CN108118025A - 一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用，该模型主要基于肝脏正常的生理结构特点，利用成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，对传统的原代肝细胞或肝细胞系单层培养模型进行改进，将定性滤纸作为细胞培养的支架材料，将滤纸放置24孔板中使滤纸悬浮在培养液中，可进行充分的物质传输和营养成分的交换，从而使细胞在滤纸上进行三维生长。所述基于滤纸的肝模型即在定性滤纸上进行hiHep细胞与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养，实现了一种可体外长期培养并维持肝特异性功能的三维肝组织，利用它可以在体外进行一系列的肝毒性药物的测试及评估，其主要作用是在体外研究药物分子对肝脏组织的长期毒性及肝功能损伤的过程。

Description

一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用
技术领域
本发明属组织工程及药物研究领域，具体涉及一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及其应用。
背景技术
人体众多器官中，肝脏是人体内最大的腺体，有非常复杂的微结构，并拥有物质代谢、血液解毒和血浆蛋白分泌等多种功能，尤其是药物和毒素代谢功能，对维持机体的稳定和代谢起到重要的作用。然而目前各种肝脏疾病严重威胁着人类健康，肝脏疾病的研究以及药物筛选、毒性检测方面大都还是依赖于动物实验和临床研究。由于物种之间的差异性，动物实验的结果难以完全转化到临床中，药物开发受到严重制约。而且在肝组织工程中，治疗肝衰竭的传统的肝脏移植方法一直面临着器官供应短缺、免疫排斥以及伦理争议等诸多问题。因此体外构建有功能性的肝组织或肝模型在研究药物代谢、疾病模型构建、生物人工肝反应器、细胞移植治疗等方面有着非常重要的研究和临床应用价值。
肝细胞在体内有很强的再生功能，然而一旦剥离出肝脏或以传统二维培养模式进行体外培养，就会很快失去增殖能力，丧失表型和正常的肝功能。因此在体外构建功能性的肝组织过程中，对体内肝细胞复杂微环境的模拟，实现体外肝细胞的三维培养，进而有效维持肝细胞的分化表型和改善肝细胞功能，就尤为重要。目前，体外维持肝细胞功能的方法有多种，包括利用非粘附性表面或带有凹形微孔结构的芯片形成肝细胞球，中空纤维以及液滴包埋技术形成肝组织，或者用图案化的细胞外基质和水凝胶支架材料构建肝组织。然而传统的肝模型或肝反应器拥有许多的局限性，如肝细胞种类和来源有限，生物材料的性能及安全性差，体外细胞生长微环境难以长期维持，培养体系复杂难以扩大等。滤纸作为一种商业化、低成本、用途广泛的材料，它的生物兼容性、稳定性较好，并且由束状纤维素微纤维形成多孔的三维结构，因此滤纸非常适合作为细胞三维培养的支架材料。目前尚未有报道利用滤纸材料进行肝细胞的培养，并构建可进行体外长期培养的三维肝组织模型。
发明内容
基于上述原因，本发明利用一种新型肝细胞hiHep作为肝细胞来源，在滤纸上与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养构建三维肝组织模型。该培养体系能够近似模拟体内肝组织微环境，使肝细胞形态和功能较长时间地维持，可以作为动物实验的替代方法，在体外实现药物长期作用于肝组织的毒性检测或药物筛选的能力。
本发明的目的是提供一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立及应用，该模型可在体外长期维持肝细胞结构和功能，可用于药物筛选和毒性检测以及药物开发等应用。
本发明提供了一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，具体步骤为：
将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层细胞外基质，然后在其上面先后种上一种内皮细胞和肝细胞，两种细胞共培养一定时间后，得到具有肝特异性功能的三维肝组织，并能进行体外长期培养。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述肝细胞包括人原代肝细胞、肝细胞系、肝癌细胞系所有具有肝细胞结构和特异性功能的肝细胞。优选为一种由成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，此细胞系含有稳定转染的大T抗原的EGFP基因，可自发绿色荧光。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述内皮细胞包括肝窦内皮细胞、脐静脉内皮细胞、微血管内皮细胞所有具有血管内皮特征和功能的细胞，优选为脐静脉内皮细胞HUVEC。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述的细胞外基质包括胶原、基质胶在内的所有天然类及合成类的细胞外基质，优选为I型鼠尾胶原。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述的内皮细胞HUVEC和肝细胞hiHep共培养时的接种比例为1:1～1:2。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，所述共培养中所用的培养基为hiHep细胞用培养基，成分包括DMEM/F12基础培养基、ITS、TGFa、EGF、地塞米松、BSA，以及多种氨基酸成分和无机盐成分。
所述共培养中所用的培养基为hiHep细胞用培养基，基础成分为DMEM/F12(1:1)，再加入占总体积1％的ITS(100X)，终浓度为40ng/ml的TGFa，终浓度为40ng/ml的EGF，终浓度为10mM的地塞米松，终浓度为2g/L的BSA，终浓度为2g/L的半乳糖，终浓度为0.1g/L的鸟氨酸，终浓度为0.3g/L的脯氨酸，终浓度为0.61g/L的烟酰胺、终浓度0.544mg/L氯化锌，终浓度0.75mg/L硫酸锌，终浓度0.2mg/L硫酸铜，终浓度0.025mg/L硫酸锰、以及占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的应用，三维肝模型用于研究肝细胞特异性功能,其操作步骤如下：
以单层培养hiHep肝细胞为对照组，检测三维共培养肝模型的脂质和糖原合成情况；以单层培养hiHep肝细胞以及纸上三维培养肝细胞为对照组，用免疫荧光方法检测三维共培养肝模型白蛋白表达水平。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型的应用，三维肝模型用于研究其在体外长期培养过程中的细胞表型和肝特异性功能，其操作步骤如下：
按照前述方法建立三维共培养肝模型，分别在第7天、第31天、第60天、第103天进行三维肝模型的形态学表征。定期收集细胞培养上清液，共收集培养到第75天的样品，并收集二维单层肝细胞培养前三天的上清液样品作为对照组，用于定量检测整个培养过程中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成水平。
一种基于定性滤纸的三维肝模型的应用，该模型用于研究包括化学合成药物、生物药物、天然药物等所有来源的用于人体的口服药物。
本发明一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其中一个优选方案为：将滤纸用打孔器制成24孔板孔大小的圆片，高压灭菌后，用100ug/ml的I型鼠尾胶原包被过夜，之后用PBS洗掉残留的胶原，将HUVEC细胞按0.4X106个/ml细胞密度接种于24孔板中，每孔加入500ul细胞悬浮液，在纸上培养两天后，吸去原来的培养液，按HUVEC/hiHep＝1:1～2的比例接种上hiHep细胞，换hiHep培养基继续培养，从而得到肝细胞功能较好的三维肝模型。
之后每隔一天换液并收集细胞培养液用于后续的白蛋白和尿素的检测。
本发明提供的一种基于定性滤纸的三维肝模型设计合理，用材简单，适用于研究包括化学合成药物、生物药物、天然药物等所有来源的用于人体的口服药物。
本发明同hiHep细胞单层培养模型相比具有如下优点：
1.该三维模型实现了肝细胞与内皮细胞的共培养，提供了细胞与细胞之间的相互作用，自组装形成了肝细胞与内皮细胞的三维聚集体，更好地模拟了体内肝细胞生长的微环境。
2.该三维模型中肝细胞的白蛋白表达水平更高，在长时间培养过程中能使肝细胞保持活性和功能。
3.该三维模型中肝细胞的尿素分泌水平更高，在长时间培养过程中能使肝细胞保持活性和功能。
4.该三维模型能较长时间维持肝细胞的活性和功能，培养时间可达两个月，而单层肝细胞培养的肝功能仅能维持三天左右。
本发明利用定性滤纸材料首次在体外构建了能长期培养的三维肝模型，并且能较长时间维持肝细胞结构和功能，更好的模拟了体内肝生理环境。本发明所建立的模型可以用于药物筛选、毒性检测以及疾病研究中，为肝病研究领域的新药开发和筛选提供了重要平台。
附图说明
图1本发明所述三维肝模型的示意图；
其中：1为孔板，2生长培养基，3内皮细胞，4滤纸，5肝细胞，6鼠尾胶原。
图2本发明所述建立三维肝模型流程图；
图3单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型中的电镜扫描和苏木素-伊红染色分析；
图4单层培养模型和单独培养三维肝模型中油红O染色脂质合成和高碘酸-希夫试剂糖原合成定性分析；
图5单层培养模型，单独培养三维肝模型以及共培养三维肝模型中白蛋白表达水平定性分析；
图6单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型在长期培养过程中的形态学观察；
图7两种三维肝模型和两种单层培养肝模型在长期培养过程中白蛋白表达水平的定量分析比较；
图8两种三维肝模型和两种单层培养肝模型在长期培养过程中尿素分泌水平的定量分析比较。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用定性滤纸构建三维肝模型。
如下图1和图2所示，将滤纸用打孔器制成24孔板或96孔板孔大小的圆片，高压灭菌后，用100ug/ml的I型鼠尾胶原包被过夜，之后用PBS洗掉残留的胶原，将HUVEC细胞按0.4X106个/ml细胞密度接种于24孔板中，每孔加入500ul细胞悬浮液，在纸上培养两天后，吸去原来的培养液，按HUVEC/hiHep＝1:1～2的比例接种上hiHep细胞，换hiHep培养基继续培养，从而得到肝细胞功能较好的三维肝模型。之后每隔一天换液并收集细胞培养液用于后续的白蛋白和尿素的检测。
模型的设计按图2分别进行单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型的构建，单独培养三维肝模型的构建只需接种同细胞密度的hiHep细胞。共培养模型的培养基为hiHep细胞用培养基，成分包括DMEM/F12基础培养基、ITS、TGFa、EGF、地塞米松、BSA，以及多种氨基酸成分和无机盐成分。
所述共培养中所用的培养基为hiHep细胞用培养基，基础成分为DMEM/F12(1:1)，再加入占总体积1％的ITS(100X)，终浓度为40ng/ml的TGFa，终浓度为40ng/ml的EGF，终浓度为10mM的地塞米松，终浓度为2g/L的BSA，终浓度为2g/L的半乳糖，终浓度为0.1g/L的鸟氨酸，终浓度为0.3g/L的脯氨酸，终浓度为0.61g/L的烟酰胺、终浓度0.544mg/L氯化锌，终浓度0.75mg/L硫酸锌，终浓度0.2mg/L硫酸铜，终浓度0.025mg/L硫酸锰、以及占总体积1％的penicillin‐streptomycin(100×)。
通过扫描电镜结果和苏木素-伊红染色实验结果(图3)可以看出该体系显示单独培养三维肝模型和共培养三维肝模型在培养第7天和第14天时都能保持良好的细胞三维形态，细胞在滤纸上生长会倾向自组装成三维球状组织，并且细胞活性较好，结果表明滤纸可以作为良好的细胞生长的三维支架材料，生物兼容性较好。单独的内皮细胞在滤纸上会依附于微纤维生长，形成类似血管网络的结构，而肝细胞加入后会迅速贴附于内皮细胞生长，与内皮细胞共同自组装成较大的肝组织聚集体。结果表明，共培养三维肝模型比单独培养三维肝模型具有更好的细胞结构形态。
实施例2
利用该三维肝模型研究肝细胞特异性功能。
三维模型按前述方法建立，培养期间每隔一天换液，从肝细胞接种孵育直到第14天时，肝细胞功能达到较好状态。采用单层肝细胞培养作为对照，检测肝细胞的脂质和糖原合成情况以及白蛋白的表达水平。将培养14天的三维肝模型用温的PBS洗一遍后，加入4％PFA室温固定15分钟，用PBS洗三遍，加入油红O工作液(油红：去离子水＝3:2)，37度染色20分钟左右，脱色，用75％酒精或60％异丙醇漂洗，除去多余的染料，再用PBS漂洗，显微镜观察脂质合成情况。用上述同样的固定方法固定培养14天的三维肝模型，PBS漂洗后加入高碘酸液处理5-10分钟，流水冲洗5分钟，再滴加希夫染液，染色10-15分钟，流水清洗5-10分钟，显微镜观察糖原合成情况。单层培养的肝细胞在第二天用上述同样的方法进行油红O和高碘酸-希夫试剂的染色。结果显示(图4)单层培养的肝细胞和在纸上培养的三维肝组织都能进行脂质和糖原合成，而在三维肝组织中脂质和糖原合成的水平明显增加，说明此模型改善了肝细胞脂质和糖原合成的功能，能更加准确地模拟体内肝细胞的微环境。
将培养14天的三维肝模型以及二维培养肝细胞用温的PBS洗一遍后，加入4％PFA室温固定15分钟，用PBS洗三遍，加入0.2％Triton X-100透化处理10分钟，PBS漂洗三遍，加入5％山羊血清室温封闭1小时，再加入稀释好的一抗羊抗人ALB(1:400)，4度孵育过夜，PBS漂洗，加入羊二抗孵育1小时，PBS漂洗加入DAPI染色五分钟后封片，荧光显微镜观察白蛋白表达情况。结果显示(图5)共培养三维肝模型的白蛋白表达水平比单层培养的肝细胞和单独培养的三维肝模型都高，说明此模型改善了肝细胞白蛋白表达的功能，能更加准确地模拟体内肝细胞的微环境。
实施例3
利用该三维肝模型研究其在体外长期培养过程中的细胞表型和肝功能情况。
同样按照前述方法建立三维肝模型，培养期间每隔一天换液，并分别在第7天、第31天、第60天、第103天观察三维模型中肝组织形态。由于肝细胞本身自发绿色荧光，因此结果(图6)显示细胞在第7天已经形成分散的小的细胞聚集体，第31天时已经有大的微组织形成，呈现出三维形态，这种三维微组织的活性能维持到60天甚至103，而且共培养三维肝模型要比单独培养三维肝模型更稳定，细胞形态维持更好。
同样按照前述方法建立三维肝模型，培养期间每隔一天换液并收集细胞培养上清液，共收集到培养第75天的样品；二维单层培养的肝细胞只收集培养前三天的细胞上清液，所得样品冻存于-80度，用于后续检测整个培养过程中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成的水平。白蛋白用Bethyl Laboratories的人白蛋白ELISA检测试剂盒进行含量测定，检测波长为450nm。结果(图7)表明纸上三维肝模型在整个培养周期中的白蛋白分泌水平要比二维单层培养的肝细胞高，而且共培养三维肝模型比单独培养三维肝模型的白蛋白分泌水平增加。尿素用BioAssay Systems的尿素检测试剂盒进行含量测定，检测波长为430nm。结果(图8)表明纸上三维肝模型在整个培养周期中的尿素合成水平要比二维单层培养的肝细胞高，而且共培养三维肝模型比单独培养三维肝模型的尿素合成水平增加。以上结果证实该三维共培养肝模型能够在体外长期培养，并能维持肝细胞表型和特异性功能。

Claims (12)

1.一种基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：将滤纸置于细胞培养24孔板中，在其上包被一层细胞外基质，然后在其上面先后种上一种内皮细胞和肝细胞，两种细胞共培养一定时间后，得到具有肝特异性功能的三维肝组织，并能进行体外长期培养。
2.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的肝细胞包括人原代肝细胞、肝细胞系或肝癌细胞系所有具有肝细胞结构和特异性功能的肝细胞。
3.按照权利要求2所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述肝细胞为一种由成纤维细胞直接诱导转分化而来的肝细胞hiHep，此细胞系含有稳定转染的大T抗原的EGFP基因，可自发绿色荧光。
4.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述内皮细胞包括肝窦内皮细胞、脐静脉内皮细胞、微血管内皮细胞所有具有血管内皮特征和功能的细胞。
5.按照权利要求4所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞HUVEC。
6.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的细胞外基质包括胶原、基质胶在内的所有天然类及合成类的细胞外基质。
7.按照权利要求6所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述细胞外基质为I型鼠尾胶原。
8.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述的内皮细胞HUVEC和肝细胞hiHep共培养时的接种比例为1:1～2。
9.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的建立，其特征在于：所述共培养中所用的培养基为hiHep细胞用培养基，基础成分为DMEM/F12(1:1)，再加入占总体积1％的ITS(100X)，终浓度为40ng/ml的TGFa，终浓度为40ng/ml的EGF，终浓度为10mM的地塞米松，终浓度为2g/L的BSA，终浓度为2g/L的半乳糖，终浓度为0.1g/L的鸟氨酸，终浓度为0.3g/L的脯氨酸，终浓度为0.61g/L的烟酰胺、终浓度0.544mg/L氯化锌，终浓度0.75mg/L硫酸锌，终浓度0.2mg/L硫酸铜，终浓度0.025mg/L硫酸锰、以及占总体积1％的penicillin‐streptomycin(100×)。
10.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于该模型用于研究肝细胞特异性功能；其操作步骤如下：
(1)以单层培养hiHep肝细胞为对照组，检测三维共培养肝模型的脂质和糖原合成情况；
(2)以单层培养hiHep肝细胞以及纸上三维培养肝细胞为对照组，用免疫荧光方法检测三维共培养肝模型的白蛋白表达水平。
11.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于所述三维肝模型用于研究其在体外长期培养过程中的细胞表型和肝特异性功能，其操作步骤如下：
(1)按照前述方法建立三维共培养肝模型，分别在第7天、第31天、第60天、第103天进行三维肝模型的形态学表征；
(2)按照前述方法建立三维共培养肝模型，定期收集细胞培养上清液，共收集培养到第75天的样品，并收集二维单层肝细胞培养前三天的上清液样品作为对照组，用于定量检测整个培养过程中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成水平。
12.按照权利要求1所述基于定性滤纸的三维肝模型的应用，其特征在于所述三维肝模型可用于研究用于人体的临床口服药物的肝毒性评价及新药开发。
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