KR101119878B1 - 프리미티브 간 줄기세포 및 프록시멀 간 줄기세포 - Google Patents
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Abstract
간 프로제니터(progenitor, 전구세포)는 사람 간 줄기세포의 2개의 집단(프리미티브 줄기세포 및 프록시멀 간 줄기세포), 및 관련 프로제니터의 2개의 집단(하나는 담관세포에 대한 것 및 하나는 간 실질세포에 대한 것)을 포함한다. 사람 프리미티브 간 줄기세포는 간장(肝臟) 세포 집단의 매우 작은 획분이며, 간장의 매우 큰 획분을 구성하는 프록시멀 간 줄기세포를 만들어낸다. 사람 프록시멀 간 줄기세포는 담관 관련 프로제니터 및 간실질 세포 관련 프로제니터를 만들어낸다. 프리미티브 줄기세포 및 프록시멀 줄기세포는 사람 간장을 위한 주요한 줄기세포이다. 사람 프리미티브 간 줄기세포는 사람 간장으로부터 면역선택에 의해, 또는 사람 프리미티브 간 줄기세포를 선택하는 조건하에서 사람 간장세포를 배양함으로서 분리될 수 있다. 프록시멀 간 줄기세포는 면역선택에 의해, 또는 발생 인자를 포함하는 조건하에서 사람 간장세포를 배양함으로서 분리될 수 있다. 또한, 프록시멀 간 줄기세포는 프리미티브 간 줄기세포를 포함하는 콜로니를, 발생 인자를 포함하는 조건하에서 배양함으로서 분리될 수 있다. 얻어진 조성물은 간장해를 치료하기 위해, 그리고 생체 인공기관을 만들기 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 성숙 간세포를 발생시키는 다기능 세포인 사람 간 줄기세포에 관한 것이다. 이들은 2개의 줄기세포 집단을 포함한다: 즉, 프록시멀 간 줄기세포를 생성하는 극히 프리미티브(始原的)한 프로제니터(前驅細胞)인 도관판 줄기세포(ductal plate stem cell), 헤파토사이트(肝實質細胞) 및 담관세포를 생성하는 프록시멀 줄기세포. 또한, 본 발명은 사람의 간 도관판 줄기세포를 분리하는 방법, 그리고 프록시멀 간 줄기세포 및 헤파토사이트 관련(committed) 프로제니터 및 담관 프로제니터를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포를 포함하는 조성물은 세포치료 및 유전자 치료를 위해, 그리고 생체 인공기관의 확립을 위해 사용될 수 있다.
1. 사람 간장의 해부학
성숙 간의 주요 구조적 및 기능적 단위는 선방(腺房, acinus)이며, 이것은 횡단면에 2개의 별개의 혈관 베드의 주위에 차 바퀴 모양으로 조직화되어 있는, 즉, 말초에 3-7 세트의 문맥3관(각각이 문맥세정맥, 간세동맥 및 담관을 가짐)이 있으며, 중앙부에 중심정맥을 갖는다. 간세포는 유창(fenestrated) 내피의 양측에 나란히 하는 세포판으로서 조직화되고, 이것은 문맥 및 중심 맥관계와 연속하는 일련의 간 동양모세혈관(洞樣毛細血管, sinusoids)을 규정한다. 최근 데이터에 의해 헤링관(Canals of Hering, 각각 문맥3관의 주위에 위치하는 가는 관)이 보틀 부러쉬(bottle brush)와 유사한 패턴을 형성하는 존 1(zone 1)의 전체에 걸쳐 신장된 간 플레이트(liver plate)에 접합하는 소관(小管)을 생성하는 것이 나타났다(Theise, N. 1999 Hepatology. 30: 1425-1433).
좁은 공간인 디세 공간(Space of Disse)은 간 동양모세혈관을 따라 헤파토사이트로부터 내피를 분리한다. 상기 조직화의 결과, 간실질세포는, 각각이 간 동양모세혈관과 마주하는 2개의 기층 도메인(basal domain) 및 인접하는 간실질세포 사이의 접촉영역에 의해 규정되는 선단 도메인(apical domain)을 갖는다. 기층 도메인은 혈액과 접촉하고, 혈장 성분의 흡수 및 분비에 관여하는 것에 대하여, 선단 도메인은 담즙산염의 분비에 특화된 미세 담도관(bile canaliculi)를 형성하며, 상호연결 네트워크를 통해 담관과 연계한다. 혈액은 문맥세정맥과 간세동맥으로부터 간 동양모세혈관을 통해 말단의 간세정맥 및 중심정맥으로 흐른다.
상기 미소 순환 패턴에 기초하여, 선방은 3개의 존으로 나뉜다: 즉, 존 1, 문맥주위 영역: 존 2, 선방중앙 영역; 및 존 3, 중심주위 영역. 증식 능력, 형태학적 기준, (염색체의) 배수성(倍數性) 및 대부분의 간장 특이적 유전자는 존의 위치와 상호 관련한다(Gebhardt, R., et al. 1998. FEBS Lett. 241: 89-93; Gumucio, J.J.1989, Vol. 19. Springer International, Madrid; Traber, P. et al. 1988. Gastroenterology. 95:1130-43). 선방을 가로질러 산소를 함유하는 혈액 성분의 농도 구배와 계속 문맥3관로부터 중심정맥으로의 혈류방향은 이 존화(zonation)의 일부 원인이다(예를 들면, 당분해 및 당 신생(gluconeogenesis)의 상호구획화). 그러나, 2 가지만 예를 들면, 틈새 이음(gap junction) 단백질 코넥신 26의 문맥주위 영역 존으로의 존재 및 글루타민 합성효소의 중심주위 영역 존에의 존재는, 이와 같은 구배에 감수성이 없고, 대부분의 조직-특이적 유전자에 의해 대표되는 것이며, 세포 또는 미세 환경에서의 혈류이외의의 변수에 고유의 인자에 의해 결정되는 것 같다.
헤파토사이트 이외에, 담관의 상피세포(cholangiocytes, 담관세포) 및 문맥관 및 중앙 관(tract) 사이의 영역인 내피세포는 Ito 세포 및 Kupffer 세포와 같은 다른 세포 형태를 포함한다. 이들은 간장의 병원성 상태, 특히 염증 및 섬유화에 현저한 역할을 하지만, 정상적인 기관의 주요한 항상성 기능에 대하여 직접적인 기여는 명백히 작다.
2. 사람 간의 발생
간장은 후부전장(後部前腸) 및 횡중격(橫中隔, 내장간엽(內臟間葉)의 일부)으로부터 형성된 곁주머니(diverticulum)의 집합의 결과로서 발생한다. 간세포 형성은 내배엽성의 상피가 심장성 간엽과, 아마도 섬유아세포 성장 인자를 통해 상호작용한 후 개시한다. 그런 다음, 특정 간장 세포가 증식하고, 코드가 같은 방식으로 횡중격의 간엽으로 침투하여 간장의 원기(anlage)를 형성한다. 직접적인 상피-간엽 상호작용은 이들 초기의 간장의 발생단계에 있어서 결정적이며, 헤파토사이트 또는 담관세포(cholangiocytes) 및 유창 내피로 되는 세포를 각각 지시한다. 간엽-특이적 유전자 hlx 및 jumonji의 변이는 간 발생을 차단하며, 이것은 상기 조직의 기여의 중요성을 나타낸다. 그 발생의 초기에 있어서, 간장은 기층막을 결실한 연속적인 내피에 접하는 프록시멀 간 줄기세포 덩어리 및 풍부한 조혈세포로 구성된다. 내피가 불연속적인 유창내피가 되도록 변형함에 따라, 혈관계(특히, 문맥의 맥관계)는 기층막의 생성과 수반하여 발달한다. 문맥 사이질(interstitium)은 담관의 발생을 위한 계기를 제공할 수 있고, 그것이 문맥세정맥, 간세동맥 및 담관을 둘러쌀 때, 문맥3관이 형성된다. 프록시멀 간 줄기세포는 빠르게 증식하여 아마도 C-CAM 105, Agp110, E-cadherin 및 코넥신 등의 조직을 조직화하는 분자의 양 및 분포의 변화에 응답하여, 대부분, 그러나 모두는 아닌, 조혈세포의 골수로의 재배치와 동시에, 실질 플레이트(parenchymal plates)가 형성된다. 최근 연구에 의해 몇 개인가의 조혈 프로제니터가 성체 정지상태 설치류 간장(adult quiescent rodent liver)에 존속하는 것, 및 조혈 줄기세포가 성체 사람 및 마우스 간장으로부터 분리된 것이 시사되고 있다(Crosbie, O.M. et al. 1999. Hepatology. 29:1193-8).
랫 간장은 배아의 생명중에서 약 10일째에 형성되며, 이것은 "배아10일째" 또는 E10이라 불린다. 이것은 배야의 중장(midgut)에 위치하고 있는 내배엽에 의한 심장 간엽의 함입(陷入)에 의한 것이다(Zaret, K. 1998, Current Opinion in Genetics ＆ Development. 8:526-31). 배아에 있어서의 간세포의 가장 초기의 인식은 알파-태아단백(AFP)을 코드화하는 mRNA에 대한 인 시튜 하이브리다이제이션 연구를 이용하여 달성되었다(Zaret, K. 1998. Current Opinion in Genetics ＆ Development. 8:526-31; Zaret, K. 1999 Developmental Biology(Orlando). 209:1-10). AFP-발현 세포는 앗세이된 모든 랫 및 마우스 간장에서 9-10일령에서 심장을 형성하는 간엽 근방의 배아 중장 영역에서 관찰된다. 간장은 E12까지 육안으로 볼 수 있게 되고, E13까지 직경 약 1 mm로 된다.
병행하여 조혈이 일어나, 최초로 동정 가능한 조혈세포는 설치류에서 E15-E16까지에, 사람에서는 3개월에서 4개월까지에 출현하고, 적혈구 생성(적혈구계 세포 또는 적혈구의 형성)의 피크에서 설치류에서는 E18까지에, 사람에서는 5-6개월째까지 일어난다. 적혈구 형성 피크에 있어서, 간장에서 이들 적혈구의 수가 지배적이며, 간장에서의 세포수의 70%를 넘는 수를 점한다. 임신기간의 말기는 설치류는 21일이고, 사람은 9개월이다. 태어나서 수 시간이내에 조혈세포의 수는 극적으로 저하하고, 설치류에서는 출생 2일까지에, 사람에서는 1주간 또는 2주간 이내에, 조혈세포의 대부분이 골수로 이동하여 소실된다. 조혈세포의 이동의 원인은 누구도 알지 못한다. 그러나, 2가지 유력한 가설이 존재한다.
첫째, 조혈 프로제니터가 비교적 혐기적 조건을 선호해서 그들 대부분은 폐의 활성화에 수반하는 간장에서의 산소 레벨의 상승에 의해 골수(이것은 비교적 혐기성이다)로 이동한다. 또한 임신 호르몬의 손실이 이동 인자일 수 있다는 가설이 있다. 출생 후에, 간장에서의 조혈 프로제니터의 손실은 간 프로제니터 수의 현저한 감소, 그리고 간실질세포 및 담관세포의 수 및 성숙도에 병행한 증가와 상관한다. 간장의 충분한 성숙은 출생후 2-3주간(설치류) 및 수개월(사람)이내에 완료된다. 그때까지, 잔존하는 간 프로제니터 세포는 헤링관의 영역에 국재화하고, 그들 대부분은 각 간 선방 주위의 문맥3관에 존재한다(Thiese et al, Crawford et al.).
그 후에, 간 선방의 고전적인 구조는 6세트의 문맥3관(각각이 담관, 간동맥 및 간정맥을 가지며, 중심에 대정맥에 접속하는 중심정맥을 가진다)에 의해 주위가 규정된 각 선방에 의해 확립된다. 간세포의 플레이트는 차 바퀴의 스포크와 같이, 말초에서 중심으로 연장되어 있다. 관례상, 플레이트는 3개의 존으로 나뉘어 있다: 즉, 존 1은 문맥3관 부근; 존 2는 선방 중앙; 및 존 3은 중심동맥 부근이다. 간장의 2배체 세포만이 존 1에 존재한다; 4배체 세포는 존 2에 존재한다; 그리고 4배체, 8배체 및 다핵성 세포가 존 3에 존재한다. 이 패턴은 아포토시스 프로세스에서 종결하는 성숙계열을 강하게 시사하고 있다(Sigal, S. H. S. et al. 1995. Differentiation, 59: 35-42).
3. 간장 질환
미국에서는, 매년 약 250,000명이 간부전으로 병원치료를 받는다. 간이식은 어떤 형태의 간부전에 치료효과가 있고, 미국에서는 1년에 대략 4100건의 이식이 행하여지고 있다. 간이식에서의 하나의 한정 요인은, 특히 장기 이식을 위한 기증자 간장은 심장정지가 아닌 뇌사를 거친 환자에 유래하지 않으면 안된다는 제약을 고려하면, 기증자 간장의 이용가능성이다. 최근 사체 기증자의 간을 이용하려는 노력에 의해, 간장이 사후 1시간 이내에 입수되는 경우 그들을 사용할 가능성이 있음이 지지되고 있으나, 이와 같은 기증자로부터의 간장에서는 성공하지 못하였다.
간장으로의 세포 이식은 대부분의 간장질환에 흥미로운 대체 요법이다. 세포이식을 위한 외과수순은 장기 전체의 이식을 위해 필요로 되는 것과 비교하여 적고, 따라서 각종 외과적 리스크(예를 들면, 연령 또는 허약 제질)를 가진 환자에게 사용될 수 있다. 사람 간장 세포의 사용은 다른 포유동물에 유래하는 간세포보다 우월하다. 왜냐하면, 잠재적인 병원체는(만일 있다면), 사람 기원이고, 환자에 의해 보다 양호한 내성을 가질 수 있으며, 따라서 사용하기 전에 쉽게 스크리닝할 수 있기 때문이다.
간세포이식을 수행하려는 시도는 분획되지 않은 성숙 간세포를 이용하여 몇 가지 효력의 척도를 보여주었다(Fox, I. J. et al. 1998. New England Journal of Medicine. 338: 1422-1426). 그러나, 이들 세포가 생체 내(in vivo)에서 증식하지 않기 때문에, 성공하려면 다수의 세포(2×1010)의 주사를 필요로 한다. 또한, 상당수의 커다란 성숙 간세포(세포의 평균 직경 30-50㎛)을 도입하기 위하여는, 주사시에 커다란 응집물을 형성하는 경향에 의해 복잡하게 되어, 치명적인 색전을 일으킨다. 더욱이, 이들 세포는 현저한 면역학적 거절반응을 유발하여, 환자는 나머지 생활을 면역억제제로 계속 의존하지 않으면 안된다. 마지막으로, 성숙 간세포는 성공적인 냉동보존이 안되고, 적절한 간장조직의 이용가능성, 세포 현택액의 조제 및 임상 치료를 위한 세포의 신속한 배달을 조정하기 위해서 복잡한 물류관리가 필요하다.
4. 분화전능성(分化全能性)의 줄기세포
줄기세포는 간장 질환을 위한 대체적(代替的)인 세포에 기초로 한 치료이다. 분화전능성의 줄기세포는 자기 복제 가능한 프리미티브 세포(primitive cell)이고, 다능성이다(즉, 1개 이상의 발생운명을 갖는 딸세포를 생산한다). 이것은 광범위하게 확장할 수 있고, 1개 또는 복수의 조직을 재구축할 수 있는 결정된 줄기세포(determined stem cells)를 발생시킬 수 있다. 줄기세포에 관한 대부분은 배아에 관한 문헌으로부터, 또는 조혈조직, 표피조직 또는 장 조직에 관한 문헌의 어느 하나에서 파생한다.
더욱 최근에는, 특정 부류의 줄기세포를 인정하기 위해서 정의가 수정되었다. 생식세포를 포함한 모든 세포의 발생에 관여하는 능력을 가진 줄기세포는 분화전능성의 줄기세포라 불리고, 접합체 및 8세포 단계(morula, 桑實胚芽)까지의 정상적인 배아 세포를 포함한다. "ES" 세포라고도 불리는 배아 줄기세포는 배반포(胚盤胞, blastocyst)에서의 분화전능성의 정상 세포에서 파생한 영속적인 세포집단으로 이루어지며, 이것은 1980년대 초에 최초로 보고되었다. ES 세포주는 분화전능성을 유지하며, 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있다. ES 세포를 정상적인 배반포에 주입했을 때, 그들은 배아 발생을 재개하고, 정상적이지만 키메라 마우스의 형성에 관여할 수 있다. ES 세포주의 여러 종(마우스, 랫, 돼지 등)으로부터 수립되었지만, 마우스계만이 배양물로부터 변형된 ES 세포를 배반포에 합체시키고, 이어서 그의 배반포를 가임신된 숙주에 이식함으로써 신규한 표현형(놋아웃, 트랜스제닉)을 갖는 동물을 생성하는 데 일상적으로 사용되고 있다. 배아 생식(EG)세포주(ES세포의 여러 특징을 나타냄)는 프리미티브 생식 세포집단으로부터 시험관내(in vitoro)에서 직접 분리될 수 있다. ES 세포와 함께이, 배반포에 주사된 경우 EG 세포는 생식 세포를 포함하는 키메라에 기여했다.
최근에, 널리 공지된 실험에 의해 사람 ES 세포 배양이 사람 배아에서 수립될 수 있다고 보고되었다. 이들 사람 ES 세포는 손상된 기관과 조직을 재건축할 수 있을 것을 기대하여 조직에 주입될 수 있는 것이 시사되고 있다. 그러나, ES 세포 및 EG 세포는 자궁 내 이외의 어떠한 부위에서도 면역 부방비 상태의 숙주로 도입된 경우에는 종양 형성성이며, 기형암종(teratocarcinomas)을 형성한다. 그 때문에, 사람 ES 세포를 환자에 접종하는 계획은 비현실적이며, 환자에게 종양을 일으키는 가능성이 크다. 상기 난점을 극복하기 위해서, 몇 개인가의 그룹이 한정된 미세 환경 조건에서 결정된 줄기세포로 되며, 이어서 그 줄기 베포를 환자에게 안전하게 접종할 수 있도록 한 ES 세포를 분화시키는 계획을 추구하고 있다. 예를 들면, 조혈 프로제니터 생성에 있어서 다소 성공을 거두고 있다. 그러나 배양물이 환자에게 접종되는 경우, 배양물 중에 잔존하는 ES 세포가 종양형성의 위험성을 내포할 수 있는 근심거리가 남아있다. 즉, 발생 생물학의 연구가 배아 형성의 사이에 세포의 운명을 결정지우는 무수 컨트롤(myriad control)을 밝힐 때까지는, ES 세포는 세포치료 또는 유전자 치료의 임상 프로그램을 위한 희망이 거의 없이 실험 도구로 남게 될 것이다. 세포치료 및 유전자 치료에서의 임상 프로그램을 위한 유일한 현실적 선택은 유전적 잠재능력이 제한된 수의 세포형으로 제한되는 결정된 줄기세포(determined stem cell)를 사용하는 것이다.
5. 결정된 줄기세포(Determined stem cell)
정해진 줄기세포는 그들의 유전적 잠재능력을 한정된 수의 세포형에 대해서의 그것에 제한되며, 또한 광범위한 증식 잠재능력을 갖는 다능성 세포이다. 텔로머라아제 분야에서 나온 증거와 같이, 증가하고 있는 증거에 의해 결정된 줄기세포는 엄밀한 의미에서 자기복제하지 않는, 즉, 그들 자손은 부모보다 낮은 성장 잠재능력을 가질 수 있는 것이 시사되어 있다. 결정된 줄기세포는 그들의 유전적 잠재능력을 단일 운명(예를 들면, 헤파토사이트, 이 세포의 관련지워진 프로제니터(committed progenitor)가 헤파토사이트 관련 프로제니터라 불린다)에 제한함으로써 다기능성을 잃은 딸세포인, 관련지워진 프로제니터를 발생시킨다. 간 세포계열에는, 헤파토사이트 관련 프로제니터(헤파토사이트를 발생시키는) 및 관련 담관 프로제니터(담관을 발생시키는)가 있다.
줄기세포로부터 성체세포로의 이행은 단계적인 프로세스에서 일어나며, 세포 크기, 형태학, 성장 잠재능력 및 유전자 발현이 그의 계열에 속박되는 성숙계열을 산생한다. 에이징(aging)에서 예로 드는 것이 이 프로세스를 규정할 때에는 유용하다. "젊은" 세포는 초기 유전자 발현 및 가장 큰 성장 잠재능력을 갖는다; 계열 중에서, 후의 세포는 "늦은" 유전자 발현을 가지며, 통상 그들의 성장은 제한되거나 또는 전혀 성장하지 않는다. 후기 세포는 "늙은" 또는 생물학적 용어인 아포토시스성(apoptotic)으로 간주될 수 있으며, 최종적으로 제거된다. 성숙계열 프로세스는 조직의 천연 대사회전을 일으키고, 상해(傷害) 후의 재생을 허용한다. 조직은 성숙 프로세스의 반응속도론이 다르다. 장의 성숙계열은 일주일 미만에서 생기는 완전한 사이클을 가지는, 상당히 빠르다; 간의 성숙계열은 천천히 발생하고, 랫 간에서는 약 1년이다.
미성숙 프로제니터 집단은, 간장질환을 처치할 때에 강한 영향력을 갖고 있기 때문에, 간장으로부터 이와 같은 세포를 분리 및 동정하는 데 강한 임상적 및 상업적인 관심이 존재한다. 세포치료 및 유전자 치료에서의 간 프로제니터의 사용은 상기 성숙 간세포 사용에 부수하는 결점의 많은 것을 극복할 수 있다. 이들 세포는 작고(7-15㎛), 커다란 색전의 형성을 최소화한다. 또한, 이들 세포는 광범위한 성장 잠재능력을 가지며, 이들은 더 적은 세포가 환자에 있어서 간장 조직의 재구성에 필요로 됨을 의미한다. 결국, 이 프로제니터는 면역학적 거절을 유발할 수 있는 최소한의 항원성 표지(marker)를 가지며, 면역억제제가 거의 또는 전혀 필요로 하지 않을지도 모르는 희망을 제공한다.
6. 간 프로제니터 분리
간장에서 간 프로제니터 분리는 간세포를 양성 선택하는 표지의 부족이 원인이며, 매우 어려운 작업이라고 알려져 있다. 간 프로제니터의 후보를 위한 유일한 이용 가능한 항체는 간 프로제니터의 아집단(subpopulation)(종양 형성성 상해에 노출된 숙주에서 분리된 경우, 오벌 세포(oval cell)라고 불림)에 대하여 조제되는 단일클론 항체이다. 그러나, 이들 항체는 조혈 세포에 존재하는 항원과 교차반응한다.
오벌 세포라는 용어는 발암(carcinogenesis) 및 종양형성(oncogenesis) 분야의 무수한 연구에서 유래된다. 발암물질 또는 종양형성성 상해에 노출된 동물은 성숙 간세포의 극적인 손실을 받고(여러 손상에 의해 사망), 그리고 2차적으로 타원형의 핵을 가지며, 또한 간장 항원과 조혈항원의 양방을 함유하는 표지를 가진 작은 세포(직경 7-15㎛)가 늘어난다(Grisham and Thorgeirrson, 1998). 오벌 세포에 대한 연구는, 이들이 종양형성성 상해의 조건하에서 확장이 유도되며, 적적한 조건에서는 종양 세포로 되도록 진행할 수 있는 간 프로제니터라는 가설을 이끌었다. 오벌 세포의 표현형은 종양형성성 상해에 의존하여 미소하게 그리고 명백하게 다르다.
또한, 그들은 특별한 지지세포(feeder) 또는 배지 조건 없이 배양에서 용이하게 배지중에 확립되는 것이 알려져 있다(J. Grisham and S. Thorgeirrson, 1998, Hepatic Stem Cell, In: Stem Cells, C Potten, editor, Academic Press, NY). 이 발견에 기초로 하여, 그리고 종양형성처리에 유래하는 세포주의 어떤 것인가를 특징지우는 연구에 기초하여, 간 종양은 악성 형질 전환된 프로제니터인 것, 그리고 오벌 세포가 부분적 또는 완전히 형질 전환된 프로제니터임을 알게 되었다(Zvibel Ⅰ, Fiorino A, Brill S, and Reid LM. Phenotypic characterization of rat hepatoma cell lines and lineage-specific regulation of gene expression by differentiation agents, Differentiation 63: 215-223, 1999).
간장의 세포치료 및 유전자 치료를 위한 가장 다용도인 세포집단인 것으로 시사되고 있는 간 프로제니터 세포집단을 얻기 위한 시도가 과거에 이루어졌다. 미국 특허등록 제 5,576,207 및 동제 5,789,246(Reid et al)은 세포표면 표지 및 사이드 스케터 플로 사이토메트리(side scatter flow cytometry)를 이용하여 간장 중의 규정된 아집단을 제공하고 있다. 랫 간 세포의 아집단은 계통 관련 세포의 제거, 이어서 OC.3-양성(오벌 세포 항원 표지), AFP-양성, 알부민-양성 및 CK 19-음성인(사이토케라틴 19) 세포 표지를 가지는 무과립 세포로서 검출된 미성숙 간장 전구 세포의 선택에 의해 분리해냈다. 상기의 랫 간장 아집단은 설치류 간장에서 풍부한 간 프로제니터를 분리 및 동정에 있어서 중요한 특정의 특성을 실증한다.
따라서, 간장질환 또는 간기능부전을 갖는 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있는 사람의 간 프로제니터를 분리해내는 방법의 개발이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고, 또한 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 프록시멀 간 줄기세포, 헤파토사이트의 프로제니터 또는 담관의 프로제니터의 전구체인 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 사람의 프리미티브 간 줄기세포는 Ep-CAM, AC133 및 알부민을 발현한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 헤파토사이트 또는 담관 프로제니터에 대한 전구체인 사람의 프록시멀 간 줄기세포를 함유하는 조성물이다. 본 발명의 사람의 프록시멀 간 줄기세포는 알파-태아단백, 알부민 및 사이토케라틴 19를 발현한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 Ep-CAM 및 AC133을 발현하는 세포를 동정하는 공정을 포함하는 사람의 간 프로제니터를 분리하는 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 사람의 간 프로제니터는, 바람직하게는 알부민을 발현한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분리된 사람의 간 프로제니터는 줄기세포이고, 바람직하게는 프리미티브 간 줄기세포 및 프록시멀 간 줄기세포이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 분리해내는 방법으로, 이 방법은 탄수화물 대사의 조절인자, 철 담체 및 막 생산 인자를 함유하는 무혈청 배지에서 간 줄기세포를 선택하는 조건하에서, 표면상에 사람의 간 조직에서 유래된 세포 혼합물을 배양하고, 그것에 의해 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 포함하는 콜로니를 형성시키는 공정을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분리된 사람의 프리미티브 간 줄기세포는 Ep-CAM, AC133 및 알부민을 발현하고, 바람직하게는 또한 사이토케라틴 8/18 및 사이토케라틴 19를 발현한다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 사람의 프록시멀 간 줄기세포를 분리하기 위한 방법으로, 이 방법은 탄수화물 대사의 조절인자, 철 담체 및 막 생산 인자를 함유하는 무혈청 배지에서 간 줄기세포를 선택하는 조건하에서, 표면상에 사람의 간 조직에서 유래된 세포 혼합물을 배양하고, 그것으로 인해 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 포함하는 콜로니를 형성시키는 공정, 그리고 발생인자(development factor)를 이용하여 콜로니로부터 세포를 배양하는 공정을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분리된 사람의 프록시멀 간 줄기세포는 알파-태아단백, 알부민 및 사이토케라틴 19를 발현한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 발생 인자는 2차적 세포, 바람직하게는 지지세포, 바람직하게는 STO 지지세포, 내피세포 또는 기질 세포(stromal cell)에 의해 공급된다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 사람의 프록시멀 간 줄기세포를 분리하기 위한 방법으로, 이 방법은 탄수화물 대사의 조절인자, 철 담체 및 막 생산 인자를 함유하는 무혈청 배지에서 간 줄기세포를 선택하는 조건하에서 사람의 간 조직에서 유래된 세포 혼합물을 배양하고, 이로 인해 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 포함하는 콜로니를 형성시키는 공정, 그리고 발생인자를 이용하여 콜로니로부터 세포를 배양하는 공정을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 분리된 사람의 프록시멀 간 줄기세포는 알파-태아단백, 알부민 및 사이토케라틴 19를 발현한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 발생인자는 2차적 세포, 바람직하게는 지지세포, 바람직하게는 STO 지지세포, 내피세포 또는 기질 세포에 의해 공급된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 분리된 프리미티브 간 줄기세포이다. 게다가 본 발명의 또 다른 실시예는 분리된 사람의 프록시멀 간 줄기세포이다.
도 1은 플라스틱 배양 1일째(윗 도면) 및 5일째(아랫 도면)에 풍부한 태아 실질세포(parenchymal cells)로부터 플라스틱 배양상의 콜로니 형성을 나타낸다.
도 2는 5일부터 14일까지의 플라스틱 배양상의 콜로니 형성을 나타낸다.
도 3은 플라스틱 배양상의 콜로니 거동을 나타낸다.
도 4는 알부민(1 열), CK(2 열), ep-CAM(3 열) 및 NCAM(4 열)에 대하여 플라스틱상에서의 콜로니 세포의 염색을 나타낸다.
도 5는 CD146 및 CD133(위), 및 AC133(아래)에 대하여, 플라스틱에서 배양된 콜로니의 염색을 나타낸다.
도 6은 프록시멀 줄기세포의 1차 배양 7일 후에 알부민(1 열), 알파-태아단백(2 열), 및 CK19(3 열)에 대하여 STO 지지세포층상의 염색을 나타낸다.
도 7은 플라스틱 배양에서 제거하여 STO 세포 지지세포층으로 평판배양된 콜로니 세포의 발생을 나타낸다.
도 8-11은 STO 지지세포층상의 콜로니로부터의 세포 발생을 나타낸다.
도 12 및 13은 사람의 간세포중에서 AFP를 발현하는 세포의 풍부함을 나타낸다.
도 14-18은 알부민, CD133 및 Ep-CAM을 동시 발현하는 성체 간세포의 아집단의 분리를 나타낸다.
도 19는 3 주 동안 플라스틱상에서 배양된 3개의 간장으로부터의 9개의 줄기세포 콜로니의 증식곡선을 나타낸다. 증식 측정은 배양 12일 후에 시작하였다. 곡선은 세포가 5.2일의 배가(倍加) 시간으로 증식함을 나타낸다.
도 20은 새롭게 분리된 태아 간 세포에서의, 그리고 플라스틱 기층상에서 후속 배양 동안의, 알부민(ALB, 위 그룹) 및 알파-태아단백(AFP, 아래 그룹) 발현의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
왼편의 그룹에 있어서, 2개의 세포 획분(P 및 I)이 피콜(Ficoll)을 통한 원심분리에 기초하여 나타난다. 피콜 중에 펠렛(pellet)화하는 세포를 P로 명명하고, 수용성 매체와 피콜사이의 계면에 층을 이룬 세포를 I로 명명한다. 단일의 중앙 블롯은 3주 동안 플라스틱상에서 배양된 정제된 콜로니 세포(프리머티브 간 줄기세포)에서의 알부민과 AFP 발현을 나타낸다. 오른쪽의 패널은 콘트롤 레인을 나타내고, 여기서 단밸질을 포함하지 않거나(블랭크), 알부민(ALB) 또는 알파 태아단백(AFP) 표준의 어느 하나가 존재한다. 10㎍의 단백질이 각 레인에 로딩된다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
1. 정의
하기 설명에서, 본 발명을 설명하기 위해서 수많은 용어가 광범위하게 사용된다. 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 돕기 위해서, 상기 용어에 주어진 범위를 포함하여 정의를 하기 서술하였다.
CD: 여기에 사용된 "분화 클러스터(cluster of differentiation)" 또는 "일반적 결정기(common determinant)"는 단일클론 항체에 의해 인식되는 세포 표면 분자를 말한다. 몇개인가의 CD의 발현은 특정 계열 또는 성숙 경로의 세포에 특이적이고, 다른 CD의 발현은 동일 세포의 활성화, 위치 또는 분화의 상태에 따라 변화한다.
세포치료: 여기에 사용된 "세포치료"는 자가 또는 동종이형의 물질로 사용되고, 또한 환자의 특정 타겟 세포로 또는 부근에 이식되는 규정된 세포집단의 생체 내 또는 생체 외로 이동하는 것을 말한다. 세포는 임의의 적절한 배지, 캐리어 및 희석액 중에서 또는 임의의 약물 전달 시스템(마이크로캐리어, 비드(beads), 미세소체, 미세구, 베시클(vesicle) 등을 포함) 중에서, 이식되어 얻어진다. 이들은 결정적 기능을 제공하는 바이오리액터내에서, 및 간기능장해를 가진 환자를 위한 보조 장치로 사용되는 바이오리액터에서도 사용될 수 있다.
관련(committed) 프로제니터 : 오직 한 번의 운명을 지닌 딸세포를 발생시키는 고도 증식성 세포. "담관 관련 프로제니터"는 답즙관을 발생시키고, 사이토케라틴 19의 발현에 의해 항원으로 인식될 수 있으나, AFB의 발현에 의해서는 인식될 수 없다. "헤파토사이토의 관련 프로제니터"는 헤파토사이트를 발생시키고, AFP 및 알부민의 발현에 의해 항원으로 인식될 수 있으나, 사이토케라틴 19의 발현에 의해서는 될 수 없다. 관련지워진 프로세스는 분자 수준에서 이해될 수 없고, 오히려 세포의 운명이 선조(predecessor) 세포의 것에 의해 좁혀질 때 일어나는 것으로서 경험적으로만 인지된다.
유전자 치료: 여기에 사용된 "유전자 치료"란 용어는 환자의 특정 타겟 세포로 규정된 유전적 물질의 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)로 이동하는 것을 말하며, 이로 인해 유전자형이 바뀌고, 대부분의 상황에 있어서 특정 질환 상태를 예방 또는 변화시키는 최종적 목적을 위하여 타겟 세포의 표현형을 변형시킨다. 이는 타겟 세포를 생체 밖에서 수식시키는 것 및 환자에게 세포를 도입하는 것을 포함한다. 대안으로, 벡터는 외인성 유전 물질을 운반하여 선조세포로 트랜스펙션하기 위해서 벡터가 생체 내에서의 간 프로제니터 세포로 타겟화할 수 있다. 또한, 유전자 조작한 프로제니터 세포는 환자를 위한 치료로서, 또는 생물학적 생산물의 공급원으로 바이로리액터내에서 사용될 수 있다. 상기 정의가 언급하는 바와 같이, 내재하고 있는 전제는 이들 치료적 유전적 절차는 궁극적으로 나타나거나 잠재성의 병리학적인 상태를 예방, 치료 또는 변화시키기 위해 설계된다고 할 수 있다. 대부분의 경우에, 유전자 치료 절차의 궁극적 치료목적은 특정 타겟 세포집단의 표현형을 바꾸는 것이다.
간 세포(hepatic cells): 헤파토사이트 및 담관세포를 포함하는 간장세포의 아집단.
간 프로제니터(hepatic progenitors): 줄기세포의 아집단으로, 이들 세포는 궁극적으로 헤파토사이트 및 담관세포를 포함하는 성숙 실질세포(parenchymal cells)를 발생시킨다. 간 프로제니터는 다음의 2가지 아집단을 포함한다: (a) 간 줄기세포 및 (b) 관련 프로제니터.
간 줄기세포(hepatic stem cells) : "프리미티브 간 줄기세포" 및 "프록시멀 간 줄기세포"를 포함하는 간 프로제니터의 아집단.
전구체(precursor): 여기에서 사용된 "전구체"는 제2의 세포형을 발생시키는 제1 세포형을 말한다. 전구체는 제2 세포형을 직접적으로 발생시킬 수 있다. 전구체는 또한 1 또는 그 이상의 다른 중간 세포형을 거쳐 제2 세포형을 발생시킬 수 있다.
프리미티브 간 줄기세포(primitive hepatic stem cells): 프록시멀 간 줄기세포를 발생시키는 간 줄기세포를 의미한다.
프록시멀 간 줄기세포(proximal hepatic stem cells): 헤파토사이트 및 담관 상피 세포를 발생시키는 간 줄기세포를 나타낸다.
간장 세포(liver cells): "간장 세포"란 그들의 기원이나 세포운명에 상관없이 정상 간장에 존재하는 모든 형태의 세포를 말한다.
줄기세포(stem cells): "줄기세포"란 한 번 이상의 운명을 지닌(즉, 다기능이다) 딸세포를 발생시킬 수 있는 증식성이 높은 세포를 말한다. 전능 줄기세포(예를 들면,배아 줄기세포(ES 세포) 또는 포유동물 배아의 8세포 단계까지의 배아 세포)는 자기복제(자기유지) 능력을 가지며, 줄기세포는 그 자체와 동일한 딸세포를 생산한다.
이와 대조적으로, 결정된 줄기세포(예를 들면, 조혈성 줄기세포, 신경세포성 줄기세포, 피부성 줄기세포 또는 간 줄기세포)는 다기능성이며, 광범위한 증식능력(growth capacity)을 가지고 있지만, 자기복제능력을 갖는 것에 대해서는 의문점이다. 전능 줄기세포의 경우에는, 몇개인가의 딸세포는 모세포와 동일하고, 몇개인가는 특정의 운명에 관려하고, 그들의 유전적 잠재능력(genetic potential)을 모세포보다 더 적게 제한한다. 결정된 줄기세포의 경우에, 몇개인가의 딸세포는 다기능성을 보유하고, 몇개인가는 잃어버려 단일의 특정 운명에 관련하고 있다.
용어 "하나(one)", "a", 또는 "an"이란 용어가 상기 개시에서 사용될 때, 달리 표시하지 않는 한, "적어도 하나" 또는 "하나 또는 그 이상"을 의미한다.
2. 간세포 계열을 위한 진단 표지
알파-태아단백(AFP) 및 알부민은 모두 세포질 단백질이며, 단백질로서 분석(assay)될 때, 간세포 계열에 대해 특히 신뢰할 수 있는 표지이다. 이들 단백질의 변이체형(variant forms)을 코드하는 메신저 RNAs가 조혈 프로제니터에서 발현되지만, 번역되지는 않는다; 예를 들면, AFP mRNA의 변이체형은 엑손(exon) 1 코드 배열이 대체적(代替的)인 엑손 1 또는 2개의 엣손의 어느 하나에 치환되고, 간세포의 변이체형과 다르다(Kubota, Storm and Reid, submitted; also in patent application).
따라서, 상기 두 가지 단백질의 발현은 간장에 있는 다른 세포형으로부터 간 아집단의 동정을 위한 기초이다. 간장의 발생에 있어서, AFP 및 알부민의 존재는 간 프로제니터 세포의 강력한 양성 지표로서 인식된다. 간장 발생의 초기 단계에서, 이들 세포는 담관 및 헤파토사이트 계열의 양쪽으로 들어가는 자손을 생산할 수 있다. 이들 딸세포는 담관 계열에 관련하는 경우, AFP 발현은 멈춘다. 그러나, AFP 발현은 헤파토사이트 계열에서는 주산기(perinatal period)에 억제될 때까지 지속되므로, 알부민 발현은 성체 헤파토사이트의 주요한 특징 중의 하나가 된다.
3. 사람의 간 프로제니터의 프로세싱
통상적으로 간장세포의 분리는 조직의 단일 세포 현탁액에 효소적 및 물리적으로 해리한 후, 이어서 밀도 구배 원심분리, 원심분리적 정체, 디퍼렌셜 효소소화의 프로토콜을 이용하여 분획을 함유(즉, 간장 성상 세포, hepatic stellate cell), 및/또는 세포 배양을 사용하는 선택을 포함한다(reviewed in Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique" 1983, Alan R Liss, Inc. NY). 간장 조직은 태아, 신생아, 유아(생후 1년까지), 아동(1살에서 사춘기까지), 또는 성인(사춘기 이후)에서 획득된다. 바람직하게는 밀도 구배 원심분리가 상이한 세포집단(예를 들면, 헤파토블라스트)을 분획 및 분리하기 위해 이용된다.
4. 프록시멀 간 줄기세포 및 기타 프로제니터의 배양
프록시멀 간 줄기세포 및 관련 간 프로제니터는 배아 간 스트로마 지지세포 및 규정 호르몬 및 성장인자 혼합물로 첨가한 무혈청 배지를 필요로한다[1-6]. 프록시멀 간 줄기세포, 관련 프로제니터 및 2배체 성인 간 세포의 클론원성 확장(clonogenic expansion) 및 철로 되는 표지의 유지 연장은 배아 간 스트로마 지지세포가 인슐린, 트랜스페린/Fe 및 바람직하게는 히드로코르티손을 첨가한 무혈청의 호르몬적으로 규정된 배지와 조합하여, STO 지지세포로 치환한 경우에 일어날 수 있다[7]. 이들 조건이 태아 조직으로부터 다양한 범위의 프로제니터 및 2배체 성체세포의 콜로니 형성조차도 지지한다면[7], 프리미티브 간 줄기세포를 선택하기 위해 다른 조건이 필요하다.
5. 프리미티브 간 줄기세포의 분리
본 발명은 사람 간장 조직프리미티브 간 줄기세포를 분리하는 방법을 포함하고, 이 방법은 간장 조직에서 유래하는 세포 현탁액, 바람직하기로는 실질세포에 대하여 풍부하게 된 것을 플라스틱 표면에 적용하는 공정과, 성숙 간세포, 프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터를 제거하는 엄격한 배양 조건에 세포를 제공하는 공정을 포함한다. 엄격한 배양 조건에는 탄수화물 대사의 조절자, 철의 공급원, 막 생산 인자 및 바람직하게는 항산화제를 보충한 무혈청 배지를 사용하는 것을 포함한다.
바람직한 탄수화물 대사의 조절자는 인슐린이고, 바람직한 철의 공급원은 트랜스페린이다. 바람직한 막 생산 인자는 하나 또는 그 이상의 리피드로 이루어진 조성물, 가장 바람직하게는 유리지방산을 포함하는 조성물이다. 바람직한 항산화제는 셀레늄이다. 무혈청 배지는, 바람직하게는 히드로코르티손으로 더 보충된다. 간장 조직은 바람직하게는 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이고, 가장 바람직하게는 태아에서 획득된다.
프리미티브 간 줄기세포는 낮은 세포 밀도(예를 들어, 1000-2000 세포/㎠)로 플라스틱 표면상에서 간장에서 유래한 세포 현탁액을 배양함으로써 분리된다. 엄격한 배양 조건에 의해 사람 간장으로부터 프록시멀 간 줄기세포의 전구체인 프리미티브 간 줄기세포가 출현한다. 이들 사람간장 유래의 프리미티브 간 줄기세포는 Ep-CAM, AC133, CK8/18, CK19 및 알부민을 동시 발현하고, 그들의 아집단은 N-CAM, CAM 5.2 및 c-kit를 발현한다.
당해 분야의 기술을 가진 자는 본 발명이 다른 조직형으로부터 프리미티브 세포를 분리하기 위하여 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
6. 프록시멀 간 줄기세포의 분리
사람 프록시멀 간 줄기세포는 헤파토사이트나 담관 상피세포 또는 그의 조합을 발생시킨다. 사람 프록시멀 간 줄기세포는 Ep-CAM, CK8/18, 사이토케라틴 19, 알파-태아단백 및 알부민을 동시 발현하고, 그들의 아집단은 AC133을 발현한다. 사람 프록시멀 간 줄기세포는 여러 방법에 의해 분리될 수 있으며, 이들 방법은 (ⅰ) Ep-CAM을 동시 발현하는 세포의 면역선택(immunoselection), (ⅱ) 바람직하게는 실질세포가 풍부한 간장 유래의 세포 현탁물을 발생 유도인자를 이용하여 배양하는 것, 또는 (ⅲ) 사람 프리미티브 간 줄기세포를 발생 유도인자를 사용하여 배양하는 것이 포함된다. 발생 유도인자는 바람직하게는 2차적인 세포에 의해 공급된다. 바람직한 2차적인 세포로는 STO 지지세포, 배아 간 기질 세포 또는 내피세포가 포함된다.
7. 면역 선택에 의한 간 프로제니터의 분리
본 발명은 또한 간 프로제니터에 특이적인 세포 표면 표지를 면역 선택하는 것을 기초로 하는 간장 유래의 세포 현탁물로부터 간 프로제니터를 분리하는 방법을 포함한다. 본 발명에 따라, Ep-CAM을 발현하는 세포, 바람직하게는 AC133 또한 발현하는 세포를 선택함으로써 간 프로제니터가 분리된다. 본 발명의 면역 선택된 간 프로제니터는 바람직하게는 또한 알부민을 발현하고, 더욱 바람직하게는 사이토케라틴 19 또한 발현한다. 바람직하게는 면역 선택된 간 프로제니터는 줄기세포이다.
본 발명의 실시예에서, 분리된 간 프로제니터는 프리미티브 간 줄기세포이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 분리된 간 프로제니터는 프록시멀 간 줄기세포이다.
8. 간 프로제니터의 생산
본 발명은 또한, 간장 프리미티브 간 줄기세포로부터 프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터를 생산하는 방법을 포함하고, 이 방법은 STO 지지세포층 및 HDM에 직접적으로 플레이팅하는 공정, 또는 배양 플라스틱의 콜로니에서 STO 지지세포층으로 프리미티브 간 줄기세포를 옮기는 공정의 어느 하나의 공정과, 프리미티브 간 줄기세포의 콜로니로부터 프록시멀 간 줄기세포가 출현하는 것을 가능하게 하는 공정을 포함한다.
프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터는 페트리접시(바람직하게는 전하를 띠지 않는 폴리스티렌 표면), 조직 배양 플라스틱(바람직하게는 이온화 가스에 노출된 폴리스티렌 표면으로, 폴리스티렌이 세포가 결합하는 쪽으로 향하여 바람직한 방향의 음전화(또는 양전하)로 분극하고 있음), 마이크로캐리어(바람직하게는 세포가 결합할 수 있는 배양 비드), 섬유재료(바람직하게는 나일론, 면직물, 폴리에스테르), 합성 골격재료(바람직하게는 폴리악티드, 폴리(프로필렌 푸말산염), 폴리(오르토 에스테르) 또는 기타 합성 재료로 만들어진 것) 또는 스폰지(바람직하게는 천연이나 합성 스폰지) 를 포함하고, 코팅되지 않은 표면에서 배양함으로써 프리미티브 간 줄기세포로부터 생산될 수 있다.
프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터는 또한, 생물학적 표면상에서 배양함으로써 프리미티브 간 줄기세포로부터 생산될 수 있다. 생물학적 표면은 상기 카테코리의 표면에 코팅되거나 조제될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 페트리접시, 조직 배양 플라스틱, 마이크로캐리어 또는 섬유재료에, 세포 외 매트릭스 코팅을 도포할 수 있다. 본 발명에서 사용된 생물학적 표면에는 다음의 것이 포함된다: (ⅰ) 세포 외 매트릭스(세포에 의해 생산되는 단백질 및 탄수화물의 복잡한 혼합물이며, 세포의 외측 및 세포사이에 국재하며, 콜라겐, 접착 단백질, 프로테오글리칸 및 기타 단백질을 포함한다), (ⅱ) 세포 외 매트릭스 성분(파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐(20 패밀리 이상의 많은 콜라겐이 있으며, Ⅰ형 콜라겐, Ⅲ형 콜라겐, Ⅳ형 콜라겐(이들 3종은 오늘날 세포 배양에서 가장 일반적으로 사용되고 있다)를 포함한다.), 세포 접착분자, 즉, "CAM"(칼슘 의존성을 것 및 그렇지 않은 것도 포함), 및 프로테오글리칸(하나 또는 그 이상의 글리코사민글리칸 사슬(글루쿠론산 또는 이드우론산 + 아미노당의 다이머 단위의 폴리머)를 결합하는 단백질로 된 분자이며, 이들은 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, 더마탄 황산염 프로테오글리칸, 헤파란 황산염 프로테오글리칸, 헤파린 황산염 프로테오글리칸을 포함한다.)를 포함하는 세포접착, 증식 및/또는 조직 특이적 기능의 발현 최적화를 위해 단독 또는 조합하여 사용되는 개개의 정제된 매트릭스 성분), (ⅲ) 세포 외 매트릭스가 풍부한 조직 추출물[Matrigel(그룹 I에 있어서 표시된 임의의 표면에 코팅될 수 있는, 이식가능한 마우스 태아 암종의 요소 추출물), ECM(묽은 알카리, 묽은 계면활성제, 고염 농도 추출물, 요소 등을 사용하고, 표면(그룹 I에 기재된 어떤 것)를 코팅하는 세포 외 매트릭스 성분이 풍부한 삼출물을 남긴, 양막의 추출물), 및 바이오매트릭스(고염농도(예를 들면, >3M NaCl) 및 뉴클레아제를 사용하고, 모든 조직의 콜라겐 및 접착 단백질과 같은 임의의 부수하는 성분을 남긴, 조직 추출물)을 포함한다.], (ⅳ) 혈청 코팅[혈청에서 페트리 접시나 조직 배양 접시를 코팅하면, 특히 혈청 중에 높은 레벨로 존재하는 부착 단백질(특히, 파이브로넥틴)을 첨가한다], 및 (ⅴ) 폴리라이신 또는 폴리류신(이들 양전하를 띠는 아미노산으로 코팅하는 것은 상피세포를 우선적으로 결합하기 위해 사용된다)을 포함한다.
프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터는 또한 안토니 아탈라 및 로버트 피. 란자(Anthony Atala and Robert P. Lanza, Methods of Tissue Engineering. Academic Press, New York 2002)(참고로 본 명세서에 넣음)에 기재된 조건에서 배양함으로써 프리미티브 간 줄기세포로부터 생산할 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 간 프로제니터는 프리미티브 및 프록시멀 간 줄기세포, 헤파토사이트의 관련 프로제니터 및 담관의 관련 프로제니터를 포함한다.
9. 치료상의 접근
본 발명에서 분리된 프로제니터는 간장에 방향 부착된 세포 및/또는 유전자 치료를 위하여, 또는 백신을 생성하기 위한 바이러스 생산(예, C형 간염 바이러스) 을 위한 숙주로 되는 세포로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 프로제니터는 간 장 생검(예, 펀치 생검)으로부터 생체 외에서 확장될 수 있고, 확장된 세포는 자가 또는 동종이형의 세포 또는 유전자 치료를 위해 사용되거나, 또는 임상적으로 또는 학문 연구용으로 사용될 수 있는 생체 인공간을 만들기 위한 바이오리액터에 접종하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 환자의 간장의 주요한 침습적 외과적 절제의 필요성이 배제될 수 있다.
일단 프로제니터가 배양 중에 확립되면, 다수의 유전자 송달 벡터 시스템 중의 어떤 것을 이용하여 유전자 이입을 실행할 수 있다. 본 발명의 프로제니터의 증식 특성에 의해 충분한 유전자 삽입 및 발현을 위해 세포 증식을 필요로 하는 일정 유전자 전달 벡터(즉, 레트로바이러스 벡터)를 사용하는 생체 외 유전자 이입에서의 사용을 가능케 한다.
유전자 치료를 위한 대체적인 접근은 특이적으로 프로제니터를 타겟으로 하는 벡터를 설계하고, 그런 다음 관심 대상의 유전자와 함께, 이 벡터를 환자에게 직접 주입하는 것이다. 이 벡터는 내인적인 프로제니터 세포군을 표적화 및 수식한다. 본 발명의 프로제니터는 자가 및 동종이형의 간장에 방향 부착된 세포 및 유전자 치료에 사용될 수 있다. 자가 간 프로제니터의 사용에 의해 이식 세포의 거절에 관한 큰 근심거리가 배제될 수 있음은 명백하다. 본 발명의 프로제니터는 특히 동종이형의 세포 도입에 매력적이다. 이는 그들의 항원성 프로파일이 최소의 면역학적 거절현상을 나타내기 때문이다.
일단 자가 및 동종이형의 프로제니터가 분리, 정제, 배양되면, 그들은 유전적으로 변형되거나 손상되지 않은 채 남아있고, 시험관내에서 확장시킨 다음, 숙주 에 다시 이식될 수 있다. 유전적 변형이 요구되면, 유전적 변형 후 및 이식 전에, 그들 유전적으로 변형된 세포는 확장되고, 및/또는 우세한 선택 표지의 결합 및 발현에 기초하여 선택될 수 있다. 이식물은 간장 구획이나 정규 장소 밖, 즉 헤테로토픽 부위로 되돌릴 수 있다. 간장 구획으로 이식하기 위해서, 문맥 주입 또는 비장 주사가 사용될 수 있다. 비장내 주사는 투여 경로일 수 있다. 즉, 비장내 주사를 통하여 이식된 간 프로제니터는 간장 구획으로 이동하기 때문이다.
추가적인 의학적 방법은 이식된 간 프로제니터가 간이식의 효과를 보조할 수 있다. 동물 모델에 의해, 부분적인 간 절제술에서, 혈관 신생 인자 및 기타 성장인자의 투여에 의해 이식된 헤파토사이트의 융합과 생존도가 촉진된다는 것을 증명하였다. 대안적인 접근은 유전적으로 변형된 프로제니터를 전위 위치(ectopic site)에 이식하는 것이다.
현재까지 세포의 조달, 세포를 동결 보존할 수 없는 것, 색전 형성 및 면역학적 거부 등을 포함하는, 간장 세포 치료 접근법과 관련하는 문제들이 있었다. 현재 간 세포 치료 접근법의 문제점들은, 사용되는 있는 기증 세포가 주로 성체 간장 세포이고, 분리 및 재주입 후의 수명가 짧다는 것에 의한 것이라고 고려된다. 더욱이, 성체세포의 사용에 의해 강략한 면역학적 거부를 가져온다. 본 발명의 프로제니터는 면역학적 거부 현상을 유발하는 그들의 능력이 한정되어 있는 것, 동결 보존되는 그들의 능력, 그런 이유로 그들의 조직 형태에 대한 기회를 제공(그로 인해 기증 세포를 수용자에게 합치시키는 것), 그리고, "규격품" 제품을 부여하는 능력때문에, 그들의 광범위한 재생 능력 때문에 더욱 큰 효율성을 제공한다.
유전자 치료에 대해서, 진행 중인 시도는 "표적화된 주사 가능한 벡터", 즉, 발생하에서의 임상 치료를 위한 가장 일반적인 경로를 이용한다. 이들 접근법은 면역학적 문제 및 벡터의 일과성 발현의 양자에 기인하여, 한정된 효력을 갖는다. 유리한 가치가 증명된 유전자 치료의 유일한 경로는 생체 밖에서의 유전자 치료였고, 거의 조혈 프로제니터에 의해 독점적으로 행하여져 왔다. 본 발명자들은 벡터는 정제된 프로제니터에 엑스 비보(시험관 밖)로 도입될 수 있고; 변형된 세포가 선택되어 생체 내로 재도입되기 때문에, 프로제니터 세포를 이용하는 엑소 비보 유전자 치료(또는 이들의 프로제니터들을 어떻한 방법으로 표적화된 주사 가능한 벡터의 사용)이 유효한 것이 증명되리라 예측하고 있다. 프로제니터 세포의 장점은 그들의 거대한 확장능력, 이들의 (만약 있다하여도) 최소한의 면역학적 반응의 유도, 또는 조직 형태로 되는 능력, 그 때문에 수용자의 면역학적 표현형과 합하하는 능력, 및 헤파토사이트와 담관세포의 양자를 생산하기 위해 분화하는 그들의 능력이다.
10. 기타 용도
사람의 간장 프리미티브 및 프록시멀 간 줄기세포의 용도는 많고 다양하다. 그 용도는 1) 사람 세포의 연구; 2) 백신 또는 항바이러스제의 생산; 3) 독성학적 연구; 4)의약 개발; 5) (각종 사람-특이적 인자의 제조를 위한 숙주로서 세포를 사용하는) 단백질 제조; 6) 간세포 치료; 7) 간장 유전자 치료; 및 8) 연구, 독성학적 및 항바이러스제 연구, 단백질 제조에, 또는 간장 보조 시스템으로 임상적으로 사용될 수 있는 생체 인공간장을 들 수 있다. 프리미티브 간 줄기세포 및 프록시멀 간 줄기세포가 헤파토사이트 및 담관세포로 분화하는 능력을 고려하면, 본 발명의 세포는 그들이 위치한 미세환경에 따라 간장 또는 담관의 발육 모두에 사용될 수 있다.
사람 간 프로제니터(4가지 모든 분야)의 이용가능성은 사람 세포에 대한 더욱 더 광범위한 연구를 가능하게 할 것이고, 성공적인 간장세포 및 유전자 치료의 발전을 촉진할 것이고, 연구나 임상학적 보조장치로서 사용되기 위한 생체 인공 간장의 발전을 가능하게 할 것이다. 현재 건강한 사람의 조직의 제한된 공급은 간장세포치료 또는 사람의 생체 인공 간장의 임상적 프로그램을 불가능하게 한다. 프로제니터 세포 집단은 이러한 제한된 공급을 극복하거나, 적어도 크게 완화시킬 수 있는 충분한 확장 능력을 가지고 있다. 더욱이, 이들 세포 및 이들의 직접 계통적인 자손들은 성숙 간세포에서 관찰되는 것과 비교해서, 낮은 온도나 높은 온도에서의 허혈에 대한 우선적 생존력을 보여주며, 이는 간장이식 또는 건강한 성숙 간세포를 생산하는 데 사용될 수 없는 간장이 프로제니터의 공급원이라는 것을 의미한다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
태아 조직으로부터 간세포 현탁액의 제조
간장 조직은 임신의 선택적 종료에 의해 얻어진 임신 18-22주령 사이의 태아로부터 얻어졌다. 간 조직의 샘플을 10% 소태아혈청으로 보충된 RPMI 1640에서 밤새 정치시킨다.
세포 완충액[소태아혈청(BSA Fraction V, 0.1%, Sigma, St. Louis, Mo.), 아셀렌산 (300 pM), 그리고 항미생물제 혼합물, AAS (Gibco BRL/Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)으로 보충된 RPMI] 중에서 예비 세척 후의 조직 부피는 2～12㎖의 범위이다. 간장 조직은 필요에 따라, 타입 Ⅳ 콜라게나제(collagenase)와 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease)(Sigma, St Louis, Mo.; 둘 다 6 ㎎/㎖)를 함유하는 세포 완충액 25㎖에서 소화시키기 위해 3㎖ 이하의 프라그먼트로 세분했다. 인큐베이션을, 32℃, 15-20분간, 자주 교반하면서 수행하여 세포 응집물의 균질한 현탁액을 얻었다. 그런 다음, 현탁물을 40 게이지 시브를 통과시키고, 1200 RPM에서 5분 동안 원심하였다. 그 후, EGTA (0.2mM, Sigma), Heps(20mM, Boehringer Mannheim), BSA(0.1% Sigma), DNase(0.01%, Sigma)를 보충하고, HBSS 모드로 불리는 Hanks 완충 염용액의 무칼슘 용액에 재현탁하였다.
효소적으로 소화된 현탁물은, 조혈 아집단 및 간 아집단을 포함한다. 효소적으로 소화된 현탁물의 항원프로필은 표 1에 나타낸다. AFP-발현 세포는 원래의 세포 현탁물의 6～9％이고(도 12), 알부민-발현 세포도 그에 필적하는 퍼센테이지이며, 조혈 세포로 상당히 협잡되어 있다(표 1에서의 CD45 및 글리코포린 A 발현 세포들의 퍼센테이지 참조). 원래의 세포 현탁물이 동결 보존되는 경우, 적혈구와 같은 세포들은 상실하고, 알부민 및 AFP를 발현하는 세포가 15-20％까지 풍부하게 된다(표 1). 그러나, 가장 현저한 풍부화는 콜리게나제로 부분 효소 소화에서 일어나, 실질조직의 세포의 응집을 일으키고, 이어서 이것을 이하에 기재한 바와 같이 저속 원심분리를 반복하여 비실질조직(부유) 세포로부터 분리하여 80％ 이상의 알부민과 AFP를 발현하는 세포인 세포 현탁물을 얻는다(표 1).
그런 다음, 조혈 세포(대부분 적혈구와 적혈모구)와 부유하는 비실질세포를, HBSS 모드에서 5분간 30 g(300 RPM)에서 저속 원심분리를 반복함으로서 실질세포 획분으로부터 분리된다. 침전물을 40 ml의 HBSS모드에 재현탁하고, 색이 최소한의 적혈구 세포의 협잡을 나타낼 때까지 재원심분리한다. 일반적으로, 다른 사람들이 보고한 바와 같이, 이것은 원심분리를 4, 5회 정도의 원심분리와 재현탁이 요구된다[14, 15]. 응집괴 형성(clumping)을, 신선한 콜라게나제 용액 중에서 2회째의 효소적 소화, 이어서 50㎛ 나일론 메쉬를 통과시키고, 세포를 무칼슘 완충액으로 되돌림에 의해 최소화된다.
얻어진 세포 현탁액을 2회 세척한 후, 각각 2×107 세포를 함유하는 5㎖ 씩으로 세척하고, 50㎖의 팔콘 튜브중 5㎖의 Ficoll Hypaque(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에 층을 형성하고, 3000 RPM에서 20분간 원심분리하였다. 계면및 펠렛으로부터의 세포를 각각 플레이팅 배지(보충한 RPMI)에서 재현탁시키고, 각각의 획분을 혈구계로 계수와 생존 평가를 하기 위해 트리판 블루(trypan blue)로 염색시킨다. 세포의 생존력은 95％ 이상이었다. 실질세포의 농축용 저속 원심분리 방법은 대략 80％의 AFP 발현 세포인 세포 현탁액을 잔존시키면서 조혈 성분을 결손하였다. 세포가 AFP, 알부민, CK 19를 발현하고, 조혈 표지를 발현하지 않으면, AFP 발현세포의 대부분은 프록시멀 간 줄기세포이다(표1).
[표 1]
OCS= 초기 세포 현탁액(original cell suspension); C-OCS= 초기 세포 현탁액을 전용 완충액 중에서 동결 보존하였다. 그런 다음, 세포를 녹이고, 이어서 표지의 발현에 대하여 분석하였다. 수많은 세포, 특히 (아집단을 적출한) 적혈구 세포는 동결 보존에서 생존하지 않았다. 실질세포 조제물=저속 회전에서 원심분리를 반복하는 것에 의한 적혈구 세포 및 기타 부유 비실질세포 제거 후; n.d.= not done
실시예 2
성인 조직으로부터 간세포 현탁액의 조제
사람의 간장을 공인 장기조달기관으로부터 입수하였다. 기증인은 뇌사 판정을 받은 13세의 여자였다. 간장을 전체 장기 관류법을 사용하여 소화하였다. 그런 다음, 단일 세포 현탁물을 2스텝 Optiprep 구배(9-12.5%)를 사용하여 Cobe 2991 세포 세척기에서 분획하여 생존 가능한 세포를 얻었다. 그런 다음, 동일한 양의 9%(밴드 1)와 12.5%(밴드 2)의 분획 세포를 각각 코브 2991에서 다시 분획하기 위하여 25% Optiprep와 각각 혼합함으로서 잔존하는 사세포로부터 생세포를 분리하였다. 전방과 측방의 산란 파라미터의 플로우 사이토메트리 분석에 의해 밴드 1과 밴드 2의 세포의 조성은 유사한 것으로 나타났다. 세포들을 저온 보존하였다.
실시예 3
성체 사람 간세포로부터 콜로니 형성
콜로니 형성에 의한 간 줄기세포의 존재를 평가하기 위해, 실시예 2의 세포를 해동시키고, 6개의 웰 플레이트 위에 12,500 생세포/웰의 밀도로 3개조에서 STO-5 지지세포(feeder) 층위에 플레이팅하였다. 사용된 조직 배양 배지는 페니실린/스트렙토마이신 (50U/㎖/50㎍/㎖), 소혈청 알부민(0.2% w/v), 트렌스페린(10㎍/㎖), 유리 지방산(7.6 μEq/L), 니코티노마이드(4.4mM), 셀레늄(3×10(-8) M), 구리(1×10(-6) M), 2-메르캅토에탄올(5×10(-5) M), L-글루타민(2mM), 인슐린(5㎍/㎖), 히드로코르티존(10(-7)M)를 함유하고, 상피성장인자의 첨가가 있거나(+EGF) 없는(-EGF) 것의 DMEM F12이었다.
세포를 5일간 배양하고, 고정하고, 광학 현미경에 의해 가시화하는 것에 의해 콜로니를 계수하였다. 분획되지 않은 세포들의 어느 웰에서도 콜로니는 관찰되지 않았다. 이것은 죽은 세포나 죽어가는 세포 또는 옵티프렙(Optiprep) 구배에서 원심분리 전에 세포 조제물의 성분의 저해효과에 기인할 가능성이 있다. 그러나, 콜로니는 밴드 1과 밴드 2 세포 분획 양쪽 모두에서 관찰되었다. 밴드 1로부터 세포를 함유하는 3개의 웰에서 총계 8개의 콜로니가 관찰되었고(+EGF 배지에서 4개, -EGF 배지에서 4개), 밴드 2로부터 3개의 웰에서 총계 13개의 콜로니가 관찰되었다(+EGF 배지에서 11개, -EGF 배지에서 2개). 이러한 실험에서 계산된 콜로니 형성 세포의 전체 빈도는 0.03％였다.
실시예 4
성체 사람 간세포의 아집단에서의 알부민, CD133, Ep-CAM의 동시 발현
본질적으로 실시예 2에서 기술한 바와 같이 기증자의 간으로부터 세포를 분리하였다. CD45 세포 표면 항원, 또는 백혈구 공통 항원(백혈구 상에서 광범위하게 발현하는 티로신 포스파타제)를 발현하는 세포의 존재를 항CD45 모노클론 항체를 사용하는 형광 활성화 셀 소팅(FACS)에 의해 평가하였다. 약 17%의 세포가 CD-양성이었다(도 14A). CD-양성 세포를 항CD45 모노클론 항체를 사용하는 자기 셀 소팅 및 수퍼 파라마그네틱 MACS 마이크로비드 및 오토MACS(자동화된 탑상 자기 셀 소터)의 의해 결손시켰다. 자기-비드 표지 항체 및 기기는 모두 Miltenyi. Biotec에서 제공받았다. 또한, CD45-양성 세포는 "패닝", 형광 활성화 셀 소팅, 또는 기타 음성 면역 선택 모드에 의해 결손시킬 수 있었다. 결손시킨 후, 간세포 조제물에 잔존하는 CD45-양성 세포의 분획은 대략 1%정도로 감소되었다(도 14B). CD45-양성 세포의 결손은 간세포와 간 프로제니터 및 줄기세포에 대하여 항원의 분석을 용이하게 한다. 또한, 이들 세포의 농축된 집단의 분리를 용이하게 하여야 한다.
a. 알부민
CD45-양성 세포의 결손 후에 간세포들의 샘플을 사람의 혈청 알부민의 발현을 위해 분석되었다. 세포를 파라포름알데히드로 고정하고, 0.2%의 트리톤 X-100 세정제로 처리하여 투과시키고, 사람 알부민에 대한 마우스 IgG1 모노클론 항체, 및 를 형광 염색 A647로 표지한 마우스 면역글로불린 G1(IgG1)에 대한 어피니티 정제한 염소 항체와 연속 배양하여 염색했다. 백그라운드 염색과 세포의 자기 형광을, 항알부민 모노클론 항체 대신에 사람의 항원에 대한 특이적 결합 활성을 가지지 않는, 정제된 마우스 골수종 단백질(또한 IgG1)에 의해 결정되었다. 약 97.5%의 세포가 알부민-양성이었다(도 15A). 양성 염색(붉은 아웃라인)을 위한 게이팅은 마우스 골수종 단백질 대조(미도시)에 대한 비교에 의해 결정하였다.
전방 광 산란과 측방 광 산란의 FACS에 의한 측정은 세포의 집단을 특징지우기 위해 사용될 수 있다. 전방 또는 측방 산란은 주로 각각 세포의 크기와 세포내 구조적 복잡성의 함수들이다. 도 15B에 나타난 바와 같이, 성체 사람 간장으로부터의 알부민-양성 세포의 집단은 비교적 고도의 전방(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 갖는 주요한 클라스의 세포를 함유한다. 크기 및 형태의 분석, 그리고 생화학적 및 항원의 표지(미도시)는, 이들 세포가 성숙된 작은 간 실질세포(평균 크기, 직경 약 18-22㎛)와 일치하는 특성을 가지고 있음을 나타낸다. 정상 성체 사람 간장으로부터의 최대의 간세포(직경이 약 30㎛ 초과)는, 명백히 본 발명자들의 조제물에서는 낮게 나타났는데, 이는 아마 기관의 수집과 관류 사이 기간에서 사멸 가능성이 높거나, 및/또는 분리 단계중 손상을 입을 가능성 때문일 것이다. 그러나 도 15B에서는 성숙한 작은 간세포가 더 낮은 전방과 측방 산란에 의해 특징지워진 많은 세포들도 또한 알부민을 발현함을 나타낸다. 조제물 중의 소량, 약 2.5％의 알부민-음성 세포들은 거의 모두 매우 낮은 전방과 측방 산란을 보여준다(도 15C). 이들은 사멸한 세포이거나, 적혈구의 전단계의 프로제니터와 같은 매우 적은 세포들일 수 있다.
b. CD133
항원 CD133(AC133)은 다섯 개의 막 관통 영역을 갖는 120 킬로달톤의 세포 표면 당단백질이다. 이 단백질은 마우스 단백질 프로미닌과 유사하다. 사람의 CD133 항원은 원래 초기 프로제니터(이것에는 혈액 형성 세포(조혈세포)의 계열에서 줄기세포가 포함된다)의 부분집합(subset) 상에서 동정되었다. 어떤 다른 미성숙 세포는 CD133을 발현하고, 이것에는 사람 배아(5주령)에서 발생하고 있는 상피, 내피 세포 전구체, 그리고 신경 프로제니터 또는 줄기세포를 포함한다. 또한, CD133의 발현은 사람의 종양과 종양 유래 세포주(예를 들면, 망막모세포종 및 결장 암종선 CaCo-2)에 대해서 보고되어 있다. 이 단백질은 플라스마 멤브레인에 풍부한 것(예를 들면, 미세융모)에서 우선적으로 농축되어 발견되었다. 상피세포에서 발견된 때에는 낮은 측면 세포막 표면이 아닌 꼭대기쪽에 우선적으로 위치한다. 선행된 연구는, 특별히 면역조직화학에 의해, 성인의 간장을 포함하여 많은 사람의 조직에서 그의 단백질을 위한 검출 가능한 메신저 RNA가 존재함에도 불구하고, 성체 사람 상피 조직에서 CD133 단백질 발현을 증명하는 데 실패하였다.
본 발명자는, 본 발명자들의 CD45-결손 성체 간장세포 조제물에서 CD133 항원을 발현하는 세포를 조사하기 위해 형광-표지 모노클론 항체를 이용하는 염색 및 FACs에 의한 분석을 사용하였다. 놀랍게도, 앞선 부정적 보고의 고려하면, 본 발명자들은 대다수의 CD45-결손 간장세포(도 14B 참조)가 CD133에 대해 양성 염색을 보여준다는 것을 관찰하였다. 도 16A는 유아(2살)의 간장으로부터의 조제물 중의 약 58% CD133-양성 세포를 나타낸다. 작은 성숙 간세포의 세포들을 포함하여 CD133-양성 세포들의 상당한 집단의 존재는 성인을 포함한 부가된 개체로부터의 세포 조제물에서 관찰되어 왔다. CD-133 양성 집단(도 16A의 상단 박스)은 측방 광산란(도 16A)와 전방 광산란(미도시)에 기초로 하여 성숙한(작은) 간세포로서 동정되는 조제물 중, 세포의 거의 반을 점한다. 또한, 이는 광산란으로 판단하건대, 성숙 간세포보다 더 작고 형태학적으로 구별되는 많은 세포들을 포함한다.
자기 셀 소팅을 이용하여 CD133을 발현하는 간장세포들을 양성 선택할 수 있다. 도 16B는 autoMACS 장치(Miltenyi Biotec사)를 이용하는 자기 소팅의 1 사이클 후의, 회수된 세포의 약 75%까지의 CD133-양성 세포의 농축화를 나타낸다. 더 많은 양의 항체 결합 MACS MacroBeads의 사용 및 소팅 조건의 조정(효과에 대한 단어 삽입-'당업자'에게는 수월하여야 한다)은 거의 정량적 수량으로 더욱 고도로 농축된 CD133-양성 세포 집단의 분리를 가능하게 하여야 한다. {또한 양성적인 면역선택의 다른 방법이 CD133-양성 세포들을 위해 농축하게 위해 사용될 수 있다는 것을 주목하라}. 측방 산란의 의해 판단하면 (도 16B와 전방 산란(미도시)), 농축된 CD133-양성 세포는 CD45-결손 세포 조제물에서 동정된 모든 CD133 아집단을 점한다.
c. Ep-CAM
상피 세포 접착 분자(Ep-CAM, 또한 GA733-2, CO 17-1A, EGP40, KS1-4, 그리고 KSA로 알려짐)는 호모필릭(homophilic), 칼슘이온 비의존성 세포-세포접착에 관여하는 당단백질이다. 단백질은 많은 사람의 상피조직에서 발현되고, 증식하고 있는 상피세포(종양 세포를 포함)에 있어서 실질적으로 잘 제어되는 것으로 나타낸다. C. J. de Boer와 그의 동료들은 8주 배아의 사람의 간장에서 모든 간세포들이 검출할 수 있는 Ep-CAM 단백질을 발현하는 것을 보고하였다[de Boer CJ, van Krieken JH, Janssen-van Rhijn CM, Litvinov SV.(1999) "보통의, 재증식하는, 후형질의, 종양의 간에서 Ep-CAM의 발현", journal of Pathology 188:201-6]. 대조적으로 정상적인 사람의 성체 간장에서 그들은 간세포에서 Ep-CAM발현을 검출할 수 없었고, 단지 담관 상피 세포만이 이러한 항원에 대해 양성으로 염색되는 것을 보고하였다. 마지막으로, 이 항원은, 간장의 재생 및 수복이 담즙성 간경변에 의해 유도되는 상황하에서, 그리고 특정 간장 종양, 특히 담관암종의 세포에서 간의 전구물질로서 동정된 세포에서 검출되었다.
FACS 분석에 의해 우리는 일관되게 유아와 성인 모두로부터 분획되지 않은 사람 간장세포의 조제물 중에서 Ep-CAM-양성 세포의 작은 집단을 검출한다. Ep-CAM 양성 집단은 약 0.4-2.5%의 세포를 점한다. 도 17에 나타난 바와 같이, Ep-CAM-양성 세포들은 CD45-양성 세포들의 95 % 초과의 결손 후에 간세포 집단에서 관찰될 수 있다. 도 17B는 하나의 그러한 사람의 간장 조제물에서 Ep-CAM-양성 세포를 보여준다(임의의 공지의 사람의 항원을 염색시키지 않는 대조 항체에 대해서의 동일 게이팅 영역에서의 0.15%와 비교하여(도 17A), 붉은 아웃라인에 의해 보여진 게이팅 플롯의 영역 안에 0.57%; 그러므로 대략 세포의 0.57 - 0.15 = 0.42 %가 Ep-CAM-양성이다). 이중의 표지 분석(데이타는 나타내지 않음)은 CD45-결손 집단에서 Ep-CAM-양성 세포의 대다수는 예측한 대로 CD45-음성이라는 것이 증명된다. 그러나, 그것은 본 발명자들의 사람의 간 조제물 증에서의 CD45-양성세포의 대략 1%정도가 Ep-CAM을 또한 발현한다는 것을 나타낸다(데이타는 나타내지 않음).
d. Ep-CAM, CD133 그리고 알부민의 공동 발현
본 발명자들은 성체 사람 간장으로부터 Ep-CAM과 CD133의 양쪽을 발현하는 간장세포를 연구하였다. 세포를 각각 다른 형광색소와 직접 결합체화한 CD133 및 Ep-CAM에 대한 모노클론 항체와 함께 인큐베이트하였다. 도 17C에서 나타난 바와 같이, 특정의 CD45-결손된 성체 사람 간장 조제물에서의 세포의 약 42％가 CD133에 대해 검출 가능하도록 염색되었다(도 16A에서 보여준 실험보다 여기에서 CD133의 염색이 조금은 더 낮은 것은 나이 또는 다른 변수의 결과로 다른 기증아로부터, 또는 실험 기술에 있어 확인되지 않은 변수로부터의 간장세포 조제물 사이에서 실제적인 차이에 기인할 수 있다.). Ep-CAM에 대해 강하게 염색된 집단 중의 세포들 사이에서(도 17B에서 붉은 경계선 안에서 나타난 바와 같이) 대략 70％가 CD133에 양성으로 염색되었다(도 17D). 그러므로, 이러한 특정의 간장 조제물에서 전체 CD45-음성 세포의 대략 0.3％가 Ep-CAM과 CD113를 동시 발현하였다.
도 17에서 보여진 실험에서 사용된 세포 조제물은, 도 14와 도 15에서 보여준 알부민 발현의 분석에서 사용된 것과 동일하다. 위에서 언급한 바와 같이, CD45 결손된 세포 집단에서의 세포의 대략 97.5％가 알부민에 대해 양성으로 염색되었고, 적은 알부민 음성 세포는 낮은 전방 산란과 측방 산란이 구별되는 패턴으로 나타났다. 도 17E에서 나타난 바와 같이, CD133과 Ep-CAM을 동시 발현하는 것으로 발견된 실질적으로 모든 세포(대략 99.5％)가 알부민 양성 세포에 특징적인 전방 산란 및 측방 산란의 특성을 나타냈다; 그들은 알부민 음성 세포의 모두를 함유하는 전방 산란 대 측방산란의 플롯의 경계를 지운 영역의 완전히 바깥쪽에 위치한다(도 15C 참조). 그러므로, Ep-CAM과 CD113을 동시 발현하는 출생후 사람의 간장세포는 사람의 혈청 알부민을 발현한다.
e. CD133 발현 및 Ep-CAM 발현세포의 동시 풍부화
도 16B에서 나타난 바와 같이, 자기 셀 소팅과 같은 양성 면역선택은 사람 간장 세포 조제물로부터 CD133-양성 세포의 풍부화를 가능하게 한다. 본 발명자들은 Ep-CAM의 발현을 위하여 출발 집단(이미 CD45-결손된) 및 CD133-풍부와 조제물에서의 세포를 평가하였다. 도 17A는 출발집단의 적어도 1.1%(신중히 엄격하게 게이팅된)가 Ep-CAM을 발현하였다. CD133-양성 세포의 풍부화 이후, 얻어진 집단(도 5B)은 적어도 4.5%의 Ep-CAM-양성 세포를 포함한다. 이것은 성체 사림 간장에서의 세포의 아집단에서의 CD133 및 Ep-CAM의 동시 발현을 확인하고, 이러한 세포들이 양성 면역 선택에 의해 풍부와될 수 있다는 것을 증명한다. 이들 2개의 표면 항원을 동시 발현하는 세포들에 의한 전방 및 측방 산란 분석(도 17의 실험에서와 같은)은 오히려 거의 100%의 이들 세포가 또한, 또한 알부민 양성임이 틀림없다는 것을 보여준다.
상기 성체 사람 간장세포는, CD133 또는 Ep-CA의 어느 것과 함께, 간세포의 계열의 원형 표지인 알부민을 동시 발현하고, 그 때문에 본 명세서에서 기재되어 있는 사람 태아 간장으로부터의 특정의 간 줄기세포와 동일한 표현형 프로필을 갖는다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 성체 사람 간 세포는 성숙 간세포보다 크기가 더 작은 간세포들이다(심지어 18-22마이크론 직경의 "작은 간세포"). 성체 사람 간장이 세포가 조작 가능하게 간 줄기 세포를 규정하는 조건하에서(즉, 무혈청 배지중에서, STO 지지세포를 사용하여) 콜로니를 형성할 수 있는 세포를 포함하는 것을 깨달음과 동시에 정리하면, 알부민, Ep-CAM 및 CD133의 동시 발현은 성인 간장중에서 그러한 줄기세포의 존재를 증명해준다. 본 명세서에 기재된 양성 면역 선택의 방법은 사람 간장(아이나 성인 유래의 조직을 포함)으로부터 간 줄기세포의 고도로 풍부화된 집단을 입수하기 위하여 2종의 표면 표지, Ep-CAM, CD133를 동시에 발현하는 세포를 분리하는데 사용될 수도 있다.
실시예 5
STO 영양 세포층 상에서 프록시멀 간 줄기세포의 초대 배양
모든 간장？프로제니터는, 프리미티브 간 줄기세포를 예외로 하고, 배아의 간장 기질 지지세포와 함께 동시 배양한 경우에 오래 생존하지 않는다; 신생아 간장, 성체 간장, 또는 다양한 성체 조직으로부터의 지지세포는 성공적이지 않았다(Sigal et al., 1994; Brill et al., 1995; Sigal et al., 1995;(Brill S, Zvibel I, and Reid LM. 배아 및 신생아의 랫 간장으로부터 조기 간 프로제니터를 위한 확장 조건. Digestive Disease and Science 44:364-371, 1999). 배아 간장 기질 지지세포는 배아의 기질 세포주인 STO 세포에 의해 치환될 수 있고, 배아 줄기세포를 위한 일상적인 지지세포로서 사용됨에 의해 새로 분리된 정상적인 설치류의 간 줄기세포와 2배체 성체 랫트 간장세포의 클론원성 확장을 지지하는 것이 발견되었다(Kubota and Reid, 2000). 이러한 조건들은 지지세포가 함께 그리고 없이, 확장되는 프리미티브 간 줄기세포를 예외로 하고, 사람 태아 간장으로부터 모든 프로제니터에 대해서도 필수적인 것이 발견되었다(Moss et al. 투고). STO 지지세포는 신생아 및 성체의 사람 간장으로부터 간의 프로제니터에 대해 성공한 것이 입증되었다(Ludlow et al,의 투고 준비중). 배아의 기질 지지세포에 의해 공급되고, 프로제니터에 대하여 필수적인 인자는 알려지지 않았다. 최초로 ATCC에서 유래하는 STO 지지세포를 10％ 소태아 혈청 FBS(Hyclone, Logan, Ut) 및 1％ DMSO(Sigma, St. Louis, Mo.)가 보충된 DMEM/F12(Gibco/BRL/In Vitrogen Corporation, Carlsbad, California)에서 75㎝ 플라스크 안에서 보존 세포로부터 확장되었다. 3회 계대하여 9개의 콘플루언트 플라스크를 얻고, 세포들을 10㎍/㎖의 미토마이신 C(Sigma, St. Louis, Mo; 또한 Biomol, Plymouth Meeting, PA)에서 2시간 처리하여 세포 사이클의 정지를 유도하고, 배양 배지에서 2회 세척하였다. 세포를 트립신 처리하고 동결 보존 배지(50％ DMEM/F12, 40％ FBS, 10％DMSO) 안에 재현탁하고, 그런 다음, 5×106 세포의 1㎖ 분량으로 동결하고, -80℃에서 보관하였다. 지지세포를 0.1％의 젤라틴(Sigma, St. Louis, Mo.)으로 프리 코팅된 배양 플레이트 상에 6×104 해동세포/㎠를 파종함으로서 조제하였다. [16]에 기재되어 있는 상세한 프로토콜은 참조로서 본 명세서에 넣었다.
삭제
STO 세포 상에서 계대된 세포를 0.2% 소혈청알부민(Fraction V 지방산 무첨가, Sigma, St. Louis), 알부민 (5 ㎍/㎖), 트랜스페린/Fe(10 ㎍/㎖), 셀레늄(3×10-8 M), 2-멜캅토에탄올(5×10-5M), 유리지방산의 콤플렉스 믹스(7.6μEq; [16, 17]), 히드로코르디존(10-7M), 글루타민(2mM), 니코틴아미드(4mM), 그리고 AAS(페니실린, 1000㎍/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 그리고 암포테라이신 B 250 ng/㎖, Sigma)로 보충된 RPMI 1640(GIBCO/BRL/InVitrogen Corporation, Carlsbad, California)를 함유하는 무혈청 호르몬 규정 배지(HDM) 중에서 배양하였다. 바람직하게는 사이토카인, 고전적인 간 성장인자(예를 들면, 상피성장인자 EGF, 간세포 성장 인자 HGF, 인슐린 유사 성장인자 IGFI 및 IGFII)의 어느 것도 사용되지 않았다.
실시예 1로부터 분산된 풍부화된 실질세포의 초대배양물을 STO 지지세포층 상에 플레이팅하고, 알부민, AFB, CK19를 발현하는 프록시멀 간 줄기세포의 안전한 응집물을 생성시켰다. 알부민, AFP, 그리고 CK19에 대해 염색한 고전적인 세포를 도 6a-6c에 나타낸다. 이러한 세포는 또한 CK8/18에 대해서도 양성이다. 실시예 6에서 기재된 플라스틱 기층 상에서 배양된 세포와는 달리, STO 지지세포에 파종된 프록시멀 줄기세포는 일정한 형태를 유지하고, 몇 주 동안 AFP 발현을 유지했다. 이러한 조건은 프록시멀 간 줄기세포와 보다 분화된 세포(2배체 성체 간 세포를 포함)의 양쪽을 지지하므로([7]), STO 지지세포를 이용하는 동시 배양은 프리미티브적인 콜로니 형성 세포의 선택에 적합하지 않다는 것이 증명되었다.
실시예 6
프리미티브 간 줄기세포의 선택
실시예 1의 풍부화된 실질 조직의 세포 현탁물을 2000-5000 세포/㎠의 밀도에서, 조직 배양 플라스틱 상에서, 지질, 인슐린 및 트랜스페린/Fe(HDM)를 보충한 무혈청 배지에서 플레이팅하였다. 플레이팅 후의 처음 12시간, 배지는 배양이 세포의 접착을 촉진하기 위해 10% FBS를 함유시키고, 그런 다음 배양은 무혈청에서 유지하였다. 배지의 교환은 3일 간격으로 하였다.
배양 직후, 배지 중에 존재하는 우세한 세포는 프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터, 고전적 실질 조직 세포 형태를 갖는 세포 응집물로서, 알부민, AFP, CK19의 발현을 수반하였다; 프록시멀 간 줄기세포는 알부민, AFP, CK19를 나타냈다(도 2a). 수일 후, 프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터는 AFP를 발현하는 것을 정지하고, 디쉬에 분산된 근육섬유모세포와 같은 외관을 갖는 단독 운동성의 세포 타입으로 치환되었다. 프록시멀 간 줄기세포뿐만 아니라 여러 다른 세포 타입이 배양 중에 존재하였다. 몇 개는 단독으로, 몇 개는 광범위한 콘플루언트한 단층을 형성하는 것에 반하여, 다른 것들은 분리한 원형 세포 그룹을 형성하였다. 세포의 이러한 형들 중에서, 알부민에 대하여 양성 염색은 단지 프록시멀 간 줄기세포, 관련 프로제니터, 그리하여 배양 중에 프록시멀 간 줄기세포 및 관련 프로제니터의 점차적인 소멸과 동시에 나타난 원형의 강하게 응집된 콜로니(프리미티브 줄기세포)에 있어서만 관찰되었다.
콜로니 형성은 예측 가능한 일련의 결과를 보여준다. 콜로니의 최초 파(wave)는 배양 최초의 수일 이내에 나타나고, 전에 존재하던 세포의 응집으로부터 발생하여 나타난다(도 1b). 그러나, 5-7일 후에 새로운 콜로니 형성의 파가 배양 디쉬 전체에 분산한 단독 세포들로부터 시작하였다. 이러한 콜로니는 최초, 주위에 좁은 연속하는 가장자리를 형성하는 레임리포디아(lamelipodia)를 갖는 작은 어둡고 빡빡하게 채워진 4-8개의 세포 그룹으로서 인식 가능하였다(도 2a). 이들 콜로니는 빡빡하게 응집된 원형의 직경이 8-10㎛의 세포의 광범위한 군으로 확장되었다(도 2b-2e). 이들의 후기에 형성된 콜로니의 전체적인 외관은 배양 초기에 형성된 콜로니(이것은 더 큰 세포들로 구성되어 있고, 태아의 간장에서 주요한 실질 조직의 세포를 구성하는 프록시멀 간 줄기세포의 초기 응집물에 유래한다)와는 별개이다.
프리미티브 간 줄기세포는 HDM 안에서 조직 배양 플라스틱에서 잘 자라고, 배양 몇 주 후에 1㎝까지 직경을 이루게 된다. 수많은 콜로니를 선택적으로 결손하고, 트립신처리에 의해 분산하여 직경 3㎜ 콜로니에 대하여 1000세포에서 직경 1㎝의 큰 콜로니에서의 15000-20000까지의 범위의 콜로니당 평균 세포수를 얻었다.
전형적으로, 가장 바깥쪽의 콜로니의 세포는 콜로니로부터 분리하여 배양 접시 전역에 분산된 단독의 큰 직경의 세포를 형성하도록 되는 편평한 표현형으로 전환되었다(도 3a). 다른 콜로니에서는 아마도 강하게 결합한 중간엽세포에서의 주변세포는 처음에는 콜로니의 주위를 밀접하게 둘러싸고 있는 긴 섬유모세포의 외견을 나타낸다(도 3b). 이러한 세포들은 분리된, 방추상(紡錘狀) 세포로서 콜로니로부터 떨어져 이동된다. 이러한 분산된 세포는 고도로 증식하여 남아 있고, 배양 중에 우세한 세포 형으로 되며, 디쉬 전반에 걸쳐 확장된 빡빡하게 채워진 층을 형성하였다. 콜로니는 이들 세포층에 둘러싸여 있지만, 이 세포층에 의해 지나치게 크게 되지 않는다. 그러나 2종류의 세포형이 점유하도록 된 각 콜로니의 경계에 이행 존이 형성되었다(도 3c).
실시예 7
플라스틱 배양에서 콜로니 형성 세포의 항원 프로필
실시예 6에서 배양된 세포의 항원적 특성을 간 기관발생에 관련된 표지에 대하여 면역세포화학 염색을 이용하여 조사하였다. 세포의 배양물을 상온에서 2분 동안 메탄올과 아세톤(50/50, V/V)의 혼합액으로 고정하였다. 몇 개인가의 염색 영역을 PAP 표지 펜(Research Products International Corp, Mt. Prospect, Illinois)으로 각 접시의 표면에 만들고, 동일 배양물 중에 복수의 항체 결합을 가능하게 하였다. 비특이적 결합 부위를 PBS 중의 10％의 염소 혈청(GIBCO/BRL/In Vitrogen, Carlsbad, California) 용액과 30분간 실온에서 인큐베이션하여 블록킹하였다. PBS로 2회 세척한 후, 1차 모노클론 항체를 각각의 염색영역에 적용하고(통상 영역당 0.1-0.3㎖), 하룻밤 인큐베이트하였다. 하룻밤 4℃에서 인큐베이트한 후, 세포들은 PBS로 2회 세척하고, 이어서 Alexa 488(1:750) 또는 Alexa 594(1:1250)(Molecular Probe, Eugene OR)의 어느 하나에 결합체화된 2차 항체와 함께 인큐베이트하였다. 어떤 경우에, FITC 또는 PE의 어느 하나에 결합체화된 1차 모노클론 항체가 이용하능하며, 결합체화하지 않은 1차 항체를 이용하는 표지 프로토콜의 완료 후에 이 항체를 이용하여 인큐베이션에 의한 2중 표지를 위한 수단을 제공하였다.
항원성 프로필을 표 2에 요약한다. 콜로니는 알부민(도 4a), CK19(도 4b), EpCAM(도 4c), NCAM(CD56 도 4d)을 포함하는 간세포형에 이전에 관련된 다수의 표지에 대하여 양성으로 염색하였으나, PECAM(CD31; 데이터는 나타내지 않음)에 대해서는 염색되지 않았다. c-kit 염색은 콜로니 경계의 좁은 세그먼트로 전체적으로 국재하고 있는 몇 개인가의 콜로니에서 보였다(도 5a). 또한 콜로니는 추정 줄기세포 표지, CD133(AC133, 도 5c)에 대하여 양성이다. 흥미롭게, 콜로니 주변의 이행 존의 세포는 최근 기재된 내피 표지, CD 146(M-CAM, 도 5c)에 대해 양성으로 염색되고, 콜로니 근방에 있는 사이, 이 단백질에 대해 양성으로 남아 있는 반면에, 아마도 밀접하게 관련하는 중간엽 세포형(아마도 내피 프로제니터)를 동정한다. 콜로니로 출현한 프리미티브 간 줄기세포는 AFP에 대해 음성이었다. 이 것은 프리미티브 간 줄기세포가 프록시멀 간 줄기세포의 프로제니터임이고, 이것은 다음에는 간세포 프로제니터와 담관의 프로제니터의 전구물질인 것을 나타낸다.
[표 2] 배양된 세포의 표현형
실시예 8
플라스틱 하부층으로부터 STO 영양세포로의 콜로니 세포의 계대 배양
STO 지지세포를 사용하여 플라스틱 하부층으로부터 선택적 게대 배양 후에 프리미티브 간 줄기세포의 운명을 평가하였다. 1-2주의 배양후에 실시예 6의 플라스틱 하부층위의 콜로니를 쌍안 확대경 하에서 흡인에 의해 플라스틱 하부층으로부터 100㎕ 피펫으로 물리적으로 빨아 올렸다. 50콜로니까지 HBSS 모드 중에 수집하고, 이어서 콜라게나제 용액 중에서 20분간 교반하면서 소화하여 세포를 현탁물에 분산시켰다.
플라스틱에서 STO 지지세포 층으로 계대 배양 후의 콜로니 형성 효율은 500 또는 50 세포수/㎠의 밀도에서 계대한 세포에 대해 0.5-1% 사이의 범위로 낮다. 계대 배양된 콜로니 형성 세포의 최초 접착은 플레이팅 배지 중에서의 EGF (20 ng/㎖)의 존재하에 개선되었다. 낮은 콜로니 형성 효율은, 부분적으로는 단일 세포 현탁액을 이루기 위해 매우 긴(최대 20분) 콜라게나제 소화에 세포를 공여하는 필요성에 기인한 가능성이 있다.
STO 지지세포로의 계대 배양 후에, 프리미티브 프로제니터가 STO 세포 층으로 융합하고, 4-5일의 배양 후에 작은 세포의 빡빡하게 꽉 찬 콜로니처럼 다시 나타났다(도 6a). 새로운 콜로니는 다음 수주에 결쳐 크게 되고, 빡빡하게 응집된 원형의 군을 생산하고, 가끔 주위가 조금 두꺼워지기도 한다(도 6c). 어떤 콜로니에서는 제2의 증식 단계가 일어나서 세포의 출현이 콜로니의 가장자리의 한 점에서 일어나고, STO층 전체로 퍼져나가고, 종종 원래의 콜로니를 둘러싸기도 한다(도 6c).
STO 세포 위에 형성되는 콜로니의 세포의 면역세포화학적 특성은 플라스틱 하부층 위에 있는 콜로니 형성 세포에 대해 위에서 기술한 바와 같았다. 이것은 알부민, CK19, CK18 그리고 CD133에 대해 양성 염색을 포함한다. 플라스틱 상에서 자란 최초의 콜로니에서와 같이, CD146 및 NCAM과 같은 표지가 STO 세포 상에서 형성된 콜로니의 주변에서 가장 명확하게 발현되어 있다. 이 경계의 발현 패턴은 콜로니가 1차 콜로니로부터 증식된 세포에 의해 둘러싸였을 때, 휠씬 더 잘 나타나게 된다. 이것은 도 9에서 NCAM에 대해서 명확히 나타나 있으며, 계대 배양된 세포로부터 형성된 원래의 콜로니와 2차적인 증식 사이의 계면이 강한 양성인 NCAM 발현을 갖는 세포 밴드에 의해 강조되고 있다. 이 패턴은 또한 팬(pan) 사이토케라틴 표지 CAM 5.2의 발현에 대해서도 보이고, NCAM 및 CAM 5.2에 대해서 이중 표지는 이들 2개의 표지가 경계 세포의 같은 영역에서 높은 수준으로 발현되었음을 나타낸다(도 9).
마지막으로, 출현하는 세포 형태의 특성은 관심 대상의 것이었다. 왜냐하면, 이들은 명확한 세포간 공간을 갖는 선상으로 배열된 세포의 분기 패턴으로 확장하는 세포의 병행한 열로 되는 별개의 배열에서 콜로니로부터 출현한 것이었기 대분이다(도 8). 이 세포들가 원래의 세포 콜로니 주위의 광범위한 시트로 확장되었을 때, 그들은 출현 시점에서 명백한 선상의 조직을 잃게 나타났다. 그러나, 알부민에 대한 염색은 세포의 열로의 조직화가 세포괴 중에서 유지된다는 것이 밝혀졌고(도 10a), CD 146에 대해서 동시 염색은 이 표지도 또한 증식되는 세포 그룹 안에서 높은 수준에서 발현된다는 것을 보여주었다(도 10b). 아마도 이러한 세포들에서 가장 중요한 것은 출현하는 세포들의 주위에서 AFP에 대해서의 염색의 출현이다(도 11). 이것은 AFP 발현이 최초의 콜로니 형성 세포의 계통적 자손에 관련지울 수 있다는, 본 명세서 중에 기재되는 생체 밖 조작에서 최초의 포인트를 나타낸다.
실시예 9
신생아 기증자로부터의 간에서의 프리미티브 및 프록시멀 간 줄기세포의 존재
간장을, 임신 후 대략 28주 후에 태어나고 단지 하루 생존한 기증자로부터 입수되었다. 심장정지와 제공자의 기관의 수집 및 세정 사이의 따뜻한 허혈(warm ischemia) 기간은 6-7시간 사이였다. 그 이후에 기관을 약 12시간 얼음 위에서 유지하였다. 전체의 기관(젖은 중량이 대략 100그램)을 관류하고, 리버라아제(liberase)로 소화하고, 그리고 세포 현탁물을 사람의 아이나 성인으로부터 입수한 간장에 대하여 본질적으로 동일하게 조제하였다. 살아 있지 않은 세포 및 많은 적혈구는 옵티프립(Optiprep)을 사용하는 조제 원심분리에 의해 제거했다. 그러나, 최종 조제물 중의 살아있는 비-적혈구 세포의 실제 수율과 비율을 결정하는 곤란하였다.
회수한 세포의 일부를 태아 간 세포에 대해여 기재된 바와 같이 본질적으로 동일하게, 분별 원심분리를 하여 적혈구를 다시 제거하고, 이어서 프리미티브 간 줄기세포의 존재를 결정하기 위하여 적합한 조건하에 배양에 파종(seed)하였다(즉, 무혈청 호르몬적으로 규정된 배지 중에서 조직 배양 플라스틱 하부층 상에서의 플레이팅). 세포의 다른 부분은 추가 정제하지 않고, 프록시멀 간 줄기세포에 대하여 앗세이하기 위한 조건하에 플레이팅하여 된다(예를 들면, STO 지지세포와 무혈청 배지 안에 플레이팅). 세포의 다른 부분은 타입 Ⅰ 콜라겐에서 코팅된 조직 배양 플라스틱 상, 5 ng/㎖의 보충적인 상피 성장인자(EGF)를 함유하거나 함유하지 않는 무혈청의 규정된 배지 중에 파종했다.
적합한 기간의 인큐베이션 후, 간 콜로니의 증식을 모든 시험 조건에서 관찰하였다. 프리미티브 및 프록시멀 간 줄기세포에 대하여 각각의 앗세이에 있어서, 콜로니의 형태 및 증식의 속도는 동일 조건에서 배양된 사람 태아의 간(일반적으로 임신 22주 후에 입수된 것)으로부터 배양된 세포에 대하여 관찰된 것과 유사하였다. 대표적인 콜로니는 사람 알부민의 발현에 대하여 면역 형광 염색에 의해 시험한 바, 이 표지에 대하여 모두 양성이었다.
명백한 상피성(추정적으로는 간성)의 형태의 콜로니가 EGF 존재 하에 콜라겐 코팅된 플레이트 상에 나타났다. 보다 충분히 규정되지 않은 형태의 추가적인 세포가, 또한 이러한 배양 중에서 빠르게 증식하였으나, 아직까지 상세히 특징지워져 있지 않았다.
상피 세포와 추정되는 콜로니가, 또한 보충적인 EGF의 비존해하에서 콜라겐이 코팅된 플레이트 상에 나타났다. 이러한 콜로니의 몇몇을 수동 피펫팅 기구를 사용하여 각각 끓어올려 96 웰 플레이트 중의 신선한 배지로 옮겨진다. 어떤 콜로니로부터의 세포는 이와 같은 배양 중에서 계속 증식시켜 세포주로서 계대 배양한다. 이들이 러한 것은 스트레인, 잠재적으로 증식 가능한 간의 프로제니터(아마도 줄기세포) 주인 가능성은 높다고 생각된다. CD133, Ep-CAM, 알부민, AFP, CK19를 포함하는 항원의 발현의 또 다른 특징지움으로서, 이들 추정적 간 줄기세포주의 분화의 상대적 상태가 결정될 것이다.
실시예 10
플로우 사이토메트리 소팅 및 플로우 사이트메트리 분석(FACscans)
세포질 항원의(예를 들면, 알부민, AFP)의 FACscans을 항혈청(antisera)을 이용하는 염색 전에 3％의 파라포름알데히드를 이용하여 고정 및 투과화 처리한 세포를 이용하여 실행하였다. 세포를 관련하는 형광 프로우브를 사용하여 직접적으로 표지한 항체를 사용하는 이외는 면역 형광에 관해 나타낸 것과 동일하게 염색하였다(표 3과 4 참조). 플로우 사이토메트리를 시토메이션(Cytomation) "Moflow" 플로우 사이토메터(Fort Collines, Colorado)(Larry Arnold 박사에 의해 관리되는 FACs 설비)에서 실행하였다. 덮은 액(sheath fluid)은 변경되지 않은 HBSS였다. MoFlow 사이토메터는 40000세포/초의 분석 또는 소팅이 가능하며, 이 때 12개의 파라미터를 병행하여(전방 산란 및/또는 측방 산란의 조합에서 6 "칼라"), 99％ 이상의 정확성을 갖는다. 대부분의 소트를 위하여 4W 아르곤 레이저를, 60mW의 전원 및 100μm 노즐과 함께 사용되었다. 488 nm 여기상태에서의 형광발광을, FITC를 위한 530/30nm 밴드 통과 필터를 통하여 수집했다. 형광은 로그 증폭에 의해 측정했다. 형광이 음성 대조군 세포의 95％ 보다 높을 때, 세포를 양성으로 간주했다. E-1의 검출 값을 전방산란(FSC)을 위해 중간 정도 범위의 증폭과 함께 사용하고, 그리고 검출기를, 측방 산란(SSC)을 위한 중간 범위에서 1의 증폭과 함께 사용하였다. SSC 게이팅을, 선상 증폭에 의하여 파라미터 분할을 256 임의의 단위로 하여 행하였다. 염색되지 않은 세포, 관련없는 항체 및 동일한 형광 프로우브로 염색한 세포 또는 동일한 항체를 이용하는 형광 프로우브를 사용하지 않는 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 샘플에서 30000-50000세포를 앗세이하였다. 음성세포(음성 대조보다도 높은 형광을 갖는 것)을 입도, 크기, 그리고 형광정도에 대해서 다시 평가하였다. 소팅 전후에서의 세포를 10％의 혈청을 부가한 HDM 중 4℃에서 유지하였다.
[표 3] 단일클론항체
[표 4] 플루오로프로브
세포질 항원(예를 들면, 알부민, AFP)의 플로우 사이토메트리 분석을 위하여, 세포를 항혈청(antisera)을 사용하는 염색 전에, 3％의 파라포름알데히드를 사용하여 고정 및 투과화 처리했다. 세포를 면역 형광에 대하여 나타난 것과 동일하게 염색하였다. 2개의 표지를 이용하는 분석을 위해 별개인, 파장이 중복하지 않는 형광 프로우브로 표지된 제2의 항체를 사용하였다. 분석은 Becton Dickenson FACscan을 사용하여 실행하였다. 제2 항체만 염색된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 샘플에서 30000-50000 세포를 앗세이하였다. 음성 대조군보다 더 큰 형광을 가진 양성 세포를 입도, 크기, 그리고 형광의 정도에 대하여 평가하였다.
실시예 11
태아 조직에서 얻은 간 세포 현탁물 중의 알부민과 알파-태아단백 발현의 결정
이 실험에서, 프록시멀 간 줄기세포와 프리미티브 간 줄기세포에서의 알부민과 알파-태아단백의 발현을 시험했다. 침전물 획분이 간모세포에서 풍부화되어 있는(프록시멀 간 줄기세포)에 대하여, 계면은 콜로니 형성 세포에서 풍부화되어 있는(프리미티브 간 줄기세포) 것이 처음으로 결정되었다.
알부민 발현은 모두 새롭게 분리된 세포중에서 10일간 배양된 후의 계면의 세포와 침전된 세포사이에서 동등하다. 그러나, 그 발현은 배양중에 감소한다. 이것은 알부민 음성의 비실질세포의, 더 낮은 발현 또는 증식에 기인할 가능성이 있다. 배양에 대해서의 관찰은 둘 다 이러한 패턴에 기여함을 나타내고 있다(도 20).
AFP는 새롭게 분리된 침전 획분중에서 강하게 발현되고, 계면 세포중에서는 약하게 발현된다. 이것은 AFP가 콜로니 세포에서 발현되지 않은 관찰과 일치한다. 배양 10일 후에 AFP는 침전물이나 계면 세포에서 검출될 수 없다. 배양 중의 콜로니 세포는 알부민을 발현하는 AFP를 발현하지 않는다. 이것은 모든 세포에서 AFP 발현의 억제를 가져오는 조건(플라스틱 배양)에 기인한 것인지도 모른다. 그러나, 계면 세포에서의 낮은 AFP 발현은 AFP가 이들 세포 중에서 강하게 발현되지 않는 것을 시사한다(도 20). 또한, 콜로니 세포가, 침전 세포에서의 AFP 발현의 연장을 지지하는 조건에서 배양될 때(STO 동시 배양), 그들은 아직 AFP 발현에 대하여 음성이다. 알부민 또는 알파-태아단백에 결합하는 항체 사이에서는 교차반응성이 존재하지 않고, 빈 레인에서는 어떠한 신호도 관찰되지 않았다.
이러한 실험의 결과는 AFP가 새로운 분리된 침전 획분중에서 강하게 발현하고, 계면 세포에서는 약하게만 발현되는 것을 나타낸다. 이것은 AFP가 콜로니 세포중에서 발현되지 않는 다는 관찰과 일치한다.
본 발명은 간세포를 성장시키는 다기능 세포인 사람 간 줄기세포, 사람의 간 도관판 줄기세포를 분리하는 방법, 분리하는 프록시멀 간 줄기세포, 관련된 간세포의 프로제니터와 관련된 담관 프로제니터를 개시한다. 따라서, 본 발명의 세포로 이루어진 조성물은 사람 세포의 연구, 백신 또는 항바이러스제의 생산, 독성학적 연구, 의약 개발, 단백질 제조; 간장 세포 치료, 간장 유전자 치료, 연구, 독성학적 및 항바이러스 연구, 단백질 제조, 또는 간장 보조 시스템으로 임상적으로 사용될 수 있는 생체 인공 간장을 포함한 장기의 확립에 이용할 수 있다.
Claims (76)
- 분리된 1차 사람 프리미티브 간 줄기세포가 알파-태아단백을 발현하지 않고, Ep-CAM을 발현하고, 헤파토사이트의 프로제니터 또는 담관의 프로제니터를 발생할 수 있는 능력을 갖는 프록시멀 간 줄기세포의 전구체인 분리된 1차 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 Ep-CAM, AC133 및 알부민을 발현하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 더욱이 사이토케라틴 8/18, 사이토케라틴 19 또는 그들의 조합을 발현하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 더욱이 N-CAM, CAM5.2, c-kit, CD 146 또는 그들의 조합을 발현하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 프록시멀 간 줄기세포의 전구체인 조성물.
- 제1항에 있어서, 프리미티브 간장 줄기세포가 헤파토사이트의 프로제니터의 전구체인, 사람의 프리미티브 간장 줄기세포로 이루어진 조성물.
- 제1항에 있어서, 프리미티브 간장 줄기세포가 담즙 프로제니터의 전구체인, 사람의 프리미티브 간장 줄기세포로 이루어진 조성물.
- 제5항에 있어서, 프록시멀 간 줄기세포가 알파-태아단백, 알부민 및 사이토케라틴 19를 발현하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 프록시멀 간 줄기세포가 Ep-CAM, AC133, 사이토케라틴 8/18 또는 그들의 조합을 발현하는 조성물.
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- (a) 사람 간 세포로부터 유래된 세포의 단일 세포 현탁액을 얻고,(b) 이들 단일 현탁액으로부터 알파-태아단백(AFP)를 발현하지 않고, Ep-CAM을 발현하고, N-CAM, c-kit, CK19의 적어도 1종을 발현하는 세포들을 선택함을 특징으로 하는 사람 프리미티브 간 줄기세포를 분리하는 방법.
- 제13항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 알부민을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 사이토케라틴 19를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 제 13항, 14항, 또는 15항에 있어서, CD45 또한 발현하는 세포들을 결손하는 것(c)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 사람의 프리미티브 간 줄기세포를 분리하는 방법에 있어서,(a) 사람의 간 조직으로부터 유래된 단일 세포 현탁액을 제공하고;(b) 단일 세포 현탁액 중의 조혈모세포와 비실질세포로부터 실질세포을 분리하여 실질 단일 세포 현탁액을 얻고;(c) 인슐린, 트랜스페린 및 지질을 포함하는 무혈청 배지 중에서 표면 위의 (b)의 실질 단일 세포 현탁액을 배양하여 단일 세포 현탁액이 콜로니를 형성하게 하고; 그리고(d) 알파-태아단백(AFP) 발현에 대해 음성인 이들 콜로니를 선택함을 특징으로 하는 사람 프리미티브 간 줄기세포의 분리방법.
- 제34항에 있어서, 간 조직은 태아, 신생아, 영아, 아이 또는 성인으로부터 획득된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 세포의 단일 세포 현탁액은 실질세포가 풍부한 사람의 간 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 표면이 코팅되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항에 있어서, 코팅되지 않은 표면은 플라스틱 표면임을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 플라스틱 표면은 하전된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항에 있어서, 하전된 플라스틱 표면은 조직 배양 플라스틱인 것을 특징으로 하는 방법.
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- 제34항에 있어서, 막 생산 인자가 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 지질이 유리 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 무혈청 배지가 추가로 히드로코르티손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 무혈청 배지가 추가로 항산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 항산화제가 셀레늄인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포는 프록시멀 간 줄기세포, 헤파토사이트의 프로제니터 또는 담관의 프로제니터의 전구체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항 기재의 방법에 의해 분리된 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
- 제34항 기재의 방법에 의해 분리된, Ep-CAM, AC113 및 알부민을 발현하는 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
- 제34항 기재의 방법에 의해 분리된, Ep-CAM, AC113, 알부민, 사이토케라틴 8/18, 및 사이토케라틴 19를 발현하는 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
- 제34항 기재의 방법에 의해 분리된 사람의 프리미티브 간 줄기세포가 또한 (ⅰ) Ep-CAM, AC113, 알부민, 사이토케라틴8/18 및 사이토케라틴 19 및 (ⅱ) N-CAM, CAM5.2, c-kit, CD 146 또는 그들의 조합을 발현하는 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
- 제13항 기재의 방법에 의해 분리된 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
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- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 사람의 프리미티브 간 줄기세포가 외인(exogenous) 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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- 알파-태아탄백을 발현하지 않고, Ep-CAM을 발현하고, 헤파토사이트의 프로제니터 또는 담관의 프로제니터를 발생할 수 있는 능력을 갖는, 분리된 1차 사람 프리미티브 간 줄기세포.
- 제1항에 있어서, 프리미티브 간 줄기세포가 PE-CAM을 발현하지 않는 조성물.
- 제74항에 있어서, 외인(exogenous) 핵산을 포함하는 사람의 프리미티브 간 줄기세포.
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