ES2569951T3 - Células madre hepáticas primitivas y proximales - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una célula madre hepática primitiva humana aislada, en la que dicha célula madre hepática primitiva aislada no expresa alfa-fetoproteína, expresa Ep-CAM y es un precursor para una célula madre hepática proximal, y dicha célula madre hepática proximal es capaz de dar lugar a un progenitor hepatocítico o un progenitor biliar, en la que dicha célula madre hepática primitiva aislada es una célula individual adulta.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre hepaticas primitivas y proximales Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a celulas madre hepaticas humanas, celulas pluripotentes que dan lugar a celulas hepaticas maduras. Estas incluyen dos poblaciones de celulas madre: un progenitor muy primitivo, las celulas madre de la placa ductal, que dan lugar a celulas madre hepaticas proximales, las celulas madre proximales que dan lugar a los hepatocitos y las celulas biliares. La presente invencion tambien se refiere a metodos para aislar las celulas madre hepaticas humanas de la placa ductal, y para aislar las celulas madre hepaticas proximales y los progenitores hepatodticos comprometidos y los progenitores biliares comprometidos. Las composiciones que comprenden las celulas de la presente invencion se pueden usar para terapias celulares y genicas, y para el establecimiento de organos bioartificiales.

Antecedentes de la invencion

1. Anatoirna del Hfgado Humano

La unidad estructural y funcional principal del hngado maduro es el acino, cuya seccion transversal esta organizada como una rueda alrededor de dos lechos vasculares diferentes: 3-7 grupos de tnadas portales (cada una con una venula portal, arteriola hepatica y un conducto biliar) en la periferia, y con la vena central en el eje. Las celulas hepaticas estan organizadas como placas de celulas revestidas a ambos lados por endotelios fenestrados, que definen una serie de sinusoides que estan contiguos a la vasculatura portal y central. Los datos recientes han indicado que los canales de Hering, pequenos conductos localizados alrededor de cada una de las tnadas portales, producen conductillos minusculos que se prolongan y se juntan en las placas hepaticas por toda la zona 1, formando un patron similar al de una escobilla (Theise, N. 1999 Hepatology. 30:1425-1433).

Un espacio estrecho, el espacio de Disse, separa los endotelios de los hepatocitos a lo largo del sinusoide. Como resultado de esta organizacion, los hepatocitos tienen dos dominios basales, cada uno de los cuales esta orientado hacia un sinusoide, y un dominio apical que esta definido por la region de contacto entre hepatocitos adyacentes. Los dominios basales entran en contacto con la sangre, y estan implicados en la absorcion y secrecion de componentes del plasma, mientras los dominios apicales forman los canalmulos biliares, especializados en la secrecion de sales biliares, y estan asociados por medio de una red de interconexion con los conductos biliares. La sangre fluye desde las venulas portales y las arteriolas hepaticas a traves de los sinusoides hacia las venulas hepaticas terminales y la vena central.

Basandose en este patron microcirculatorio, el acino se divide en tres zonas: zona 1, la region periportal; zona 2, la region acinar media; y zona 3, la region pericentral. El potencial proliferativo, los criterios morfologicos, la ploidfa y la mayona de los genes espedficos del hngado se correlacionan con la ubicacion zonal (Gebhardt, R., et al. 1988. FeBs Lett. 241:89-93; Gumucio, J. J. 1989, Vol. 19. Springer International, Madrid; Traber, P. et al. 1988. Gastroenterology. 95:1130-43). Los gradientes de la concentracion de los componentes sangumeos, que incluyen el oxfgeno, a traves del acino y el seguimiento de la direccion del flujo sangumeo desde las tnadas portales hacia la vena central, son responsables de parte de esta formacion de zonas, por ejemplo la compartimentacion redproca de la glucolisis y la gluconeogenesis. Sin embargo, la formacion de la zona periportal de la protema de union en hendidura conexina 26 y la formacion de la zona pericentral de la glutamina sintetasa, por nombrar solamente dos, son insensibles a tales gradientes, son mas representativas de la mayona de genes espedficos de tejidos, y parecen estar determinadas por factores intnnsecos a las celulas o a variables distintas del flujo sangumeo en el microambiente.

Ademas de hepatocitos, celulas epiteliales de los conductos biliares (colangiocitos) y celulas endoteliales, la region entre los tractos portal y central contiene otros tipos de celulas, tales como las celulas de Ito y las celulas de Kupffer. Estas desempenan papeles prominentes en condiciones patogenicas del hngado, especialmente en la inflamacion y la fibrosis, pero su contribucion directa a las funciones homeostaticas principales del organo normal es aparentemente pequena.

2. Desarrollo del Hfgado Humano

El hngado se desarrolla como resultado de la convergencia de un divertmulo formado del intestino anterior caudal y el septum transversum, parte del mesenquima esplacnico. La formacion de las celulas hepaticas comienza despues de que el epitelio endodermico interaccione con el mesodermo cardiogenico, probablemente por medio de factores de crecimiento de fibroblastos. Las celulas hepaticas especificadas proliferan y penetran despues en el mesenquima del septum transversum con un patron similar a un cordon, lo que forma el primordio hepatico. La interaccion epitelial- mesenquimatosa directa es cntica en estas etapas tempranas del desarrollo del hngado, y determina que celulas se convertiran en hepatocitos o en colangiocitos, y los endotelios fenestrados, respectivamente. Las mutaciones de los genes hlx y jumonji espedficos del mesenquima bloquean el desarrollo del hngado, lo que ilustra la importancia de las contribuciones de este tejido. De manera temprana en su desarrollo, el hngado consiste en agrupamientos de celulas madre hepaticas proximales rodeadas por un endotelio continuo que carece de membrana basal y

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abundantes celulas hematopoyeticas. A medida que el endotelio se transforma para convertirse en un endotelio discontinuo, fenestrado, la vasculatura, en especial la vasculatura portal, se desarrolla mas con la produccion de membranas basales. El intersticio portal puede proporcionar el desencadenante para el desarrollo de los conductos biliares, y a medida que rodea las venulas portales, arteriolas hepaticas y conductos biliares, se forman las tnadas portales. Las celulas madre hepaticas proximales proliferan rapidamente y se forman las placas parenquimatosas, probablemente en respuesta a cambios en la cantidad y distribucion de moleculas de organizacion de tejidos, tales como C-CAM 105, Agp110, E-cadherina y conexinas, que coincide con el traslado de la mayona, pero no todas, las celulas hematopoyeticas hacia la medula osea. Los estudios recientes sugieren que algunos progenitores hematopoyeticos persisten en el hngado de roedor adulto en reposo, y se han aislado celulas madre hematopoyeticas de tngado adulto humano y murino (Crosbie, O. M. et al. 1999. Hepatology. 29:1193-8).

El hngado de rata se forma en la vida embrionaria alrededor del dfa 10, denominado "dfa embrionario 10" o E10, con la invaginacion del mesenquima cardiaco por endodermo localizado en la region del intestino medio del embrion (Zaret, K. 1998. Current Opinion in Genetics & Development. 8:526-31). Se ha conseguido el reconocimiento mas temprano de las celulas hepaticas en los embriones mediante el uso de estudios de hibridacion in situ para mARN que codifica la alfa-fetoprotema (AFP) ((Zaret, K. 1998. Current Opinion in Genetics & Development. 8:526-31; Zaret, K. 1999 Developmental, Biology (Orlando). 209:1-10). Se observan celulas que expresan AFP en la region del intestino medio del embrion cerca del mesenquima que produce el corazon en los dfas 9-10 en todos los hngados de rata y de raton ensayados. El hngado se hace visible macroscopicamente en E12, y tiene alrededor de 1 mm de diametro en E13.

En paralelo, la hematopoyesis se da al aparecer las primeras celulas hematopoyeticas identificables en E15-E16 (en roedores) y del 3er al 4° mes (en humanos), y el nivel maximo de eritropoyesis (formacion de celulas eritroides o globulos rojos) se da en E18 (en roedores) y en el 5°-6° mes (en humanos). En el nivel maximo de eritropoyesis, el numero de estos globulos rojos domina en el hngado y representa mas del 70% del numero de celulas en el hngado. El final del penodo gestacional es en el dfa 21 en roedores, y 9 meses en humanos. En horas tras el nacimiento, el numero de celulas hematopoyeticas disminuye drasticamente, de forma que en dos dfas de vida postnatal (roedores), y en una o dos semanas (humanos), la gran mayona de las celulas hematopoyeticas ha desaparecido, y han migrado a la medula osea. No se conoce la causa de la migracion de las celulas hematopoyeticas. Sin embargo, existen dos especulaciones predominantes.

En primer lugar, los progenitores hematopoyeticos prefieren condiciones relativamente anaerobicas, y la mayona de ellos migra hacia la medula osea (que es relativamente anaerobica) al elevarse los niveles de oxfgeno en el hngado con la activacion de los pulmones. Ademas, se ha especulado que la perdida de las hormonas del embarazo tambien puede ser un factor en la migracion. De manera postnatal, la perdida de los progenitores hematopoyeticos en el hngado se correlaciona con una reduccion drastica del numero de progenitores hepaticos y un incremento paralelo del numero y la madurez de los hepatocitos y las celulas biliares. La madurez plena del hngado se completa en 2 a 3 semanas de vida postnatal (en roedores), y en unos cuantos meses (en humanos). En ese momento, las celulas progenitoras hepaticas restantes se localizan en las regiones de los canales de Hering, y el numero predominante de ellas esta presente en las tnadas portales en la periferia de cada acino hepatico (Thiese et al, Crawford et al.).

Posteriormente se establece la arquitectura clasica del acino hepatico, y cada acino se define perifericamente por seis grupos de tnadas portales, y cada una tiene un conducto biliar, una arteria hepatica y una vena hepatica, y en el centro una vena central que conecta con la vena cava. Las placas de celulas hepaticas, como radios en una rueda, se prolongan desde la periferia hacia el centro. Por convencion, las placas se dividen en tres zonas: La zona 1 esta cerca de las tnadas portales; la zona 2 es acinar media; y la zona 3 esta cerca de las venas centrales. Las unicas celulas diploides del hngado estan en la zona 1; las celulas tetraploides estan en la zona 2; y las celulas tetraploides, octaploides y multinucleadas estan en la zona 3. El patron sugiere claramente un linaje madurativo que termina en un proceso apoptotico (Sigal, S. H., S. et al. 1995. Differentiation. 59:35-42).

3. Enfermedad Hepatica

Cada ano en Estados Unidos se hospitalizan alrededor de 250.000 personas por insuficiencia hepatica. Los trasplantes de hngado son curativos para algunas formas de insuficiencia hepatica, y se llevan a cabo aproximadamente 4100 trasplantes cada ano en Estados Unidos. Uno de los factores limitantes en el trasplante de hngado es la disponibilidad de hngados de donantes, en especial dada la limitacion de que los hngados de donantes para trasplante de organos deben proceder de pacientes que hayan sufrido muerte cerebral, pero no paro cardiaco. Los hngados de cadaveres no han tenido exito, aunque los esfuerzos recientes para usar tales donantes han apoyado la posibilidad de usarlos si el hngado se obtiene en una hora desde la muerte.

El trasplante de celulas en el hngado es una terapia alternativa atractiva para la mayona de las enfermedades hepaticas. Los procedimientos quirurgicos para el trasplante de celulas son de poca importancia respecto de los necesarios para el trasplante de organos completos y, por lo tanto, se pueden usar para pacientes con diversos riesgos quirurgicos, tales como la edad o la debilidad. El uso de celulas hepaticas humanas es superior a las celulas hepaticas derivadas de otros mairnferos, ya que los posibles patogenos, si los hay, son de origen humano, y los pacientes podnan tolerarlos mejor, y se podnan cribar facilmente antes del uso.

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Los intentos de llevar a cabo el trasplante de celulas hepaticas han usado celulas hepaticas maduras sin fraccionar, y han mostrado cierta eficacia (Fox, I. J. et al. 1998. New England Journal of Medicine. 338:1422-1426). Sin embargo, el exito requiere la inyeccion de un gran numero de celulas (2x1010), ya que las celulas no crecen in vivo. Ademas, la introduccion de un numero sustancial de grandes celulas hepaticas maduras (diametro celular medio de 30-50 pm) se complica por su tendencia a formar grandes agregados tras la inyeccion, lo que da como resultado embolos potencialmente mortales. Ademas, estas celulas generan una respuesta notable de rechazo inmunologico, lo que fuerza a que los pacientes se mantengan en tratamiento con farmacos inmunosupresores durante el resto de sus vidas. Finalmente, no se han criopreservado con exito celulas hepaticas maduras, y se necesita una logfstica compleja para coordinar la disponibilidad del tejido hepatico adecuado, la preparacion de suspensiones de celulas, y la administracion inmediata de las celulas para las terapias clmicas.

4. Celulas Madre Totipotentes

Las celulas madre son una terapia alternativa basada en celulas para la enfermedad hepatica. Las celulas madre totipotentes son celulas primitivas que se pueden auto-replicar, son pluripotentes, es decir, producen celulas hijas con mas de un destino, y se pueden expandir considerablemente y pueden dar lugar a celulas madre determinadas que pueden reconstituir un tejido o tejidos. La mayona de la bibliograffa sobre las celulas madre procede de la bibliograffa sobre embriones, o aquella sobre los tejidos hematopoyetico, epidermico o intestinal.

Mas recientemente, se han modificado las definiciones para reconocer clases particulares de celulas madre. Aquellas con capacidad de participar en el desarrollo de todos los tipos de celulas, que incluyen las celulas germinales, se denominan celulas madre totipotentes, e incluyen el cigoto y las celulas embrionarias normales hasta la etapa de 8 celulas (la morula). Las celulas madre embrionarias, tambien denominadas celulas "ES", consisten en poblaciones celulares permanentes derivadas de celulas totipotentes normales en blastocistos, que se informaron por primera vez a principios de los anos ochenta. Las lmeas de celulas ES se pueden cultivar in vitro con el mantenimiento de la totipotencia. Cuando las celulas ES se inyectan de vuelta a blastocistos normales, son capaces de reanudar el desarrollo embrionario y de participar en la formacion de un raton normal, pero quimerico. Aunque se han establecido lmeas de celulas ES de muchas especies (raton, rata, cerdo, etc.), solamente se ha usado de manera rutinaria el sistema de raton para generar animales con fenotipos nuevos (con expresion inactivada, transgenicos) fusionando celulas ES modificadas de cultivo con blastocistos, y despues implantando los blastocistos en hospedadores pseudoprenados. Las lmeas de celulas germinales embrionarias (EG), que muestran muchas de las caractensticas de las celulas ES, se pueden aislar directamente in vitro de la poblacion de celulas germinales primordiales. Como con las celulas ES, las celulas EG contribuyeron a quimeras, lo que incluye la lmea germinal, cuando se inyectaron en blastocistos.

Recientemente, experimentos muy publicitados han informado que se pueden establecer cultivos de celulas ES humanas a partir de embriones humanos. Se ha propuesto que estas celulas ES humanas se pueden inyectar en tejidos con la esperanza de que puedan reconstituir organos y tejidos danados. Sin embargo, las celulas ES y EG son tumorigenicas si se introducen en hospedadores inmunocomprometidos en cualquier localizacion distinta del utero, formando teratocarcinomas. Por lo tanto, el plan de inocular celulas ES humanas en pacientes no es realista, y tiene la grave posibilidad de crear tumores en los pacientes. Para superar este punto muerto, algunos grupos estan dedicandose al proyecto de diferenciar las celulas ES en condiciones microambientales definidas para convertirlas en celulas madre determinadas que despues se pueden inocular con seguridad a los pacientes. Por ejemplo, existe cierto grado de exito en la generacion de progenitores hematopoyeticos. Sin embargo, sigue existiendo la preocupacion de que las celulas ES residuales del cultivo pudieran plantear el riesgo de tumorigenesis, si los cultivos se inoculan a un paciente. En resumen, hasta que la investigacion en la biologfa del desarrollo revele la minada de controles que determinan los destinos de las celulas durante la embriogenesis, las celulas ES seguiran siendo una herramienta experimental con poca esperanza para los programas clmicos en las terapias celulares o genicas. La unica opcion realista para los programas clmicos en las terapias celulares y genicas es usar celulas madre determinadas, en las que el potencial genetico esta restringido a un numero limitado de tipos de celulas.

5. Celulas Madre Determinadas

Las celulas madre determinadas son celulas pluripotentes que han restringido su potencial genetico al de un numero limitado de tipos de celulas, y tienen un potencial de crecimiento extenso. Pruebas cada vez mas numerosas, tales como la del campo de la telomerasa, sugieren que las celulas madre determinadas, en sentido estricto, no se autorreplican, es decir, su progenie puede tener menos potencial de crecimiento que el progenitor. Las celulas madre determinadas dan lugar a progenitores comprometidos, celulas hijas que pierden la pluripotencia restringiendo su potencial genetico a un unico destino, p.ej., hepatocitos, cuyos progenitores comprometidos se denominan progenitores hepatodticos comprometidos. En el linaje hepatico, existen progenitores hepatodticos comprometidos (que dan lugar a hepatocitos) y progenitores biliares comprometidos (que dan lugar a conductos biliares).

Las transiciones desde la celula madre hasta las celulas adultas se dan en un proceso por etapas, que produce un linaje madurativo en el que el tamano celular, la morfologfa, el potencial de crecimiento y la expresion genica estan asociadas al linaje. La metafora del envejecimiento es util para definir el proceso. Las celulas "jovenes" tienen una expresion genica temprana y el mayor potencial de crecimiento; las celulas tardfas del linaje tienen una expresion

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genica "tardfa", y normalmente estan limitadas en su crecimiento, o no crecen en absoluto. Las celulas ta^as se pueden considerar "viejas" o, en terminos biologicos, apoptoticas, y finalmente son desechadas. El proceso de linaje madurativo da como resultado una renovacion natural para el tejido, y permite la regeneracion tras lesiones. Los tejidos difieren en la cinetica del proceso madurativo. El linaje madurativo del intestino es bastante rapido, y un ciclo completo se da en menos de una semana; el del hngado se da lentamente, y en el hngado de rata es de alrededor de un ano.

Existe un gran interes clmico y comercial por aislar e identificar las celulas progenitoras inmaduras del hngado, debido al impacto que tal poblacion de celulas puede tener en el tratamiento de las enfermedades hepaticas. El uso de progenitores hepaticos en las terapias celulares y genicas puede superar muchos de los defectos asociados al uso de las celulas hepaticas maduras descritas anteriormente. Las celulas son pequenas (7-15 pm), y por lo tanto se minimiza la formacion de grandes embolos. Ademas, las celulas tienen un gran potencial de crecimiento, lo que significa que se necesitan menos celulas para la reconstitucion del tejido hepatico en un paciente. Finalmente, los progenitores tienen mmimos marcadores antigenicos que podnan provocar el rechazo inmunologico, lo que proporciona la esperanza de que se puedan necesitar pocos o ningun farmaco inmunosupresor.

6. Aislamiento de Progenitores Hepaticos

Se sabe que el aislamiento de progenitores hepaticos del hngado es una tarea que supone un gran reto, debido a la escasez de marcadores que seleccionen positivamente las celulas hepaticas. Los unicos anticuerpos disponibles para los candidatos de progenitores hepaticos son los anticuerpos monoclonales que se preparan contra subpoblaciones de progenitores hepaticos, denominados celulas ovales si se afslan de hospedadores expuestos a agresiones oncogenicas. Estos anticuerpos, sin embargo, reaccionan en manera cruzada con los antfgenos presentes en las celulas hematopoyeticas.

La expresion celulas ovales procede de una minada de estudios en el campo de la carcinogenesis y la oncogenesis. Los animales expuestos a carcinogenos u otras agresiones oncogenicas experimentan una perdida drastica de celulas hepaticas maduras (destruidas por las diversas agresiones) y, de manera secundaria, la expansion de celulas pequenas (7-15 pm de diametro) con nucleos ovalados y que albergan marcadores que comprenden antfgenos hepaticos y hematopoyeticos (Grisham y Thorgeirrson, 1998). Los estudios con celulas ovales condujeron a las hipotesis de que son progenitores hepaticos que se desencadenan para expandirse en las condiciones de las agresiones oncogenicas, y que con las condiciones adecuadas pueden continuar hasta llegar a ser celulas tumorales. El fenotipo de las celulas ovales vana de maneras sutiles y no sutiles, dependiendo de la(s) agresion(es) oncogenica(s). Ademas, se sabe que se pueden establecer facilmente en cultivo sin condiciones especiales de celulas de soporte o medios. (J. Grisham y S. Thorgeirrson, 1998, Hepatic Stem Cells, En: Stem Cells, C Potten, editor, Academic Press, NY). Basandose en estos hallazgos y en estudios que caracterizan algunas de las lmeas celulares derivadas de los tratamientos oncogenicos, se comprendio que los tumores hepaticos son progenitores transformados de manera maligna, y que las celulas ovales son progenitores parcialmente o completamente transformados (Zvibel I, Fiorino A, Brill S, y Reid LM. Phenotypic characterization of rat hepatoma cell lines and lineage-specific regulation of gene expression by differentiation agents. Differentiation 63:215-223, 1999).

En el pasado se han hecho intentos de obtener la poblacion de celulas progenitoras hepaticas propuesta como la poblacion mas versatil para la terapia celular y genica del hngado. Las pat. de EE.UU. n°s 5.576.207 y 5.789.246 (Reid et al.) utilizan marcadores superficiales celulares y citometna de flujo de dispersion lateral para proporcionar una subpoblacion definida en el fngado. Se han aislado subpoblaciones de celulas hepaticas de rata mediante extraccion de celulas comprometidas a un linaje, seguido de seleccion de precursores hepaticos inmaduros que se detectaron como celulas agranulares que albergaban marcadores celulares positivos para OC.3 (marcador antigenico de celulas ovales), positivos para AFP, positivos para albumina y negativos para CK19 (citoqueratina 19). Las subpoblaciones de hngado de rata anteriores muestran caractensticas particulares importantes en el aislamiento y la identificacion de progenitores hepaticos enriquecidos de hngado de roedor.

De esta manera, existe la necesidad de desarrollar metodos para aislar progenitores hepaticos humanos que se puedan usar para tratar pacientes con enfermedad o disfuncion hepatica. La presente invencion satisface esta necesidad.

Compendio de la invencion

La presente invencion se dirige a una composicion que comprende una celula madre hepatica primitiva humana aislada, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada no expresa alfa-fetoprotema, expresa Ep-CAM y es un precursor para una celula madre hepatica proximal, y dicha celula madre hepatica proximal es capaz de dar lugar a un progenitor hepatocftico o un progenitor biliar, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada es una celula individual adulta.

La presente invencion tambien se dirige a un metodo para aislar un progenitor hepatico primitivo humano capaz de dar lugar a progenitores hepatocfticos o progenitores biliares, y el metodo comprende:

(a) proporcionar una suspension de celulas derivadas de tejido hepatico;

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(b) aplicar dicha suspension de celulas a una superficie de plastico;

(c) cultivar las celulas en condiciones que incluyen el uso de medio sin suero que comprende un regulador del metabolismo de carbohidratos, una fuente de hierro, y un factor de produccion de membranas; y

(d) seleccionar las celulas que expresan Ep-CAM y que no expresan alfa-fetoprotema.

La presente invencion se dirige ademas a una celula madre hepatica primitiva humana aislada que no expresa alfa- fetoprotema y que expresa Ep-CAM y es capaz de dar lugar a progenitores hepatodticos o progenitores biliares, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada es una celula individual adulta.

Ademas, la presente invencion se dirige a un metodo para producir un medicamento para tratar una disfuncion o enfermedad hepatica que comprende mezclar una cantidad eficaz de dicha celula madre hepatica primitiva humana con un vehnculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 demuestra la formacion de colonias en cultivo sobre plastico de celulas parenquimatosas fetales enriquecidas en el Dfa 1 de cultivo sobre plastico (Panel Superior) y Dfa 5 (Panel Inferior).

La FIG. 2 demuestra la formacion de colonias en cultivo sobre plastico del Dfa 5 al Dfa 14.

La FIG. 3 demuestra el comportamiento de las colonias en el cultivo sobre plastico.

La FIG. 4 demuestra la tincion de las celulas de las colonias sobre plastico para albumina (fila 1), CK19 (fila 2), ep- CAM (fila 3) y NCAM (fila 4).

La FIG. 5 demuestra la tincion para colonias cultivadas sobre plastico para CD146 y CD133 (superior), y AC133 (inferior).

La FIG. 6 demuestra un cultivo primario de celulas madre proximales despues de 7 dfas sobre una capa de soporte de STO tenido para albumina (fila 1), alfa-fetoprotema (fila 2), y CK19 (fila 3).

La FIG. 7 demuestra el desarrollo de una celula de una colonia retirada de un cultivo sobre plastico y colocada en placas sobre una capa de celulas de soporte STO.

Las FIGS. 8-11 demuestran la irrupcion de celulas desde la colonia sobre una capa de soporte de STO.

Las FIGS. 12 y 13 demuestran el enriquecimiento de celulas que expresan AFP en celulas hepaticas humanas.

Las FIGS. 14-18 demuestran el aislamiento de una subpoblacion de celulas de hngado humano adulto que co- expresan albumina, CD133, y Ep-CAM.

La FIG. 19 representa la curva de crecimiento de 9 colonias de celulas madre de 3 hngados cultivadas sobre plastico a lo largo de un periodo de 3 semanas. Las medidas del crecimiento se iniciaron despues de 12 dfas en cultivo. La curva muestra que las celulas crecen con un tiempo de duplicacion de 5,2 dfas.

La FIG. 20 representa transferencias de Western de la expresion de albumina (ALB, grupo superior) y de alfa- fetoprotema (AFP, grupo inferior) en celulas de tngado fetal recien aisladas y durante su cultivo posterior sobre un sustrato de plastico.

En el grupo de la izquierda, se muestran dos fracciones de celulas (P e I) basadas en una centrifugacion a traves de Ficoll. Las celulas que se sedimentan en el Ficoll se denominan P, y las celulas que forman capas en la interfase entre el medio acuoso y el Ficoll se denominan I. La transferencia individual del medio muestra la expresion de albumina y AFP en las celulas de colonias purificadas (celulas madre hepaticas primitivas) cultivadas sobre plastico durante 3 semanas. El panel de la derecha muestra los carriles de control, en los que no hubo protema (blanco), o patrones de albumina (ALB) o alfa-fetoprotema (AFP). Se cargaron 10 |jg de protema en cada carril.

Descripcion detallada de la invencion

1. Definiciones

En la descripcion siguiente se usan ampliamente varios terminos para describir la invencion. Para proporcionar una comprension clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, lo que incluye el alcance a dar a tales terminos, se proporcionan las siguientes definiciones:

CD: "Grupo de diferenciacion" o "determinante comun", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a moleculas de la superficie celular reconocidas por anticuerpos monoclonales. La expresion de algunos CDs es espedfica de las celulas de un linaje o ruta de maduracion particular, y la expresion de otros vana segun el estado de activacion, la posicion o la diferenciacion de las mismas celulas.

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Terapia Celular: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "terapia celular" se refiere a la transferencia in vivo o ex vivo de poblaciones celulares definidas usadas como material autologo o alogenico y trasplantadas a, o cerca de, una celula objetivo espedfica de un paciente. Las celulas se pueden trasplantar en cualquier medio, vehmulo o diluyente adecuado, o cualquier tipo de sistema de administracion de farmacos, que incluye los microportadores, esferas, microsomas, microesferas, vesmulas, etc. Tambien se pueden usar en un biorreactor en el que proporcionan funciones cnticas, y el biorreactor se puede usar como un dispositivo de asistencia para pacientes con disfuncion(es) hepatica(s).

Progenitores Comprometidos: Celulas sumamente proliferativas que dan lugar a celulas hijas de un solo destino. Un "progenitor biliar comprometido" da lugar a conductos biliares y se puede reconocer antigenicamente por la expresion de citoqueratina 19, pero no AFP. Un "progenitor hepatodtico comprometido" da lugar a hepatocitos, y se puede reconocer antigenicamente por la expresion de AFP y albumina, pero no citoqueratina 19. El proceso de compromiso no se comprende a nivel molecular. Mas bien, se reconoce que ha ocurrido solamente de manera experimental cuando los destinos de las celulas se han estrechado desde el de un predecesor.

Terapia Genica: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "terapia genica" se refiere a la transferencia in vivo o ex vivo de material genetico definido a celulas objetivo espedficas de un paciente, por lo que se altera el genotipo y, en la mayona de las situaciones, se altera el fenotipo de las celulas objetivo con el proposito final de prevenir o alterar un estado patologico particular. Esto puede incluir modificar la celula objetivo ex vivo e introducir las celulas en el paciente. En manera alternativa, se puede dirigir un vector hacia las celulas progenitoras hepaticas in vivo para administrar el material genetico exogeno y transfectar los progenitores. Ademas, se pueden usar celulas progenitoras modificadas geneticamente en un biorreactor como terapia para pacientes o como fuente de productos biologicos. Como indica esta definicion, la premisa subyacente es que estos procedimientos geneticos terapeuticos estan disenados para prevenir, tratar o alterar finalmente una afeccion patologica manifiesta o encubierta. En la mayona de las situaciones, el proposito terapeutico final de los procedimientos de terapia genica es alterar el fenotipo de la poblacion celular objetivo espedfica.

Celulas Hepaticas: Una subpoblacion de celulas hepaticas que incluyen hepatocitos y celulas biliares.

Progenitores Hepaticos: Una subpoblacion de celulas madre, y estas celulas dan lugar finalmente a celulas parenquimatosas maduras que comprenden hepatocitos y celulas biliares. Los progenitores hepaticos incluyen las dos subpoblaciones siguientes: (a) celulas madre hepaticas y (b) progenitores comprometidos.

Celulas Madre Hepaticas: Una subpoblacion de progenitores hepaticos, que incluyen "celulas madre hepaticas primitivas" y "celulas madre hepaticas proximales".

Precursor: Tal como se usa en la presente memoria, el termino "precursor" se refiere a un primer tipo de celula que da lugar a un segundo tipo de celula. El precursor puede dar lugar directamente al segundo tipo de celula. El precursor tambien puede dar lugar al segundo tipo de celula a traves de otro u otros tipos de celulas intermediarias.

Celulas Madre Hepaticas Primitivas: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "celulas madre hepaticas primitivas" se refiere a celulas madre hepaticas que dan lugar a celulas madre hepaticas proximales.

Celulas Madre Hepaticas Proximales: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "celulas madre hepaticas proximales" se refiere a celulas madre hepaticas que dan lugar a hepatocitos y celulas epiteliales biliares.

Celulas Hepaticas: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "celulas hepaticas" se refiere a todos los tipos de celulas presentes en el tugado normal, independientemente de su origen o destino.

Celulas Madre: Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "celulas madre" se refiere a celulas sumamente proliferativas que pueden dar lugar a celulas hijas con mas de un destino, es decir, son pluripotentes. Las celulas madre totipotentes, tales como las celulas madre embrionarias (celulas ES) o las celulas embrionarias hasta la etapa de 8 celulas de un embrion de mairnfero, tienen capacidad de autorrenovacion (automantenimiento), en donde la celula madre produce una celula hija identica a sf misma. En contraste, las celulas madre determinadas, tales como las celulas madre hematopoyeticas, neuronales, cutaneas o hepaticas, son pluripotentes, y tienen una amplia capacidad de crecimiento, pero tienen una capacidad de autorrenovacion cuestionable. En el caso de las celulas madre totipotentes, algunas celulas hijas son identicas al progenitor, y algunas "se comprometen" hacia destino(s) espedfico(s), lo que limita su potencial genetico al que es menor que el del progenitor. En el caso de las celulas madre determinadas, algunas celulas hijas conservan la pluripotencia y algunas la pierden, comprometiendose a un unico destino espedfico.

Cuando se usan los terminos "uno", "un" o "una" en esta descripcion, significan "por lo menos uno" o "uno o mas", a menos que se indique de otra manera.

2. Marcadores de Diagnostico para Linajes Hepaticos

La alfa-fetoprotema (AFP) y la albumina, ambas protemas citoplasmicas, son marcadores especialmente fiables para los linajes hepaticos cuando se ensayan como protemas. Se expresan ARNs mensajeros que codifican formas

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variantes de estas protemas en los progenitores hematopoyeticos, pero no se traducen; por ejemplo, una forma variante de mARN de AFP que difiere de la de las celulas hepaticas por la sustitucion de las secuencias codificadas por el exon 1 con un exon 1 alternativo o dos exones (Kubota, Storm y Reid, presentado; tambien en solicitud de patente). Por lo tanto, la expresion de estas dos protemas es el fundamento para la identificacion de las subpoblaciones hepaticas de otros tipos de celulas en el hngado. En el hngado en desarrollo, se reconoce la presencia de AFP y albumina como un buen indicador positivo de las celulas progenitoras hepaticas. En las etapas mas tempranas del desarrollo del hngado, estas celulas son capaces de producir una descendencia que entra en los linajes biliar y hepatodtico. Si estas celulas hijas se comprometen hacia el linaje biliar, cesa la expresion de AFP. Sin embargo, la expresion de AFP persiste en el linaje hepatocftico hasta el penodo perinatal, cuando se inhibe, y queda la expresion de albumina como una de las caractensticas principales del hepatocito adulto.

3. Procesamiento de Progenitores Hepaticos Humanos

El aislamiento de las celulas hepaticas normalmente implica la disociacion enzimatica y mecanica del tejido hasta suspensiones de celulas individuales, seguido del fraccionamiento con una centrifugacion en gradiente de densidad, elutriacion centnfuga, protocolos de digestion enzimatica diferencial (es decir, celulas hepaticas estrelladas), y/o con seleccion mediante el uso de cultivo celular (revisado en Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique" 1983, Alan R Liss, Inc. NY). Se puede obtener tejido hepatico de un adulto (tras la pubertad). Se usa preferiblemente la centrifugacion en gradiente de densidad para fraccionar y aislar las diferentes poblaciones celulares (p.ej., hepatoblastos).

4. Cultivo de Celulas Madre Hepaticas Proximales y Otros Progenitores

Las celulas madre hepaticas proximales y los progenitores hepaticos comprometidos necesitan celulas de soporte de estroma hepatico embrionario y un medio sin suero complementado con una mezcla de hormonas y factores de crecimiento definidos [1-6]. Se puede dar la expansion clonogenica y el mantenimiento prolongado de marcadores clave de las celulas madre hepaticas proximales, de los progenitores comprometidos y de las celulas diploides de hngado adulto, si las celulas de soporte de estroma hepatico embrionario se sustituyen por celulas de soporte STO en combinacion con un medio sin suero definido hormonalmente complementado con insulina, transferrina/Fe, y preferiblemente hidrocortisona [7]. Dado que estas condiciones mantienen una diversidad de progenitores de tejido fetal e incluso la formacion de colonias de celulas adultas diploides [7], son necesarias condiciones diferentes para seleccionar las celulas madre hepaticas primitivas.

5. Aislamiento de Celulas Madre Hepaticas Primitivas

La presente invencion implica un metodo para aislar celulas madre hepaticas primitivas de tejido hepatico humano que comprende aplicar una suspension de celulas derivadas de tejido hepatico, preferiblemente enriquecida en celulas parenquimatosas, a una superficie de plastico, y someter a las celulas a condiciones de cultivo rigurosas que eliminan las celulas hepaticas maduras, las celulas madre hepaticas proximales y los progenitores comprometidos. Las condiciones de cultivo rigurosas incluyen el uso de medio sin suero complementado con un regulador del metabolismo de carbohidratos, una fuente de hierro, un factor de produccion de membranas, y preferiblemente un antioxidante.

Un regulador preferido del metabolismo de carbohidratos es insulina. Una fuente preferida de hierro es transferrina. Un factor de produccion de membranas preferido es una composicion que comprende uno o mas lfpidos, mas preferiblemente, acidos grasos libres. Un antioxidante preferido es selenio. El medio sin suero ademas esta complementado preferiblemente con hidrocortisona. El tejido hepatico se obtiene preferiblemente de un feto, un neonato, un lactante, un nino, un adolescente o un adulto, y lo mas preferiblemente de un feto.

Las celulas madre hepaticas primitivas se afslan cultivando la suspension de celulas derivadas de hngado sobre una superficie de plastico a densidades celulares bajas (p.ej., 1000-2000 celulas/cm2). Las condiciones de cultivo rigurosas dan como resultado la aparicion de celulas madre hepaticas primitivas de hngado humano que son precursores de celulas madre hepaticas proximales. Estas celulas madre hepaticas primitivas de hngado humano co- expresan Ep-CAM, AC133, CK8/18, CK19 y albumina, y subpoblaciones de las mismas expresan N-CAM, CAM 5.2 y c-kit.

Alguien de experiencia en la tecnica reconocera que la presente invencion se puede usar para aislar celulas primitivas de otros tipos de tejido.

6. Aislamiento de las Celulas Madre Hepaticas Proximales

Las celulas madre hepaticas proximales humanas dan lugar a hepatocitos o epitelios biliares, o combinaciones de los mismos. Las celulas madre hepaticas proximales humanas co-expresan Ep-CAM, CK8/18, citoqueratina 19, alfa- fetoprotema y albumina, y subpoblaciones expresan AC133. Las celulas madre hepaticas proximales humanas se pueden aislar mediante diversos metodos, que incluyen (i) inmunoseleccion de celulas que co-expresan EP-CAM, (ii) cultivo de suspensiones de celulas derivadas de hngado, preferiblemente enriquecidas en celulas parenquimatosas, con un factor inductor del desarrollo, o (iii) cultivo de celulas madre hepaticas primitivas humanas con un factor inductor del desarrollo. El factor inductor del desarrollo lo proporciona preferiblemente una celula secundaria. Las

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celulas secundarias preferidas incluyen una celula de soporte STO, una celula del estroma hepatico embrionario o una celula endotelial.

8. Produccion de Progenitores Hepaticos

La presente invencion implica ademas un metodo para producir celulas madre hepaticas proximales y progenitores comprometidos a partir de celulas madre hepaticas primitivas que comprende colocar en placas directamente sobre celulas de soporte STO y en el HDM, o transferir las celulas madre hepaticas primitivas de colonias sobre plastico para cultivo a una capa de celulas de soporte STO, y permitir que las celulas madre hepaticas proximales surjan de las colonias de celulas madre hepaticas primitivas.

Tambien se pueden producir celulas madre hepaticas proximales y progenitores comprometidos a partir de celulas madre hepaticas primitivas cultivando sobre superficies sin revestir, que incluyen placas de Petri (preferiblemente superficies de poliestireno sin carga), plastico para cultivo de tejidos (preferiblemente superficies de poliestireno expuestas a gas ionizante, de forma que el poliestireno esta polarizado con una orientacion preferente de cargas negativas (o positivas) hacia el lado al que se van a unir las celulas), microportadores (preferiblemente esferas de cultivo a las que se pueden unir las celulas), telas textiles (preferiblemente nailon, algodon, poliester), estructuras sinteticas (preferiblemente hechas de polilactidas, poli(fumarato de propileno), poli(orto esteres) u otros materiales sinteticos) o esponjas (preferiblemente esponjas naturales o sinteticas).

Tambien se pueden producir celulas madre hepaticas proximales y progenitores comprometidos a partir de celulas madre hepaticas primitivas cultivando sobre superficies biologicas. Las superficies biologicas se pueden revestir o preparar sobre las superficies de las categonas anteriores. Asf, por ejemplo, se pueden aplicar revestimientos de matriz extracelular sobre placas de Petri, plastico para cultivo de tejidos, microportadores o telas textiles. Las superficies biologicas usadas en la presente invencion incluyen (i) matriz extracelular (una mezcla compleja de protemas y carbohidratos producidos por las celulas y localizados fuera y entre las celulas, y que comprende colagenos, protemas de adhesion, proteoglucanos y otras protemas), (ii) componentes de la matriz extracelular (componentes de la matriz individuales, purificados, usados solos o en combinaciones para la optimizacion de la union celular, el crecimiento y/o la expresion de funcion(es) espedfica(s) de tejido(s), que incluyen fibronectina, laminina, colagenos (existen mas de 20 familias de colagenos) que incluyen colageno tipo I, colageno tipo III y colageno tipo IV (estos tres son los usados mas habitualmente hoy dfa en el cultivo de celulas), moleculas de adhesion celular o "CAMs", algunas de las cuales son dependientes de calcio y algunas no lo son, y proteoglucanos (moleculas que consisten en una protema central a la que se unen una o mas cadenas de glucosaminoglucanos, polfmeros de una unidad dimerica de acido glucuronico o acido iduronico + un aminoazucar). Estos incluyen proteoglucano de sulfato de condroitina, proteoglucano de sulfato de dermatano, proteoglucano de sulfato de heparitina, proteoglucano de heparano), (iii) extractos de tejidos enriquecidos en matriz extracelular, que incluyen Matrigel (un extracto de urea de un carcinoma embrionario murino trasplantable). Se puede revestir sobre cualquiera de las superficies proporcionadas en el grupo I)), ECM (extraccion de celulas cultivadas mediante el uso de alcali diluido, detergente diluido, extraccion a concentracion salina elevada, urea, etc., y dejando un exudado enriquecido en componentes de la matriz extracelular que reviste la superficie (cualquiera de los del grupo I)), matriz de la membrana amniotica (extraccion del amnios con alcali diluido, detergente diluido, extraccion a concentracion salina elevada, urea, etc., y dejando los componentes de la matriz presentes en el amnios) y biomatrix (extraccion de tejido con concentracion salina elevada (p.ej., NaCl >3 M) y nucleasas para dejar todos los colagenos del tejido y cualquier componente asociado, tal como protemas de adhesion), (iv) revestimiento de suero (si se recubren placas de Petri o placas de cultivo de tejidos con suero, se anaden protemas de adhesion, en especial fibronectina, presente a niveles elevados en el suero), y (v) polilisina o polileucina (el revestimiento con estos aminoacidos cargados positivamente se usa para unir de manera preferente las celulas epiteliales).

Los progenitores hepaticos producidos mediante la presente invencion incluyen celulas madre hepaticas primitivas y proximales, progenitores hepatocfticos comprometidos y progenitores biliares comprometidos.

9. Aproximaciones Terapeuticas

Los progenitores aislados de la presente invencion se pueden usar para la terapia celular y/o genica dirigida al hngado, o como celulas para ser hospedadores para la produccion de virus (p.ej., hepatitis C) para generar vacunas. Ademas, los progenitores de la presente invencion se pueden expandir ex vivo a partir de biopsias hepaticas (p.ej., biopsia en sacabocados), y las celulas expandidas se pueden usar para terapias celulares o genicas autologas o alogenicas, o se pueden usar para sembrar biorreactores para crear hngados bioartificiales que se pueden usar clmicamente o para estudios academicos. Esto eliminana la necesidad de reseccion quirurgica invasiva mayor del hngado del paciente.

Una vez que los progenitores se establecen en cultivo, se puede llevar a cabo la transferencia genica mediante el uso de cualquiera de varios sistemas diferentes de vectores de administracion de genes. Las caractensticas de crecimiento de los progenitores de esta invencion permiten el uso en una transferencia genica ex vivo mediante el uso de ciertos vectores de administracion de genes (es decir, vectores retrovirales) que necesitaran la proliferacion celular para una insercion y expresion genica eficaz.

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Un procedimiento alternativo para la terapia genica es disenar vectores que seleccionen como objetivo espedficamente los progenitores, y despues inyectar el vector, acoplado con el gen de interes, directamente al paciente. Los vectores seleccionanan y modificanan la poblacion de celulas progenitoras endogenas.

El progenitor de esta invencion se puede usar en una terapia celular o genica autologa o alogenica dirigida al tngado. Claramente, el uso de progenitores hepaticos autologos eliminara una preocupacion importante con respecto al rechazo de las celulas trasplantadas. Los progenitores de esta invencion son especialmente atractivos para la transferencia de celulas alogenicas, ya que su perfil antigenico indica mmimos fenomenos de rechazo inmunologico.

Una vez que los progenitores autologos o alogenicos se afslan, purifican y cultivan, se pueden modificar geneticamente o pueden permanecer intactos, se pueden expandir in vitro, y despues se pueden trasplantar de nuevo al hospedador. Si se desea la modificacion genetica, despues de la modificacion genetica y antes del trasplante, las celulas modificadas geneticamente se pueden expandir y/o seleccionar basandose en la incorporacion y la expresion de un marcador seleccionable dominante. El trasplante puede ser otra vez en el compartimento hepatico o en un sitio ectopico o heterotopico. Para el trasplante en el compartimento hepatico, se podna usar infusion en la vena portal o inyeccion intraesplenica. La inyeccion intraesplenica puede ser la v^a de administracion de eleccion, ya que los progenitores hepaticos trasplantados por medio de una inyeccion intraesplenica se trasladan al compartimento hepatico.

Otros procedimientos medicos pueden favorecer la eficacia del injerto hepatico de los progenitores hepaticos trasplantados. Los modelos animales han demostrado que en la hepatectoirna parcial, la administracion de factores de angiogenesis y otros factores de crecimiento favorecen el injerto y la viabilidad de los hepatocitos trasplantados. Una aproximacion alternativa es trasplantar los progenitores modificados geneticamente en un sitio ectopico.

Hasta la fecha ha habido problemas asociados a las aproximaciones de la terapia celular hepatica, que incluyen la procedencia de las celulas, la incapacidad de criopreservar las celulas, la formacion de embolos y el rechazo inmunologico, etc. Los problemas asociados a las aproximaciones actuales de la terapia celular hepatica se pueden deber al hecho de que las celulas donantes que se usan son predominantemente celulas hepaticas adultas, y viven poco tiempo tras el aislamiento y la reinyeccion. Ademas, el uso de celulas adultas da como resultado un intenso rechazo inmunologico. Las celulas progenitoras de la presente invencion ofrecen mayor eficacia debido a su capacidad limitada de generar fenomenos de rechazo inmunologico, su capacidad de ser criopreservadas, y por lo tanto ofrecer oportunidades para tipificar en ellas el tejido (y por tanto hacer coincidir las celulas donantes con el receptor), y ofrecer un producto "de fabricacion estandar", y debido a su extenso potencial regenerativo.

Con respecto a la terapia genica, los esfuerzos en curso hacen uso de "vectores inyectables dirigidos", la via mas utilizada para las terapias clmicas en desarrollo. Estas aproximaciones han tenido una eficacia limitada debido a los problemas inmunologicos y la expresion transitoria de los vectores. La unica via para la terapia genica que se ha demostrado que merece merito ha sido la terapia genica ex vivo, y se ha realizado casi exclusivamente en las celulas progenitoras hematopoyeticas. Se predice que la terapia genica ex vivo con celulas progenitoras (o el uso de vectores inyectables de alguna manera dirigidos hacia esos progenitores) demostrara ser mas eficaz, ya que los vectores se pueden introducir ex vivo en las celulas progenitoras purificadas; seleccionar las celulas modificadas y reintroducirlas in vivo. Las ventajas de las celulas progenitoras son su enorme potencial de expansion, su minima induccion, si la hay, de reacciones inmunologicas, o la capacidad de tipificar su tejido y por lo tanto hacerlas coincidir con el fenotipo inmunologico del receptor, y su capacidad de diferenciarse para producir hepatocitos y celulas biliares.

10. Otros Usos

Los usos de las celulas madre hepaticas primitivas y proximales humanas son muchos y diversos. Incluyen: 1) investigacion en celulas humanas; 2) produccion de vacunas o antivirales; 3) estudios toxicologicos; 4) desarrollo de farmacos; 5) fabricacion de protemas (mediante el uso de las celulas como hospedadores para la produccion de diversos factores espedficos humanos); 6) terapias celulares hepaticas; 7) terapias genicas hepaticas; y 8) hfgados bioartificiales que se pueden usar en estudios de investigacion, toxicologicos y antimicrobianos, fabricacion de protemas, o clmicamente como un sistema de asistencia para el tngado. Considerando la capacidad de las celulas madre hepaticas primitivas y proximales de diferenciarse en hepatocitos y celulas biliares, las celulas de la presente invencion se pueden usar para destinos hepaticos o biliares, dependiendo del microambiente en el que se coloquen.

La disponibilidad de las celulas progenitoras hepaticas humanas (las cuatro categonas) permitira una investigacion mucho mas exhaustiva en las celulas humanas, facilitara el desarrollo de formas eficaces de terapia celular y genica del tngado, y debena permitir el desarrollo de tngados bioartificiales humanos para el uso en investigacion y como dispositivos de asistencia clmica. En la actualidad, el suministro limitado de tejidos humanos sanos impide los programas clmicos en la terapia celular del tngado o en tngados bioartificiales humanos. Las poblaciones de celulas progenitoras debenan tener un potencial de expansion suficiente para superar, o al menos aliviar en gran medida, ese suministro limitado. Ademas, estas celulas y sus descendientes inmediatos muestran una supervivencia preferente a la isquemia, en fno y en caliente, respecto de la observada con las celulas hepaticas maduras, lo que

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significa que los hugados que no se pueden usar para el trasplante hepatico o para producir celulas hepaticas maduras sanas son fuentes de celulas progenitoras.

La invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 (ejemplo de referencia)

Preparacion de una Suspension de Celulas Hepaticas a Partir de Tejido Fetal

Se obtuvo tejido hepatico de fetos de una edad gestacional de 18-22 semanas mediante interrupciones electivas de la gestacion. Las muestras de tejido hepatico se enviaron durante la noche en RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal del 10%.

El volumen de tejido oscilo de 2 a 12 mL despues de un lavado preliminar en tampon de celulas (RPMI complementado con albumina de suero bovino (fraccion V de BSA, 0.1%, Sigma, St. Louis, Mo.), acido selenioso (300 pM) y mezcla antimicrobiana, AAS (Gibco BRL/Invitrogen Corporation, Carlsbad, California). Se subdividio el tejido hepatico segun fue necesario en fragmentos de 3 mL o menos para la digestion en 25 mL de tampon de celulas que contema colagenasa tipo IV y desoxirribonucleasa (Sigma, St Louis, Mo.; ambos a 6 mg por mL). Se llevo a cabo la incubacion a 32 °C con agitacion frecuente durante 15 - 20 minutos, y dio como resultado una suspension homogenea de agregados celulares. La suspension se hizo pasar despues a traves de un tamiz de calibre 40, y se centrifugo a 1200 RPM durante cinco minutos antes de la resuspension en una disolucion sin calcio de solucion salina tamponada de Hanks complementada con EGTA (0.2 mM, Sigma), Hepes (20 mM, Boehringer Mannheim), BSA (0.1%, Sigma), DNasa (0.01%, Sigma), y se denomino HBSS mod.

La suspension digerida enzimaticamente comprende subpoblaciones hematopoyeticas y hepaticas. Se muestra un perfil antigenico de la suspension digerida enzimaticamente en la Tabla 1, y las celulas que expresan AFP son un 69% de la suspension de celulas original (Figura 12), y con un porcentaje comparable de celulas que expresan albumina junto con una contaminacion significativa de celulas hematopoyeticas (veanse los porcentajes de celulas que expresan CD45 y glucoforina A en la Tabla 1). Si se criopreserva la suspension de celulas original, se pierden algunas celulas, tales como las celulas eritroides, lo que enriquece las celulas que expresan albumina y AFP hasta un 15-20% (Tabla 1). Sin embargo, el enriquecimiento mas notable se da con la digestion enzimatica parcial con colagenasa para proporcionar agregados de celulas parenquimatosas que se separan despues de las celulas no parenquimatosas (flotantes) mediante centrifugacion repetida a baja velocidad como se describe mas adelante, y proporciona una suspension de celulas que tiene mas de un 80% de celulas que expresan albumina y AFP (Tabla 1).

Las celulas hematopoyeticas (principalmente eritrocitos y eritroblastos) y las celulas no parenquimatosas flotantes se separaron despues de la fraccion de celulas parenquimatosas mediante centrifugacion repetida a velocidad lenta a 30 g (300 RPM) durante cinco minutos en HBSS mod. El sedimento se resuspendio y se volvio a centrifugar en 40 ml de HBSS mod, hasta que el color mostro una contaminacion minima con globulos rojos. Normalmente, como informaron otros, esto requirio cuatro o cinco ciclos de centrifugacion y resuspension [14, 15]. Se minimizo la agregacion mediante una segunda ronda de digestion enzimatica en disolucion reciente de colagenasa seguido de tamizado a traves de una malla de nailon de 50 pm, y la vuelta de las celulas a un tampon sin calcio.

La suspension de celulas resultante se lavo dos veces y despues se colocaron por capas alfcuotas de 5 mL, que conteman cada una alrededor de 2x107 celulas, sobre 5 mL de Ficoll Hypaque (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) en tubos Falcon de 50 mL, y se centrifugaron a 3000 RPM durante 20 minutos. Las celulas de la interfase y el sedimento se resuspendieron por separado en medios de siembra (complementados con RPMI), y se tino una alfcuota de cada uno con azul de tripano para la enumeracion y el estudio de la viabilidad con un hemocitometro. La viabilidad celular fue de manera rutinaria mayor del 95 por ciento. El metodo de centrifugacion a baja velocidad para el enriquecimiento de las celulas parenquimatosas elimino los constituyentes hematopoyeticos, lo que dejo una suspension de celulas que tuvo aproximadamente un 80% de celulas que expresaban AFP. La mayona de las celulas que expresan AFP son celulas madre hepaticas proximales, dado que expresan AFP, albumina y CK19, pero no marcadores hematopoyeticos (Tabla 1).

Tabla 1. Analisis Mediante Citometna de Flujo en Celulas de Hfgado Fetal Recien Aisladas

Marcador

Localizacion % Positivo en la Suspension de Celulas Original, OCS (% en C-OCS) % Positivo en la Preparacion Enriquecida de Celulas Parenquimatosas

AFP

Citoplasmatica 6,4±0,8% (~15-20%) 75.5%

Albumina

Citoplasmatica 9,3% (~15-20%) >80%

CD45

Superficie 1,4%±0,4

Glicoforina A

Superficie >50% (37,5±9%) Insignificante

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CD34

Superficie (2,7±0,5%)

CD38

Superficie (1,2+0,3%)

CD14

Superficie 3,0±

CD 117 (c-kit)

Superficie ~1%

Ep-CAM

Superficie n.d.

CD146

Superficie n.d.

N-CAM

Superficie n.d.

CAM-5.2

Superficie n.d.

PE-CAM

Superficie n.d.

CD133

Superficie n.d.

Citoqueratina 19

Citoplasmatica n.d.

Citoqueratina 8/18

Citoplasmatica n.d.

OCS= suspension de celulas original; C-OCS= la suspension de celulas original se criopreservo en un tampon patentado. Las celulas se descongelaron mas tarde y despues se analizo la expresion de los marcadores. Varias celulas, en especial las celulas eritroides (subpoblacion enucleada), no sobreviven a la criopreservacion. Preparacion de celulas parenquimatosas= tras la eliminacion de las celulas eritroides y de otras celulas no parenquimatosas flotantes mediante centrifugacion repetida a baja velocidad; n.d. = no determinado

Ejemplo 2

Preparacion de una Suspension de Celulas Hepaticas a Partir de Tejido Adulto

Se obtuvo un fngado humano de una organizacion de adquisicion de organos autorizada. El donante fue una nina de 13 anos que ha^a sufrido muerte cerebral. El fngado se digirio mediante el uso de una tecnica de perfusion de organos completos. Despues se fracciono la suspension de celulas individuales para obtener celulas viables mediante el uso de un gradiente de Optiprep de 2 etapas (9-12,5%) en un lavador de celulas Cobe 2991. Las celulas vivas se separaron despues de las celulas muertas residuales mezclando volumenes iguales de las celulas fraccionadas al 9% (banda 1) y 12,5% (banda 2) individualmente con Optiprep del 25% para el fraccionamiento adicional en el Cobe 2991. Basandose en el analisis mediante citometna de flujo de los parametros de dispersion frontal y lateral, la composicion celular de la banda 1 y de la banda 2 parecio similar. Las celulas se criopreservaron.

Ejemplo 3

Formacion de Colonias a Partir de Celulas de Hfgado Humano Adulto

Para estudiar la presencia de celulas madre hepaticas mediante formacion de colonias, las celulas del Ejemplo 2 se descongelaron y se colocaron en placas a una densidad de 12.500 celulas vivas/pocillo en una placa de 6 pocillos, por triplicado, sobre una capa de celulas de soporte STO-5. El medio de cultivo de tejidos usado fue DMEM F12 que contema penicilina/estreptomicina (50 U/ml/50 pg/ml), albumina de suero bovino (0,2%, p/v), transferrina (10 pg/ml), acidos grasos libres (7,6 pEq/L), nicotinamida (4,4 mM), selenio (3 x 10"8 M), cobre (1x10-6 M), 2-mercaptoetanol (5 x 10"5 M), L-glutamina (2 mM), insulina (5 pg/ml), hidrocortisona (10-7 M), con o sin la adicion de factor de crecimiento epidermico.

Las celulas se cultivaron durante 5 dfas, se fijaron, y se contaron las colonias visualizadas mediante microscopfa optica. No se observaron colonias en ningun pocillo de las celulas sin fraccionar. Esto se puede deber a los efectos inhibitorios de las celulas muertas o moribundas, o a otro componente de la preparacion celular antes de la centrifugacion en el gradiente de Optiprep. Sin embargo, se observaron colonias de las fracciones celulares de la banda 1 y banda 2. Se observaron 8 colonias en total en los 3 pocillos que conteman celulas de la banda 1 (4 del medio +EGF, 4 del medio -EGF), y se observaron 13 colonias en total en los 3 pocillos de la banda 2 (11 del medio +EGF, 2 del medio -EGF). La frecuencia global de las celulas formadoras de colonias calculada para este experimento fue del 0,03%.

Ejemplo 4

Co-Expresion de Albumina, CD133 y Ep-CAM en una Subpoblacion de Celulas de Hfgado Humano Adulto

Se aislaron celulas de hngados de donantes basicamente como se describio en el Ejemplo 2. La presencia de celulas que expresaban el antfgeno de superficie celular CD45, o antfgeno comun de leucocitos, una tirosina fosfatasa

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expresada de manera generalizada en los globulos blancos (leucocitos), se determino mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD45. Aproximadamente un 17 por ciento de las celulas fueron positivas para CD45 (Figura 14A). Las celulas positivas para CD45 se redujeron mediante clasificacion magnetica de celulas, con el uso del anticuerpo monoclonal anti-CD45 y MicroEsferas MACS super-paramagneticas y el autoMACS, un clasificador de celulas magnetico automatizado de sobremesa. Tanto el anticuerpo marcado con esferas magneticas como el instrumento fueron suministrados por Miltenyi Biotec. Las celulas positivas para CD45 tambien se podnan haber reducido mediante "lavado selectivo", clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, u otros modos de inmunoseleccion negativa. Tras la reduccion, la fraccion de celulas positivas para CD45 que quedaron en la preparacion de celulas hepaticas se redujo hasta aproximadamente el 1 por ciento (Figura 14B). La reduccion de celulas positivas para CD45 facilita el analisis posterior de los antfgenos de los hepatocitos y los progenitores hepaticos y las celulas madre. Tambien debena facilitar el aislamiento de poblaciones enriquecidas de estas celulas.

a. Albumina

Tras la reduccion de las celulas positivas para CD45, se analizo la expresion de albumina de suero humano en una muestra de las celulas hepaticas. Las celulas se fijaron con paraformaldefudo, se permeabilizaron mediante tratamiento con detergente Triton X-100 del 0,2%, y se tineron mediante incubacion secuencial con un anticuerpo monoclonal IgGi de raton hacia albumina humana, y anticuerpos de cabra purificados por afinidad contra la inmunoglobulina Gi (IgGi) de raton marcados con el colorante fluorescente A647. Se determino la tincion de fondo y la autofluorescencia de las celulas mediante el uso de una protema purificada de mieloma de raton (tambien una IgGi) sin actividad de union espedfica a antfgenos humanos, en lugar del anticuerpo monoclonal anti-albumina. Aproximadamente un 97,5 por ciento de las celulas fueron positivas para albumina (Figura 15A). El acotamiento de subpoblaciones para la tincion positiva (contorno rojo) se determino mediante comparacion con el control de protema de mieloma de raton (no mostrado).

Se puede usar la medicion mediante FACS de la dispersion frontal y dispersion lateral de luz para caracterizar las poblaciones celulares. Las dispersiones frontal y lateral son principalmente funciones del tamano celular y de la complejidad estructural intracelular, respectivamente. Como se muestra en la Figura 15B, la poblacion celular positiva para albumina del fugado humano adulto comprende una clase mayoritaria de celulas con dispersion frontal (FSC) y dispersion lateral (SSC) relativamente elevadas. El analisis del tamano y la morfologfa, asf como de marcadores bioqmmicos y antigenicos adicionales (no mostrados), muestra que estas celulas tienen propiedades coherentes con hepatocitos maduros pequenos (tamano medio de aproximadamente 18-22 micrometros de diametro). Los hepatocitos mas grandes (aproximadamente > 30 micrometros de diametro) del fugado humano adulto normal estan aparentemente sub-representados en las preparaciones, probablemente debido a la mayor susceptibilidad a la muerte durante el periodo entre la recogida del organo y la perfusion, y/o la mayor susceptibilidad al dano durante el procedimiento de aislamiento. Sin embargo, la Fig. 15B tambien muestra que, ademas de los hepatocitos maduros pequenos, muchas celulas caracterizadas por una dispersion frontal y lateral menor tambien expresan albumina. Las pocas celulas negativas para albumina (aproximadamente un 2,5 por ciento) de la preparacion muestran casi exclusivamente dispersion frontal y lateral muy baja (Fig. 15C). Estas pueden ser celulas muertas, o celulas muy pequenas, tales como precursores de etapa tardfa de globulos rojos.

b. CD133

El antfgeno CD133 (AC133) es una glucoprotema de la superficie celular de 120 kilodaltons que tiene cinco dominios transmembrana. La protema es similar u ortologa a la protema de raton prominina. El antfgeno CD133 humano se identifico originariamente en un subgrupo de progenitores tempranos, que incluyen celulas madre, en el linaje de celulas formadoras de sangre (hematopoyeticas). Algunas otras celulas inmaduras expresan CD133, que incluyen el epitelio en desarrollo en embriones humanos (semana 5), los precursores de celulas endoteliales y los progenitores neuronales o las celulas madre. Tambien se ha informado la expresion de CD133 en ciertos tumores humanos y lmeas celulares derivadas de tumores, tales como retinoblastomas y la lmea de carcinoma de colon CaCo-2. La protema se halla concentrada de manera preferente en profusiones de membranas plasmaticas, tales como las microvellosidades. Cuando se halla en las celulas epiteliales, se localiza de manera preferente en la superficie de membrana apical, pero no en la vasolateral. Los estudios previos, en particular mediante inmunohistoqmmica, no han podido demostrar la expresion de la protema CD133 en el tejido epitelial humano adulto, a pesar de la presencia de ARN mensajero detectable para la protema en muchos tejidos humanos, que incluyen el fugado adulto.

Se uso una tincion con un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia y analisis mediante FACS para buscar las celulas que expresaban el antfgeno CD133 en las preparaciones de celulas de fugado humano adulto reducidas en CD45. Sorprendentemente, a la luz de los anteriores informes negativos, se observo que una mayona de las celulas hepaticas reducidas en CD45 (vease la Fig. 14B) muestran una tincion positiva para CD133. La Fig. 16A revela aproximadamente un 58 por ciento de celulas positivas para CD133 en una preparacion de fugado de un individuo infantil (de dos anos). La presencia de una poblacion sustancial de celulas positivas para CD133, que incluyen celulas del tamano de pequenos hepatocitos maduros, se ha observado en preparaciones de celulas de otros individuos, que incluyen adultos. La poblacion positiva para CD133 (caja superior de la Fig. 16A), comprende aproximadamente la mitad de las celulas de la preparacion identificada como hepatocitos maduros (pequenos), basandose en la dispersion de luz lateral (Fig. 16A) y la dispersion de luz frontal (no mostrada). Tambien comprende

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muchas celulas que son mas pequenas y distintas morfologicamente de los hepatocitos maduros, a juzgar por la dispersion de la luz.

Se puede usar la clasificacion celular magnetica para seleccionar positivamente las celulas hepaticas que expresan CD133. La Figura 16B muestra el enriquecimiento de celulas positivas para CD133 hasta aproximadamente un 75% de las celulas recuperadas despues de un ciclo de clasificacion magnetica mediante el uso del instrumento autoMACS (Miltenyi Biotec). El uso de cantidades mayores de MicroEsferas MACS acopladas a anticuerpos y el ajuste de las condiciones de clasificacion [insertar mencion a tal efecto - ^debena ser sencillo para un "experto en la tecnica"?] debena permitir el aislamiento de poblaciones de celulas positivas para CD133 sumamente enriquecidas con un rendimiento casi cuantitativo. {Tambien notese que se pueden usar otros metodos de inmunoseleccion positiva para enriquecer las celulas positivas para CD133}. A juzgar por la dispersion lateral (Fig. 16B) y la dispersion frontal (no mostrada), las celulas positivas para CD133 enriquecidas comprenden todas las subpoblaciones de CD133 identificadas en la preparacion de celulas hepaticas reducidas en CD45.

c. Ep-CAM

La molecula de adhesion de celulas epiteliales (Ep-CAM, tambien conocida como GA733-2, CO17-1A, EGP40, KS1- 4 y KSA), es una glucoprotema implicada en la adhesion celula-celula homofflica, independiente de iones de calcio. La protema se expresa en muchos tejidos epiteliales humanos, y parece estar elevada sustancialmente en las celulas epiteliales en proliferacion, lo que incluye las celulas tumorales. C.J. de Boer y sus colegas informaron que en el hngado humano embrionario de 8 semanas la mayona de los hepatocitos expresan protema Ep-CAM detectable [de Boer CJ, van Krieken JH, Janssen-van Rhijn CM, Litvinov SV. (1999). "Expression of Ep-GAM in normal, regenerating, metaplastic, and neoplastic liver," Journal of Pathology 188:201-6]. En contraste, en el hngado humano adulto normal, no pudieron detectar la expresion de Ep-CAM en los hepatocitos, e informaron que solo las celulas epiteliales del conducto biliar se tinen positivamente para este antigeno. Finalmente, se detecto el antfgeno en celulas identificadas como precursores hepaticos en situaciones en las que se indujo la regeneracion y reparacion del hngado mediante cirrosis biliar, y en celulas de ciertos tumores hepaticos, en particular colangiocarcinomas.

Mediante analisis FACS se detecto sistematicamente una poblacion menor de celulas positivas para Ep-CAM en preparaciones de celulas hepaticas humanas sin fraccionar de ninos y adultos. La poblacion positiva para Ep-CAM comprende aproximadamente del 0,4 al 2,5 por ciento de las celulas. Como se muestra en la Figura 17, tambien se pueden observar celulas positivas para Ep-CAM en poblaciones de celulas hepaticas despues de la reduccion de > 95 por ciento de las celulas positivas para CD45. La Fig. 17B muestra las celulas positivas para Ep-CAM de dicha preparacion de hngado humano (0,57 por ciento en la region de la grafica acotada como se muestra mediante el contorno rojo, en comparacion con el 0,15 por ciento en la misma region acotada para un anticuerpo de control que no tine ningun antfgeno humano conocido, Fig. 17A; asf, aproximadamente un 0,57 - 0,15 = 0,42 por ciento de las celulas son positivas para Ep-CAM). El analisis de doble marcador (datos no mostrados) demuestra que la gran mayona de las celulas positivas para Ep-CAM en la poblacion reducida en CD45 son, como se esperaba, negativas para CD45. Sin embargo, parece que algunas de las celulas positivas para CD45 (aproximadamente el 1 por ciento) en las preparaciones de tngado humano tambien expresan Ep-CAM (datos no mostrados).

d. Co-expresion de Ep-CAM, CD133, y Albumina

Se buscaron celulas hepaticas de hngado humano adulto que expresasen Ep-CAM y CD133. Se incubaron celulas con anticuerpos monoclonales hacia CD133 y Ep-CAM, cada uno conjugado directamente con un fluorocromo diferente. Como se muestra en la Fig. 17C, aproximadamente un 42 por ciento de las celulas en esta preparacion particular de celulas de hngado humano adulto reducidas en CD45 se tineron de manera detectable para CD133. (El grado un poco menor de tincion de CD133 en este caso en comparacion con el experimento mostrado en la Fig. 16A puede ser el resultado de diferencias reales entre preparaciones de celulas hepaticas de diferentes donantes como consecuencia de la edad u otras variables, o de variaciones sin identificar en la tecnica experimental). Entre las celulas de la poblacion que se tineron intensamente para Ep-CAM (mostradas dentro del lfmite rojo en la Fig. 17B), alrededor del 70 por ciento se tineron tambien positivamente para CD133 (Fig. 17D). Asf, en esta preparacion de hngado particular, aproximadamente un 0,3 por ciento del total de las celulas negativas para CD45 co-expresaron Ep-CAM y CD133.

La preparacion de celulas usada para el experimento mostrado en la Fig. 17 fue identica a la usada en el analisis de la expresion de albumina mostrada en las Figs. 14 y 15. Como se indico anteriormente, aproximadamente un 97,5 por ciento de las celulas de la poblacion de celulas reducidas en CD45 se tineron positivamente para albumina, y las pocas celulas negativas para albumina exhibieron un patron diferente de baja dispersion frontal y lateral. Como se muestra en la Fig. 17E, practicamente todas (aproximadamente un 99,5 por ciento) las celulas que se descubrio que co-expresaban CD133 y Ep-CAM mostraron una dispersion de luz frontal y lateral caractensticas de las celulas positivas para albumina; se hallan completamente fuera de la region limitada de la grafica de dispersion frontal frente a la dispersion lateral que contiene todas las celulas negativas para albumina (vease la Fig. 15C). Asf, las celulas de hngado humano postnatal que co-expresan Ep-CAM y CD133 tambien expresan albumina de suero humano.

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e. Co-Enriquecimiento de Celulas que Expresan CD133 y Ep-CAM

Como se muestra en la Fig. 16B, la inmunoseleccion positiva, tal como la clasificacion celular magnetica, permite el enriquecimiento de las celulas positivas para CD133 de preparaciones de celulas hepaticas humanas. Se estudiaron las celulas en la poblacion de partida (ya reducidas en CD45) y la preparacion enriquecida en CD133 en funcion de la expresion de Ep-CAM. La Fig. 17A muestra que por lo menos el 1,1 por ciento (acotado estrechamente a proposito) de la poblacion de partida expreso Ep-CAM. Despues del enriquecimiento de las celulas positivas para CD133, la poblacion resultante (Fig. 5B) contiene al menos un 4,5 por ciento de celulas positivas para Ep-CAM. Esto confirma la co-expresion de CD133 y Ep-CAM en una subpoblacion de celulas de hngado humano adulto, y demuestra que estas celulas se pueden enriquecer mediante inmunoseleccion positiva. El analisis de la dispersion frontal y lateral (como en el experimento de la Fig. 17) por las celulas que co-expresan los dos antigenos de superficie muestra de nuevo que casi el 100 por ciento de estas celulas tambien deben ser positivas para albumina.

Las celulas de tngado humano adulto descritas anteriormente co-expresan albumina, un marcador prototfpico del linaje de hepatocitos, junto con CD133 o Ep-CAM, y por lo tanto tienen el mismo perfil fenotfpico de ciertas celulas madre hepaticas de hngado fetal humano que se describen en la presente memoria. Ademas, las celulas de hngado humano adulto descritas en la presente memoria son celulas hepaticas de un tamano menor que los hepatocitos maduros (incluso los "hepatocitos pequenos" de 18-22 micras de diametro). En conjunto con el hallazgo de que el hngado humano adulto contiene celulas capaces de formar colonias en condiciones que definen operacionalmente las celulas madre hepaticas (es decir, en medio sin suero con celulas de soporte STO), la co-expresion de albumina, Ep-CAM y CD133 demuestra la presencia de dichas celulas madre en el hngado adulto. Se pueden usar los metodos de inmunoseleccion positiva descritos en la presente memoria para aislar celulas que expresan simultaneamente los dos marcadores superficiales, Ep-CAM y CD133, para obtener poblaciones sumamente enriquecidas de celulas madre hepaticas de hngado humano, que incluyen tejido derivado de un nino o un adulto.

Ejemplo 5

Cultivos Primarios de Celulas Madre Hepaticas Proximales sobre Capas de Celulas de Soporte STO

La mayona de los progenitores hepaticos, a excepcion de las celulas madre hepaticas primitivas, no sobreviven mucho tiempo al co-cultivarlas con celulas de soporte estromales de hngado embrionario; las celulas de soporte de hngados neonatales, hngados adultos o diversos tejidos adultos no tuvieron exito (Sigal et al, 1994; Brill et al, 1995; Sigal et al, 1995; (Brill S, Zvibel I, y Reid LM. Expansion conditions for early hepatic progenitor cells from embryonal and neonatal rat livers. Digestive Diseases and Sciences 44:364-371, 1999). Las celulas de soporte estromales de hngado embrionario se pueden sustituir por celulas STO, una lmea de celulas estromales embrionarias usadas como celulas de soporte de rutina para celulas madre embrionarias, y que se descubrio que mantienen la expansion clonogenica de las celulas madre hepaticas de roedor normales recien aisladas y las celulas diploides de hngado de rata adulta (Kubota y Reid, 2000). Se descubrio que estas condiciones tambien son esenciales para todos los progenitores de hngado fetal humano, con la excepcion de la celula madre hepatica primitiva que se expandina con y sin las celulas de soporte. Tambien se ha demostrado que las celulas de soporte STO son eficaces para los progenitores hepaticos de hngados humanos neonatales y adultos. No se conocen los factores aportados por las celulas de soporte estromales embrionarias, esenciales para los progenitores.

Se expandieron celulas de soporte STO, originariamente de la ATCC, a partir de celulas de reserva en matraces de 75 cm en DMEM/F12 (Gibco/BRL/InVitrogen Corporation, Carlsbad, California) complementado con suero bovino fetal, FBS, del 10% (Hyclone, Logan, UT) y DmSo del 1% (Sigma, St. Louis, Mo.). Despues de tres pases para proporcionar nueve matraces confluentes, las celulas se trataron durante 2 horas con 10 pg/mL de mitomicina C (Sigma, St. Louis, Mo; tambien, Biomol, Plymouth Meeting, PA), para inducir la detencion del ciclo celular, y se lavaron dos veces con medio de cultivo. Las celulas se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de criopreservacion (DMEM/F12 del 50%, FBS del 40%, DMSO del 10%) antes de congelarlas en alfcuotas de 1 mL de 5x106 celulas, y se almacenaron a -80 °C. Se prepararon celulas de soporte sembrando 6x104 celulas descongeladas/cm2 en placas de cultivo pre-revestidas con gelatina del 0,1% (Sigma, St. Louis, Mo). Los protocolos detallados descritos en [16] se incorporan en la presente memoria como referencia.

Las celulas que se pasaron a celulas STO se cultivaron en un medio sin suero, hormonalmente definido (HDM) que comprendfa RPMI 1640 (GIBCO/BRL/InVitrogen Corporation, Carlsbad, California) complementado con albumina de suero bovino del 0,2% (Fraccion V sin acidos grasos, Sigma, St. Louis), insulina (5 pg/ml), transferrina/Fe (10 pg/ml), selenio (3x10-8 M)2-mercaptoetanol (5x10-5 M), una mezcla compleja de acidos grasos libres (7,6 pEq; [16, 17]), hidrocortisona (10-7 M), glutamina (2 mM), nicotinamida (4 mM) y AAS (penicilina, 1000 pg/mL, estreptomicina, 100 pg/ml, y anfotericina B 250 ng/mL, Sigma). Preferiblemente, no se usaron ni citocinas ni factores de crecimiento hepatico clasicos (p.ej., factor de crecimiento epidermico, EGF, factor de crecimiento de hepatocitos, HGF, ni factores de crecimiento similares a insulina, IGFI e IGFII).

Se sembraron en placas cultivos primarios de celulas parenquimatosas dispersadas y enriquecidas del Ejemplo 1 sobre una capa de celulas de soporte STO, y produjeron agregados estables de celulas madre hepaticas proximales que expresaron albumina, AFB y CK19. La tincion celular tfpica para albumina, AFP y CK19 se muestra en las

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Figuras 6a-6c. Estas celulas tambien fueron positivas para CK8/18. A diferencia de las celulas cultivadas sobre un sustrato de plastico como se describe en el Ejemplo 6, las celulas madre hepaticas proximales sembradas sobre celulas de soporte STO conservaron una morfolog^a coherente y mantuvieron la expresion de AFP durante varias semanas. Debido a que estas condiciones mantienen tanto a las celulas madre hepaticas proximales como a celulas mas diferenciadas, que incluyen las celulas diploides de hugado adulto ([7]), el co-cultivo con celulas de soporte STO demostro ser inadecuado para la seleccion de celulas formadoras de colonias realmente primitivas.

Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)

Seleccion de Celulas Madre Hepaticas Primitivas

La suspension enriquecida de celulas parenquimatosas del Ejemplo 1 se coloco en placas a una densidad de 20005000 celulas/cm2 sobre plastico para cultivo de tejidos en un medio sin suero complementado con lfpidos, insulina y transferrina/Fe (HDM). Durante las primeras 12 horas tras la colocacion en placas, el medio contuvo FBS del 10% para estimular la union de las celulas, tras lo cual los cultivos se mantuvieron sin suero. Se realizaron cambios del medio a intervalos de tres dfas.

Inmediatamente tras la union, las celulas predominantes presentes en el cultivo fueron celulas madre hepaticas proximales y progenitores comprometidos, agregados de celulas con una morfologfa celular parenquimatosa clasica, y con expresion de albumina, AFP y/o CK19; las celulas madre hepaticas proximales mostraran expresion de albumina, AFP y CK19 (Figura 2a). Despues de varios dfas, las celulas madre hepaticas proximales y los progenitores comprometidos dejaron de expresar AFP, y se sustituyeron por tipos de celulas solitarias moviles con una apariencia miofibroblastica que se dispersaron en la placa. Ademas de las celulas madre hepaticas proximales, hubo presentes otros tipos de celulas en el cultivo, algunos solitarios, algunos formando monocapas confluentes extensas, mientras otros formaron agrupamientos de celulas redondas discretas. Entre estos tipos de celulas, se observo la tincion positiva para albumina solo en las celulas madre hepaticas proximales, los progenitores comprometidos y en colonias circulares firmemente agregadas, las celulas madre hepaticas primitivas, que aparecieron en cultivo de manera concurrente con la desaparicion gradual de las celulas madre hepaticas proximales y los progenitores comprometidos.

La formacion de colonias mostro una secuencia de eventos predecible. En los primeros dfas de cultivo aparecio una oleada inicial de colonias, y parecieron surgir a partir de agregaciones de celulas preexistentes (Figura 1b). Sin embargo, despues de 5-7 dfas, se inicio una nueva oleada de formacion de colonias a partir de celulas solitarias dispersadas por toda la placa de cultivo. Estas colonias fueron reconocibles primero como grupos de 4-8 celulas pequenas, oscuras, firmemente compactadas, con lamelipodios en la periferia que formaban un borde continuo estrecho (Figura 2a). Las colonias se expandieron en agrupamientos extensos de celulas redondeadas firmemente agregadas de 8-10 pm de diametro (Figura 2b-2e). La apariencia general de estas colonias de formacion tardfa es diferente de las colonias que se forman en los primeros dfas de cultivo, que estuvieron compuestas de celulas mas grandes, y de los agregados iniciales de celulas madre hepaticas proximales que constituyen las celulas parenquimatosas principales del hugado fetal.

Las celulas madre hepaticas primitivas crecieron bien sobre plastico para cultivo de tejidos en el HDM, y alcanzaron diametros de hasta 1 cm despues de varias semanas en cultivo. Se retiraron de manera selectiva numerosas colonias y se dispersaron mediante tripsinizacion para proporcionar un numero medio de celulas por colonia que oscilo de 1000 celulas para las colonias de 3 mm de diametro a 15.000-20.000 en las colonias grandes, con diametros de 1 cm.

En general, las celulas mas exteriores de las colonias se convirtieron en un fenotipo aplanado que se separo de la colonia para formar celulas solitarias de gran diametro que se dispersaron por toda la placa de cultivo (Figura 3a). En otras colonias, las celulas del penmetro asumieron una apariencia fibroblastica elongada que inicialmente se enrollo estrechamente alrededor de la circunferencia de la colonia, quiza celulas mesenquimatosas firmemente asociadas (Figura 3b). Estas celulas tambien migraron lejos de las colonias en forma de celulas fusiformes aisladas. Estas celulas dispersadas siguieron siendo sumamente proliferativas, y a menudo llegaron a ser el tipo de celulas predominante en el cultivo, formando una capa firmemente empaquetada que se extendio por toda la placa. Esta capa de celulas rodeo las colonias, pero no las supero, aunque se formo una zona de transicion en el margen de cada colonia, donde los dos tipos de celulas se entremezclaban (Figura 3c).

Ejemplo 7 (ejemplo de referencia)

Perfiles Antigenicos de Celulas Formadoras de Colonias en Cultivo sobre Plastico

Se investigaron las caractensticas antigenicas de las celulas cultivadas en el Ejemplo 6 con tincion inmunocitoqmmica para marcadores relevantes para la organogenesis hepatica. Se fijaron los cultivos celulares con una mezcla 50/50 (V/V) de metanol y acetona durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se crearon varias regiones de tincion sobre la superficie de cada placa con un rotulador PAP (Research Products International Corp, Mt. Prospect, Illinois) para permitir multiples combinaciones de anticuerpos en el mismo cultivo. Los sitios de union inespedfica se bloquearon mediante incubacion con una solucion de suero de cabra del 10% (GIBCO/BRL/In Vitrogen, Carlsbad, California) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Despues de lavar dos veces con

PBS, se aplicaron anticuerpos monoclonales primarios a cada una de las regiones de tincion (normalmente 0,1-0,3 mL por region), y se incubaron durante la noche. Tras la incubacion durante la noche a 4 °C las celulas se lavaron dos veces con PBS y despues se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado a Alexa 488 (1:750) o Alexa 594 (1:1250) (Molecular Probes, Eugene OR). En algunos casos estuvo disponible un anticuerpo monoclonal 5 primario conjugado a FITC o PE y proporciono el medio para el marcaje doble mediante incubacion con este anticuerpo tras la finalizacion del protocolo de marcaje con un anticuerpo primario sin conjugar.

El perfil antigenico se resume en la Tabla 2. Las colonias se tineron positivamente para varios marcadores previamente asociados a los tipos de celulas hepaticas, que incluyen albumina (Figura 4a), CK19 (Figura 4b), epCAM (Figura 4c) y NCAM (CD56, Figura 4d), pero no PeCaM (CD31; datos no mostrados). Se observo la tincion 10 con c-kit en varias colonias, localizada en general en un segmento estrecho en el margen de las colonias (Figura 5a). Ademas, las colonias fueron positivas para el supuesto marcador de celulas madre, CD133 (AC133, Figura 5c). De manera interesante, las celulas de la zona de transicion en la periferia de las colonias se tineron positivamente para un marcador endotelial recientemente descrito, CD146 (M-CAm, Figura 5c), y siguieron siendo positivas para esta protema mientras estuvieron proximas a las colonias, lo que posiblemente identifica un tipo de celula 15 mesenquimatosa estrechamente asociada, posiblemente un progenitor endotelial. Las celulas madre hepaticas primitivas que surgieron en forma de colonias fueron negativas para AFP, lo que indica que las celulas madre hepaticas primitivas son un precursor de las celulas madre hepaticas proximales, que a su vez son precursores de los progenitores de hepatocitos y los progenitores biliares.

Tabla 2 - Fenotipos de las Celulas Cultivadas

Fenotipo

Celulas Madre de la Placa Ductal Celulas madre hepaticas proximales Hepatocitos Epitelios Biliares

Morfologfa en condiciones rigurosas: plastico para cultivo de tejidos y HDM

Celulas oscuras, firmemente empaquetadas, 7-10 de diametro, con morfologfa de "alfiletero" Transitoriamente son agregados de celulas pequenas, cuboides que llegan a ser moviles No sobreviven a las condiciones rigurosas

Morfologfa sobre celulas de soporte STO y en HDM

Celulas oscuras, firmemente empaquetadas, 7-10 de diametro, con morfologfa de "alfiletero" Agregados de celulas estables, densamente empaquetados Subpoblacion diploide aplanada y que tiene diferentes lfmites celulares; Las celulas poliploides sobreviven pero no crecen

Alfa-fetoprotema

No Expresada + + + No expresada No expresada

Albumina

+ + + + + + + + + No Expresada

CK8/18

+ + + + + + + + + + + +

CK19

+ + + + + + No expresada + + +

c-Kit

+++ (celulas en la periferia de la colonia) No expresada No expresada No expresada

Ep-CAM

+ + + + + +

N-CAM

+++ (celulas en la periferia de las colonias) No expresada No expresada No expresada

CAM-5.2

+++ (algunas, no todas, las celulas) No expresada

CD133 (AC133)

+ + + + + + No expresada No expresada

CD146

Periferia de las colonias (se desconoce si es una celula mesenquimatosa asociada o derivada de la celula madre hepatica primitiva) No expresada No expresada No expresada

PE-CAM

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Ejemplo 8 (ejemplo de referencia)

Paso de las Celulas de las Colonias desde el Substrato de Plastico a Celulas de Soporte STO

Se usaron celulas de soporte STO para estudiar los destinos de las celulas madre hepaticas primitivas tras el paso selectivo desde el substrato de plastico. Despues de 1-2 semanas en cultivo, las colonias del substrato de plastico del Ejemplo 6 se levantaron ffsicamente de los substratos de plastico mediante aspiracion en una pipeta de 100 pL con aumento binocular. Se recogieron hasta 50 colonias en HBSS mod, y despues se digirieron durante hasta 20 min en disolucion de colagenasa con agitacion para dispersar las celulas en suspension.

La eficacia de formacion de colonias tras el paso desde el plastico a una capa de celulas de soporte STO fue bajo, y vario entre un 0,5 y 1% para las celulas que se pasaron a densidades de 500 o 50 celulas por cm2. La union inicial de las celulas formadoras de colonias pasadas mejoro por la presencia de EGF (20 ng/mL) en el medio de colocacion en placas. La baja eficacia de formacion de colonias se pudo haber debido, en parte, a la necesidad de someter a las celulas a digestion prolongada (hasta 20 minutos) con colagenasa para conseguir suspensiones de celulas individuales.

Despues del paso a las celulas de soporte STO, las celulas progenitoras primitivas se fusionaron en la capa de celulas STO, y reaparecieron en forma de colonias firmemente compactadas de celulas pequenas despues de 4-5 dfas en cultivo (Figura 6a). Las nuevas colonias se ampliaron durante las siguientes semanas para producir agrupamientos circulares firmemente agregados, a menudo con un ligero engrosamiento en la circunferencia (Figura 6c). En algunas colonias, se dio una etapa proliferativa secundaria en la que se dio una irrupcion de celulas desde un punto en el borde de la colonia, y se extendieron sobre la capa de STO, a menudo rodeando la colonia original (Figura 6c).

Las propiedades inmunocitoqmmicas de las colonias formadas sobre las celulas STO fueron iguales a las descritas anteriormente para las celulas formadoras de colonias sobre los substratos de plastico. Esto incluye la tincion positiva para albumina, CK19, CK18 y CD133. Como en las colonias iniciales generadas sobre plastico, se expresaron marcadores tales como CD146 y NCAM mas claramente en la periferia de las colonias formadas sobre las celulas STO. Este patron de expresion marginal se volvio incluso mas pronunciado cuando las colonias fueron rodeadas por celulas que proliferaron desde la colonia primaria. Esto se muestra claramente para NCAM en la Figura 9, en la que la interfase entre la colonia original formada por las celulas pasadas y la proliferacion secundaria esta marcada por una banda de celulas con expresion de NCAM intensamente positiva. Este patron se observo tambien para la expresion del marcador de pan-citoqueratina CAM 5.2, y el marcaje doble para NCAM y CAM 5.2 mostro que los dos marcadores se expresaron a niveles elevados en la misma region de las celulas marginales (Figura 9).

Finalmente, las caractensticas del tipo de celula en irrupcion fueron de interes, ya que surgieron de las colonias en una disposicion diferente que consistio en una fila paralela de celulas que se alargaban en un patron de ramificacion de celulas dispuestas linealmente con espacios intercelulares claros (Figura 8). Cuando estas celulas se alargaron en una hoja extensa alrededor de las colonias de celulas originales, parecieron perder su organizacion lineal aparente en el momento de su aparicion. Sin embargo, la tincion para albumina revelo que la organizacion en filas de celulas se mantuvo dentro de la masa de celulas (Figura 10a), y la co-tincion para CD146 mostro que este marcador se expresa tambien a niveles elevados dentro del grupo de celulas en proliferacion (Figura 10b). Quiza lo mas importante en estas celulas es la aparicion de tincion para AFP en la periferia de las celulas emergentes (Figura 11). Esto representa el primer punto en las manipulaciones ex vivo descritas en la presente memoria de que la expresion de AFP se puede asociar a la progenie de las celulas formadoras de colonias iniciales. Estos datos indican que las celulas madre hepaticas primitivas aisladas en el Ejemplo 6 se pueden usar para producir progenitores hepaticos comprometidos.

Ejemplo 9

Presencia de Celulas Madre Hepaticas Primitivas y Proximales en un Hfgado de un Donante Neonatal

Se obtuvo un hngado de un donante que habfa nacido despues de aproximadamente 28 semanas de gestacion, y que sobrevivio solamente un dfa. El periodo de isquemia caliente entre el paro cardiaco y la recogida y el lavado del organo donante fue de entre seis y siete horas. Despues, el organo se mantuvo sobre hielo durante aproximadamente doce horas. El organo completo (peso humedo de aproximadamente 100 gramos) se sometio a perfusion y digestion con Liberasa, y se preparo una suspension de celulas basicamente como para un hngado obtenido de un nino o adulto humano. Se eliminaron las celulas no viables y muchos globulos rojos mediante centrifugacion preparativa con el uso de Optiprep. Sin embargo, fue diffcil determinar el rendimiento real y el porcentaje de celulas viables no eritroides en la preparacion final.

Las porciones de las celulas recuperadas se redujeron adicionalmente en globulos rojos mediante centrifugacion diferencial, basicamente como se describe para las celulas de hngado fetal, y despues se sembraron en cultivo en condiciones adecuadas para determinar la presencia de celulas madre hepaticas primitivas (es decir, colocandolas en placas en un medio sin suero hormonalmente definido sobre un substrato de plastico para cultivo de tejidos). Otras porciones de celulas se colocaron en placas, sin purificacion adicional, en condiciones para ensayar las

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celulas madre hepaticas proximales (es decir, colocandolas en placas en medio definido sin suero con celulas de soporte STO). Se sembraron porciones adicionales de las celulas sobre plastico para cultivo de tejidos revestido con colageno tipo I, en medio sin suero definido que contema o que careda de factor de crecimiento epidermico (EGF) complementary a 5 ng/ml.

Despues de periodos adecuados de incubacion, se observo el crecimiento de las colonias hepaticas en todas las condiciones ensayadas. En los ensayos respectivos para celulas madre hepaticas primitivas y proximales, la morfologfa de las colonias y la velocidad de crecimiento fueron similares a las observadas para las celulas cultivadas de tugado fetal humano (obtenido en general despues de < 22 semanas de gestacion) cultivadas en las mismas condiciones. Se pusieron a prueba colonias representativas mediante tincion de inmunofluorescencia para la expresion de albumina humana, y todas fueron positivas para este marcador.

Aparecieron colonias de morfologfa epitelial aparente (presuntamente hepaticas) en las placas revestidas de colageno en presencia de EGF. Tambien crecieron rapidamente otras celulas de morfologfa menos definida en estos cultivos, pero aun no se han caracterizado con detalle.

Tambien aparecieron colonias de celulas presuntamente epiteliales en las placas revestidas de colageno en ausencia de EGF complementario. Algunas de estas colonias se recogieron individualmente mediante el uso de un dispositivo de pipeteo manual, y se transfirieron a medio fresco en placas de 96 pocillos. Las celulas de ciertas colonias han continuado proliferando en tales cultivos, y se estan haciendo pases como cepas celulares. Parece probable que estas representen cepas, potencialmente clonales, de precursores hepaticos propagables, quiza celulas madre. La caracterizacion adicional de la expresion de los andgenos, que incluyen CD133, Ep-CAM, albumina, AFP y CK19, determinara el estado relativo de diferenciacion de estas supuestas lmeas de celulas madre hepaticas.

Ejemplo 10

Clasificacion Mediante Citometna de Flujo y Analisis Mediante Citometna de Flujo (FACscan)

Se realizaron analisis mediante FACscan de andgenos citoplasmicos (p.ej., albumina, AFP) con celulas fijadas y permeabilizadas con paraformaldetddo del 3% antes de la tincion con los antisueros. Las celulas se tineron como se indico para la inmunofluorescencia, pero mediante el uso de anticuerpos marcados directamente con la sonda fluorescente relevante (veanse las Tablas 3 y 4). La citometna de flujo se llevo a cabo en un citometro de flujo "MoFlow" Cytomation (Fort Collins, Colorado) (instalacion de FACs dirigida por el Dr. Larry Arnold). El lfquido de recubrimiento fue HBSS sin modificar. El citometro MoFlow es capaz de analizar o clasificar 40.000 celulas/segundo, con hasta 12 parametros en paralelo (6 "colores" en combinacion con la dispersion frontal y/o la dispersion lateral), y con una exactitud mayor del 99%. Para la mayoria de las clasificaciones se uso un laser de argon de 4 W con una potencia de 60 mW y con una boquilla de 100 pm. Se recogieron las emisiones de fluorescencia a 488 nm de excitacion tras el paso a traves de un filtro de paso de banda de 530/30 nm para FITC. La fluorescencia se midio mediante amplificacion logaritmica. Las celulas se consideraron positivas cuando la fluorescencia fue mayor del 95% de las celulas de control negativo. Se uso un valor de detector de E-1 para la dispersion frontal (FSC) con una amplificacion de escala media, y el detector se uso a escala media para la dispersion lateral (SSC) con una amplificacion de 1. Los acotamientos de SSC se realizaron por medio de amplificacion lineal con division de los parametros en 256 unidades arbitrarias. Como controles negativos se usaron celulas sin tenir, celulas tenidas con un anticuerpo irrelevante y la misma sonda fluorescente o con el mismo anticuerpo pero sin sonda fluorescente. En cada muestra se ensayaron 30.000-50.000 celulas. En las celulas positivas, aquellas con una fluorescencia mayor que los controles negativos, se estudio adicionalmente la granularidad, el tamano y el grado de fluorescencia. Las celulas antes y despues de la clasificacion se mantuvieron a 4 °C en el HDM al cual se anadio suero al 10%.

Tabla 3 - Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos (todos preparados en ratones)

Isotipo/Dilucion Andgeno objetivo (todos humanos) Fuente comercial

CD45 (31254X; 31255X)

IgG1 Kappa/ 1: Andgeno leucocitario comun en todas las celulas hematopoyeticas Pharmingen

CD 235A (32591A)

IgG2b Kappa/ 1: Glucoforina A (andgeno de globulos rojos)

CD 14 (APC)

IgG2a Kappa/ 1: Andgeno presente en monocitos, dendritas, (uno de los receptores de endotoxinas)

CD34 (34374X)

IgG1 Kappa/ 1: Andgeno de celulas madre presentes en diversas poblaciones de progenitores

CD38 (31015X; 31014X)

IgG1 Kappa/ 1: Andgeno presente en celulas B, timocitos y celulas T activadas

CAM 5.2

IgG2a/1:500 CAM en la placa ductal

CD117 (CD11704) (MHCK04)

IgG-i/ 1: c-kit: receptor para factor de celulas madre Caltag

CD31

IgG-/ 1:250 PE-CAM: CAM en endotelios

ALB (A-6684)

IgG2a/1:120 Albumina Sigma, St. Louis, Mo.

CD56

IgG-/ 1:250 N-CAM: CAM en ciertas neuronas y en la placa ductal

AFP (18-0003)

IgG1 Kappa/ 1:250 AFB Zymed

CK 8/18

IgG-/ 1:1000 Citoqueratinas genericas para epitelios

CD146

IgG-/ 1:250 M-CAM: hallado en endotelios Chemicon,

CD133

IgG-i/ 1: AC133, marcador de celulas madre Mylteni Biotek,

Ep-CAM

IgG-/ 1:750 Una CAM en la mayoria de progenitores epiteliales Neomarkers

CK-19

IgG2b/ 1:300 Citoqueratina-19, queratina espedfica de epitelios biliares NovCastra

Tabla 4 - Sondas Fluorescentes

Sondas Fluorescentes

Color Maximo de Absorbancia/ Maximo de Emision 11. Fuente

FITC

Verde 494/525 Sigma, St. Louis, Mo

Ficoeritrina (PE)

Amarillo 480/578 Molecular Probes, Eugene, Oregon

Alexa 488

Verde 495/519

7-AAD (A-1310) usado sin un anticuerpo para la eliminacion de las celulas muertas

Rojo 488/650

Cy-5

Rojo Lejano 649/670 Jackson Labs, West Row, Pennsylvania

AMCA

Azul 350/450

Para el analisis mediante citometna de flujo de antfgenos citoplasmicos (p.ej., albumina, AFP), las celulas se fijaron 5 y se permeabilizaron con paraformaldefudo al 3% antes de la tincion con los antisueros. Las celulas se tineron como se indico anteriormente para inmunofluorescencia. Para el analisis mediante el uso de 2 marcadores, se usara un segundo anticuerpo marcado con una sonda fluorescente distinta y no solapante en longitud de onda. El analisis se llevo a cabo mediante el uso de un FACscan de Becton Dickinson. Las celulas tenidas solo con el anticuerpo secundario se usaron como controles negativos. En cada muestra se ensayaron 30.000-50.000 celulas. En las 10 celulas positivas, aquellas con una fluorescencia mayor que los controles negativos, se estudio adicionalmente la granularidad, el tamano y el grado de fluorescencia.

Ejemplo 11 (ejemplo de referencia)

Determinacion de la Expresion de Albumina y Alfa-Fetoprotema en una Suspension de Celulas Hepaticas Obtenidas de Tejido Fetal

15 En este experimento, se examino la expresion de albumina y alfa-fetoprotema en celulas madre hepaticas proximales y en celulas madre hepaticas primitivas. Inicialmente se determino que la fraccion de sedimento esta enriquecida en hepatoblastos (celulas madre hepaticas proximales), mientras la interfase esta enriquecida en celulas formadoras de colonias (celulas madre hepaticas primitivas).

La expresion de albumina es comparable entre las celulas de la interfase y del sedimento, tanto en celulas recien 20 aisladas como despues de 10 dfas de cultivo. Sin embargo, la expresion disminuye en cultivo. Esto se pudo deber a una menor expresion o proliferacion de las celulas no parenquimatosas negativas a albumina. Las observaciones en los cultivos indican que ambas contribuyen a este patron (Fig. 20).

La AFP se expresa intensamente en la fraccion de sedimento recien aislada, y se expresa debilmente en las celulas de la interfase. Esto es coherente con la observacion de que la AFP no se expresa en las celulas de las colonias.

Despues de 10 dfas en cultivo, la AFP no es detectable en las celulas del sedimento o de la interfase. Las celulas de las colonias en cultivo expresan albumina, pero no AFP. Esto pudo haberse debido a las condiciones (cultivo sobre plastico), que llevan a la inhibicion de la expresion de AFP en todas las celulas. Sin embargo, la baja expresion de AFP en las celulas de la interfase indica que la AFP nunca se expresa intensamente en estas celulas (Fig. 20).

5 Ademas, cuando las celulas de las colonias se cultivan en condiciones que mantienen una expresion prolongada de AFP en las celulas del sedimento (co-cultivo con STO), todavfa son negativas para la expresion de AFP. No hubo reactividad cruzada entre la union de anticuerpos a albumina o alfa-fetoprotema, y no se observo ninguna senal en los carriles vactes.

Los resultados de estos experimented demuestran, por tanto, que la AFP se expresa intensamente en la fraccion de 10 sedimento recien aislada, y se expresan solo debilmente en las celulas de la interfase. Esto es coherente con la observacion de que la AFP no se expresa en las celulas de las colonias.

Claims (16)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende una celula madre hepatica primitiva humana aislada, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada no expresa alfa-fetoprotema, expresa Ep-CAM y es un precursor para una celula madre hepatica proximal, y dicha celula madre hepatica proximal es capaz de dar lugar a un progenitor hepatocftico o un progenitor biliar, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada es una celula individual adulta.
2. 2. La composicion segun la reivindicacion 1, en la que la celula madre hepatica primitiva humana aislada expresa AC133 y albumina.
3. 3. La composicion segun la reivindicacion 2, en la que la celula madre hepatica primitiva humana aislada expresa citoqueratina 8/18, citoqueratina 19, o combinaciones de las mismas.
4. 4. La composicion segun la reivindicacion 3, en la que la celula madre hepatica primitiva humana aislada expresa N- CAM, CAM5.2, c-kit, CD146, o combinaciones de las mismas.
5. 5. Un metodo para aislar un progenitor hepatico primitivo humano capaz de dar lugar a progenitores hepatocfticos o progenitores biliares, y el metodo comprende:

   (a) proporcionar una suspension de celulas derivadas de tejido hepatico;

   (b) aplicar dicha suspension de celulas a una superficie de plastico;

   (c) cultivar las celulas en condiciones que incluyen el uso de medio sin suero que comprende un regulador del metabolismo de carbohidratos, una fuente de hierro, y un factor de produccion de membranas; y

   (d) seleccionar las celulas que expresan Ep-CAM y que no expresan alfa-fetoprotema.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas seleccionar de la suspension las celulas que expresan albumina, citoqueratina 19, AC133, citoqueratina 8/18, o combinaciones de las mismas.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el tejido hepatico se obtiene de un feto o de un neonato.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el tejido hepatico se obtiene de un nino o de un adulto.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 5 o 6, que comprende ademas seleccionar de la suspension las celulas que expresan N-CAM, CAM5.2, c-kit, CD146, o combinaciones de las mismas.
10. 10. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la celula madre hepatica primitiva humana comprende un acido nucleico exogeno.
11. 11. Una celula madre hepatica primitiva humana aislada, que no expresa alfa-fetoprotema y que expresa Ep-CAM y es capaz de dar lugar a progenitores hepatocfticos o progenitores biliares, en la que dicha celula madre hepatica primitiva aislada es una celula individual adulta.
12. 12. La celula madre hepatica primitiva humana aislada segun la reivindicacion 11, que expresa ademas AC133 y albumina.
13. 13. La celula madre hepatica primitiva humana aislada segun la reivindicacion 12, que expresa ademas citoqueratina 8/18, citoqueratina 19, o combinaciones de las mismas.
14. 14. La celula madre hepatica primitiva humana aislada segun la reivindicacion 12, que expresa ademas N-CAM, CAM5.2, c-kit, CD146, o combinaciones de las mismas.
15. 15. La celula madre hepatica primitiva humana aislada segun cualquiera de las reivindicaciones 12-14, que comprende ademas un acido nucleico exogeno.
16. 16. Un metodo para producir un medicamento para tratar una disfuncion o enfermedad hepatica que comprende mezclar una cantidad eficaz de la celula madre hepatica primitiva humana segun cualquiera de las reivindicaciones 11-15 con un vehmulo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.