CN102168065A - 一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用。该方法包括如下步骤：待人脐带间充质干细胞培养对数生长期时加入肝细胞诱导分化培养基进行分化诱导，得到由人脐带间充质干细胞分化形成的肝细胞。其中：肝细胞诱导分化培养基的组成为：基本培养基为IMDM培养基，其中含有10～70ng/ml的肝细胞生长因子、3～30ng/ml的成纤维细胞生长因子4、5～50ng/ml的抑瘤素、2～40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮生长因子、1μM的地塞米松和50mg/ml的ITS+premix。该方法具有如下特点：一步法、简单，重复性好，分化过程持续时间短，诱导分化效果好。本发明可应用于将间充质干细胞诱导分化为肝细胞的研究。
Description
技术领域
本发明涉及诱导间充质干细胞分化的生物技术领域，，特别涉及一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用。
背景技术
肝脏是机体最重要的生命器官之一，具有代谢、排毒、循环调节等功能，同时肝脏疾病也是影响人类生活和生命健康的重要疾病。肝硬化，肝炎，肝功能衰竭，肝癌等都是一些临床的常见病，尤其我国是病毒性肝炎的高发区，由病毒性肝炎导致的重症肝炎死亡率可达50～70％或更高。对于这些严重疾病的治疗，原位肝移植是最理想也是目前唯一可行的治疗方法，但由于供体肝缺乏，异种免疫排斥，长期服用免疫抑制剂带来多种毒副作用和保存供体的时间限制，且费用昂贵等原因，限制了这一治疗手段的开展。肝细胞的移植和生物人工肝提供了一种新的治疗方法，但是患者自体肝细胞获取难度很大，细胞增殖能力有限，且细胞体外长期培养易失去活性和功能，而且异基因或异种肝细胞会产生免疫排斥反应等。因此，寻求非肝源干细胞并促进其向肝细胞定向分化是亟待解决的重要问题。
近年来的研究表明间充质干细胞是具有多向分化潜能的干细胞，在特定分化诱导条件下可分化为特定的细胞，而且具有易得性、体外可连续培养等特点，使其成为研究的热点。研究表明间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能，目前主要采取的诱导方法包括：体外诱导法(培养液中加入多种细胞因子，化学药物诱导)，与肝细胞或肝非实质细胞共培养，条件培养，或体内移植，另外还有转基因等方法，采用生长因子诱导的方法较为常用，采用分步诱导的方法比较多，两步法较为常见，这些诱导方法都较为复杂。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法。该方法为采用多种细胞因子联合的一步诱导法，简单，更具实用性。
本发明的另一目的在于提供所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，包含以下步骤：待人脐带间充质干细胞处于对数生长期时加入肝细胞诱导分化培养基进行分化诱导，得到由人脐带间充质干细胞分化形成的肝细胞；其中：肝细胞诱导分化培养基的组成为：基本培养基为IMDM培养基，其中含有10～70ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)、3～30ng/ml的成纤维细胞生长因子4(FGF-4)、5～50ng/ml的抑瘤素(OSM)、2～40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml的表皮生长因子(EGF)、1μM的地塞米松(Dex)和50mg/ml的ITS+premix；
所述的对数生长期为细胞密度60～80％；
所述分化诱导的时间优选为21天，诱导期间每3天换1次液；
所述的人脐带间充质干细胞优选通过如下方法制备得到：首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到华尔通胶质，将华尔通胶质剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)，5ng/ml bFGF，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO3，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液；
人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子可用FACScan流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105；流式细胞的鉴定条件为：细胞的密度不低于106/ml，采用mouse anti IgG1/R-PE，mouse anti IgG1/FITC作为同型对照。
所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法应用于将间充质干细胞诱导分化为肝细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)诱导体系简单：本发明采用一步法，多种细胞因子的组合的联合诱导，与两步法或多步法相比，分化方法有了很大的优化，较为简单。通过体外诱导21天，得到具有表达肝细胞特异蛋白和基因的肝细胞，且诱导得到的肝细胞具有糖原合成能力和低密度脂蛋白的吸收能力。
(2)重复性好：本发明所述方法诱导分化多批细胞，都得到了很好的分化效果。
(3)分化过程持续时间短：本发明所述方法的整个分化过程只需要21天即可分化得到肝样细胞。
(4)诱导分化效果好：使用本发明所述方法通过体外诱导人脐带间充质干细胞21天，经免疫荧光，Western blot和Real-time PCR分析都表明得到具有表达肝细胞特异蛋白和基因的肝细胞，PAS染色和DiI-Ac-LDL表明诱导得到的肝细胞具有糖原合成能力和低密度脂蛋白的吸收能力。
(5)细胞来源：本发明所用的人脐带间充质干细胞可用商业来源的人脐带间充质干细胞，也可分离自人新生儿的脐带。人新生儿的脐带属于医疗废弃物，本发明所述的方法可以充分利用人新生儿的脐带，不受伦理限制。而且从人新生儿的脐带分离得到的间充质干细胞免疫源性低，细胞容易分离和培养，增殖效率高。
总而言之，本发明对诱导体系进行改进，建立了一种多种生长因子联合的一步法的诱导体系，实现了脐带间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化。本发明大大简化了实验方法，更具实用性，为脐带间充质干细胞在肝病治疗的研究和临床应用上打下了基础。
附图说明
图1是人脐带间充质干细胞细胞形态图(100×)。
图2是人脐带间充质干细胞的流式细胞鉴定图：人脐带间充质干细胞经胰酶消化收集，分别加入PE或FITC标记的相应小鼠抗人单克隆抗体进行免疫染色，采用mouse anti IgG1/R-PE或mouse anti IgG1/FITC做为同型对照，流式细胞仪检测各组细胞荧光强度；其中空白峰的部分代表着相应的同型对照抗体。
图3是人脐带间充质干细胞成骨分化，成脂肪分化和成软骨分化的鉴定图，其中：
图(a)为诱导分化后细胞进行ALP染色检测细胞碱性磷酸酶活性的图；
图(b)为未分化细胞进行ALP染色检测细胞碱性磷酸酶活性的图；
图(c)为诱导分化后细胞进行Von Kossa染色检测细胞中钙质沉淀的图；
图(d)为未分化细胞进行Von Kossa染色检测细胞中钙质沉淀的图；
图(e)为诱导分化后细胞进行油红O染色检测成脂肪细胞分化的图；
图(f)为未分化细胞进行油红O染色检测成脂肪细胞分化的图；
图(g)为诱导分化后细胞进行Alcian blue染色染色检测成软骨分化的图；
图(h)为未分化细胞进行Alcian blue染色检测成软骨分化的图。
图4是免疫荧光技术分析肝细胞特异性蛋白的表达图，其中：图(a)、(c)和(e)分别为诱导分化21天后，分化细胞的ALB、AFP和CK-18的阳性表达；图(b)、(d)和(f)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。
图5是Real-time RT-PCR分析肝脏细胞特异性基因mRNA的表达图，在人脐带间充质干细胞向肝细胞方向诱导分化的第0、7、14和21天分别提取总RNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作内参，分别进行Real-time RT-PCR反应分析三个肝脏细胞特异性基因mRNA的表达情况，所得数据通过2-ΔΔCT方法分析基因相对表达量的变化，然后用Origin 7.0软件处理数据并作图。
图6是PAS染色检测诱导分化的人脐带间充质干细胞合成糖原的能力图，其中图(a)是诱导分化21天后，分化细胞的糖原合成能力呈阳性；图(b)是未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。
图7是DiI-Ac-LDL检测诱导分化的人脐带间充质干细胞的低密度脂蛋白吸收能力图，其中图(a)为分化细胞的DiI-Ac-LDL检测呈阳性图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：人脐带间充质干细胞的分离，培养与鉴定
(1)人脐带间充质干细胞的分离，培养。在无菌条件下取得人脐带(由汕头大学第一附属医院无菌取得，本实验脐带均来源于健康产妇，得到志愿者与家属的同意)，6h内分离细胞。体积百分比0.25％碘伏浸泡人脐带3min后，用生理盐水洗去表面及血管内血凝块(尽量完全将血块去除以减少血细胞污染)，借助手术镊子将脐带撕开，找到两根动脉和一根静脉，用镊子挑取血管周围的华尔通胶质(又称脐带基质)，剪成1～2mm3大小的组织块，并均匀加到24孔板里，用含有10％(v/v)FBS，5ng/ml bFGF，216μg/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO3，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1μg/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液培养，混匀板里组织块，置CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养。培养期间不能摇晃培养板。大约10天后，用倒置显微镜观察细胞，可见有梭形细胞从组织块中游离出来。待原代细胞(如图1所示)长满至细胞密度为90％时传代，先去除(尽量除尽)板中组织块，PBS溶液(pH值7.4)洗一次，再用质量体积比0.25％的胰蛋白酶和EDTA的混合消化液(含2.5g/L的胰蛋白酶和0.38g/L的EDTA)消化细胞，用含有10％(v/v)FBS的L-DMEM培养液中止消化，用移液器将细胞吹打至悬浮，转至离心管中，1054rpm离心5min，取沉淀的细胞，用生长培养液吸打混匀后计数，以1～2×104个细胞/cm2接种至25cm2的培养瓶中(从第二代起以3×104个细胞/cm2接种)，2～3天换液，待细胞长满95％时，照上述方法进行传代。3代之后的细胞可以进行细胞冻存，细胞冻存前一天更换培养液，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶和EDTA的混合消化液(含2.5g/L的胰蛋白酶和0.38g/L的EDTA)消化细胞，1054rpm离心5min，加新鲜培养液悬浮细胞，并计数。以一定的细胞密度(6×105-1×106个细胞/ml)冻存，冻存时需要补加10％(v/v)的FBS和二甲基亚砜(DMSO)，然后将冻存管迅速置于异丙醇程序降温盒中并直接放入-80℃低温冰箱中过夜，然后将之放入液氮罐中冻存以备用。
(2)人脐带间充质干细胞的流式细胞FACS鉴定
利用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原，鉴定从新生儿脐带沃顿胶组织(Wharton’s Jelly)中分离所得的细胞是否表阳性达间充质干细胞(MSCs)的细胞表面标志CD105，CD73，CD90及阴性表达细胞表面标志CD45，CD34，CD14，CD19，HLA-DR。
具体的步骤为：①待细胞长满80-90％后，采用质量体积比0.25％胰酶消化收集细胞，使细胞密度至少达到106个/ml；②加2ml PBS溶液(pH值7.4)，吸打混匀细胞，4℃1054rpm离心5min，重复2次；③加1ml 2.5％FCS，吸打混匀细胞，4℃，1054rpm离心5min；④加抗体温育：CD105-PE，CD73-PE，CD90-PE，CD45-PE，CD34-FITC，CD19-PE，CD14-FITC，HLA-DR-FITC，mouse anti IgG1/R-PE，mouse anti IgG1/FITC均由PBS溶液按照1∶50稀释后使用；冰上避光孵育40min；⑤加2ml PBS溶液，吸打混匀细胞，4℃，1054rpm离心5min，重复1次；⑥弃去PBS溶液，加500μl PBS溶液重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞荧光值，结果如图2所示。图2表明，体外扩增培养的绝大部分人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105，阳性率均在90％以上。这表明本试验中所分离扩增的细胞是人脐带来源的间充质干细胞，而非造血干细胞。
(3)人脐带间充质干细胞的成骨分化
取培养第4-9代处于对数生长的人脐带间充质干细胞，以2×104个细胞/孔的细胞数量接种至24孔板里，待细胞长满至70％时，弃正常生长培养基，用成骨细胞诱导培养液(含10％FBS，0.216g/L NaHCO3，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100mM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸钠，0.2mM L-抗坏血酸盐的LG-DMEM细胞培养液)进行诱导分化，每3天更换培养液一次。经诱导28天后进行碱性磷酸酶染色(ALP染色)和von-Kossa染色。
碱性磷酸酶染色(ALP染色)的步骤为：①制备重盐溶液：室温下量取48ml双蒸水，加入Fast Violet B胶囊，加入转子，在磁力搅拌器上搅拌，使胶囊溶解；②在上述稀释了的重盐溶液中加入2ml萘酚碱性磷酸酶溶液，混匀；③去除培养板内旧培养液，加入柠檬酸盐丙酮溶液，固定30s；④去除固定液，加双蒸水洗3次，除去双蒸水，切忌干燥；⑤加步骤2的混合液(染液)，常温下避光孵育30min；⑥除去染液，立即加入双蒸水，浸泡2min，除去双蒸水，切忌干燥；⑦立即加入Mayer’s苏木精溶液，染色90s；⑧除去Mayer’s苏木精溶液，双蒸水浸泡2min；⑨显微镜观察。
von-Kossa染色的步骤为：①在诱导分化培养28天后，弃培养液，PBS(PH值7.4)冲洗3次，10％福尔马林常温固定细胞15分钟；②双蒸水重复漂洗3次，加入5％硝酸银溶液，将培养板开盖放在强光或紫外灯下照射1小时；③倒出残留的硝酸银溶液，去离子水漂洗3次；④加入5％的硫代硫酸钠溶液于常温5分钟；⑤显微镜下观察并拍照。
结果如图3(a，b，c，d)所示，经成骨分化诱导培养28天的细胞碱性磷酸酶活性和Von Kossa染色均呈明显的阳性(图3-a和图3-c)，而在正常生长培养基中生长的对照组细胞则两种检测均无阳性显示，即既没有碱性磷酸酶活动，Von Kossa染色后也未有矿质沉淀的黑色颗粒状小结(图3-b和图3-d)，表明人脐带间充质干细胞有向成骨细胞分化的能力。
(4)人脐带间充质干细胞的成脂肪细胞分化
取培养第4-9代的人脐带间充质干细胞，以1×104个/孔的细胞数量接种至24孔板里，待细胞长满至80％时，弃正常生长培养基，用成脂分化诱导培养液(含10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，60μM吲哚美辛，1μM地塞米松，0.5mM IBMX，5μg/ml胰岛素的LG-DMEM细胞培养液)诱导分化培养21天，每3天更换培养液一次。诱导21天后，进行油红O染色检测。
油红O染色检测中性脂滴的形成，方法如下：①诱导分化21天后，弃培养液，用PBS(PH7.4)漂洗3次；②10％福尔马林常温固定细胞15分钟；③用去离子水漂洗3次，加入新鲜配制的0.18％油红O染色15分钟；④用去离子水漂洗3次后，加入苏木精染色2分钟；⑤用去离子水漂洗3次后，显微镜下观察并拍照。
结果如图3(e，f)所示，诱导分化21天后，分化的细胞有脂滴形成，经油红O染色，脂滴呈红色(图3-e)，而在正常生长培养基中生长的未分化的脐带间充质干细胞均未有明显中性油滴的出现(图3-f)，表明人脐带间充质干细胞有向成脂肪细胞分化的能力。
(5)人脐带间充质干细胞的成软骨细胞分化
取早期培养的第3-5代的人脐带间充质干细胞，培养至细胞密度90％融合时，利用0.25％胰蛋白酶消化，并用聚丙烯离心管收集细胞，1000rpm离心5分钟，细胞在离心管底部形成坚硬的小球，去除培养液，然后小心加入成软骨分化诱导培养基(含1％胰岛素铁硒传递蛋白，牛血清白蛋白1.25mg/ml，地塞米松10-7M，维生素C磷酸酯50μg/ml，L-脯氨酸40μg/ml，丙酮酸钠100μg/ml，转化生长因子10ng/ml，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的HG-DMEM细胞培养液)，切勿吹散细胞团，以后每隔3天更换培养液1次，诱导21天后将细胞团块取出，切片后，使用亚甲基蓝染色，进行分化检测。
亚甲基蓝染色方法如下：①固定：细胞分化21天后，去除培养液，用PBS缓冲液(PH7.4)漂洗2次，后用4％多聚甲醛固定过夜；②将细胞团取出，用OCT包埋在冰冻头子上，冰冻切片机切片，切片厚为10μm；③切片水洗10S，亚甲基蓝染色30分钟；④流水冲洗2分钟，去离子水漂洗3次；⑤脱水：分别采用95％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇、二甲苯、二甲苯依次各放放置1min、1min、2min、2min、5min、5min；⑥中性树脂封片；⑦在显微镜下观察结果。
结果如图3(g，h)所示，人脐带间充质干细胞在成软骨分化诱导的培养基中诱导分化21天后，亚甲基蓝染色呈蓝色(图3-g)，表明细胞基质中富含蛋白多糖，并且在胞外基质中分泌较多的I型胶原。而在正常生长培养基中生长的未分化的人脐带间充质干细胞在亚甲基蓝染色实验中呈现阴性(图3-h)。
实施例2：体外诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞
本实施例的目的是通过添加了诱导因子的诱导培养液的培养，促使人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞。取传至3-8代的人脐带间充质干细胞，以1×105细胞/孔的细胞密度接种于6孔或1×104细胞/孔的细胞密度接种于24孔培养板中，待细胞密度达到70％时，弃正常生长培养基，换为肝细胞诱导分化培养基进行诱导分化，得到肝细胞。肝细胞诱导分化培养基为IMDM培养液中含有：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1μg/ml两性霉素、HGF(PeproTech)40ng/ml、FGF-4(PeproTech)10ng/ml、OSM(Sigma-Aldrich)20ng/ml、bFGF(PeproTech)10ng/ml、EGF(PeproTech)20ng/ml、Dex(Sigma-Aldrich)1μM、ITS+premix(Sigma-Aldrich)50mg/ml。置37℃，5％CO2培养箱中持续诱导分化21天，诱导分化期间每3天换一次分化培养液。诱导分化后的细胞可以通过免疫荧光和Real Time PCR技术检测肝细胞特异蛋白和基因的表达，用PAS染色和DiI-Ac-LDL检测肝细胞糖原合成能力和低密度脂蛋白的吸收能力。
实施例3：分化细胞的鉴定
(1)免疫荧光检测肝细胞特异蛋白的表达
按照实施例2中的方法将人脐带间充质干细胞经诱导分化培养基培养21天后，用0.25％胰蛋白酶消化，采用诱导分化培养基重悬后，以1×104细胞/cm2接种于24孔培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。以正常生长培养基中培养的未分化人脐带间充质干细胞作为阴性对照。采用免疫细胞化学检测肝细胞特异蛋白：α-fetoprotein(AFP)，albumin(ALB)和cytokeratin 18(CK-18)。细胞固定后，滴加鼠抗人单克隆抗体α-fetoprotein(AFP)，albumin(ALB)和cytokeratin 18(CK-18)于37℃孵育1小时，然后加FITC或PE标记的二抗于37℃闭光孵育1小时，细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，最后细胞置荧光显微镜下观察并拍摄图片，如图4所示。从图4可以看出，在诱导分化培养液中培养21天后，经免疫荧光细胞化学染色后，肝细胞的三种特异性蛋白AFP、ALB、CK18均呈阳性表达(图4(a)，(c)和(e))，在正常生长培养基中培养的未分化细胞组均为阴性，即未分化的人脐带间充质干细胞不表达这三种蛋白(图4(b)，(d)和(f))。
(2)Real Time PCR技术鉴定肝细胞特异基因的表达
按照实施例2中的方法将人脐带间充质干细胞分化21天后，采用RNA抽提试剂盒提取得到的细胞的总RNA，使用Toyobo公司的反转录试剂制备cDNA，使用SYBRGreen法进行实时定量聚合酶链式反应(Real Time-PCR)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH作为内参，检测肝细胞特异性基因AFP，ALB和CK18mRNA的表达。Real time PCR反应体系为25μl：12.5μl Real time PCR Mix，0.5μl上下游引物(25mM)，cDNA 5μl。扩增条件为：95℃5min，95℃15s，60℃1min，72℃1min，于ABI 7300 Real-Time PCR System中进行40个循环。所得数据通过2-ΔΔCT方法分析基因相对表达量的变化，然后用Origin 7.0软件处理数据并作图，如图5所示。图5表明，在诱导分化的第0天，这三个肝脏细胞特异性基因在未分化的脐带间充质干细胞内均不表达；而在分化7天后，表达量均有不同程度的提高。3个基因在第14天的表达量均高于第7天，AFP的表达量在21天时有所下降，呈现先增长后减退的趋势，ALB和CK18mRNA表达呈现持续上升的趋势。
所用引物序列如下所示：
ALB：上游引物：5’-GCCTGCTGACTTGCCTTCATTAG-3’
下游引物：5’-TCAGCAGCAGCACGACAGAGTA-3’
AFP：上游引物：5’-GAAACCCACTGGAGATGAACAGTC-3’
下游引物：5’-AAGTGGGATCGATGCAGGA-3’
CK-18：上游引物：5’-GATCGACCTGGACTCCATGAGAA-3’
下游引物：5’-CCGTTGAGCTGCTCCATCTGTA-3’
GAPDH：上游引物：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’
下游引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGT-3’
(3)采用糖原合成能力鉴定肝细胞分化
按照实施例2中的方法将人脐带间充质干细胞培养21天后，用PBS溶液(pH值7.4)冲洗得到的肝细胞3次，使用甲醛酒精固定液，室温下固定细胞1分钟，加入过碘酸，室温反应5分钟，用蒸馏水洗3遍，加入希夫试剂，室温反应15分钟，用自来水冲洗5分钟，苏木精染色90秒，用自来水冲洗15-30秒，未分化的细胞作为阴性对照，在倒置显微镜下观察。图6为PAS染色结果，从图中可以看出，分化的细胞具有糖原合成能力，被染成紫红色，而未分化的细胞呈现微弱阳性。图6-a为分化细胞的PAS染色结果，呈阳性；图6-b为未分化细胞作为阴性对照的结果，呈阴性。
(4)采用低密度脂蛋白吸收能力鉴定肝细胞分化
按照实施例2中的方法将人脐带间充质干细胞分化诱导21天后，将分化的细胞贴壁于96孔培养板，用150μl含有10μg/mL吲哚羰花青荧光染料标记的乙酰低密度脂蛋白(1，1’-dioctadecyl-1-3，3，3’，3’-tetramethyl-indo-carbocyanine perchlorate conjugated to acetylated-LDL，DiI-Ac-LDL)和肝细胞分化诱导培养基，置含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养24小时，然后常温下用体积百分比2％多聚甲醛固定15分钟，PBS溶液(pH值7.4)小心冲洗三次，再加入150μl含有30mM 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的PBS溶液染细胞核，置37℃细胞培养箱中孵育15分钟，然后于荧光显微镜下观察荧光标记的低密度脂蛋白的吸收情况并拍摄图片。取正常生长培养基中培养的未分化的脐带间充质干细胞作为对照，如图7所示。从图7中可以看出分化的细胞显示相当程度的红色荧光，表明分化诱导后的脐带间充质干细胞能将荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白吸收进细胞质中。而正常生长培养基中培养的未分化的脐带间充质干细胞无红色荧光，表明不能吸收低密度脂蛋白。图7-a为分化细胞的DiI-Ac-LDL检测结果，呈阳性；图7-b为未分化细胞作为阴性对照的结果，呈阴性。
实施例4：采用不同来源的脐带分离和培养人脐带间充质干细胞
采用与实施例1中不同的脐带，脐带取自汕头大学第一附属医院，并得到志愿者与家属的同意。采用与实施例1的相同方法分离和培养人脐带间充质干细胞，分离得到的人脐带间充质干细胞通过流式细胞的方法鉴定表面抗原分子的表达，通过成骨分化、成脂分化和成软骨分化鉴定细胞的多向分化能力，得到的结果与图2和图3一致。
采用与实施例2的相同方法进行肝细胞的诱导分化，但采用不同的肝细胞诱导分化培养基，肝细胞诱导分化培养基为IMDM培养液中含有：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1μg/ml两性霉素、HGF 10ng/ml、FGF-4 30ng/ml、OSM 50ng/ml、bFGF 10ng/ml、EGF 20ng/ml、Dex 1μM、ITS+premix 50mg/ml。置37℃，5％CO2培养箱中持续诱导分化21天，诱导分化期间每3天换一次分化培养液。
诱导分化培养21天后，采用实施例3中相同的免疫荧光方法鉴定肝细胞的3种特异蛋白AFP、ALB、CK18的表达，结果与图4一致：诱导分化后的细胞阳性表达AFP、ALB、CK18，未分化的对照组细胞呈阴性。采用与实施例3中相同的Real-Time PCR方法检测AFP、ALB、CK18mRNA的表达，所得结果与图5一致：在诱导分化的第0天，这三个肝脏细胞特异性基因在未分化的脐带间充质干细胞内均不表达；而在分化7天后，表达量均有不同程度的提高。3个基因在分化第14天的表达量均高于第7天，AFP的表达量在21天时有所下降，呈现先增长后减退的趋势，ALB和CK18mRNA表达呈现持续上升的趋势。采用与实施例3中相同的PAS染色方法检测分化细胞的糖原合成能力，结果与图6一致：分化细胞具有糖原合成能力，染成紫红色，未分化细胞呈阴性。采用与实施例3中相同的DiI-Ac-LDL检测方法鉴定分化细胞的低密度脂蛋白吸收能力，结果与图7一致：分化的细胞具有低密度脂蛋白吸收能力，未分化细胞呈阴性。
实施例5：采用不同来源的脐带分离和培养人脐带间充质干细胞
采用与实施例1和4中不同的脐带，采用与实施例4中所有相同的方法分离，培养，鉴定和分化人脐带间充质干细胞，但采用不同的肝细胞诱导分化培养基，肝细胞诱导分化培养基为IMDM培养液中含有：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1μg/ml两性霉素、HGF 70ng/ml、FGF-43ng/ml、OSM 50ng/ml、bFGF 10ng/ml、EGF 20ng/ml、Dex 1μM、ITS+premix 50mg/ml。得到的所有结果与实施例4的结果一致。
实施例6：采用不同来源的脐带分离和培养人脐带间充质干细胞
采用与实施例1，4，5中不同的脐带，采用与实施例4中所有相同的方法分离，培养，鉴定和分化人脐带间充质干细胞，但采用不同的肝细胞诱导分化培养基，肝细胞诱导分化培养基为IMDM培养液中含有：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1μg/ml两性霉素、HGF 40ng/ml、FGF-410ng/ml、OSM 5ng/ml、bFGF 40ng/ml、EGF 20ng/ml、Dex 1μM、ITS+premix 50mg/ml。得到的所有结果与实施例4的结果一致。
实施例7：采用不同来源的脐带分离和培养人脐带间充质干细胞
采用与实施例1，4，5，6中不同的脐带，采用与实施例4中所有相同的方法分离，培养，鉴定和分化人脐带间充质干细胞，但采用不同的肝细胞诱导分化培养基，肝细胞诱导分化培养基为IMDM培养液中含有：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、1μg/ml两性霉素、HGF 10ng/ml、FGF-4 30ng/ml、OSM 50ng/ml、bFGF 2ng/ml、EGF 20ng/ml、Dex 1μM、ITS+premix50mg/ml。得到的所有结果与实施例4的结果一致。
上述分化细胞的鉴定中，免疫荧光细胞化学，及Real-Time PCR的结果都表明，分化的细胞表达肝细胞特异的蛋白和基因。PAS染色和DiI-Ac-LDL检测表明分化的细胞具有糖原的合成能力和低密度脂蛋白吸收能力，表明分化的细胞具有肝细胞的功能。本发明采用的诱导方法，成功的实现了将人脐带间充质干细胞诱导为肝样细胞，这些细胞在基因水平、蛋白质水平上不同程度地表达肝细胞特异性的标志，并初步具有某些肝脏细胞的功能，说明该诱导体系达到了理想的诱导效果，为人脐带间充质干细胞向肝细胞分化提供了一种新的简单，实用方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：待人脐带间充质干细胞培养对数生长期时加入肝细胞诱导分化培养基进行分化诱导，得到由人脐带间充质干细胞分化形成的肝细胞；其中：肝细胞诱导分化培养基的组成为：基本培养基为IMDM培养基，其中含有10～70ng/ml的肝细胞生长因子、3～30ng/ml的成纤维细胞生长因子4、5～50ng/ml的抑瘤素、2～40ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮生长因子、1μM的地塞米松和50mg/ml的ITS+premix。
2.根据权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，其特征在于：所述的对数生长期为细胞密度为60～80％。
3.根据权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，其特征在于：所述分化诱导的时间为21天，诱导期间每3天换1次液。
4.根据权利要求1所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，其特征在于：所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到：首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到华尔通胶质，将华尔通胶质剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80～90％融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中前述的培养液为含有体积百分比10％的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，216μg/ml的谷氨酸盐，2mg/ml的NaHCO3，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和1μg/ml的两性霉素B的LG-DMEM培养液。
5.根据权利要求4所述体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞的鉴定方法为通过FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原分子，人脐带间充质干细胞是不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105的；流式细胞的鉴定条件为：细胞的密度不低于106/ml，采用mouse anti IgG1/R-PE，mouse anti IgG1/FITC作为同型对照。
6.权利要求1～5任一项所述的体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法应用于将间充质干细胞诱导分化为肝细胞。
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