JP2005520513A - 始原肝幹細胞および近位肝幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、成熟肝細胞を生じる多能性細胞であるヒト肝幹細胞に関する。これらは、2つの幹細胞集団を含む:近位(proximal)肝幹細胞を生じる非常に始原的な前駆細胞である導管板(ductal plate)幹細胞、肝実質細胞および胆管細胞を生じる近位幹細胞。本発明はまた、ヒト肝導管板幹細胞を単離する方法、ならびに近位肝幹細胞および肝実質細胞関連(committed)前駆細胞および胆管関連前駆細胞を単離することに関する。本発明の細胞を含む組成物は、細胞治療および遺伝子治療のため、ならびに生体人工器官の確立のために使用され得る。
1. ヒト肝臓の解剖学
成熟肝の主要な構造的および機能的単位は腺房であり、これは、横断面において2つの別個の血管床の周りに車輪様に組織化されている:末梢に3〜7セットの門脈三管(各々が門脈細静脈、肝細動脈、および胆管を有する)があり、中央部に中心静脈を有する。肝細胞は、有窓内皮の両側に並ぶ細胞板として組織化され、これは、門脈および中心の脈管系と連続する一連の肝洞様毛細血管を規定する。最近のデータにより、ヘーリング管(各々の門脈三管の周りに位置する細管)が、ボトルブラシと同様のパターンを形成するゾーン1の全体にわたって伸長し肝板(liver plate)に接合する小管を産生することが示された(Theise, N. 1999 Hepatology. 30: 1425-1433)。
肝臓は、後部前腸および横中隔(内臓間葉の一部)から形成される憩室の集合の結果として発生する。肝細胞の形成は、内胚葉性の上皮が心臓性中胚葉と、おそらく線維芽細胞成長因子を介して相互作用した後に開始する。次いで、特定の肝細胞が増殖し、索状構造様の様式で横中隔の間葉に突き通り、肝臓の原基を形成する。直接的な上皮−間葉相互作用は、これらの初期の肝臓の発生段階において決定的であり、肝実質細胞または胆管細胞、および有窓内皮になる細胞をそれぞれ指示する。間葉特異的遺伝子hlxおよびjumonjiの変異は肝発生をブロックし、これは、この組織からの寄与の重要性を示す。その発生の初期において、肝臓は、基底膜を欠く連続的な内皮に接する近位肝幹細胞のクラスターおよび豊富な造血細胞からなる。内皮が不連続的な有窓内皮になるように変化するのにつれて、脈管系(とりわけ、門脈の脈管系)は基底膜の産生を伴ってより発達する。門脈間隙は胆管の発生のための引き金を提供し得、そしてそれが門脈細静脈、肝細動脈、および胆管を取り囲んで、門脈三管が形成される。近位肝幹細胞は迅速に増殖し、そして、おそらくC-CAM 105、Agp110、E-カドヘリン、およびコネキシンのような組織を組織化する分子の量および分布の変化に応答して、大部分ではあるがすべてではない造血細胞の骨髄への再配置と同時に、実質板(parenchymal plate)が形成される。最近の研究により、いくつかの造血前駆細胞が成体静止状態げっ歯類肝臓(adult quiescent rodent liver)に存続すること、および造血幹細胞が成体ヒトおよびマウスの両方の肝臓から単離されたことが示唆されている(Crosbie, O. M. ら、1999. Hepatology. 29: 1193-8)。
米国においては、毎年約250,000人が肝不全のために入院している。肝移植はいくつかの型の肝不全に治療効果があり、およそ4100例の移植が米国で1年に行われている。肝移植における1つの限定要因は、とりわけ臓器移植のためのドナー肝臓は心停止でなく脳死を経た患者に由来しなくてはならないという制約を考慮すると、ドナー肝臓の利用可能性である。死体のドナーを使うための最近の努力により、肝臓が死から1時間以内に入手される場合それらを使用する可能性があることが支持されているが、このようなドナーからの肝臓では成功していない。
幹細胞は、肝臓疾患のための代替的な細胞に基づく治療である。分化全能性幹細胞は、自己複製可能な始原細胞であり、多能性である(すなわち、1つより多くの発生運命を有する娘細胞を産生する)。これは、広範に拡張し得、1つまたは複数の組織を再構築し得る決定された幹細胞(determined stem cell)を生じ得る。幹細胞に関する文献の大部分は、胚に関する文献から、または造血組織、表皮組織、もしくは腸組織に関する文献のいずれかから派生する。
決定された幹細胞は、その遺伝的潜在能力を限られた数の細胞型についてのそれに制限され、かつ広範な増殖潜在能力を有する多能性細胞である。増加しつつある証拠(例えば、テロメラーゼの分野における証拠)により、決定された幹細胞は厳密な意味で自己複製しない、すなわちそれらの子孫は親よりも低い成長潜在能力を有し得ることが示唆されている。決定された幹細胞は、それらの遺伝的潜在能力を単一の運命(例えば、肝実質細胞、この細胞の関連づけられた前駆細胞(committed progenitor)は肝実質細胞関連前駆細胞といわれる)に制限することによって多能性を失う娘細胞である、関連づけられた前駆細胞を生じる。肝細胞系列には、肝実質細胞関連前駆細胞(肝実質細胞を生じる)および胆管関連前駆細胞(胆管を生じる)がある。
肝臓からの肝前駆細胞の単離は、肝細胞を陽性選択するマーカーの不足が原因で、極度に困難な作業であることが知られている。肝前駆細胞の候補のための唯一の利用可能な抗体は、肝前駆細胞の亜集団(腫瘍形成性傷害にさらされた宿主から単離された場合、卵円細胞(oval cell)と呼ばれる)に対して調製されるモノクローナル抗体である。しかし、これらの抗体は造血細胞に存在する抗原と交差反応する。
本発明は、近位肝幹細胞、肝実質細胞、または胆管の前駆細胞に対する前駆細胞であるヒト始原(primitive)肝幹細胞を含む組成物に関する。本発明のヒト始原肝幹細胞は、ep-CAM、AC133、およびアルブミンを発現する。
1. 定義
以下の記載において、多数の用語が本発明を記載するために広範に使用される。このような用語に与えられる範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
αフェトプロテイン(AFP)およびアルブミンは共に細胞質タンパク質であり、タンパク質としてアッセイされる場合、肝細胞系列についての特に信頼できるマーカーである。これらのタンパク質の変異体型をコードするメッセンジャーRNAは、造血前駆細胞において発現されるが翻訳されない;例えば、AFP mRNAの変異体型は、エキソン1コード配列が、代替的なエキソン1または2つのエキソンのいずれかで置換され、肝細胞におけるものと異なっている(Kubota、Storm、およびReid、投稿中;また特許出願中)。それゆえに、これらの2つのタンパク質の発現は、肝臓における他の細胞型からの肝亜集団の同定のための基礎である。肝臓の発生において、AFPおよびアルブミンの存在は、肝前駆細胞の強力な陽性指標として認められている。肝臓発生の最も初期の段階において、これらの細胞は、胆管系列および肝実質細胞系列の両方に入る子孫を産生し得る。これらの娘細胞が胆管系列に関連する場合、AFP発現は停止する。しかし、AFP発現は肝実質細胞系列においては周産期に抑制されるまで持続し、アルブミン発現は成体肝実質細胞の主要な特徴の1つとしてそのまま留まる。
肝臓細胞の単離は通常、組織の単一細胞懸濁物への酵素的および機械的解離、続いて密度勾配遠心分離、遠心分離的精製、ディファレンシャル酵素消化のプロトコールを用いる分画を含み(すなわち肝星細胞)、および/または細胞培養を使用する選択を伴う(Freshney、「Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique」1983, Alan R Liss, Inc. NYに概説されている)。肝臓組織は、胎児、新生児、乳児(誕生から1歳まで)、小児(1歳から思春期まで)、または成人(思春期過ぎ)から得られる。密度勾配遠心分離が、異なる細胞集団(例えば、肝芽細胞)を分画および単離するために好ましく使用される。
近位肝幹細胞および肝関連前駆細胞は、胚性肝間質支持細胞と、規定のホルモンおよび成長因子の混合物を添加した無血清培地とを必要とする[1-6]。近位肝幹細胞、関連前駆細胞、および二倍体成体肝細胞の、クローン原性の拡張および鍵となるマーカーの維持の延長は、胚性肝間質支持細胞が、インスリン、トランスフェリン/Fe、および好ましくはヒドロコルチゾンを添加した無血清のホルモン的に規定された培地と組み合わせて、STO支持細胞と置き換えられた場合に起こり得る[7]。これらの条件が胎児組織からの多様な範囲の前駆細胞および二倍体成体細胞のコロニー形成さえも支持するならば[7]、異なる条件が始原肝幹細胞を選択するために必要である。
本発明は、ヒト肝臓組織から始原肝幹細胞を単離する方法を包含し、この方法は、肝臓組織に由来する細胞懸濁液、好ましくは実質細胞について富化されたものをプラスチック表面に適用する工程と、成熟肝細胞、近位肝幹細胞、および関連前駆細胞を除去するストリンジェントな培養条件に細胞を供する工程とを含む。ストリンジェントな培養条件には、炭水化物代謝のレギュレーター、鉄の供給源、膜産生因子、および好ましくは抗酸化剤を補充した無血清培地の使用が含まれる。
ヒト近位肝幹細胞は、肝実質細胞もしくは胆管上皮、またはその組み合わせを生じる。ヒト近位肝幹細胞は、Ep-CAM、CK8/18、サイトケラチン19、αフェトプロテイン、およびアルブミンを同時発現し、亜集団はAC133を発現する。ヒト近位肝幹細胞は種々の方法によって単離され得、これらには(i)EP-CAMを同時発現する細胞の免疫選択、(ii)好ましくは実質細胞について富化した肝臓由来の細胞懸濁物を、発生誘導因子を用いて培養すること、または(iii)ヒト始原肝幹細胞を発生誘導因子を用いて培養することが含まれる。発生誘導因子は好ましくは二次的な細胞によって供給される。好ましい二次的な細胞には、STO支持細胞、胚肝間質細胞、または内皮細胞が含まれる。
本発明はまた、肝前駆細胞に特異的な細胞表面マーカーを免疫選択することに基づく肝臓由来の細胞懸濁物から肝前駆細胞を単離する方法を含む。肝前駆細胞は、ep-CAMを発現する細胞を選択することによって本発明に従って単離され得る。好ましくはこれらの細胞はAC133をさらに発現する。本発明の免疫選択された肝前駆細胞は、好ましくはさらにアルブミンを発現し、より好ましくはさらにサイトケラチン19を発現する。好ましくは、免疫選択された肝前駆細胞は幹細胞である。
本発明はまた、始原肝幹細胞から近位肝幹細胞および関連前駆細胞を産生する方法を包含し、この方法は、STO支持細胞層上およびHDM中に直接的にプレーティングする工程、または、培養プラスチック上のコロニーからSTO支持細胞層に始原肝幹細胞を移す工程のいずれかの工程と、始原肝幹細胞のコロニーから近位肝幹細胞が出現することを可能にする工程とを含む。
本発明の単離された前駆細胞は、肝臓に方向付けられた細胞および/もしくは遺伝子治療のために、またはワクチンを生成するためのウイルス産生(例えば、C型肝炎ウイルス)のための宿主となる細胞として、使用され得る。また、本発明の前駆細胞は、肝臓生検(例えば、パンチ生検)からエキソビボで拡張され得、拡張された細胞は、自系もしくは同種異系の細胞、または遺伝子治療のために使用されるか、あるいは臨床的にまたは学問的な研究のために使用され得る生体人工肝臓を作製するためにバイオリアクターに播種するために使用される。このことにより、患者の肝臓の主要な侵襲的外科的切除の必要性が排除される。
ヒト肝臓の始原肝幹細胞および近位肝幹細胞についての用途は多く、多様である。それらには以下が含まれる:1)ヒト細胞上での研究;2)ワクチンまたは抗ウイルス剤の産生;3)毒物学的研究;4)薬物開発;5)タンパク質製造(種々のヒト特異的因子の製造のための宿主として細胞を使用する);6)肝細胞治療;7)肝臓遺伝子治療;および8)研究、毒物学的および抗微生物学的研究、タンパク質製造、または臨床的に肝臓補助系として使用され得る生体人工肝臓。始原肝幹細胞および近位肝幹細胞が肝実質細胞および胆管細胞に分化する能力を考慮すると、本発明の細胞は、それらが置かれる微小環境に依存して肝臓および胆管の両方の細胞運命のために使用され得る。
胎児組織からの肝細胞懸濁物の調製
肝臓組織を、妊娠の選択的終止によって得られた妊娠18〜22週齢の間の胎児から得た。肝臓組織試料を、10%胎仔ウシ血清を補充したRPMI 1640中に一晩浸した。
OCS=もともとの細胞懸濁物;C-OCS=もともとの細胞懸濁物を専用のバッファー中で凍結保存した。後に細胞を融解し、次いでマーカーの発現について分析した。多くの細胞(特に赤血球細胞)(除核された亜集団)は凍結保存で生存しない。実質調製物=低速回転で遠心分離を繰り返すことによる赤血球細胞および他の浮遊非実質細胞の除去後;n.d.=行っていない。
成人組織からの肝細胞懸濁物の調製
ヒト肝臓を認可された臓器調達機関から入手した。ドナーは脳死した13歳の女性であった。肝臓を臓器全体灌流技術を使用して消化した。次いで、単一細胞懸濁物を、2ステップOptiprep勾配(9-12.5%)を使用して、Cobe 2991セルウォッシャー上で分画して生存可能な細胞を得た。次いで、Cobe 2991上でのさらなる分画のために、等量の9%分画細胞(バンド1)および12.5%分画細胞(バンド2)を25% Optiprepと個々に混合することにより、生きている細胞を残った死細胞から分離した。前方(forward)および側方の散乱パラメーターのフローサイトメトリー分析に基づき、バンド1およびバンド2の細胞組成は同様であると思われた。細胞を凍結保存した。
成体ヒト肝細胞からのコロニー形成
コロニー形成による肝幹細胞の存在を評価するために、実施例2からの細胞を融解し、12,500生細胞/ウェルの密度で、6ウェルプレート上、三つ組で、STO-5支持細胞層上にプレーティングした。使用した組織培養培地は、ペニシリン/ストレプトマイシン(50U/ml/50μg/ml)、ウシ血清アルブミン(0.2% w/v)、トランスフェリン(10μg/ml)、遊離脂肪酸(7.6μEq/L)、ニコチンアミド(nicotinomide)(4.4mM)、セレン(3×10(-8)M)、銅(1×10(-6)M)、2-メルカプトエタノール(5×10(-5)M)、L-グルタミン(2mM)、インスリン(5μg/ml)、ヒドロコルチゾン(10(-7)M)を含み、上皮成長因子の添加あり(+EGF)または添加なし(-EGF)の、DMEM F12であった。
成体ヒト肝細胞の亜集団におけるアルブミン、CD133、およびEp-CAMの同時発現
細胞を、本質的に実施例2に記載されるようにドナーの肝臓から単離した。CD45細胞表面抗原、または白血球共通抗原(白血球(leukocyte)上で広範に発現するチロシンホスファターゼ)を発現する細胞の存在を、抗CD45モノクローナル抗体を使用する蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって評価した。約17%の細胞がCD45陽性であった(図14A)。CD45陽性細胞を、抗CD45モノクローナル抗体を使用する磁気セルソーティングならびにsuper-paramagnetic MACS MicroBeadsおよびautoMACS(自動化卓上磁気セルソーター)によって取り除いた。磁気ビーズ標識抗体および機器は共に、Miltenyi Biotecによって供給された。CD45陽性細胞はまた、「パニング」、蛍光活性化セルソーティング、または他の陰性免疫選択の形態によって除くことができる。除去後、肝細胞調製物に残存しているCD45陽性細胞の画分は、約1%まで減少した(図14B)。CD45陽性細胞の除去は、肝実質細胞および肝前駆細胞および幹細胞上の抗原のさらなる分析を容易にする。これはまた、これらの細胞の富化された集団の単離を容易にするはずである。
CD45陽性細胞の除去後、肝細胞の試料をヒト血清アルブミンの発現について分析した。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、0.2% Triton X-100界面活性剤処理によって透過化し、そしてヒトアルブミンに対するマウスIgG1モノクローナル抗体、および蛍光色素A647で標識したマウス免疫グロブリンG1(IgG1)に対するアフィニティー精製したヤギ抗体との連続的インキュベーションによって染色した。バックグラウンド染色および細胞の自己蛍光を、抗アルブミンモノクローナル抗体の代わりに、ヒト抗原に対する特異的結合活性を有しない、精製したマウスミエローマタンパク質(IgG1も)を使用することによって測定した。細胞の約97.5%がアルブミン陽性であった(図15A)。陽性染色のゲーティング(赤色の輪郭)は、マウスミエローマタンパク質対照(示さず)に対する比較によって決定した。
抗原CD133(AC133)は、5つの膜貫通ドメインを有する120キロダルトンの細胞表面糖タンパク質である。このタンパク質は、マウスタンパク質プロミニンに類似かまたはオルトロガス(orthologous)なものである。ヒトCD133抗原はもともと、初期前駆細胞(これには、血液形成(造血)細胞の系列における幹細胞が含まれる)のサブセット上で同定された。特定の他の未成熟細胞はCD133を発現し、これには、ヒト胚(5週齢)において発生している上皮、内皮細胞前駆細胞、および神経細胞前駆細胞、または幹細胞が含まれる。CD133の発現はまた、あるヒト腫瘍および腫瘍由来細胞株(例えば、網膜芽細胞腫および結腸癌腫CaCo-2)について報告されている。このタンパク質は、原形質膜に豊富なもの(例えば、微小絨毛)において優先的に濃縮されて見い出される。上皮細胞で見い出される場合、これは、先端に優先的に局在するが、膜表面の底側面には局在しない。特に免疫組織化学による以前の研究は、多くのヒト組織(成人肝臓を含む)においてそのタンパク質についての検出可能なメッセンジャーRNAが存在するにも関わらず、成体ヒト上皮組織においてCD133タンパク質発現を実証することに失敗してきた。
上皮細胞接着分子(Ep-CAM(GA733-2、CO17-1A、EGP40、KS1-4、およびKSAとしても知られる))は、同種親和性の、カルシウムイオン非依存性の細胞−細胞接着に関与する糖タンパク質である。このタンパク質は、多くのヒト上皮組織において発現され、増殖している上皮細胞(腫瘍細胞を含む)において実質的にアップレギュレートされるようである。C. J. de Boerおよび共同研究者らは、8週齢胚ヒト肝臓において、大部分の肝実質細胞が検出可能なEp-CAMタンパク質を発現することを報告した[de Boer CJ, van Krieken JH, Janssen-van Rhijn CM, Litvinov SV (1999). 「Expression of Ep-CAM in normal, regenerating, metaplastic, and neoplastic liver」, Journal of Pathology 188: 201-6]。対照的に、正常ヒト成体肝臓において、彼らは、肝実質細胞においてEp-CAM発現を検出できず、そして胆管上皮細胞のみがこの抗原に対して陽性に染まると報告した。最後に、この抗原は、肝臓の再生および修復が胆汁性肝硬変によって誘導される状況において、ならびに特定の肝臓の腫瘍(特に胆管癌)の細胞において、肝前駆細胞として同定された細胞中で検出された。
本発明者らは、成体ヒト肝臓から、Ep-CAMとCD133の両方を発現する肝臓細胞を探索した。細胞を、各々異なる蛍光色素と直接結合体化したEp-CAMおよびCD133に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートした。図17Cに示されるように、この特定のCD45除去成体ヒト肝臓細胞調製物における細胞の約42%が、CD133について検出可能に染色された。(図16Aに示される実験よりもいくぶん低めのここでのCD133染色の程度は、異なるドナーからの肝臓細胞調製物間の実際の違いから、年齢もしくは他の変数の結果として、または同定されていない実験的技術のバリエーションから生じる可能性がある)。Ep-CAMについて強力に染色された集団中の細胞の間で(図17Bの赤い境界内に示される)、約70%がまたCD133について陽性染色された(図17D)。このように、この特定の肝臓調製物において、全体のCD45陰性細胞の約0.3%がEp-CAMおよびCD133を同時発現した。
図16Bに示されるように、磁気セルソーティングのような陽性免疫選択は、ヒト肝臓細胞調製物からのCD133陽性細胞の富化を可能にする。本発明者らは、Ep-CAMの発現のために、開始集団(すでにCD45除去されている)およびCD133富化調製物における細胞を評価した。図17Aは、開始集団の少なくとも1.1%(慎重に厳しくゲーティングされた)がEp-CAMを発現した。CD133陽性細胞の富化後、得られる集団(図5B)は、少なくとも4.5%のEp-CAM陽性細胞を含む。このことは、成体ヒト肝臓からの細胞の亜集団におけるCD133およびEp-CAMの同時発現を確証し、そしてこれらの細胞が陽性免疫選択によって富化され得ることを実証する。これら2種の表面抗原を同時発現する細胞による前方および側方散乱分析(図17の実験におけるように)は、やはりほぼ100%のこれらの細胞がまた、アルブミン陽性であるに違いないことを示す。
STO支持細胞層上での近位肝幹細胞の初代培養
大部分の肝臓前駆細胞は、始原肝幹細胞を例外として、胚性肝臓間質支持細胞とともに同時培養した場合に長くは生存しない;新生児肝臓、成体肝臓、または多様な成体組織からの支持細胞が成功しなかった(Sigalら、1994;Brillら、1995;Sigalら、1995;Brill S, Zvibel I, およびReid LM. Expansion conditions for early hepatic progenitor cells from embryonal and neonatal rat livers. Digestive Diseases and Sciences 44: 364-371, 1999)。胚性肝臓間質支持細胞は、胚性間質細胞株であるSTO細胞によって置き換えることができ、胚性幹細胞のための日常的な支持細胞として使用され、そして新たに単離された正常なげっ歯類の肝幹細胞および二倍体成体ラット肝臓細胞のクローン原性拡張を支持することが見い出されている(KubotaおよびReid、2000)。これらの条件は、支持細胞ありおよびなしで拡張する(Mossら、投稿中)始原肝幹細胞を例外として、ヒト胎児肝臓からの前駆細胞すべてについてもまた必須であることが見い出された。STO支持細胞はまた、新生児および成体のヒト肝臓からの肝前駆細胞について成功することが証明された(Ludlowら、投稿準備中)。胚性間質支持細胞によって供給され、前駆細胞のために必須である因子は知られていない。
始原肝幹細胞の選択
実施例1の富化された実質細胞懸濁物を、2000〜5000細胞/cm2の密度で、組織培養プラスチック上で、脂質、インスリン、およびトランスフェリン/Fe(HDM)を補充した無血清培地中でプレーティングした。プレーティング後最初の12時間、培地は、細胞接着を促進するために10% FBSを含み、その後、培養は無血清で維持した。培地の交換を3日の間隔で行った。
プラスチック培養中におけるコロニー形成細胞の抗原性プロフィール
実施例6において培養された細胞の抗原性特性を、肝器官発生に関連するマーカーについて免疫細胞化学的染色を用いて調べた。細胞培養物を、メタノールおよびアセトンの50/50(v/v)混合物を用いて、2分間室温で固定した。いくつかの染色領域を、PAPマーカーペン(Research Products International Corp, Mt. Prospect, Illinois)を用いて、各ディッシュの表面に作製し、同じ培養物中で複数の抗体の組み合わせを可能にした。非特異的結合部位を、PBS中の10%ヤギ血清溶液(GIBCO/BRL/Invitrogen, Carlsbad, California)とともに、30分間室温でインキュベーションすることによってブロックした。PBSで2回すすいだ後、一次モノクローナル抗体を各々の染色領域に適用し(通常、領域あたり0.1〜0.3mL)、一晩インキュベートした。4℃で一晩インキュベーションした後、細胞をPBSで2回洗浄し、次いでAlexa 488(1:750)またはAlexa 594(1:1250)(Molecular Probes, Eugene OR)のいずれかに結合体化された二次抗体とともにインキュベートした。いくつかの場合において、FITCまたはPEのいずれかに結合体化された一次モノクローナル抗体が利用可能であり、結合体化していない一次抗体を用いる標識プロトコールの完了後に、この抗体を用いるインキュベーションによる二重標識のための手段を提供した。
プラスチック基層からSTO支持細胞へのコロニー細胞の継代
STO支持細胞を使用して、プラスチック基層からの選択的継代の後で始原肝幹細胞の運命を評価した。培養1〜2週間後、実施例6からのプラスチック基層上のコロニーを、双眼拡大鏡の下で吸引によってプラスチック基層から100μLピペットに物理的に拾い上げた。50コロニーまでをHBSS mod中に収集し、次いで20分間までコラゲナーゼ溶液中で攪拌しながら消化して、細胞を懸濁物に分散させた。
新生児ドナーからの肝臓における始原肝幹細胞および近位肝幹細胞の存在
肝臓を、妊娠後約28週で生まれ、1日しか生存しなかったドナーから入手した。心停止と、ドナー器官の収集および洗浄との間の温暖虚血(warm ischemia)の期間は、6時間から7時間であった。その後、器官を約12時間氷上に維持した。器官全体(湿重量約100グラム)を灌流に供し、Liberaseを用いて消化し、そして細胞懸濁物を、ヒト小児または成人から得られる肝臓についてと本質的に同様にして調製した。生きていない細胞および多くの赤血球を、Optiprepを使用する調製遠心分離によって除去した。しかし、最終調製物中の生きている非赤血球細胞の実際の収量およびパーセンテージを決定することは困難であった。
フローサイトメトリーソーティングおよびフローサイトメトリー分析(FACscan)
細胞質抗原(例えば、アルブミン、AFP)のFACscanを、抗血清を用いる染色の前に3%パラホルムアルデヒドを用いて固定および透過化処理した細胞を用いて行った。細胞を、関連する蛍光プローブを用いて直接的に標識した抗体を使用する以外は免疫蛍光について示されたのと同様に染色した(表3および4を参照されたい)。フローサイトメトリーを、Cytomation「MoFlow」フローサイトメーター(Fort Collins, Colorado)(Larry Arnold博士によって管理されるFACS設備)で実行した。覆い液は改変していないHBSSであった。MoFlowサイトメーターは、40,000細胞/秒の分析またはソーティングが可能であり、このとき12までのパラメーターを並行して(前方散乱および/または側方散乱と組み合わせて6「色」)、99%を超える正確さを有する。大部分のソートのために、4Wのアルゴンレーザーを、60mWの電源および100μmのノズルとともに使用した。488nm励起での蛍光発光を、FITCのための530/30nmバンドパスフィルターを通して収集した。蛍光を、対数増幅によって測定した。蛍光が陰性対照細胞の95%より高い場合、細胞を陽性と見なした。E-1の検出器値を、前方散乱(FSC)のために、中程度の範囲の増幅とともに使用し、検出器を、側方散乱(SSC)のために中程度の範囲で、1の増幅とともに使用した。SSCゲーティングを、線状増幅によって、パラメーターの分割を256の任意単位にして行った。染色していない細胞、関連のない抗体および同じ蛍光プローブで染色した細胞、または同じ抗体を用いるが蛍光プローブを用いない細胞を、陰性対照として使用した。各々の試料において、30,000〜50,000細胞をアッセイした。陽性細胞(陰性対照よりも高い蛍光を有するもの)を、粒度、サイズ、および蛍光の程度についてさらに評価した。ソーティングの前後での細胞を、10%血清を付加したHDM中4℃で維持した。
胎児組織から得られた肝細胞懸濁物中のアルブミンおよびαフェトプロテインの発現の決定
この実験において、近位肝幹細胞および始原肝幹細胞におけるアルブミンおよびαフェトプロテインの発現を試験した。ペレット画分が肝芽細胞で富化されている(近位肝幹細胞)のに対して、界面はコロニー形成細胞で富化されている(始原肝幹細胞)ことが最初に決定された。
Claims (72)
- ヒト始原肝幹細胞を含む組成物であって、該始原肝幹細胞が、近位肝幹細胞、肝実質細胞の前駆細胞、または胆管の前駆細胞に対する前駆細胞である、組成物。
- 始原肝幹細胞が、Ep-CAM、AC133、およびアルブミンを発現する、請求項1記載の始原肝幹細胞。
- 始原肝幹細胞が、サイトケラチン8/18、サイトケラチン19、またはその組み合わせをさらに発現する、請求項2記載の始原肝幹細胞。
- 始原肝幹細胞が、N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146、またはその組み合わせをさらに発現する、請求項3記載の始原肝幹細胞。
- 始原肝幹細胞が近位肝幹細胞の前駆細胞である、請求項1記載の始原肝幹細胞。
- 始原肝幹細胞が肝実質細胞の前駆細胞の前駆細胞である、請求項1記載の始原肝幹細胞。
- 始原肝幹細胞が胆管前駆細胞の前駆細胞である、請求項1記載の始原肝幹細胞。
- 近位肝幹細胞が、α-フェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチン19を発現する、請求項5記載の始原肝幹細胞。
- 近位肝幹細胞が、Ep-CAM、AC133、サイトケラチン8/18、またはその組み合わせをさらに発現する、請求項8記載の始原肝幹細胞。
- 近位肝幹細胞が肝実質細胞の前駆細胞または胆管前駆細胞に対する前駆細胞である、ヒト近位肝幹細胞を含む組成物。
- 近位肝幹細胞が、α-フェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチン19を発現する、請求項10記載の近位肝幹細胞。
- 近位肝幹細胞が、Ep-CAM、AC133、サイトケラチン8/18、またはその組み合わせをさらに発現する、請求項11記載の近位肝幹細胞。
- Ep-CAMおよびAC133を発現する細胞を同定する工程を含む、ヒト肝組織由来のヒト肝前駆細胞を単離する方法。
- 前駆細胞がアルブミンをさらに発現する、請求項13記載の方法。
- 前駆細胞がサイトケラチン19をさらに発現する、請求項14記載の方法。
- 前駆細胞が幹細胞である、請求項14記載の方法。
- 前駆細胞が幹細胞である、請求項15記載の方法。
- CD45を発現する細胞を除去する工程をさらに含む、請求項13、14、または15記載の方法。
- 肝組織が胎児または新生児から得られる、請求項13、14、または15記載の方法。
- 肝組織が小児または成人から得られる、請求項13、14、または15記載の方法。
- 始原肝幹細胞である、請求項19または20記載の方法によって単離されたヒト肝前駆細胞。
- N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146、またはその組み合わせをさらに発現する始原肝幹細胞である、請求項19または20記載の方法によって単離されたヒト肝前駆細胞。
- 近位肝幹細胞である、請求項19または20記載の方法によって単離されたヒト肝前駆細胞。
- αフェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチン19をさらに発現する近位肝幹細胞である、請求項19または20記載の方法によって単離されたヒト肝前駆細胞。
- Ep-CAMを発現する細胞を同定する工程を含む、ヒト肝組織由来のヒト肝前駆細胞を単離する方法。
- CD45を発現する細胞を除去する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 前駆細胞がさらにアルブミンを発現する、請求項25記載の方法。
- 肝組織が成人から得られる、請求項25記載の方法。
- 肝前駆細胞が始原肝幹細胞である、請求項25または27記載の方法。
- 肝前駆細胞が近位肝幹細胞である、請求項25または27記載の方法。
- 前駆細胞がAC133をさらに発現する、請求項25または27記載の方法。
- 近位肝幹細胞である、請求項28記載の方法によって単離されたヒト肝幹細胞。
- AC133をさらに発現する近位肝幹細胞である、請求項28の方法によって単離されたヒト肝幹細胞。
- 以下の工程を含む、ヒト始原肝幹細胞を単離する方法:
(a)ヒト肝組織に由来する細胞の混合物を提供する工程;および
(b)炭水化物代謝のレギュレーター、鉄キャリア、および膜産生因子を含有する無血清培地を含む、ヒト始原肝幹細胞を選択する条件下で表面上において該細胞の混合物を培養し、それによってヒト始原肝幹細胞を含むコロニーを形成させる工程。 - 肝組織が、胎児、新生児、乳児、小児、または成人から得られる、請求項34記載の方法。
- 細胞の混合物が、実質細胞を豊富に含むヒト肝組織に由来する、請求項34記載の方法。
- 表面がコートされていない、請求項34記載の方法。
- コートされていない表面がプラスチック表面である、請求項37記載の方法。
- プラスチック表面が荷電している、請求項38記載の方法。
- 荷電しているプラスチック表面が組織培養プラスチックである、請求項39記載の方法。
- 炭水化物代謝のレギュレーターがインスリンである、請求項34記載の方法。
- 鉄キャリアがトランスフェリンである、請求項34記載の方法。
- 膜産生因子が、1つまたはそれ以上の脂質を含む組成物である、請求項34記載の方法。
- 脂質が遊離脂肪酸である、請求項43記載の方法。
- 無血清培地がヒドロコルチゾンをさらに含む、請求項34記載の方法。
- 無血清培地が抗酸化剤をさらに含む、請求項34記載の方法。
- 抗酸化剤がセレンである、請求項46記載の方法。
- 始原肝幹細胞が、近位肝幹細胞、肝実質細胞の前駆細胞、または胆管前駆細胞に対する前駆細胞である、請求項34記載の方法。
- 請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞。
- Ep-CAM、AC133、およびアルブミンを発現する、請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞。
- Ep-CAM、AC133、アルブミン、サイトケラチン8/18、およびサイトケラチン19を発現する、請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞。
- 以下のものをさらに発現する、請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞:(i)Ep-CAM、AC133、アルブミン、サイトケラチン8/18、およびサイトケラチン19、ならびに(ii)N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146、またはその組み合わせ。
- 近位肝幹細胞の前駆細胞である、請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞。
- 請求項34記載の方法によって単離されたヒト始原肝幹細胞であって、始原肝幹細胞は、系統的子孫の肝幹細胞の前駆細胞であり、系統的子孫の肝幹細胞は、α-フェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチン19を発現する、細胞。
- 以下の工程を含む、ヒト近位肝幹細胞を単離する方法:
(a)ヒト肝組織に由来する細胞の混合物を提供する工程;
(b)炭水化物代謝のレギュレーター、鉄キャリア、および膜産生因子を含有する無血清培地を含むヒト始原肝幹細胞を選択する条件下で、プラスチック表面上において該細胞の混合物を培養し、それによってヒト始原肝幹細胞を含むコロニーを形成させる工程;ならびに
(c)少なくとも1種の発生因子を含む培地中で該コロニーからの細胞を培養し、それによってヒト近位肝幹細胞を含む細胞が産生される工程。 - 以下の工程を含む、ヒト近位肝幹細胞を単離する方法:
(a)ヒト肝組織に由来する細胞の混合物を提供する工程;
(b)炭水化物代謝のレギュレーター、鉄キャリア、および膜産生因子を含有する無血清培地を含むヒト始原肝幹細胞を選択する条件下で、該細胞の混合物を培養し、それによってヒト始原肝幹細胞を含むコロニーを形成させる工程;ならびに
(c)少なくとも1種の発生因子を含む培地中で該コロニーからの細胞を培養し、それによって近位肝幹細胞を含む細胞が産生される工程。 - 発生因子が二次的な細胞によって供給される、請求項55〜56のいずれか一項記載の方法。
- 二次的な細胞が支持細胞である、請求項57記載の方法。
- 支持細胞がSTO支持細胞である、請求項58記載の方法。
- 支持細胞が内皮細胞である、請求項58記載の方法。
- 支持細胞が間質細胞である、請求項58記載の方法。
- 間質細胞が胚性細胞である、請求項61記載の方法。
- 胚性細胞が胚性肝間質細胞である、請求項62記載の方法。
- 近位肝幹細胞が、肝実質細胞の前駆細胞または胆管前駆細胞に対する前駆細胞である、請求項55〜56のいずれか一項記載の方法。
- 請求項55または56記載の方法によって単離されたヒト近位肝幹細胞。
- αフェトプロテイン、アルブミン、およびサイトケラチン19を発現する、請求項55または56記載の方法によって単離されたヒト近位肝幹細胞。
- ヒト始原肝幹細胞が外因性核酸を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
- ヒト近位肝幹細胞が外因性核酸を含む、請求項10〜11のいずれか一項記載の組成物。
- 請求項1〜8、49〜54、または67のいずれか一項記載のヒト始原肝幹細胞の有効量を被験体に投与する工程を含む、肝機能不全または肝疾患を処置する方法。
- 請求項10〜11、65〜66、または68のいずれか一項記載のヒト近位肝幹細胞の有効量を被験体に投与する工程を含む、肝機能不全または肝疾患を処置する方法。
- 単離されたヒト始原肝幹細胞。
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