ES2941686T3

ES2941686T3 - Estructuras de células similares a islotes pancreáticos y un método para prepararlas

Info

Publication number: ES2941686T3
Application number: ES14812530T
Authority: ES
Inventors: Ciro Tetta; Giovanni Camussi; Sara Giunti; Tableros Victor Manuel Navarro
Original assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Current assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2023-05-24
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: US11453863B2; KR20160098439A; US10174286B2; AU2014364632B2; JP2017500859A; CA2933135C; DK3083941T3; EP3083941B1; WO2015091493A1; CA2933135A1; KR102338815B1; AU2014364632A1; BR112016013623B1; CN111635883A; CN105814193A; CN105814193B; EP3083941A1; US20190119648A1; JP6643993B2; JP2020014477A

Abstract

La invención se refiere a un método para preparar estructuras de células similares a islotes pancreáticos caracterizadas por una combinación única de características morfológicas y funcionales que las hacen particularmente adecuadas para su uso en aplicaciones clínicas y de detección de fármacos, así como para las estructuras de células similares a islotes pancreáticos. obtenido de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Estructuras de células similares a islotes pancreáticos y un método para prepararlas

La presente invención se refiere al campo de la diferenciación de células madre. En particular, la presente invención se refiere a un método para diferenciar una célula madre en una estructura de células similares a islotes pancreáticos y a la estructura de células similares a islotes pancreáticos obtenida a partir de la misma.

La diabetes tipo 1 es una enfermedad con un enorme impacto socioeconómico que, si no se trata, conduce a la muerte. Es causada por la destrucción autoinmune de las células pancreáticas productoras de insulina (células p) y se asocia con el desarrollo de complicaciones microvasculares y macrovasculares debilitantes.

Se ha demostrado que tanto el trasplante de páncreas como el trasplante de islotes restauran la función de los islotes y reducen potencialmente las complicaciones diabéticas a largo plazo, pero están limitados tanto por la escasez de donantes como por la necesidad de inmunosupresión. En este contexto, las células madre representan una fuente promisoria para la generación de células productoras de insulina, ya que pueden tener propiedades que permitan satisfacer los requerimientos para la cura de la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM por sus siglas en inglés). En primer lugar, pueden permitir restaurar la función de las células p y prevenir la recurrencia de la autoinmunidad, sin necesidad de utilizar una terapia inmunosupresora. En segundo lugar, debido a su capacidad potencialmente ilimitada de autorrenovación, podrían utilizarse ampliamente.

Se describen en la técnica anterior, métodos in vitro para generar bajo condiciones de cultivo específicas, estructuras similares a islotes a partir de células madre embrionarias humanas (Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Corte A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29; Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20), células madre derivadas de tejido adiposo humano (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PloS One. 2011; 6(6):e20615), células positivas para nestina derivadas de la médula ósea (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), células madre aisladas de líquido amniótico humano y pulpa dental (Carnevale G et al. Dig Liver Dis. 2013; 45(8): 669-76), y células madre mesenquimales derivadas de sangre de cordón umbilical humano (Prabakar KR et al. Cell Transplant. 2012; 21(6): 1321-39).

Sin embargo, se encontraron estructuras similares a islotes derivadas in vitro de células madre embrionarias humanas inmaduras, lo que requería un período de diferenciación adicional de 3 a 4 meses in vivo para convertirse en islotes funcionales maduros (Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Rezania A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29). Además, un estudio reporta la generación 3D in vitro de células secretoras de insulina a partir de células madre embrionarias humanas, mientras reporta una tendencia estable a una disminución de la glucemia de 300 mg/dL a 200 mg/dL, aunque no demostró, con la excepción de la insulina, la expresión proteica de otras hormonas normalmente producidas dentro de los islotes pancreáticos (glucagón, polipéptido pancreático (PP), somatostatina y grelina) (Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20).

Células productoras de insulina generadas in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PloS One. 2011; 6(6):e20615), células positivas para nestina derivadas de la médula ósea (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), células madre aisladas de líquido amniótico humano y pulpa dental (Carnevale G et al. Dig Liver Dis 2013; 45(8): 669-76) liberan insulina humana en respuesta a la estimulación con glucosa in vitro. Sin embargo, no se demostró la expresión de glucagón, PP y grelina.

Se demostró que las células productoras de insulina generadas a partir de células madre mesenquimales derivadas de la sangre del cordón umbilical humano (CB-MSC, por sus siglas en inglés) expresan insulina, péptido C, glucagón y polipéptido pancreático y liberan péptido C en respuesta a la estimulación con glucosa in vitro. Sin embargo, no se demostró la capacidad de dichas células para reducir la glucosa en sangre en la diabetes experimental, ya que los autores solo demostraron diferenciación in vivo de células endodérmicas pancreáticas derivadas de CB-MSC injertadas en células endocrinas funcionales, con detección de niveles bajos de péptido C después de la estimulación con glucosa, 60 días después de la implantación (Prabakar KR et al. Cell Transplant. 2012; 21(6): 1321-39).

Los métodos de diferenciación de células madre hepáticas humanas (HLSC, por sus siglas en inglés) en células de los islotes pancreáticos se describen en Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50 y en la solicitud de patente internacional WO 2006/126236.

In Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50, se demostró que las HLSC cambiaban su morfología alargada a pequeños grupos de células esferoides, morfológicamente parecidas a islotes pancreáticos, cuando se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (23 mM) durante un mes seguido de 5-7 días de cultivo en presencia de nicotinamida 10 mM. Dichos grupos de células esferoides se tiñen positivamente para insulina humana y Glut2 y se tiñeron positivamente con el agente quelante de zinc ditizona, que es específico para gránulos que contienen insulina, lo que sugiere la diferenciación de las HLSC en estructuras similares a islotes. A pesar de estos emocionantes resultados, el protocolo de diferenciación estuvo limitado por una baja eficiencia, particularmente en lo que se refiere tanto a la cantidad de estructuras generadas como al tiempo requerido para generarlas. Además, incluso después de un cultivo extenso, las estructuras no alcanzaron un tamaño y una morfología muy parecidas a las estructuras pancreáticas humanas.

Con el fin de superar los inconvenientes de la técnica anterior, los presentes inventores han proporcionado un nuevo método para preparar una estructura de células similares a islotes pancreáticos esferoides, que se define en las reivindicaciones adjuntas. El contenido de las reivindicaciones forma parte integrante de la descripción.

En comparación con la técnica anterior, no sólo el método según la presente invención es más simple, más rápido y eficiente, sino que también da como resultado estructuras que se asemejan más a las estructuras de islotes pancreáticos humanos naturales tanto en tamaño como en morfología. Esto da como resultado la generación de un mayor número de estructuras celulares similares a islotes pancreáticos que, ventajosamente, tienen un diámetro comparable al de los islotes pancreáticos humanos naturales y que expresan, a nivel de proteínas, todas las hormonas que normalmente se producen por islotes pancreáticos humanos (es decir, insulina, glucagón, PP, somatostatina y grelina). Además, después del implante debajo de la cápsula renal de ratones SCID diabéticos inducidos por estreptozotocina, las estructuras de células similares a islotes pancreáticos que se pueden obtener mediante el método de la presente invención son capaces de reducir los niveles de glucosa en sangre de manera significativa en una etapa temprana (dentro de los 13 días), con un aumento concomitante en el péptido C humano. Según el conocimiento de los inventores, esta fuerte similitud de las características estructurales con las estructuras de los islotes pancreáticos humanos naturales hace que las estructuras celulares similares a los islotes pancreáticos sean las únicas generadas con el método de la invención. De hecho, ningún estudio previo ha demostrado tal combinación de características in vitro e in vivo en estructuras similares a islotes derivadas de un solo tipo de célula madre aislada. Debido a sus características, las estructuras de células similares a islotes pancreáticos que se pueden obtener mediante el método de la presente invención son particularmente adecuadas para su uso en diversas aplicaciones, tales como investigación básica, exploración de fármacos y medicina regenerativa.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para preparar una estructura celular similar a un islote pancreático esferoide cultivada artificialmente, que comprende el paso de cultivar una célula madre adulta aislada en un medio de cultivo celular líquido de primera diferenciación que comprende una sustancia policatiónico seleccionada de protamina y poli-lisina.

En realidad, los inventores descubrieron sorprendentemente que las células madre adultas aisladas, cuando se cultivan en un medio de cultivo celular líquido en presencia de una sustancia policatiónica seleccionada entre protamina y polilisina, se agregan y se diferencian bastante rápido (es decir, después de aproximadamente 2 a 4 días) en estructuras celulares esferoides similares a los islotes pancreáticos, que se parecen mucho a las estructuras celulares de los islotes pancreáticos naturales tanto en tamaño como en morfología, y que son capaces de expresar las hormonas que normalmente producen los islotes pancreáticos humanos (es decir, insulina, glucagón, PP, somatostatina y grelina).

La célula madre adulta utilizada en el método de la invención es preferiblemente una célula madre adulta de mamífero. Por lo tanto, cualquier medio de cultivo celular líquido capaz de mantener el crecimiento de células de mamíferos es adecuado para su uso en el método de la invención. En una realización preferida, el medio de cultivo celular líquido es un medio de cultivo celular enriquecido con suero. Se mencionan DMEM o RPMI enriquecidos en suero como ejemplos no limitantes. La concentración de suero en el medio de cultivo celular está preferiblemente comprendida dentro del rango de 5 a 20 %. Preferiblemente, el medio de cultivo celular líquido también comprende una o más fuentes de carbono, como por ejemplo glucosa y glutamina. Las concentraciones de glucosa preferidas están dentro del rango de 6-25 mM. Las concentraciones de glutamina preferidas están dentro del rango de 0,5-3 mM.

Dentro del contexto de la presente descripción, la expresión "célula madre adulta" pretende significar una célula madre que se aísla de un tejido adulto, en contraste con una "célula madre embrionaria" que se aísla de la masa celular interna de un blastocisto. Las células madre adultas también se conocen como "células madre somáticas".

La protamina, que es la sustancia policatiónica preferida por ser adecuada para aplicaciones clínicas, se añade preferentemente al medio en forma de una sal soluble, como por ejemplo sulfato de protamina o clorhidrato de protamina, a una concentración que oscila preferentemente entre 5 y 20 mM.

En otra realización preferida, el método de la invención comprende además el paso de reemplazar el primer medio de cultivo celular líquido de diferenciación por un segundo medio de cultivo celular líquido de diferenciación que no comprende la sustancia policatiónica y cultivar las células en dicho segundo medio. Cualquier medio de cultivo celular líquido capaz de mantener el crecimiento de células de mamífero es adecuado para su uso como medio de cultivo celular líquido de segunda diferenciación. De acuerdo con una realización preferida, el mismo medio de cultivo celular líquido que se utilizó en el primer paso también se utilizará en el segundo paso, excepto que no contiene la sustancia policatiónica. El objetivo de este paso es obtener la maduración completa de las estructuras celulares similares a islotes pancreáticos formadas durante el primer paso, así como su aumento tanto en el número de células como en el número de estructuras. El cultivo en el medio de cultivo celular líquido de segunda diferenciación se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo de al menos 2 días, más preferiblemente durante al menos 10 días, incluso más preferiblemente durante aproximadamente de 10 a 14 días.

Como se mencionó anteriormente, la presencia de la sustancia policatiónica en el medio de cultivo celular líquido de primera diferenciación es el elemento clave de la invención, ya que acelera la formación de grupos de células esferoides que se asemejan a estructuras similares a islotes que se asemejan mucho a estructuras de islotes pancreáticos humanos que existen de manera natural.

De hecho, como se ilustra en los ejemplos siguientes, la exposición de las HLSC a medios de diferenciación basados en DMEM o RPMI (véanse las Tablas 2 y 3 a continuación), tanto en presencia como en ausencia de glucosa, no resultó en la formación de estructuras similares a islotes. después de un período de cultivo de 4 días. Por el contrario, la adición de protamina a un medio basado en DMEM o RPMI, tanto en presencia como en ausencia de glucosa, resultó en la formación de estructuras similares a islotes después de un período de cultivo de 4 días (figura 11). El diámetro de las estructuras derivadas de las HLSC es comparable al reportado para los islotes pancreáticos humanos (Chandra V et al. PloS One.

2011; 6(6):e20615) y en su mayoría comprendía entre 50 y 150 um, con un volumen medio de islotes de 109 19 um (media SD) (figura 12).

Por el contrario, la glucosa no afectó la formación de estructuras similares a islotes (figura 13A), pero desempeña un papel clave tanto en la inducción de la especificación endocrina (expresión de NgN3) como en el aumento de la expresión de insulina y glucagón dentro de las estructuras (figura 13B).

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, la célula madre adulta que se diferencia en estructuras de células similares a islotes pancreáticos es una célula madre de hígado humano adulto (HLSC). Una célula madre hepática humana preferida es la célula madre hepática humana no ovalada (HLSC) que expresa marcadores de células madre tanto mesenquimales como embrionarias descritas en el documento WO 2006/126219. Esta línea celular se caracteriza en particular porque es una línea celular progenitora pluripotente de hígado humano no ovalada que se aísla de tejido adulto, que expresa marcadores de células hepáticas y que tiene capacidades de diferenciación multipotente y propiedades regenerativas. Más particularmente, esta línea celular es capaz de diferenciarse en células hepáticas maduras, células productoras de insulina, células osteogénicas y células epiteliales. Según una realización preferida, esta línea expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que comprende albúmina, a-fetoproteína, CK18, CD44, CD29, CD73, CD146, CD105, CD90 y cualquier combinación de los mismos, y no expresa marcadores seleccionados del grupo que comprende CD133, CD117, CK19, CD34, citocromo P450.

Se demostró que las células madre/progenitoras pluripotentes de hígado humano no ovaladas descritas en el documento WO 2006/126236 experimentan diferenciación en una variedad de tipos de células tisulares (es decir, células hepáticas maduras, células epiteliales, células productoras de insulina y células osteogénicas) y ejercen efectos regeneradores de órganos. Dichas células se derivan de una línea celular progenitora pluripotente de hígado humano no ovalada que expresa marcadores de células hepáticas. Dichas células se aíslan mediante un método que comprende las etapas de:

(i) cultivar hepatocitos maduros humanos derivados de hígado adulto en un medio de cultivo celular hasta la muerte de los hepatocitos maduros y seleccionar una población de células supervivientes que tengan morfología epitelioide;

(ii) ampliar la población de células supervivientes que tienen morfología epitelioide mediante el cultivo en un medio de cultivo que contiene glucosa y suero complementado con hEGF (factor de crecimiento epitelial humano, por sus siglas en inglés) y bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico, por sus siglas en inglés) y que comprende las sales inorgánicas, aminoácidos y vitaminas habituales necesarias para el crecimiento de las células de los mamíferos

y en particular donde los hepatocitos maduros se congelan en un medio de cultivo que contiene suero en presencia de un agente crioprotector y luego se descongelan antes del cultivo de acuerdo con el paso (i).

La caracterización de las células madre/progenitoras hepáticas no ovales humanas descritas en el documento WO 2006/126236 y el método para prepararlas se incorporan en su totalidad aquí como referencia.

Se prefiere el uso de HLSC en la presente invención por varias razones: 1) son relativamente fáciles de aislar y expandir, 2) se caracterizan por un grado de proliferación que permite proporcionar un número adecuado de células para uso terapéutico, 3) pueden usarse de forma autóloga y 4) evitan preocupaciones éticas. Además, el hígado y el páncreas comparten orígenes embrionarios comunes y se ha demostrado que el hígado en desarrollo exhibe características transcripcionales similares a las del páncreas adulto (Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20). Sin embargo, dado que se prevé que las sustancias policatiónicas antes mencionadas sean eficaces para promover la agregación y diferenciación de otras células madre adultas distintas de las HLSC, el alcance de la invención no se limita únicamente al uso de HLSC, sino que incluye el uso de cualquier tipo de células madre adultas.

Como se mencionó anteriormente, las estructuras de células similares a islotes pancreáticos obtenidas por el método de la presente invención se caracterizan por una combinación única de características morfológicas y funcionales que no se observan en otras estructuras de células similares a islotes preparadas por los métodos de la técnica anterior. En consecuencia, el alcance de la invención también incluye una estructura de células similares a islotes pancreáticos esferoides como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En particular, la estructura celular similar a islotes pancreáticos esferoides según la presente invención se caracteriza ventajosamente por un diámetro de 50 a 250 |im, preferiblemente de 50 a 200 |im, que es comparable a los islotes pancreáticos humanos naturales. También se caracteriza por la capacidad de expresar, a nivel de proteínas, todas las hormonas pancreáticas que normalmente expresan los islotes pancreáticos humanos, es decir, insulina, glucagón, polipéptido pancreático, somatostatina y grelina.

Dentro del contexto de la presente descripción, IEQ/100 ILS, por sus siglas en inglés, es el Equivalente en Islotes de un diámetro medio de 150 |im (IEQ) normalizado a 100 islotes (ILS). De acuerdo con los protocolos convencionales, el IEQ de islotes aislados del páncreas y usados para trasplante se determina de la siguiente manera. Los islotes suspendidos aislados del páncreas se evalúan tanto en número como en tamaño (diámetro) para determinar el equivalente total de islotes (es decir, el volumen total de islotes). La evaluación del diámetro de los islotes tiene en cuenta incrementos del rango de diámetro de 50 |im, desde 50 |im hasta >350 |im, sin tomar en cuenta los diámetros < 50 |im, que no aportan una contribución significativa al volumen total. Un factor de conversión relativo se usa convencionalmente para convertir el número total de islotes en el equivalente de islotes de un diámetro promedio de 150 |im (IEQ).

Los islotes suspendidos aislados del páncreas se separan en diferentes capas según su grado de pureza. Luego se analiza una muestra de islotes de cada capa del producto final: luego se calcula el número total de islotes y el IEQ en función del número, la pureza y el tamaño de los islotes, usando métodos estandarizados. Dado que en el contexto de la presente invención las estructuras similares a islotes se obtienen a partir de células cultivadas que se adhieren a la placa, los inventores evaluaron tanto el número como el diámetro de las estructuras similares a islotes analizando 200 micrografías 10x, seleccionadas al azar, por experimento, y expresaron los resultados como % SD (Fig. 12 A) y IEQ normalizado a 100 islotes (Fig. 12 C).

Gracias a las características ilustradas anteriormente, la estructura de células similares a islotes pancreáticos esferoides de acuerdo con la presente invención es particularmente adecuada para su uso tanto en aplicaciones clínicas, como en un método de tratamiento de diabetes mediante trasplante de islotes pancreáticos, y en aplicaciones in vitro, tales como métodos de detección para identificar sustancias capaces de promover la expresión de una o más hormonas pancreáticas por parte de las células de los islotes pancreáticos o para identificar sustancias capaces de ejercer un efecto citotóxico en las células de los islotes pancreáticos.

Los siguientes ejemplos describen en detalle la diferenciación de las HLSC en estructuras celulares similares a islotes pancreáticos esferoides según la presente invención, usando protamina como sustancia policatiónica. Sin embargo, los ejemplos no pretenden limitar el propósito y el alcance de la invención.

Ejemplos

1. Cultivo y expansión de las HLSC

1.1 Aislamiento, caracterización y cultivo de las HLSC

Las líneas de HLSC se aíslan de tejidos hepáticos sanos de pacientes sometidos a hepatectomías y se caracterizan como se describió anteriormente (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1):83-8). Específicamente, las HLSC se siembran en frascos de cultivo de 75 cm3 y se cultivan en un medio (ver Tabla 1) que contiene una proporción de 3 a 1 de medio esencial (-mínimo y 1-medio basal de células endoteliales, suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/mL/estreptomicina 100 |ig/mL y Suero Fetal Bovino al 10 %. Las células se mantienen en una incubadora humidificada con CO²al 5 % a 37°C.

1.2 Desprendimiento de las HLSC

Una vez alcanzada una confluencia de H 80 %, las células se lavan dos veces con PBS y se incuban con tripsina-EDTA 1X durante unos 5 minutos a 37°C, para inducir el desprendimiento celular. Posteriormente se neutraliza la actividad de la tripsina mediante la adición de RPMI suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/mL/estreptomicina 100 |ig/mL y Suero Fetal Bovino al 10 %. Luego, las células se recolectan por centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos, se retira el sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en medio de cultivo y se reparte entre cinco matraces de cultivo de 75 cm3.

1.3 Criopreservación de células

Las células con una confluencia de hasta « 80 % se separan y se recolectan mediante centrifugación como se describe en el párrafo 1,2. Se cuentan las células y se crioconservan 106 células por vial. El sedimento celular se resuspende en una solución de 1 mL que contiene 90 % de FBS y 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO) y se coloca en crioviales preenfriados. Los crioviales se congelan a -80 °C durante la noche antes de colocarlos en el recipiente de nitrógeno líquido a -196 °C.

1.4 Descongelación de células criopreservadas

Se extrae un vial de HLSC congeladas del tanque de nitrógeno líquido y se coloca en un vaso de precipitados con agua precalentada a 37 °C. Una vez que la suspensión celular se ha descongelado por completo, se coloca en un tubo falcon estéril de 50 ml con 10 ml de medio estéril y se centrifuga a 1200 rpm durante 5 minutos. A continuación, el sedimento celular se resuspende en medio de cultivo y se divide en tres matraces de cultivo de 75 cm3 y se deja adherir durante la noche a 37 °C en un incubador humidificado con CO²al 5 %. El medio se cambia al día siguiente.

2. Diferenciación de las HLSC en estructuras similares a islotes.

Las HLSC se siembran a una densidad de 12 X 103/cm2 en matraces de cultivo de 25 cm3 o en una placa de Petri 100 X 20 mm en el medio de cultivo de diferenciación 1 (ver Tabla 1) que consiste en RPMI 1640 o DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10 %, glucosa 11,6 mM, cloruro de protamina 10 mg/mL, L-glutamina 2 mM y penicilina 100 UI/mL/estreptomicina 100 |ig/mL. Las células se colocan, durante un período de 4 días, sin cambiar el medio, en una incubadora humidificada con CO²al 5 % a 37 °C. En el día 5, el medio se reemplaza con medio de cultivo de diferenciación 2 (ver Tabla 3) que consiste en RPMI 1640 o DMEM suplementado con F^bS al 10 %, glucosa 11,6 mM, L-glutamina 2 mM y penicilina 100 UI/mL/estreptomicina 100 |ig/mL. El medio se cambia posteriormente cada dos días. Se espera que dentro de 2 a 4 días las células comiencen a organizarse en estructuras similares a islotes que alcanzan un número máximo después de 14 a 18 días (figura 1).

Tabla 1

Tabla 2

Tabla 3

Los resultados obtenidos se ilustran en las figuras adjuntas, cuyo contenido se ilustra brevemente a continuación.

Figura 1: micrografías representativas 20x que muestran las HLSC en medio de cultivo basal (A) y cultivo posterior en medio de diferenciación con protamina (B-D). Después de 24 h, las células cambiaron de morfología y comenzaron a formar pequeños grupos (B) que aumentaron progresivamente tanto en tamaño como en número, alcanzando un número máximo después de un período de cultivo de 18 días (C). Micrografía de 40x (D) que muestra estructuras similares a islotes después de un período de cultivo de 18 días. Gráfico (E) que muestra el número total de estructuras similares a islotes por matraz de cultivo de 25 cm3 después de 18 días de cultivo. Gráfico (F) que representa el número medio de SD de estructuras similares a islotes después de 18 días de cultivo (n = 10).

Figuras 2-8: imágenes representativas que muestran la caracterización de estructuras similares a islotes por inmunofluorescencia después de 14 días de cultivo: las estructuras similares a islotes se tiñen positivamente para PDX-1 y NgN3 (figura 2), insulina y glucagón (figura 3), péptido C y GLUT-2 (figura 4), somatostatina (figura 5), grelina y PP (figura 6), colágeno IV (figura 7) y factor von Willebrand (figura 8).

Figura 9: imágenes representativas que muestran la caracterización de inmunofluorescencia de células de estructuras similares a islotes después de la disgregación de estructuras similares a islotes (tripsina 1X) después de 14 días de cultivo.

Figura 10: gráfico que muestra los niveles de glucosa en sangre y de péptido C humano en ratones SCID no diabéticos (línea continua, CTRL), ratones SCID diabéticos inducidos por estreptozotocina (55 mg/Kg/día durante 5 días) (línea punteada, DM) y ratones SCID diabéticos inducidos por estreptozotocina que recibieron implante de estructuras similares a islotes derivadas de HLSC (5000 IEQ/Kg) debajo de la cápsula renal (línea discontinua, DM ILS), antes y 13 días después del implante. En comparación con los ratones diabéticos, los ratones diabéticos que recibieron implantes de estructuras similares a islotes tuvieron una disminución significativa en los niveles de glucosa en sangre. Esto fue paralelo a un aumento concomitante en el péptido C humano, que permaneció indetectable tanto en ratones SCID no diabéticos como en ratones SCID diabéticos que no recibieron el implante.

Figura 11: gráfico que muestra la formación de estructuras similares a islotes (ILS, por sus siglas en inglés) después del cultivo de HLSC en medio basado en RPMI o DMEM suplementado con FBS al 10 % (F), FBS al 10 % glucosa 11,6 mM cloruro de protamina 10 |ig/mL (FGP) durante 48 horas.

Figura 12: gráficos que muestran la distribución de tamaños (A), el diámetro medio de SD (B) y el IEQ/100 ILS (C) de estructuras similares a islotes derivadas de HLSC después de 14 días de cultivo en medio basado en RPMI complementado con FBS al 10 % glucosa 11,6 mM cloruro de protamina 10 |ig/mL.

Figura 13: La glucosa no afecta la formación de estructuras similares a islotes (ILS) (A), pero juega un papel clave en la inducción de la especificación endocrina y la expresión de insulina/glucagón (B). A. Imagen y gráfico representativos que muestran la formación de estructuras similares a islotes después del cultivo (4 días) en RPMI/DMEM suplementado con cloruro de protamina 10 |ig/mL (P) sin o con diferentes concentraciones de glucosa (6, 11,6 y 28 mM). B. Imagen representativa que muestra la expresión de PDX-1, NgN3, insulina y glucagón en medio basado en RPMI con glucosa 1 o 25 mM.

Figura 14: imágenes representativas que muestran la expresión de PDX-1, NgN3, GLUT-2, péptido C, glucagón y somatostatina en células cultivadas en un medio de diferenciación de poli-lisina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una estructura celular similar a un islote pancreático esferoide cultivada artificialmente que tiene un diámetro de 50 a 250 |im y que comprende células diferenciadas derivadas de una célula madre adulta aislada, caracterizada porque expresa a nivel proteico las hormonas pancreáticas insulina, glucagón, polipéptido pancreático, somatostatina y grelina y la cual además está caracterizada porque las células diferenciadas expresan al menos los marcadores PDX-1 y NgN3.

2. La estructura de células similares a islotes pancreáticos esferoides cultivados artificialmente según la reivindicación 1, que tiene un diámetro de 50 a 200 |im.

3. La estructura celular tipo islote pancreático esferoide cultivada artificialmente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde las células diferenciadas expresan los marcadores PDX-1, NgN3, péptido C, Glut-2, colágeno IV y factor Von Willebrand.

4. La estructura celular tipo islote pancreático esferoide cultivada artificialmente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la célula madre adulta es una célula madre hepática humana (HLSC).

5. Un método para preparar una estructura celular similar a un islote pancreático esferoide cultivada artificialmente, que comprende el paso de cultivar una célula madre adulta en un medio de cultivo celular líquido de primera diferenciación que comprende una sustancia policatiónica seleccionada entre protamina y poli-lisina.

6. El método según la reivindicación 5, donde dicho paso de cultivar la célula madre adulta en el medio de cultivo celular líquido de primera diferenciación que comprende la sustancia policatiónica se realiza durante un período de tiempo de 2 a 4 días.

7. El método según la reivindicación 5 ó 6, donde la sustancia policatiónica es una sal soluble de protamina.

8. El método según la reivindicación 7, donde la sal soluble de protamina es sulfato de protamina o clorhidrato de protamina.

9. El método según la reivindicación 8, donde el sulfato de protamina o clorhidrato de protamina está en una concentración comprendida dentro del rango de 5 a 20 mM.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que además comprende el paso de reemplazar el primer medio de cultivo celular líquido de diferenciación que comprende una sustancia policatiónica con un segundo medio de cultivo celular líquido de diferenciación que no comprende una sustancia policatiónica y cultivar hasta que se obtengan células completamente diferenciadas.

11. El método según la reivindicación 10, donde la etapa de cultivo en el segundo medio de cultivo celular líquido de diferenciación que no comprende una sustancia policatiónica se realiza durante un período de tiempo de al menos 2 días.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, donde la célula madre adulta es una célula madre de hígado humano.

13. La estructura celular similar a un islote pancreático esferoide cultivada artificialmente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usarse en el tratamiento de la diabetes mediante trasplante de islotes pancreáticos.

14. El uso de una estructura de células similares a islotes pancreáticos esferoides cultivados artificialmente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un método de cribado in vitro para identificar sustancias capaces de promover la expresión de una o más hormonas pancreáticas por parte de las células de los islotes pancreáticos o para identificar sustancias capaces de ejercer un efecto citotóxico sobre las células de los islotes pancreáticos.