医院肝胆外科手术切除的新鲜离体成人肝癌组织，该肝癌组织切除后经病理诊断为高分化肝癌组织。去除结缔组织的肝癌组织，使用5ml无菌注射器吸取HBSS平衡盐溶液对肝癌组织进行多点穿刺灌流直至肝癌组织变为苍白色。

(2)用5ml无菌注射器吸取37℃预热的0.05%Ⅳ型胶原酶溶液对肝癌组织进行第二次多点穿刺灌流，直至肝癌组织变柔软无弹性。0.05%型胶原酶溶液为型胶原酶溶于DMEM培养基配制而成。

(3)将肝癌组织剪切为约1mm³组织块，加入Ⅳ型胶原酶7.5mg，在37℃下，100rmp震荡消化半小时。

(4)加入等体积含10%胎牛血清的DMEM培养液中和胶原酶，反复轻轻吹打肝癌组织细胞悬液，100目砂网过滤第一次，离心，弃上清，PBS缓冲液重悬细胞后200目砂网过滤第二次，弃上清。

(5)用无菌0.006mol/L乙酸将I型鼠尾胶原蛋白稀释到0.012mg/ml，将2.5ml稀释后的鼠尾胶原加入25cm²的培养瓶中，I型鼠尾胶原蛋白溶液铺满培养瓶的表面，开盖在超净台上过夜晾干后使用。

用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，台盼蓝染色进行细胞活力测定。将细胞密度调整为10⁶/ml，接种于预先使用鼠尾胶原包被的培养瓶中，在37℃，气体环境为5%CO₂/95%空气，湿度为饱和湿度的条件下培养。

2.长期传代培养建立细胞株

原代培养的细胞通过选择性消化法和反复贴壁法去除成纤维样细胞使上皮样细胞逐渐得到纯化，并获得生长优势，其中残存的少量成纤维细胞在培养过程中逐渐被自然淘汰。人源性肝细胞株在体外经连续传代50代以上并连续三次检测其细胞形态和各项功能指标均稳定，不再发生明显变化。

二、新型人源性肝细胞株生物学特性的检测

1.形态学观察：

在光学显微镜下观察细胞体积及形态变化，如图1所示，细胞形态不规则，多数为多角形，在第一代至第55代的传代过程中细胞体积有所减小，建株之后细胞形态、体积不再发生明显变化。

HL1017细胞形态为不规则多角形，接近于正常肝细胞，但体积小于原代肝细胞。细胞核较大，细胞浆丰富。

2．增殖动力学检测：

检测方法：细胞计数法绘制细胞生长曲线

a.取对数生长期的HL1017细胞，将细胞密度调整为2×10⁴/ml，将其接种于六孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，每组接种7个孔。

b.分别于接种后第1、2、3、4、5、6、7天的同一时间随机抽取一孔胰酶消化后进行细胞计数，连续计数7天。

c.根据每日细胞数绘制细胞生长曲线。

连续细胞计数绘制细胞的生长曲线并计算其细胞倍增时间。

检测结果，如图2所示，HL1017细胞在贴壁后72小时进入快速生长期，生长速度较快，由细胞生长曲线，根据公式DT=t*[lg2/(lgNt-lgNo)]计算得，HL1017细胞株的倍增时间为27小时左右。

3．功能检测：

3.1肝细胞相关功能基因水平的检测：

实时荧光定量PCR反应（RealtimePCR）法检测HL1017细胞肝细胞相关功能mRNA水平的表达。

3.1.1总RNA提取

按Trizol说明书进行以下操作：

1)将HL1017细胞预先接种于直径3.5cm的培养皿中，待细胞长至培养皿底面积的80%时丢弃培养基，PBS清洗一次，之后按每10cm²生长的培养细胞中加入1mlTrizol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落至液体澄清且无细胞团块。

2)裂解液转移至1.5mlEP管，颠倒混匀10下，室温静置5分钟。12000g，4℃离心5分钟。小心吸取上清液，移入新的离心管中。

3)加氯仿1/5体积（0.2ml），振荡混匀30s，待溶液充分乳化后，且无分相现象，室温静置5分钟。

4)12000g，4℃离心，15分钟。

5)上层水相约400μl转于另一1.5mlEP管中，往水相中加入等体积异丙醇约400μl，颠倒混匀，室温静置10分钟。

6)12000g，4℃离心，10分钟，底部可见微量RNA沉淀。

7)弃上清，沿管壁缓慢加入1ml预冷的75%乙醇，该75%乙醇用高压过的DEPC水加无水乙醇配成，混匀，每使用1mlTrizol试剂至少加1mL75%的乙醇。

8)12000g，4℃离心，5分钟。

9)弃上清，空气干燥5~10分钟。

10)溶于DEPC水中至20μl，可在55~60℃水浴中，进行小于10分钟助溶。

11)沉淀溶于20μlDEPC水，Nanodrop检测RNA样品浓度和i纯度。RNA纯度选择A260/A280比值在1.8~2.0之间的样品立即于-80℃保存或用于逆转录实验。

3.1.2两步法逆转录合成cDNA

按PrimeScript逆转录试剂盒说明书依次操作（冰上操作）。

1)0.2mL无RNA酶的离心管内加入：

2)37℃温育15min，进行逆转录反应。

3)85℃加热5s，灭活逆转录酶活性。

合成的cDNA产物置于-20℃冰箱备用。

3.1.3PCR反应

引物序列的设计根据文献报道并在Genebank查找目的基因序列，核对准确后经上海英骏生物技术有限公司合成，引物上下游序列见表1。

表1.RealtimePCR各引物上下游序列

Table1.TheupstreamanddownstreamsequenceofprimersinRealtimePCR

按照试剂盒说明书于PCR板内加入以下试剂：

RocheLightCycler480RealTime荧光定量PCR仪上机进行PCR反应。反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火20s，共40个循环，溶解曲线分析65℃15s。PCR结果分析，分别观察溶解曲线、扩增曲线、基因表达水平。

检测结果：如图3所示，HL1017细胞建株后，提取第100代细胞的RNA，利用qRT-PCR技术对肝脏功能相关蛋白的mRNA表达水平进行检测，并与目前人工肝用商业化的C3A细胞的表达水平进行比较。如图6所示，肝脏功能相关基因白蛋白(ALB)、前白蛋白(TTR)、α-抗胰蛋白酶(AAT)、转铁蛋白(TF)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)、葡萄糖6磷酸酶(G6P)、π谷胱甘肽巯基转移酶(GST-π)、氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-1)、酪胺酸胺基转移酶（TAT）、细胞角蛋白18（CK18）、细胞色素P4503A5（CYP3A5）、α谷胱甘肽巯基转移酶（GST-α）在HL1017细胞中均可检测到不同程度的表达。与C3A相比，除CPS-1、TAT、CYP3A5、GST-α相差较大外（5倍以上），其他功能相关指标均接近于C3A细胞。

肝细胞相关功能蛋白水平的检测：

3.2.1细胞免疫荧光检测肝细胞重要功能蛋白及表面标志物的表达：

细胞免疫荧光：

1)准备：完全培养基：含10%胎牛血清的DMEM培养液。封闭液：5%BSA：微佳科技生物公司。一抗：CK18山羊抗人抗体（sc-31700）：SantaCruz公司、ALB山羊抗人抗体（sc-46293）：SantaCruz公司、CYP2E1兔抗人抗体（ab-28146）：abcam公司。二抗：羊抗兔IgG-FITC荧光二抗（BS-10950）：美国Bioworld公司、小鼠抗羊IgG-TRITC荧光二抗（BS50251）：美国Bioworld公司。抗荧光淬灭封片液：Beyotime公司。细胞核染色液（DAPI）：sigma公司。

2)将经过高压灭菌的盖玻片放入6孔板内，消化细胞，接种于玻片上，加入完全培养液，于培养箱中培养24h使细胞爬片。

3)吸除培养液，1×PBS冲洗3次，每次5分钟，4%多聚甲醛室温下固定20min，再用1×PBS冲洗3次，每次3分钟。

4)每张玻片滴加封闭液，室温下孵育20分钟。

5)除去封闭液，样品每张玻片滴加50uL一抗，放入湿盒内4℃孵育过夜；

6)1×PBS冲洗3次，每次3分钟，加入荧光标记二抗，避光室温孵育1h，1×PBS冲洗3次，每次3分钟。

7)加入细胞核染色液，室温避光染色10分钟，1×PBS避光冲洗3次，每次3分钟。

8)取出盖玻片，滴加适当量的抗荧光淬灭封片液，封片于载玻片上。

9)荧光显微镜下观察、拍照。

检测结果：细胞免疫荧光检测HL1017细胞部分功能指标蛋白水平的表达，如图4所示：反映肝细胞合成功能的最主要蛋白白蛋白（Alb）、上皮细胞标记物细胞角蛋白18（CK18）及代表肝细胞解毒功能的细胞色素P450在HL1017细胞中有较强表达。白蛋白及P450以胞浆表达为主，CK18则以包膜为主，胞浆中也有少量表达。

糖原染色（PAS）检测HL1017细胞糖原合成及储存能力：

细胞糖原染色

1)准备：完全培养液：含10%胎牛血清的DMEM培养液

2)将经过高压灭菌的盖玻片放入24孔板内，消化细胞，接种于玻片上，加入完全培养液，于培养箱中培养24h使细胞爬片。

3)吸除培养液，1×PBS冲洗3次，4%多聚甲醛室温下固定20min，再用1×PBS冲洗3次，每次5min。

4)每张玻片滴加一滴（100ul）高碘酸（试剂A）染色10min，蒸馏水冲洗。

5)每张玻片滴加一滴（100ul）Schiff氏液（试剂B）染色20min，倾去试剂B。

6)直接滴加一滴（100ul）偏重亚硫酸钠（试剂C）作用1min，共作用2次。

7)流水冲洗10min。

8)苏木素染核4min后，自来水冲洗。

9)1%盐酸乙醇（75%乙醇配置）分化1s，自来水冲洗。

10)温水或PBS溶液返蓝5min。

11)分别经75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇各3min、无水乙醇5min梯度酒精脱水。

12)二甲苯透明，中性树胶封片。

13)显微镜下观察并拍照。

检测结果：如图5所示，HL1017细胞糖原染色后大多数细胞胞浆中可见红色颗粒状物分布说明该细胞株具有合成储存糖原的功能。

4.功能优化实验：应用水凝胶三维立体培养HL1017细胞一周后，利用实时定量荧光PCR技术检测肝细胞相关功能基因的表达变化。

1)准备：取20μLMatrigel均匀地预包埋24孔板底部，置于37°C约半小时使其凝固，完全培养基：含10%胎牛血清的DMEM培养液；

2)取消化细胞，计数，稀释至8×10⁴/mL，取125μL细胞悬液（10000个/孔）；

3)细胞悬液与Matrigel按1:1混合后，共250μL，转入24孔板；

4)置于37°C约15min待其凝固后，在胶上层加入500μL完全培养基；

5)37°C，5%CO₂静置培养；

6)3~4天换一次液，分别于培养1，3，5，7天进行观察拍照。并于培养一周后收集细胞，提取细胞RNA行qRT-PCR检测。实时定量荧光PCR与3.1.3相同。

检测结果：如图7所示：细胞在水凝胶中形成细胞团，光镜下呈球形。接种后前2天生长速度较慢，细胞团体积及数量增加不明显。自接种后第3天开始生长速度明显增加，细胞团数量增多，体积增大。提取在水凝胶中生长至第7天的HL1017细胞的RNA并用qRT-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达，并与二维培养中HL1017细胞的表达水平进行比较。如图8所示，肝脏功能相关基因的mRNA表达水平，除G6P外，均有不同程度的提高。

5.安全性评价：收集HL1017细胞株培养上清对其乙肝表面抗原(HBs-Ag)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)及丙肝病毒DNA(HCV-DNA)的含量进行检测。

消化并收集对数生长期细胞，调整细胞密度为4×10⁴/ml并接种于6孔板中，细胞贴壁后换液，每孔均加入2ml培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养液)，继续培养48小时后留取细胞的培养上清1500rmp/min离心除去单个浮游细胞和碎片，发光法检测乙肝表面抗原(HBs-Ag)，荧光定量PCR法检测乙肝及丙肝病毒DNA的含量。

检测结果：电化学发光法检测NLBL2细胞培养上清中乙肝抗原，结果显示：HL1017细胞乙肝表面抗原(HBs-Ag)为阴性。进一步利用实时定量荧光PCR法对其培养上清中乙肝病毒DNA(HBV-DNA)、丙肝病毒DNA(HCV-DNA)含量进行检测，二者亦均为阴性（<1000copies/ml）。

遗传学特性检测

主要试剂：

方法：

1)准备：固定液：甲醇:冰醋酸=3:1；浓度为0.02μg/ml的秋水仙素溶液；低渗液：0.075mol/L的KCl。

2)取处于对数生长期的细胞，于终止培养前加入浓度为0.02μg/ml的秋水仙素溶液继续培养6小时。

3)去掉培养基，加入胰酶消化，离心，弃去上清。加入5ml低渗液重悬细胞，37°C水浴箱中静置20min。

4)加入2ml固定液不停地混匀，离心，弃上清。加入5ml固定液混匀，室温下静置30min。离心，弃上清。再次加入固定液混匀，室温下静置15min。离心，弃上清。

5)以0.2ml固定液重悬细胞，用吸管吸一滴细胞悬液，从约30cm处滴到预冷的玻片上，倾斜玻片，让液滴流下并铺开。

6)空气干燥。Giemsa染色，封片，进行分析。

检测结果：如图6-1和6-2所示：该细胞株为多倍体核型，细胞染色体数目大多在58~75之间，染色体核型存在一定变异，具有肝癌细胞染色体的特点。

以上结果显示：通过基因水平（realtimePCR）、蛋白水平（免疫细胞化学）等对肝功能相关指标的检测证实本发明所构建的人源性高分化肝癌细胞株HL1017具有重要的肝脏合成、代谢、解毒功能。本发明构建的HL1017细胞株为人源性、低度恶性的肝癌组织来源的肝细胞株，无乙肝、丙肝病毒污染，很大程度上降低了应用于生物人工肝中存在的安全性顾虑。在生物人工肝及药物筛选中具有广阔的应用前景。

实施例2

HL1017的水凝胶三维培养

1)取20μLMatrigel均匀地预包埋24孔板底部，置于37°C约半小时至其凝固；

2)HL1017细胞消化

①移去培养瓶中旧培养液；

②加入2mlPBS，轻摇培养瓶，使PBS流遍所有细胞表面，之后移去PBS，重复操作1~2次；

③加入1ml0.25%胰酶消化液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)，轻轻摇动培养瓶，使胰酶消化液流遍所有细胞表面，静置2~3min，于倒置显微镜下观察细胞变圆上浮、细胞间隙增大后，移去消化液并直立培养瓶，加与胰酶等体积的培养液终止消化；

④用移液器轻柔吹打瓶底细胞，从培养瓶底部一侧开始到另一侧结束，尽量避免瓶内气泡的产生，反复吹打制成单细胞悬液，细胞计数，然后将细胞悬液稀释至8×10⁴/mL，取125μL细胞悬液与Matrigel按1:1混合，共250μL，然后按10000个/孔将细胞转入24孔板；

3)置于37℃约15min待其凝固后，在胶上层加入500μL完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养液)；

4)37°C，5%CO₂静置培养；

5)每2天换一次液，分别于培养1，3，5，7天进行观察拍照。并于培养一周后收集细胞，提取细胞RNA行qRT-PCR检测。

结果表明，将稳定建株后的HL1017细胞接种于水凝胶中作三维立体培养，光镜下细胞在水凝胶中形成细胞团，呈球形。接种后前2天生长速度较慢，细胞团体积及数量增加不明显。自接种后第3天开始生长速度明显增加，细胞团数量增多，体积增大(图7)。在水凝胶中生长至一周的细胞与二维培养中HL1017细胞的表达水平进行比较。肝脏功能相关基因的mRNA表达水平，除G6P外，均由不同程度的提高，尤其是二维培养中与C3A细胞差距较大的CPS-1、TAT、CYP3A5、GST-α等指标改善最为明显，有3~5倍升高(图8)。可见，水凝胶三维培养可优化提高HL1017细胞株的功能水平，使HL1017细胞更符合生物人工肝对理想生物材料的要求。

序列表

<110>南方医科大学南方医院

<120>人源性高分化肝癌细胞株HL1017及其构建方法

<160>30

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>白蛋白(ALB)的上游引物

<400>1

gcctgctgacttgccttcattag23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>白蛋白(ALB)的下游引物

<400>2

tcagcagcagcacgacagagta22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>前白蛋白(TTR)的上游引物

<400>3

cagaaaggctgctgatgaca20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>前白蛋白(TTR)的下游引物

<400>4

atgccaagtgccttccagta20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>α-抗胰蛋白酶(AAT)的上游引物

<400>5

caacctggctgagttcgcct20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>α-抗胰蛋白酶(AAT)的下游引物

<400>6

ctcgctgaggaacaggccat20

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>转铁蛋白(TF)的上游引物

<400>7

cccttaaccaatacttcggctac23

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>转铁蛋白(TF)的下游引物

<400>8

tttgccaagttctcaaatatagtcg25

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>细胞色素P4502E1(CYP2E1)的上游引物

<400>9

ctacaaggcggtgaaggaa19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>细胞色素P4502E1(CYP2E1)的下游引物

<400>10

tctcattgccctgtttccc19

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>葡萄糖6磷酸酶(G6P)的上游引物

<400>11

gctgctcattttcctcatcaa21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>葡萄糖6磷酸酶(G6P)的下游引物

<400>12

ttctgtaacagcaatgcctga21

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>π谷胱甘肽巯基转移酶(GST-π)的上游引物

<400>13

cctgtaccagtccaataccatcct24

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>π谷胱甘肽巯基转移酶(GST-π)的下游引物

<400>14

tcctgctggtccttcccata20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-1)的上游引物

<400>15

tgagggatgctgaccccatt20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-1)的下游引物

<400>16

cattgttggcgttgagccag20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>酪胺酸胺基转移酶（TAT）的上游引物

<400>17

aggccaggtggtctgtgagg20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>酪胺酸胺基转移酶（TAT）的下游引物

<400>18

aggggtgcctcaggacagtg20

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>甲胎蛋白(AFP)的上游引物

<400>19

gctgacattattatcggacac21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>甲胎蛋白(AFP)的下游引物

<400>20

gaacttgtcatcagagaatgc21

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>细胞角蛋白18（CK18）的上游引物

<400>21

gagacgtacagtccagtccttgg23

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>细胞角蛋白18（CK18）的下游引物

<400>22

ccacctccctcaggctgtt19

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>肝细胞核因子1α抗体(HNF-1α)的上游引物

<400>23

tacaccactctggcagccacact23

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>肝细胞核因子1α抗体(HNF-1α)的下游引物

<400>24

cggtgggtacattggtgacagaac24

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>细胞色素P4503A5（CYP3A5）的上游引物

<400>25

ccttaccccagtttttgaagca22

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>细胞色素P4503A5（CYP3A5）的下游引物

<400>26

tccagatcagacagagctttgtg23

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>α谷胱甘肽巯基转移酶（GST-α）的上游引物

<400>27

tggcagagaagcccaagctc20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>α谷胱甘肽巯基转移酶（GST-α）的下游引物

<400>28

tgcaccagcttcatcccatc20

<210>29

<211>22

<212>DNA

<213>甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的上游引物

<400>29

caatgaccccttcattgacctc22

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的下游引物

<400>30

agcatcgccccacttgatt19

Claims (1)

1.人源性高分化肝癌细胞株HL1017，其保藏号为CCTCCNO：C201357，具有肝脏的合成、代谢、解毒功能。