CN105814193B - 胰岛样细胞结构及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备胰岛样细胞结构的方法，所述胰岛样细胞结构表征为形态特征和功能特征独特的组合，使得它们特别适合用于临床应用和药物筛选应用，以及涉及由其获得的胰岛样细胞结构。

Description

胰岛样细胞结构及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞分化领域。具体地，本发明涉及用于将干细胞分化成胰岛样细胞结构(pancreatic islet-like cell structure)的方法以及涉及由其获得的胰岛样细胞结构。
背景技术
1型糖尿病是具有极大的社会经济影响的疾病，如果未经治疗，导致死亡。其是由生产胰岛素的细胞(β-细胞)的自身免疫破坏所引起并且与使人衰弱的小血管(microvascular)和大血管(macrovascular)并发症的发展有关。
胰脏移植和胰岛移植两者都已经显示出了恢复胰岛功能并且潜在地降低长期的糖尿病并发病，但是受到供体不足以及需要免疫抑制的限制。在上下文中，干细胞代表了用于生产胰岛素细胞(insulin-producing cell)产生的有希望的来源，由于它们可以具有允许满足用于治愈1型糖尿病(T1DM)的要求的特性。首先，它们可以允许两者恢复β细胞功能并且防止自身免疫的复发，而不需要使用免疫抑制疗法。其次，由于它们潜在地不受限制的自身更新(self-renewal)的能力，可以将它们广泛地使用。
在现有技术中公开了，在特定的培养条件下，由人类胚胎干细胞(Kroon E etal.Nat Biotechnol.2008；26(4):443-52；Rezania A et al.Diabetes.2012；61(8):2016-29；Bose B et al.Cell Biol Int.2012；36(11):1013-20)、人体脂组织衍生的干细胞(Mohamad Buang ML et al.Arch Med Res.2012；43(1):83-8；Chandra V et al.PLoSOne.2011；6(6):e20615)，衍生自骨髓的巢蛋白阳性的细胞(Milanesi A et al.JEndocrinol.2011；209(2)；193-201)、分离自人类羊水和牙髓的干细胞(Carnevale G etal.Dig Liver Dis.2013；45(8):669-76)、以及人类脐带血衍生的间充质干细胞(PrabakarKR et al.Cell Transplant.2012；21(6):1321-39)产生胰岛样结构的体外方法。
然而，发现由人类胚胎干细胞体外衍生的胰岛样结构是不成熟的，因此要求进一步的体内3至4个月的分化期以便变为成熟的功能性胰岛(Kroon E et al.NatBiotechnol.2008；26(4):443-52；Rezania A et al.Diabetes.2012；61(8):2016-29)。此外，报告了从人类胚胎干细胞3D体外产生胰岛素分泌细胞，同时示出了血糖从300mg/dl降低至200mg/dl的稳定趋势的一项研究，没有证实通常在胰岛内生产的其他激素(胰高血糖素、胰多肽(PP)、生长激素抑制素以及胃饥饿素)的蛋白表达(除了胰岛素之外)(Bose B etal.Cell Biol Int.2012；36(11):1013-20)。
由人体脂组织衍生的干细胞(Mohamad Buang ML et al.Arch Med Res.2012；43(1):83-8；Chandra V et al.PLoS One.2011；6(6):e20615)、衍生自骨髓的巢蛋白阳性的细胞(Milanesi A et al.J Endocrinol.2011；209(2)；193-201)、分离自人类羊水和牙髓的干细胞(Carnevale G et al.Dig Liver Dis.2013；45(8):669-76)体外产生的生产胰岛素的细胞显示出了释放人类胰岛素(响应于体外葡萄糖刺激)。然而，没有证实胰高血糖素、PP和胃饥饿素的表达。
由人类脐带血衍生的间充质干细胞(CB-MSC)产生的生产胰岛素的细胞显示出了表达胰岛素、C肽、胰高血糖素和胰多肽并且释放C肽(响应于体外葡萄糖刺激)。然而，没有证实这类细胞在实验性糖尿病中降低血糖的能力，因为作者仅仅示出了移入(engraft)的CB-MSC-衍生的胰腺的内皮细胞体内分化成功能性内分泌细胞，在移植之后的继葡萄糖挑战(glucose challenge)60天之后检测低水平的C肽(Prabakar KR et al.CellTransplant.2012；21(6):1321-39)。
在Herrera MB等人，Stem Cells.2006；24(12):2840-50以及在国际专利申请WO2006/126236中公开了人类肝脏干细胞(HLSC)分化成胰岛细胞的方法。
在Herrera MB等人，Stem Cells.2006；24(12):2840-50中，当在10mM的尼克酰胺存在下培养5–7天之后将其培养在具有高的葡萄糖含量(23mM)的DMEM中一个月时，HLSC显示出了它们的细长的形态改变成小的球状细胞群集(spheroid cell cluster)，形态上相似于胰岛。将这种球状细胞群集阳性地染色(对于人体胰岛素和Glut2)，并且利用锌-螯合剂双硫腙(其对于包含胰岛素的颗粒具有特异性)进行阳性染色，暗示HLSC分化成胰岛样结构。尽管这种令人兴奋的结果，但是分化方案受到低效率的限制，特别是关于产生的结构的量以及产生它们所需要的时间。此外，甚至在大规模的培养之后，该结构没有生长至非常相似于人类胰脏结构的尺寸和形态。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明人已经提供了制备在所附权利要求中限定的球状胰岛样细胞结构的新方法。权利要求的内容形成了说明书的不可分割的部分。
与现有技术相比，根据本发明的方法不仅是更简单的、更快的并且更有效的，而且其还导致结构在尺寸和形态两者上更加紧密地相似于天然的人类胰岛结构。其导致更多数量的胰岛样细胞结构的产生，其有利地具有可与天然存在的人类胰岛相比较的直径，并且其在蛋白水平下表达通常通过人类胰岛生产的所有激素(即，胰岛素、胰高血糖素、PP、生长激素抑制素和胃饥饿素)。而且，在链脲菌素诱导的糖尿病SCID小鼠的肾囊下移植之后，通过本发明的方法可获得的胰岛样细胞结构能够在初期显著地降低血糖水平(在13天之内)，具有人类C肽的伴随增加。对于发明人的知识来说，结构特征与天然的人类胰岛结构的这种强烈的相似性致使了由本发明的方法产生的独特的胰岛样细胞结构。实际上，无先前研究已经示出了衍生自单一分离的干细胞类型的胰岛样结构的体外特征和体内特征的组合。由于它们的特征，通过本发明的方法可获得的胰岛样细胞结构是特别地适合用于各种应用，如基础研究、药物筛选和再生的药物。
因此，在第一方面，本发明提供了制备人工生长的球状胰岛样细胞结构的方法，其包括在包含聚-阳离子物质的第一分化液体细胞培养基中培养分离的成体干细胞的步骤。
实际地，本发明人出乎意料地发现了，当在存在聚-阳离子物质的液体细胞培养基中培养时，在相当早的时间段(即在约2至4天之后)分离的成体干细胞聚集并且分化成在尺寸和形态两者上紧密地相似于天然存在的胰岛细胞结构的球状胰岛样细胞结构，并且其能够表达通常由人类胰岛生产的激素(即，胰岛素、胰高血糖素、PP、生长激素抑制素和胃饥饿素)。
用于本发明的方法的成体干细胞优选地是成体的哺乳动物干细胞。因此，任何能够维持哺乳动物细胞生长的液体细胞培养基适合用于本发明的方法。在优选的实施方式中，液体细胞培养基是富含血清的细胞培养基。将富含血清的DMEM或者RPMI作为非限制性的实例提及。优选地细胞培养基中的血清浓度包含在从5至20％的范围内。优选地，液体细胞培养基还包含一种或多种碳源，如例如葡萄糖和谷氨酰胺。优选的葡萄糖浓度是在6-25mM的范围内。优选的谷氨酰胺浓度是在0.5-3mM的范围内。
在本说明书的上下文之内，与分离自胚囊的内细胞群(inner cell mass)的“胚胎干细胞”对比，表述“成体干细胞”旨在意指分离自成体组织的干细胞。
在给定浓度下任何能够促进成体干细胞聚集并且分化成胰岛细胞(并且在该浓度下其对细胞是非细胞毒性的)的聚-阳离子物质可以用于本发明的方法。适合用于本发明的方法的聚-阳离子物质的说明性的、非限制性的实例是聚-赖氨酸和鱼精蛋白。
鱼精蛋白(其是优选的聚-阳离子物质(由于其适合于临床应用))优选以可溶盐的形式，如例如鱼精蛋白硫酸盐或者鱼精蛋白盐酸盐，在优选地5和20mM之间的范围内的浓度下，添加至培养基。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法进一步地包括利用不包含聚-阳离子物质的第二分化液体细胞培养基代替第一分化液体细胞培养基并且在所述第二培养基中培养细胞的步骤。任何能够维持哺乳动物细胞生长的液体细胞培养基适合用于作为第二分化液体细胞培养基。根据优选的实施方式，除了其不包含聚-阳离子物质之外，还将用于第一步骤中的相同的液体细胞培养基用于第二步骤中。该步骤的目的是为了获得在第一步骤期间形成的胰岛样细胞结构的完全成熟以及在细胞数量和结构数量两者上它们的增加。在第二分化液体细胞培养基中的培养优选地进行至少2天、更加优选地至少10天、甚至更加优选地约10至14天的时间段。
如以上提及的，由于其使相似于胰岛样结构(紧密地相似于天然存在的人类胰岛结构)的球状细胞群集的形成加速，在第一分化液体细胞培养基中的聚-阳离子物质的存在是本发明的关键要素。
实际上，如在随后的实施例中举例说明的，将HLSC暴露至DMEM或者RPMI类分化培养基(参见以下表2和3)，在存在葡萄糖以及在不存在葡萄糖两者的情况下，在4天的培养期之后，没有导致胰岛样结构形成。相反，将鱼精蛋白增加至DMEM或者RPMI类培养基，在存在葡萄糖以及在不存在葡萄糖两者的情况下，在4天的培养期之后，导致了胰岛样结构形成(图11)。衍生自HLSC的结构的直径是可与对于人类胰岛报道的那些(Chandra V etal.PLoS One.2011；6(6):e20615)相比较的，并且大部分包含在50和150um之间，具有109±19uM(平均值±SD)的平均胰岛体积(图12)。
相反，葡萄糖没有影响胰岛样结构形成(图13A)，但是在诱导内分泌特异性(endocrine specification)(NgN3表达)以及增加在结构之内的胰岛素和胰高血糖素两者表达的两者上，其起关键作用(图13B)。
根据本发明的另一优选的实施方式，分化成胰岛样细胞结构的成体干细胞是成体人类肝脏干细胞(HLSC)。优选的人类肝脏干细胞是在WO2006/126219中公开的表达间充质和胚胎干细胞标记两者的人类非卵肝脏干细胞(human non-oval liver stem cell)(HLSC)。这种细胞系特别地表征为，其是分离自成体组织的非卵人类肝脏多能性的祖细胞系，其表达肝细胞标记并且其具有多能性的分化能力以及再生特性。更加特别地，这种细胞系能够分化成成熟的肝脏细胞、生产胰岛素的细胞、生骨细胞和上皮细胞。根据优选的实施方式，其表达选自包括以下各项的组中的一种或多种标记：白蛋白、α-胎蛋白、CK18、CD44、CD29、CD73、CD146、CD105、CD90以及任何它们的组合，并且其不表达选自包括以下各项的组中的标记：CD133、CD117、CK19、CD34、细胞色素P450。
在WO 2006/126236中公开的人类非卵肝脏多能性的祖/干细胞显示出了，经历分化成各种组织细胞类型(也就是，成熟的肝脏细胞、上皮细胞、生产胰岛素的细胞和生骨细胞)以及产生组织再生的效果。这类细胞衍生自表达肝细胞标记的非卵人类肝脏多能性的祖细胞系。通过包括以下步骤的方法将这类细胞分离：
(i)在细胞培养基中培养成体肝脏衍生的人类成熟的肝细胞直至成熟的肝细胞死亡并且选择具有上皮状的形态的成活细胞群；
(ii)通过在补充有hEGF(人类上皮生长因子)和bFGF(basic fibroblast growthfactor)(基础成纤维细胞生长因子)并且包含哺乳动物细胞生长所必需的常规的无机盐、氨基酸和维生素的包含血清、包含葡萄糖的培养基中培养将具有上皮状的形态的成活细胞群扩展
并且特别地其中，将成熟的肝细胞在防冻剂存在下包含血清的培养基中冷冻，然后在根据步骤(i)培养前融化。
在WO 2006/126236中公开的人类非卵肝脏干/祖细胞的表征及其制备方法通过引证全部地合并于本文。
出于多种原因，在本发明中HLSC的使用是优选的：1)它们相对容易地分离和扩展，2)它们表征为允许提供用于治疗用途的合适数量的细胞的增殖程度，3)可以将它们自身地使用以及4)它们避免伦理的担忧。此外，肝脏和胰腺共享共同的胚胎起源并且发展的肝脏已经显示出了表现出与成体胰腺相似的翻译特征(Bose B et al.Cell Biol Int.2012；36(11):1013-20)。然而，由于设想的是，聚-阳离子物质应该比HLSC有效地促进其他成体干细胞的聚集以及分化，所以本发明的范围并不仅仅局限于HLSC的使用，但是其包括任何成体干细胞类型的使用。
如以上提及的，通过本发明的方法获得的胰岛样细胞结构表征为形态特征和功能特征的独特的组合，其在通过现有技术的方法制备的其他胰岛样细胞结构中是观察不到的。因此，本发明的范围还包括如在所附权利要求中限定的球状胰岛样细胞结构。
特别地，根据本发明的球状胰岛样细胞结构有利地表征为从50至250μm、优选地从50至200μm的直径，其是可与天然存在的人类胰岛相比较的。其还表征为从30至200μm、优选地从50至130μm的范围内的表示为IEQ/100ILS的体积，并且甚至更加有利地，表征为在蛋白水平下表达所有的通常通过人类胰岛表达的胰激素的能力，即胰岛素、胰高血糖素、胰多肽、生长激素抑制素和胃饥饿素。
在本说明书的上下文之内，IEQ/100ILS是针对100个胰岛(ILS)标准化的150μm的平均直径的胰岛当量(Islets Equivalent)(IEQ)。根据常规的方案，按照如下测定分离自胰腺并且用于移植的胰岛的IEQ。在数量和尺寸(直径)两者上评价分离自胰腺的悬浮胰岛以便确定总的胰岛当量(即，总的胰岛体积)。胰岛直径评价考虑了从50μm至>350μm的50μm直径范围的增加，没有考虑对总的体积不提供显著贡献的直径<50μm。相对转变因子是常规地用于将总的胰岛数量转变成150μm的平均直径的胰岛当量(IEQ)。
基于它们的纯度，将分离自胰腺的悬浮胰岛分离在不同的层中。然后分析来自每层最终产物的胰岛样品：然后使用标准化方法，基于胰岛的数量、纯度和尺寸，计算胰岛的总数和IEQ。由于在本发明的上下文中，胰岛样结构获得自粘附至平板的培养细胞，所以发明人通过分析每个实验随机选定的200 10x显微照片，评价胰岛样结构的数量和直径，并且将结果表示为％±SD(图12A)以及针对100个胰岛标准化的IEQ(图12C)。
由于以上举例说明的特征，根据本发明的球状胰岛样细胞结构是特别地适合用于临床应用(如通过胰岛移植术治疗糖尿病的方法)，以及体外应用(如用于鉴定能够通过胰岛细胞促进一种或多种的胰激素表达的物质或者用于鉴定能够在胰岛细胞上施加细胞毒性效应的物质的筛选方法)。
根据本发明，使用鱼精蛋白作为聚-阳离子物质，以下实施例详细地公开了HLSC分化成球状胰岛样细胞结构。然而，实施例并不旨在限制本发明的意图和范围。
具体实施方式
实施例
1.HLSC培养和扩展
1.1HLSC的分离、表征和培养
HLSC系分离自经受肝切除的患者的健康的肝脏组织并且表征为如先前所描述的(Mohamad Buang ML et al.Arch Med Res.2012；43(1):83-8)。具体地，将HLSC接种在75cm3的培养烧瓶中并且在补充有L-谷氨酰胺2mM、青霉素100UI/ml/链霉素100μg/ml以及10％的胎牛血清，包含3至1比例的α-最小必需培养基与内皮细胞基础培养基-1的培养基(参见表1)中培养。将细胞保持在37℃下的湿润的5％CO2的培育箱中。
1.2HLSC的脱离
一旦最高达≈80％的融合，用PBS将细胞洗涤两次并且用胰蛋白酶-EDTA 1X在37℃下温育约5分钟，以便诱导细胞脱离。随后通过添加补充有L-谷氨酰胺2mM、青霉素100UI/ml/链霉素100μg/ml以及10％的胎牛血清的RPMI将胰蛋白酶活性中和。随后，通过在1200rpm下离心5分钟收获细胞，除去上清液并且将颗粒再悬浮在培养基中并且分在五个75cm3的培养烧瓶中。
1.3细胞的冷冻保存
将最高达≈80％融合的细胞脱离并且通过如在段落1.2中描述的离心收获。将细胞计数并且将106细胞/管进行冷冻保存。将细胞颗粒再悬浮在包含90％FBS以及10％二甲基亚砜(DMSO)的1ml的溶液中并且放置在预冷却的冷冻小瓶中。在放置至在-196℃下的液氮容器中之前，将冷冻小瓶冻结在-80℃下过夜。
1.4冷冻保存细胞的融化
从液氮罐中移出冻结HLSC的小瓶并且放置在水预加温至37℃的烧杯中。一旦细胞悬浮液已经完全地融化，那么将其放置至具有10mL的无菌培养基的无菌的50mL的falcon管中并且在1200rpm下离心5分钟。然后将细胞颗粒再悬浮在培养基中并且分在三个75cm3的培养烧瓶中并且留下以在37℃下在湿润的5％CO2培育箱中粘合过夜。在随后的一天改变该培养基。
2.HLSC分化成胰岛样结构。
将在12X103/cm2密度下的HLSC接种在由补充有10％的胎牛血清、葡萄糖11.6mM、鱼精蛋白氯化物10μg/ml、L-谷氨酰胺2mM以及青霉素100UI/ml/链霉素100μg/ml的RPMI 1640或者DMEM组成的分化培养基1(参见表1)中的25cm3的培养烧瓶中或者100x 20mm的皮氏培养皿中。在不改变培养基的情况下，将细胞放置在37℃下的湿润的5％的CO2培育箱中4天的时间段。在第5天，用由补充有10％的FBS、葡萄糖11.6mM、L-谷氨酰胺2mM以及青霉素100UI/ml/链霉素100μg/ml的RPMI 1640或者DMEM组成的分化培养基2(参见表3)代替该培养基。随后每隔一天改变培养基。在2至4天之内，期待细胞开始组织化成胰岛样结构，在14-18天之后达到最大化的数量(图1)。
表1
Figure BDA0001014792170000101
表2
Figure BDA0001014792170000102
Figure BDA0001014792170000111
表3
Figure BDA0001014792170000112
附图说明
在附图中举例说明了获得的结果，在本文中以下简要地举例说明了其内容。
图1：示出了在基础培养基(A)中的HLSC以及在具有鱼精蛋白的分化培养基(B-D)中随后培养的代表性的20x显微照片。在24h之后，细胞在形态上改变并且开始形成在尺寸和数量两者上逐渐增加的小群集(B)，在18天的培养期之后达到最大的数量(C)。(D)示出了在18天的培养期之后的胰岛样结构的40x显微照片。(E)示出了在18天的培养之后的每个25cm3的培养烧瓶的胰岛样结构的总数量的曲线图。(F)代表了在18天的培养之后的胰岛样结构的平均值±SD数量(n＝10)的曲线图。
图2-8：示出了在14天的培养之后通过免疫荧光的胰岛样结构表征的代表性的图：对于PDX-1和NgN3两者(图2)、胰岛素和胰高血糖素(图3)、C肽和GLUT-2(图4)、生长激素抑制素(图5)、胃饥饿素和PP(图6)、胶原IV(图7)和Von Willebrand因子(von WillebrandFactor)(图8)，胰岛样结构变为阳性染色。
图9：示出了在14天的培养之后，继胰岛样结构解体(胰蛋白酶1X)之后的胰岛样结构细胞的免疫荧光表征的代表性的图。
图10：示出了在移植之前以及移植之后13天，在非糖尿病的SCID小鼠(实线，CTRL)、链脲菌素诱导的(55mg/kg/天，5天)糖尿病的SCID小鼠(虚线，DM)以及在肾囊下接收HLSC衍生的胰岛样结构移植(5000IEQ/kg)的链脲菌素诱导的糖尿病的SCID小鼠(短划线，DM+ILS)中的血糖和人类C肽水平的图。与糖尿病的小鼠相比，接收胰岛样结构移植的糖尿病的小鼠具有显著降低的血糖水平。这与人类C肽的伴随增加是平行的，该人类C肽在非糖尿病的SCID小鼠以及没有接收移植的糖尿病的SCID小鼠两者中保持为无法觉察的。
图11：示出了在补充有FBS 10％(F)、FBS 10％+葡萄糖11.6mM(FG)或者FBS 10％+葡萄糖11.6mM+鱼精蛋白氯化物10μg/ml(FGP)的RPMI或者DMEM基础培养基中HLSC培养48小时之后的胰岛样结构(ILS)形成的图。
图12：示出了在补充有FBS 10％+葡萄糖11.6mM+鱼精蛋白氯化物10μg/ml的RPMI基础培养基中培养14天之后衍生自HLSC的胰岛样结构的尺寸分布(A)、平均值±SD直径(B)和IEQ/100ILS(C)的图。
图13：葡萄糖没有影响胰岛样结构(ILS)形成(A)，但是在诱导内分泌特异性以及胰岛素/胰高血糖素表达(B)上起关键的作用。A.示出了在补充有鱼精蛋白氯化物10ug/ml(P)的不含有或者含有不同的葡萄糖浓度(6、11.6和28mM)的RPMI/DMEM中培养(4天)之后的胰岛样结构形成的代表性的图片和曲线图。B.示出了在含有葡萄糖1或25mM的RPMI类培养基中的PDX-1、NgN3、胰岛素和胰高血糖素表达的代表性的图。
图14：示出了培养在聚-赖氨酸分化培养基中的细胞中的PDX-1、NgN3、GLUT-2、C肽、胰高血糖素和生长激素抑制素的表达的代表性的图。

Claims (8)

1.一种制备人工生长的球状胰岛样细胞结构的方法，包括在包含聚-阳离子物质的第一分化液体细胞培养基中培养干细胞的步骤，所述聚-阳离子物质选自鱼精蛋白的可溶盐和聚-赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在包含所述聚-阳离子物质的第一分化液体细胞培养基中培养干细胞的所述步骤进行2至4天的时间段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鱼精蛋白的可溶盐是鱼精蛋白硫酸盐或者鱼精蛋白盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述鱼精蛋白硫酸盐或者鱼精蛋白盐酸盐的浓度包含在5至20mM的范围内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其进一步包括用不包含聚-阳离子物质的第二分化液体细胞培养基代替包含所述聚-阳离子物质的所述第一分化液体细胞培养基并且培养直至获得完全分化的细胞的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在不包含聚-阳离子物质的第二分化液体细胞培养基中培养的所述步骤进行至少2天的时间段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述干细胞是成体干细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述成体干细胞是人类肝脏干细胞。
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