BR112016013623B1

BR112016013623B1 - Método de preparação de uma estrutura de célula esferoide semelhante à ilhota pancreática cultivada artificialmente, e uso de uma estrutura de célula esferoide

Info

Publication number: BR112016013623B1
Application number: BR112016013623-3A
Authority: BR
Inventors: Ciro Tetta; Giovanni Camussi; Sara Giunti; Victor Manuel Navarro Tableros
Original assignee: Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2023-03-21
Also published as: BR112016013623A2; US20190119648A1; US10174286B2; CN105814193A; CN105814193B; EP3083941B1; CN111635883A; EP3083941A1; DK3083941T3; AU2014364632A1; KR20160098439A; US20160312189A1; ES2941686T3; JP6643993B2; AU2014364632B2; WO2015091493A1; KR102338815B1; CA2933135C; JP2017500859A; US11453863B2

Abstract

CÉLULAS COM ESTRUTURA SEMELHANTE ÀS ILHOTAS PANCREÁTICAS E SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO A invenção se refere a um método de preparação de células esferoides com estrutura semelhante à ilhota pancreáticas caracterizado por uma combinação única de características morfológicas e funcionais que as tornam particularmente adequadas para uso em aplicação de seleção clínica e de drogas, bem como às células com estrutura semelhante à ilhota pancreática obtidas do mesmo

Description

[001] A presente invenção se refere ao campo da diferenciação das células-tronco. Em particular, a presente invenção se refere a um método para a diferenciação de uma célula-tronco em uma estrutura de célula semelhante às ilhotas pancreáticas e à estrutura de célula semelhante à ilhota pancreática obtida a partir deste.

[002] O diabetes tipo 1 é uma doença com um enorme impacto socioeconômico que, se não tratada, leva à morte. É causada pela destruição autoimune das células produtoras de insulina do pâncreas (células beta) e associada ao desenvolvimento de complicações microvasculares e macrovasculares debilitantes.

[003] Foi demonstrado que tanto o transplante de pâncreas e transplante de ilhotas restauram a função das ilhotas e, potencialmente, reduzem as complicações diabéticas em longo prazo, mas são limitados tanto pela escassez de dadores como a necessidade de imunossupressão. Neste contexto, as células-tronco representam uma fonte promissora para a geração de células produtoras de insulina, uma vez que podem ter propriedades que permitam satisfazer os requisitos para a cura da diabetes mellitus tipo 1 (DMT1). Inicialmente, elas podem permitir tanto a restauração da função da célula β como prevenir a recorrência de autoimunidade, sem a necessidade de uso de terapia imunossupressora. Em segundo lugar, devido à sua capacidade de potencialmente ilimitada de auto renovação, que pode ser usada de forma ampla.

[004] Os métodos in vitro para gerar, sob condições específicas de cultura, estruturas semelhantes a ilhotas a partir de células-tronco embrionárias humanas ((Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Rezania A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29; Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20), células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PLoS One. 2011; 6(6):e20615), Células nestina-positivas derivadas da medula óssea (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), Células-tronco isoladas de fluido amniótico humano e polpa dentária (Carnevale G et al. Dig Liver Dis. 2013; 45(8): 669-76), e Células-tronco mesenquimais derivados do sangue do cordão umbilical humano (Prabakar KR et al. Cell Transplant. 2012; 21(6): 1321-39) são revelados no estado da técnica.

[005] No entanto, as estruturas semelhantes às ilhotas derivadas in vitro a partir de células-tronco embrionárias humanas foram encontradas como sendo imaturas, exigindo assim um novo período de diferenciação in vivo de 3- a-4 meses, a fim de se tornarem ilhotas maduras funcionais (Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Rezania A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29). Além disso, um estudo relatando a geração 3D in vitro de células secretoras de insulina a partir de células-tronco embrionárias humanas, enquanto mostram uma tendência estável a uma diminuição na glicemia de 300 mg/dl para 200 mg/dl, não demonstram, com a exceção de insulina, a expressão de outras proteína hormonais geralmente produzidas dentro das ilhotas pancreáticas (glucagina, polipeptídeo pancreático (PP), somatostatina e grelina) (Bose B et ai Cell Biol Int 2012; 36 (11): 1013 1020).

[006] As células produtoras de insulina geradas in vitro a partir de células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PLoS One. 2011; 6(6):e20615), células nestina-positivas derivadas da medula óssea (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), células-tronco isoladas de fluido amniótico humano e polpa dentária (Carnevale G et al. Dig Liver Dis. 2013; 45(8): 669-76) foram mostradas como liberando a insulina humana em resposta à estimulação in vitro à glicose. No entanto, a expressão de glucagon, PP e grelina não foram demonstradas.

[007] As células produtoras de insulina geradas a partir do cordão umbilical de células-tronco mesenquimais humanas derivadas do sangue (CB-MSC) foram demonstradas como expressando a insulina, peptídeo-C, glucagon e polipeptídeo pancreático e liberando o peptídeo-C em resposta à estimulação in vitro por glicose. No entanto, a capacidade destas células de reduzir a glicose no sangue em diabetes experimental não foi demonstrada, como os autores só mostraram a diferenciação in vivo de células derivadas da endoderme pancreática CB-MSC enxertadas em células endócrinas funcionais com a detecção de baixos níveis de peptídeo-C seguido de desafio com glucose 60 dias após a implantação (Prabakar KR et al. Cell Transplant 2012; 21 (6): 1321-1339).

[008] Os métodos de diferenciação células-tronco de fígado humano (HLSCs) em células de ilhotas pancreáticas são divulgados em Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50 e no pedido Internacional de patente WO 2006/126236.

[009] Em Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50, HLSCs foram mostradas alterando a sua morfologia alongada em aglomerados de células pequenas esferoides, morfologicamente assemelhadas às ilhotas pancreáticas, quando cultivadas em meio DMEM com elevado teor de glicose (23 mM) durante um mês, seguido de 5-7 dias de cultura na presença de 10 mM de nicotinamida. Tais agrupamentos de células esferoides foram positivamente coradas para insulina humana e Glut2 e se tornaram positivamente coradas com ditizona o agente quelante de zinco, que é específico para os grânulos contendo insulina, sugerindo a diferenciação de HLSCs em estruturas semelhantes a ilhotas. Apesar de tais resultados excitantes, o protocolo de diferenciação foi limitado por uma baixa eficiência, particularmente se referindo tanto à quantidade das estruturas geradas e ao tempo necessário para gerá-los. Além disso, mesmo após extensa cultura as estruturas não chegaram a crescer a um tamanho e morfologia muito parecidos com as estruturas pancreáticas humanas.

[010] A fim de ultrapassar os inconvenientes da técnica anterior, os presentes inventores proporcionaram um novo método de preparação de uma estrutura semelhante às células das ilhotas pancreáticas esferoides, que é definido nas reivindicações anexas. O conteúdo das reivindicações forma uma parte integral da descrição.

[011] Em comparação com a técnica anterior, não só o método de acordo com a presente invenção é mais simples, mais rápido e mais eficiente, mas também resulta em estruturas que se assemelham mais às estruturas de ilhotas pancreáticas humanas naturais, tanto em tamanho e morfologia. Isso resulta na geração de um maior número de estruturas semelhantes a células das ilhotas pancreáticas, que vantajosamente, têm um diâmetro comparável às ilhotas pancreáticas humanas de ocorrência natural e que expressam, ao nível da proteína, todos os hormônios que são geralmente produzidos pelas ilhotas pancreáticas humanas (ou seja, a insulina, glucagon, PP, somatostatina e grelina). Além disso, seguido de implante sob a cápsula renal de camundongos SCID com diabetes induzida por estreptozotocina, às estruturas semelhantes às ilhotas pancreáticas obtidas pelo método do presente invenção são capazes de reduzir significativamente mais cedo os níveis de glicose no sangue (em 13 dias), com um aumento concomitante do peptídeo-C humano. Para conhecimento dos inventores, uma similaridade tão forte de características estruturais das estruturas semelhantes às ilhotas pancreáticas humanas naturais tornam únicas as estruturas semelhantes às células das ilhotas pancreáticas geradas com o método da invenção. De fato, nenhum estudo anterior mostra uma combinação in vitro e in vivo de tais características em estruturas semelhantes a ilhotas derivadas de um único tipo de células-tronco isolado. Devido às suas características, as estruturas semelhantes às células das ilhotas pancreáticas obtidas pelo método da presente invenção são particularmente adequadas para uso em várias aplicações, tais como a pesquisa de base, a seleção de fármacos e medicina regenerativa.

[012] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de uma célula esferoide com estrutura semelhante às ilhotas pancreáticas crescida artificialmente, que compreende a etapa de cultivar células- tronco adultas isoladas em um primeiro meio de cultura líquido de diferenciação celular que compreende uma substância policatiônica.

[013] Na verdade, os inventores verificaram, surpreendentemente, que as cultivar células-tronco adultas isoladas, quando cultivadas em um meio líquido de cultura de células, na presença de uma substância policatiônica, bastante cedo (isto é, após cerca de 2 a 4 dias) se agregam e se diferenciam em estruturas de células esferoides semelhantes a ilhotas pancreáticas, que se assemelham bastante com as estruturas de células esferoides das ilhotas pancreáticas naturais, tanto em tamanho e morfologia, e que são capazes de expressar os hormônios que são normalmente produzidos pelas ilhotas pancreáticas humanas (ou seja, insulina, glucagon, PP, somatostatina e grelina).

[014] A célula-tronco adulta usada no método da invenção é preferencialmente uma célula-tronco adulta de mamífero. Portanto, qualquer meio líquido de cultura de células capaz de sustentar o crescimento de células de mamífero é adequado para uso no método da invenção. Em uma modalidade preferencial, o meio líquido de cultura de células é um meio de cultura de células enriquecido com soro. DMEM ou RPMI enriquecido com soro são mencionados como exemplos não limitativos. A concentração do soro no meio de cultura de células é, preferencialmente, compreendida na faixa de 5 a 20 %. Preferencialmente, o meio líquido de cultura de células também compreende uma ou mais fontes de carbono, tais como, por exemplo, glicose e glutamina. As concentrações preferenciais de glicose estão dentro da faixa de 6-25 mM. As concentrações preferenciais de glutamina estão dentro da faixa de 0,5-3 mM.

[015] Dentro do contexto da presente descrição, a expressão “células-tronco adultas” tem a intensão de significar uma célula-tronco que é isolada a partir de tecido adulto, em contraste com uma “célula-tronco embrionária”, que é isolada a partir da massa celular interna do blastocisto. As células-tronco adultas são também conhecidas como “células-tronco” somáticas.

[016] Qualquer substância policatiônica que é capaz de promover a agregação de células-tronco adultas e diferenciação em células de ilhotas pancreáticas a uma dada concentração e que, a essa concentração é não citotóxica para as células, pode ser usada no método da presente invenção. Os exemplos ilustrativos, não limitativos de substâncias policatiônicas adequadas para uso no método da invenção são polilisina e protamina.

[017] A protamina, que é a substância policatiônica preferencial porque ela é adequada para aplicações clínicas, é preferencialmente adicionada ao meio na forma de um sal solúvel, tal como, por exemplo, sulfato de protamina ou cloridrato de protamina, em uma concentração que varia preferencialmente entre 5 e 20 mM.

[018] Em uma outra modalidade preferencial, o método da invenção compreende ainda a etapa de substituir o primeiro meio de cultura líquido de diferenciação celular com um segundo meio de cultura líquido de diferenciação celular não compreendendo uma substância de policatiônica e a cultura das células no dito segundo meio. Qualquer meio líquido de cultura de células capaz de sustentar o crescimento de células de mamífero é adequado para uso como o segundo meio de cultura líquido de diferenciação celular. De acordo com uma modalidade preferencial, o mesmo meio líquido de cultura de células que foi usado na primeira etapa deve também ser empregue na segunda etapa, exceto que não contém a substância policatiônica. O objetivo desta etapa é a obtenção da maturação completa das estruturas de células semelhantes às ilhotas pancreáticas formadas durante a primeira etapa, bem como o seu aumento, tanto no número de células e no número estrutura. Cultivo no segundo meio de cultura líquido de diferenciação celular ocorre preferencialmente por um período de tempo de pelo menos 2 dias, mais preferencialmente durante pelo menos 10 dias, ainda mais preferencialmente durante cerca de 10 a 14 dias.

[019] Como mencionado acima, a presença de uma substância policatiônica no primeiro meio líquido de cultura para diferenciação celular é o elemento chave da presente invenção, na medida em que ele acelera a formação de agregados de células esferoides que se assemelham a estruturas semelhantes a ilhotas que tem grande semelhança com estruturas de ilhotas pancreáticas humanas que ocorrem naturalmente.

[020] Com efeito, como ilustrado nos exemplos que se seguem, a exposição das HLSCs quer ao DMEM ou meio de diferenciação com base em RPMI (ver Tabelas 2 e 3 abaixo), ambos na presença e na ausência de glicose, não resultou na formação de estruturas semelhantes a ilhota após um período de cultura de 4 dias. Em contraste, o meio de adição de protamina, quer um meio DMEM ou com base em RPMI, ambos na presença e na ausência de glicose, resultou na formação de estruturas semelhantes às ilhotas após um período de cultura de 4 dias (Figura 11). O diâmetro das estruturas derivadas de HLSCs é comparável com a relatado para ilhotas pancreáticas humanas (Chandra V et al. PLoS One 2011; 6(6): E20615) e principalmente compreendido entre 50 e 150 um, com um volume médio de ilhotas de 109 ± 19uM (média ± SD) (figura 12).

[021] Em contraste, a glicose não afetou a formação de estruturas semelhantes às ilhotas a (figura 13A), mas que desempenham um papel fundamental na tanto na indução da especificação endócrina (expressão NgN3) e aumentando a expressão tanto da insulina como do glucagon dentro das estruturas (figura 13B).

[022] De acordo com uma outra modalidade preferencial da invenção, a células-tronco adultas que se diferencia em estruturas de células semelhantes às ilhotas é uma célula-tronco adulta do fígado humano (HLSC). Uma célula- tronco do fígado humano preferencial é a célula-tronco não oval humana de fígado (HLSC) expressando ambos os marcadores de células-tronco embrionárias e mesenquimais divulgados no documento WO 2006/126219. Esta linhagem de células é, particularmente, caracterizada pelo fato de que é uma linhagem pluripotente de células não ovais de fígado humano, que é isolada a partir do tecido adulto que expressa marcadores de células hepáticas e que tem capacidades de diferenciação multipotente e propriedades regenerativas. Mais particularmente, esta linhagem de células é capaz de se diferenciar em células maduras do fígado, células produtoras de insulina, células osteogênicas e células epiteliais. De acordo com uma modalidade preferencial, esta expressa um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que compreende albumina, D-fetoproteína, CK18, CD44, CD29, CD73, CD146, CD105, CD90 e qualquer combinação dos mesmos, e não expressam marcadores selecionados do grupo compreendendo CD133, CD117, CK19, CD34, citocromo P450.

[023] As células progenitoras pluripotentes não ovais de fígado humano/tronco divulgadas no documento WO 2006/126236 foram exibidas sofrendo diferenciação em uma variedade de tipos de células de tecido (nomeadamente, células maduras de fígado, células epiteliais, células produtoras de insulina e células osteogênicas) e exercendo efeito de regeneração de órgãos. Estas células são derivadas de uma linhagem de células progenitoras pluripotentes não ovais de fígado humano que expressam marcadores de células hepáticas. Tais células são isoladas por um método compreendendo as etapas de:

[024] (i) cultivar do hepatócitos maduros derivado de fígado de humano adulto em um meio de cultura de células até à morte dos hepatócitos maduros e seleção de uma população de células sobreviventes possuindo morfologia epitelioide;

[025] (ii) expandir a população de células com morfologia epitelioide pelo cultivo em um meio de cultura contendo glicose contendo soro suplementado com hEGF (fator de crescimento epitelial humano) e bFGF (fator básico de crescimento de fibroblastos) e compreendendo os sais inorgânicos usuais, aminoácidos e vitaminas necessários para o crescimento de células de mamíferos

[026] e em particular em que os hepatócitos maduros são congelados em um meio de cultura contendo soro, na presença de um agente crioprotetor e depois descongeladas antes da cultura de acordo na etapa (i).

[027] A caracterização das células-tronco hepáticas humanas não ovais/progenitoras divulgadas no documento WO 2006/126236 e o método de preparação das mesmas são aqui inteiramente incorporados por referência.

[028] O uso de HLSCs na presente invenção é preferencialmente por inúmeras razões: 1) que são relativamente fáceis de isolar e expandir, 2) elas são caracterizadas por um grau de proliferação, que permite fornecer um número adequado de células para uso terapêutico, 3) elas podem ser usadas autólogamente e 4) elas evitam preocupações de ordem ética. Além disso, o fígado e o pâncreas compartilham origem embrionária comum e tem sido demonstrado que o fígado em desenvolvimento exibe características transcricionais semelhantes às do pâncreas adulto (Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20). No entanto, uma vez que está previsto que as substâncias policatiônicas devem ser eficazes na promoção da agregação e diferenciação de outras células-tronco adultas além das HLSCs, o âmbito da invenção não se limita ao uso de apenas HLSCs, mas inclui a uso de qualquer tipo de célula-tronco adulta.

[029] Como mencionado acima, as estruturas semelhantes às ilhotas pancreáticas obtidas pelo método do presente invenção, são caracterizadas por uma combinação única de características morfológicas e funcionais que não é observado em outras estruturas de células semelhantes às ilhotas, tal como preparadas pelos métodos do estado da técnica. Consequentemente, o âmbito da invenção também inclui uma estrutura celular esferoide semelhante às ilhotas pancreáticas conforme definido nas reivindicações anexas.

[030] Particularmente, a estrutura celular esferoide semelhante às ilhotas pancreáticas de acordo com a presente invenção é vantajosamente caracterizada por um diâmetro de desde 50 a 250 Dm, preferencialmente de 50 a 200 Dm, o que é comparável às ilhotas pancreáticas humanas que ocorrem naturalmente. É também caracterizada por um volume, expresso como IEQ/100 ILS, variando de 30 a 200 Dm, preferencialmente de 50 a 130 Dm e, ainda mais vantajosamente, por a capacidade de expressar, ao nível da proteína, todos os hormônios pancreáticos que são normalmente expressos por ilhotas pancreáticas humanas, ou seja, insulina, glucagon, polipeptídeo pancreático, somatostatina e grelina.

[031] Dentro do contexto da presente descrição, IEQ/100 ILS é o Equivalente de Ilhotas com um diâmetro médio de 150 Dm (IEQ) normalizado para 100 ilhotas (ILS). De acordo com protocolos convencionais, o IEQ de ilhotas isoladas do pâncreas e usadas para transplante é determinado como se segue. Ilhotas suspensas isoladas do pâncreas são avaliadas tanto em número e tamanho (diâmetro) a fim de determinar o Equivalente de Ilhotas total (isto é, Volume Total de ilhotas). Avaliação do diâmetro das ilhotas leva em conta a faixa de aumento de diâmetro de 50 Um, de 50 Um a >350 Um, sem levar em conta diâmetros <50 Um, que não fornece uma contribuição significativa para o volume total. Um fator de conversão relativo é convencionalmente usado para converter o número total de ilhotas para Equivalente de Ilhotas de um diâmetro médio de 150 Dm (IEQ).

[032] Ilhotas suspensas isoladas do pâncreas são separadas em camadas diferentes com base no seu grau de pureza. Uma amostra de ilhota de cada camada do produto final é então analisada: o número total de ilhotas e o IEQ são, então, calculados com base no número, pureza e tamanho das ilhotas, usando métodos padronizados. Uma vez que, no contexto da presente invenção, as estruturas semelhantes a ilhotas são obtidas a partir de células cultivadas, que são aderentes à placa, os inventores avaliam tanto o número e o diâmetro das estruturas semelhantes às ilhotas pela analise de 200 micrografias 10x, selecionadas aleatoriamente, cada ensaio, e os resultados expressos como % ±DP (Fig. 12 A) e IEQ normalizado para 100 ilhotas (Fig. 12 C).

[033] Graças às características acima ilustradas, as estruturas celulares esferoides semelhantes às ilhotas pancreáticas de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para o uso tanto em aplicações clínicas, tais como em um método de tratamento de diabetes por transplante de ilhotas pancreáticas, e em aplicações in vitro, tais como os métodos de seleção para a identificação de substâncias capazes de promover a expressão de um ou mais hormônios pancreáticas pelas células de ilhotas pancreáticas, ou para a identificação de substâncias capazes de exercer um efeito citotóxico sobre as células das ilhotas pancreáticas.

[034] Os exemplos seguintes descrevem em detalhes a diferenciação de HLSCs em estruturas celulares esferoides semelhantes às ilhotas pancreáticas de acordo com a presente invenção, usando protamina como a substância policatiônica. No entanto, os exemplos não se destinam a limitar o objetivo e âmbito da invenção.

Exemplos 1. Cultura e expansão de HLSC 1.1 Isolamento, caracterização e cultura de HLSCs

[035] Linhagens HLSCs são isoladas a partir de tecidos saudáveis do fígado de pacientes submetidos a hepatectomia e caracterizadas como descrito anteriormente (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res 2012; 43 (1): 83-8). Especificamente, HLSCs são semeadas em frascos de cultura de 75 cm3 e cultivadas em um meio (ver Tabela 1) que contém a proporção 3 para 1 de meio essencial a-mínimo e meio basal-1 de células endoteliais, suplementado com L-glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml/estreptomicina a 100 μg/ml e 10 % de soro Fetal bovino. As células são mantidas em uma atmosfera umidificada a 5 % em incubadora de CO2 a 37 °C.

1.2 Descolamento de HLSCs

[036] Uma vez que até a « 80 % de confluência, as células são lavadas duas vezes com PBS e incubadas com tripsina-EDTA 1X durante cerca de 5 minutos a 37 °C, a fim de induzir o descolamento celular. A atividade da tripsina é subsequentemente neutralizada pela adição de meio RPMI suplementado com L-glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml/estreptomicina a 100 μg/ml e 10 % de Soro Fetal Bovino. Em seguida, as células são colhidas por centrifugação a 1200 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante é removido e o sedimento ressuspenso em meio de cultura e dividido entre cinco frascos de cultura de 75 cm3.

1.3 criopreservação de células

[037] Células até ~ 80 % de confluência são destacadas e colhidas por centrifugação, tal como descrito no parágrafo 1.2. As células são contadas e 106 células por frasco são criopreservadas. O sedimento celular é ressuspenso em 1 ml de uma solução contendo 90 % de FBS e 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO) e colocadas em criotubo/s refrigerado previamente. Os criotubos são congelados a -80 °C overnigh antes de serem colocados para dentro do recipiente de nitrogênio líquido a -196 °C.

1.4 O descongelamento das células criopreservadas

[038] Um frasco de HLSCs congeladas é removido do tanque de nitrogênio líquido e colocado em um béquer de água pré-aquecido a 37 °C. Uma vez que a suspensão de células foi completamente descongelada, é colocada em um tubo Falcon de 50 ml estéril com 10 ml de meio estéril e centrifugado a 1200 rpm durante 5 minutos. O sedimento celular é então ressuspenso em meio de cultura e dividido em três frascos de cultura de 75 cm3 e deixados aderindo durante a noite a 37 °C em uma atmosfera umidificada a 5 % em incubadora de CO2. O meio é mudado no dia seguinte.

2. Diferenciação de HLSC em estruturas semelhantes às ilhotas.

[039] HLSCs a uma densidade de 12X103/cm2 são semeadas em frascos de cultura de 25 cm3 ou em uma placa de Petri de 100 x 20 mm, no meio 1 de diferenciação de cultura (ver Tabela 1), consistido em meio RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 10 % de Soro Fetal Bovino, glicose 11,6 mM, cloreto de protamina 10 μg/ml, L-glutamina 2 mM e penicilina 100 IU/ml/estreptomicina a 100 μg/ml. As células são colocadas, por um período de 4 dias, sem alterar o meio, em uma atmosfera umidificada a 5 % em incubadora de CO2 a 37 °C. No dia 5, o meio é substituído por meio 2 de diferenciação de cultura (ver Tabela 3) consistido em RPMI 1640 ou DMEM suplementado com FBS a 10 %, glicose 11,6 mM, L-glutamina 2 mM e penicilina 100 IU/ml/estreptomicina a 100 μg/ml. O meio é posteriormente trocado todos os dias. Dentro de 2 a 4 dias é esperado que as células comecem a se organizar em estruturas semelhantes às ilhotas que atingem um número máximo após 14-18 dias (figura 1).

[040] Os resultados obtidos estão ilustrados nos desenhos em anexo, cujo teor está aqui abaixo brevemente ilustrado.

[041] Figura 1: micrografias 20X representativas que mostram HLSCs em meio basal de cultura (a) e após cultura em meio de diferenciação com protamina (B-D). Após 24 h, as células alteradas em morfologia e começam a formar pequenos agregados (B) que progressivamente aumentam em tamanho e número, atingindo um número máximo após um período de cultura de 18 dias (C). (D) micrografia 40x mostrando estruturas semelhantes às ilhotas após um período de cultura de 18 dias. (E) O gráfico mostra o número total de estruturas semelhantes às ilhotas por balão de cultura de 25 cm3 após 18 dias de cultura. (F) O gráfico representa a média ± DP do número de estruturas semelhantes às ilhotas após 18 dias de cultura (n = 10).

[042] Figuras 2-8: imagens representativas que mostram a caracterização de estruturas semelhantes às ilhotas por imunofluorescência após 14 dias de cultura: estruturas semelhantes às ilhotas se tornam positivamente coradas para ambos PDX-1 e NgN3 (figura 2), insulina e glucagon (figura 3), Peptídeo-C e GLUT-2 (figura 4), somatostatina (figura 5), grelina e PP (figura 6), colágeno IV (Figura 7) e fator von Willebrand (figura 8).

[043] Figura 9: imagens representativas que mostram a caracterização por imunofluorescência de células com estrutura semelhante às ilhotas seguido da desagregação da estrutura semelhante às ilhotas (tripsina 1X) após 14 dias de cultura.

[044] Figura 10: gráfico mostrando a glicose no sangue e os níveis do peptídeo-C humano em camundongos SCID não diabéticos (linha solida, CTRL), induzida pela estreptozotocina (55 mg/kg/dia durante 5 dias) camundongos SCID diabéticos (linha pontilhada, DM) e camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina SCID que receberam implante de HLSC derivadas de estrutura semelhante às ilhotas (5000 IEQ/kg) abaixo da cápsula renal (linha tracejada, DM + ILS), antes e 13 dias após o implante. Em comparação com camundongos diabéticos, camundongos diabéticos que receberam implante de estrutura semelhante às ilhotas tiveram uma diminuição significativa nos níveis de glicose no sangue. Esta foi acompanhada por um aumento concomitante no peptídeo- C humano, que permaneceu indetectável em ambos os camundongos SCID não diabéticos e diabéticos e em camundongos SCID que não receberam o implante.

[045] Figura 11: Gráfico mostrando a formação das estruturas semelhantes às ilhotas (ILS) seguido da cultura das HLSCs em meio com base em RPMI ou DMEM suplementado com FBS a 10 % (F), FBS a 10 % + glicose 11,6 mM (FG) ou FBS a 10 % + glicose 11,6 mM + cloreto de protamina de 10 μg/ml (FGP) durante 48 horas.

[046] Figura 12: gráficos que mostram a distribuição do tamanho (A), o diâmetro médio ± DP (B) e IEQ/100 ILS (C) estruturas semelhantes às ilhotas derivadas de HLSCs após 14 dias de cultura em meio com base em RPMI suplementado com FBS a 10 % + glicose 11,6 mM + cloreto de protamina a 10 μg/ml.

[047] Figura 13: A glicose não afeta as estruturas semelhantes às ilhotas (ILS) na formação (A), mas desempenha um papel fundamental na indução da especificação endócrina e de expressão de insulina/glucagon (B). A. imagem representativa e gráfico que mostra a formação das estruturas semelhantes às ilhotas seguido de cultura (4 dias) em meio RPMI/DMEM suplementado com cloreto de protamina de 10 ug/ml (P) com ou sem diferentes concentrações de glicose (6, 11,6 e 28 mM). B. imagem representativa mostrando a expressão de PDX-1, NgN3, insulina e glucagon em meio à base de RPMI com 1 ou 25 mM de glicose.

[048] Figura 14: imagens representativas que mostram a expressão de PDX-1, NgN3, GLUT-2, peptídeo-C, glucagon e somatostatina em células cultivadas em um meio de diferenciação com poli-lisina.

Claims

1. Método de preparação de uma estrutura de célula esferoide semelhante à ilhota pancreática cultivada artificialmente, caracterizado por compreender a etapa de cultivar uma célula-tronco adulta em um primeiro meio de cultura líquido de diferenciação celular que compreende uma substância policatiônica, selecionada dentre protamina e polilisina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de cultivar a célula-tronco adulta no primeiro meio de cultura líquido de diferenciação celular que compreende uma substância policatiônica, selecionada dentre protamina e polilisina, é realizada durante um período de tempo de 2 a 4 dias.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a substância policatiônica é um sal solúvel de protamina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o sal solúvel de protamina é o sulfato de protamina ou cloridrato de protamina.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sulfato de protamina ou cloridrato de protamina está em uma concentração compreendida na faixa de 5 a 20 mM.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender ainda a etapa de substituir o primeiro meio de cultura líquido de diferenciação celular compreendendo a substância policatiônica por um segundo meio de cultura líquido de diferenciação celular não compreendendo uma substância policatiônica e cultivar até a obtenção de células completamente diferenciadas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo no segundo meio de cultura líquido de diferenciação celular não compreendendo uma substância de policatiônica é realizada durante um período de tempo de pelo menos 2 dias.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco adulta é uma célula-tronco do fígado humano.

9. Uso de uma estrutura de célula esferoide, semelhante à ilhota pancreática cultivada artificialmente, obtida pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser em um método de seleção in vitro para identificação de substâncias capazes de promover a expressão de um ou mais hormônios pancreáticos por células de ilhotas pancreáticas, ou para a identificação das substâncias capazes de exercer um efeito citotóxico sobre as células das ilhotas pancreáticas.