KR102338815B1 - 췌장섬-유사 세포 구조물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임상 적용 및 약물 스크리닝 적용 둘 모두에 사용하기에 특히 적합하게 하는 형태학적 및 기능적 특징의 독특한 조합을 특징으로 하는 췌장섬-유사 세포 구조물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 뿐만 아니라 이로부터 수득된 췌장섬-유사 세포 구조물에 관한 것이다.

Description

췌장섬-유사 세포 구조물 및 이의 제조 방법 {PANCREATIC ISLET-LIKE CELL STRUCTURES AND A METHOD OF PREPARING THEREOF}
본 발명은 줄기 세포 분화 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 줄기 세포를 췌장섬-유사 세포 구조물로 분화시키는 방법 및 이로부터 수득된 췌장섬-유사 세포 구조물에 관한 것이다.
타입 I 당뇨병은 막대한 사회-경제적 충격을 갖는 질환으로서, 치료되지 않는 경우 사망에 이르게 된다. 이는 췌장 인슐린 생성 세포 (β-세포)의 자가면역 파괴에 의해 초래되며 미세혈관 및 거대혈관 합병증을 약화시키는 개발과 관련된다.
췌장 이식 및 섬 이식 둘 모두는 섬 기능을 복원하고 잠재적으로 장기간 당뇨병 합병증을 감소시키는 것으로 보여졌으나, 이는 기증자 부족 및 면역억제에 대한 요구 둘 모두에 의해 제한되다. 이러한 상황에서, 줄기 세포는 인슐린-생산 세포의 생성을 위한 유망한 공급원을 제시하는데, 이들이 타입 1 진성 당뇨병 (T1DM)의 치유를 위한 요건을 만족시키는 특성을 가질 수 있기 때문이다. 첫 번째로, 이들은 면역억제 요법을 사용할 필요 없이, β-세포 기능을 복원하고 자가면역의 재발을 예방하는 것 둘 모두를 허용할 수 있다. 두 번째로, 자가-재생에 대한 이들의 잠재적으로 비제한된 역량으로 인해, 이들은 광범위하게 사용될 수 있다.
특정 배양 조건하에서 인간 배아 줄기 세포 (Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Rezania A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29; Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20), 인간 지방 조직-유래된 줄기 세포 (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PLoS One. 2011; 6(6):e20615), 골수로부터 유래된 네스틴-양성 세포 (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), 인간 양막 유체 및 치수로부터 분리된 줄기 세포 (Carnevale G et al. Dig Liver Dis. 2013; 45(8): 669-76), 및 인간 제대혈-유래된 중간엽 줄기 세포 (Prabakar KR et al. Cell Transplant. 2012; 21(6): 1321-39)로부터의 섬-유사 구조물을 생성하는 시험관내 방법이 종래 기술에 기재되어 있다.
그러나, 인간 배아 줄기 세로로부터 시험관내에서 유래된 섬-유사 구조물은 미숙한 것으로 밝혀졌으며, 따라서, 성숙한 작용성 섬이 되기 위해서는 생체내에서 추가로 3 내지 4 개월의 분화 기간을 필요로 한다 (Kroon E et al. Nat Biotechnol.2008; 26(4): 443-52; Rezania A et al. Diabetes. 2012; 61(8): 2016-29). 게다가, 인간 배아 줄기 세포로부터 인슐린 분비 세포의 3D 시험관내 생성을 보고하는 반면, 300 mg/dl로부터 200 mg/dl로의 당혈증의 안정한 감소 동향을 보여주는 한 연구는, 인슐린을 제외하고는, 췌장섬 내에서 일반적으로 생성되는 기타 호르몬 (글루카곤, 췌장 폴리펩티드 (PP), 소마토스타틴 및 그렐린)의 단백질 발현을 입증하지 못하였다 (Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20).
인간 지방 조직-유래된 줄기 세포 (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8; Chandra V et al. PLoS One. 2011; 6(6):e20615), 골수로부터 유래된 네스틴-양성 세포 (Milanesi A et al. J Endocrinol. 2011; 209(2); 193-201), 인간 양막 유체 및 치수로부터 분리된 줄기 세포 (Carnevale G et al. Dig Liver Dis. 2013; 45(8): 669-76)로부터 시험관내에서 생성된 인슐린-생성 세포는 시험관내에서 글루코스 자극에 대한 반응으로 인간 인슐린을 방출하는 것으로 보여졌다. 그러나, 글루카곤, PP 및 그렐린의 발현은 입증되지 않았다.
인간 제대혈-유래된 중간엽 줄기 세포 (CB-MSC)로부터 생성된 인슐린-생성 세포는 시험관 내에서 글루코스 자극에 대한 반응으로 인슐린, C-펩티드, 글루카곤 및 췌장 폴리펩티드를 발현하고 C-펩티드를 방출하는 것으로 보여졌다. 그러나, 저자는 단지 이식 후 글루코스 자극 60일 후 낮은 수준의 C-펩티드 검출과 함께 주입된 CB-MSC-유래된 췌장 내배엽 세포의 작용성 내분비 세포로의 생체내 분화를 보여주었기 때문에, 실험 당뇨병에서 혈당을 감소시키는 이러한 세포의 능력은 입증되지 않았다 (Prabakar KR et al. Cell Transplant. 2012; 21(6): 1321-39).
인간 간 줄기 세포 (HLSC)의 췌장섬 세포로의 분화 방법은 문헌 [Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50] 및 국제 특허 출원 WO 2006/126236에 기재되어 있다.
문헌 [Herrera MB et al. Stem Cells. 2006; 24(12):2840-50]에서, HLSC는 한 달 동안 높은 글루코스 함량 (23 mM)을 갖는 DMEM에서 배양된 후 5-7일 동안 10 mM 니코틴아미드의 존재하에 배양하는 경우, 이들의 가늘고 긴 형태가 형태학적으로 췌장섬을 닮은 구형의 작은 세포 클러스터로 변화되는 것으로 보여졌다. 이러한 구형의 세포 클러스터는 인간 인슐린 및 Glut2에 대해 양성적으로 염색되었고 인슐린-함유 과립에 특이적인 아연-킬레이팅제 디티존으로 양성적으로 염색되었으며, 이는 HLSC의 섬-유사 구조물로의 분화를 암시한다. 이러한 흥미진진한 결과에도 불구하고, 분화 프로토콜은 낮은 효율성, 특히 생성된 구조물의 양 및 이들을 생성하는데 필요한 시간 둘 모두에 있어서의 낮은 효율성에 의해 제한된다. 게다가, 광범위한 배양 후에도, 구조물은 그다지 인간 췌장 구조물과 매우 유사한 크기 및 형태로 성장하지는 않았다.
종래 기술의 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 첨부된 청구범위에서 규정되는 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물을 제조하는 신규한 방법을 제공하였다. 청구범위의 내용은 설명의 일체 부분을 형성한다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명에 따른 방법은 더욱 단순하고 더욱 신속하며 더욱 효율적일 뿐만 아니라, 또한 크기 및 형태 둘 모두에서 천연의 인간 췌장섬 구조물과 더욱 밀접하게 유사한 구조물을 발생시킨다. 이는 더 많은 수의 췌장섬-유사 세포 구조물의 생성을 유도하며, 이러한 구조물은 유리하게는 자연-발생 인간 췌장섬에 필적하는 직경을 가지며, 인간 췌장섬에 의해 일반적으로 생성되는 호르몬 (즉, 인슐린, 글루카곤, PP, 소마토스타틴 및 그렐린) 모두를 단백질 수준으로 발현시킨다. 게다가, 스트렙토조토신-유발된 당뇨병 SCID 마우스의 신피막 아래로의 임플란트 후, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 췌장섬-유사 세포 구조물은 수반되는 인간 C-펩티드의 증가와 함께 충분히 초기에 (13일 이내) 혈당 수준을 감소시킬 수 있다. 발명자의 지식에 따르면, 자연 인간 췌장섬 구조물에 대한 구조적 특징의 이러한 강한 유사성은 본 발명의 방법으로 생성된 췌장섬-유사 세포 구조물을 독특하게 한다. 실제로, 종래의 연구는 단일의 분리된 줄기 세포 타입으로부터 유래된 섬-유사 구조물의 시험관내 특징과 생체내 특징의 이러한 조합을 보여주지 못하였다. 이들의 특징으로 인해, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 췌장섬-유사 세포 구조물은 다양한 적용 예컨대, 기본 연구, 약물 스크리닝 및 재생 의약에 사용하기에 특히 적합하다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 인공적으로 성장한 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물을 제조하는 방법으로서, 다중-양이온 물질을 포함하는 제 1 분화 액체 세포 배양 배지에서 분리된 성체 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
실제로, 본 발명자들은 놀랍게도, 분리된 성제 줄기 세포를 다중-양이온 물질의 존재하에 액체 세포 배양 배지에서 배양하는 경우 이는 매우 초기에 (즉, 약 2 내지 4일 후) 응집되며 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물로 분화됨을 발견하였으며, 이러한 구조물은 크기 및 형태 둘 모두에 있어서 자연-발생 췌장섬 세포 구조물과 매우 유사하며, 인간 췌장섬에 의해 일반적으로 생산되는 호르몬 (즉, 인슐린, 글루카곤, PP, 소마토스타틴 및 그렐린)을 발현할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 성체 줄기 세포는 바람직하게는, 성체 포유동물 줄기 세포이다. 따라서, 포유동물 세포의 성장을 지속할 수 있는 임의의 액체 세포 배양 배지는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 바람직한 구체예에서, 액체 세포 배양 배지는 혈청-풍부 세포 배양 배지이다. 혈청-풍부 DMEM 또는 RPMI는 비-제한적 예로서 언급된다. 세포 배양 배지에서 혈청 농도는 바람직하게는 5 내지 20% 범위내에 포함된다. 바람직하게는, 액체 세포 배양 배지는 또한, 하나 이상의 탄소 공급원 예컨대, 예를 들어, 글루코스 및 글루타민을 포함한다. 바람직한 글루코스 농도는 6-25 mM 범위 내에 있다. 바람직한 글루타민 농도는 0.5-3 mM의 범위 내에 있다.
본 설명의 문맥 하에서, 표현 "성체 줄기 세포"는 주머니배의 내부 세포 질량으로부터 분리된 "배아 줄기 세포"와는 대조적으로, 성체 조직으로부터 분리되는 줄기 세포를 의미하고자 한다. 성제 줄기 세포는 또한 "체세포 줄기 세포"로서 공지되어 있다.
주어진 농도에서 성체 줄기 세포 응집 및 췌장섬 세포로의 분화를 촉진할 수 있으며, 그러한 농도에서 세포에 무-세포독성인 임의의 다중-양이온 물질이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다중-양이온 물질의 예시적인 비제한적 예는 폴리-리신 및 프로타민이다.
임상 적용에 적합하기 때문에 바람직한 다중-양이온 물질인 프로타민은 바람직하게는, 가용성 염의 형태 예컨대, 예를 들어, 프로타민 설페이트 또는 프로타민 하이드로클로라이드로서 바람직하게는, 5 내지 20 mM 범위의 농도로 배지에 첨가된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 제 1 분화 액체 세포 배양 배지를 다중-양이온 물질을 포함하지 않는 제 2 분화 액체 세포 배양 배지로 대체하고, 상기 제 2 배지에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 포유동물 세포의 성장을 지속시킬 수 있는 임의의 액체 세포 배양 배지가 제 2 분화 액체 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 바람직한 구체예에 따르면, 다중-양이온 물질을 함유하지 않는다는 점을 제외하고는 제 1 단계에 사용되었던 동일한 액체 세포 배양 배지가 제 2 단계에서 또한 사용될 것이다. 본 단계의 목적은 제 1 단계 동안 형성된 췌장섬-유사 세포 구조물의 완전한 성숙은 물론 세포 수 및 구조물 수 둘 모두에 있어서 이들의 증가를 획득하는 것이다. 제 2 분화 액체 세포 배양 배지의 배양은 바람직하게는, 적어도 2일, 더욱 바람직하게는, 적어도 10일, 더욱 더 바람직하게는 약 10 내지 14일의 기간 동안 수행된다.
상기 언급된 바와 같이, 제 1 분화 액체 세포 배양 배지에서 다중-양이온 물질의 존재는, 이것이 자연 발생 인간 췌장섬 구조물과 매우 유사한 섬-유사 구조물을 닮은 구형의 세포 클러스터의 형성을 가속화시킨다는 점에서 본 발명의 주요 요소이다.
실제로, 하기 실시예에서 예시된 바와 같이, 글루코스의 존재 및 부재 둘 모두에서 DMEM 또는 RPMI-기반 분화 배지 (하기 표 2 및 3 참조)로의 HLSC 노출은 4일의 배양 기간 후 섬-유사 구조물 형성을 유도하지 않았다. 이에 반해서, 글루코스의 존재 및 부재 둘 모두에서 DMEM 또는 RPMI-기반 배지로의 프로타민의 첨가는 4일의 배양 기간 후 섬-유사 구조물 형성을 유도하였다 (도 11). HLSC로부터 유래된 구조물의 직경은 인간 췌장섬에 대해 보고된 것에 필적하며 (Chandra V et al. PLoS One. 2011; 6(6);e20615), 대부분 50 내지 150 um를 포함하며, 평균 섬 부피는 109 ± 19uM (평균 ± SD)이다 (도 12).
이에 반해, 글루코스는 섬-유사 구조물 형성에 영향을 끼치지 않았으나 (도 13A), 이는 구조물 내의 인슐린 및 글루카곤 둘 모두의 발현 증가와 내분비물 특정화 (NgN3 발현) 유도 둘 모두에서 주요 역할을 수행한다 (도 13B).
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 췌장섬-유사 세포 구조물로 분화되는 성체 줄기 세포는 성체 인간 간 줄기 세포 (HLSC)이다. 바람직한 인간 간 줄기 세포는 WO 2006/126219에 기재된 중간엽 및 내배엽 줄기 세포 마커 둘 모두를 발현하는 인간 비-타원형 간 줄기 세포 (HLSC)이다. 이러한 세포주는 특히, 성체 조직으로부터 분리된 비-타원형 인간 간 만능성 전구 세포주임을 특징으로 하며, 이는 간 세포 마커를 발현하며, 다능성 분화 능력 및 재생 특성을 갖는다. 더욱 특히, 이러한 세포주는 성숙한 간 세포, 인슐린 생산 세포, 골형성 세포 및 상피 세포로 분화될 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 이는 알부민, α-태아단백질, CK18, CD44, CD29, CD73, CD146, CD105, CD90 및 이들의 임의의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하며, 이는 CD133, CD117, CK19, CD34, 사이토크롬 P450을 포함하는 군으로부터 선택된 마커를 발현하지 않는다.
WO 2006/126236에 기재된 인간 비-타원형 간 만능성 전구/줄기 세포는 다양한 조직 세포 유형 (즉, 성숙한 간 세포, 상피 세포, 인슐린-생산 세포 및 골형성 세포)으로의 분화를 겪고 기관 재생 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포는 간 세포 마커를 발현하는 비-타원형 인간 간 만능성 전구 세포주로부터 유래된다. 이러한 세포는
(i) 성숙한 간세포의 치사 및 상피모양 형태를 갖는 생존 세포의 군집을 선별할 때까지 세포 배양 배지에서 성제 간-유래된 인간 성숙 간세포를 배양하는 단계;
(ii) hEGF (인간 상피 성장 인자) 및 bFGF (기본 섬유모세포 성장 인자)가 보충되고 포유동물 세포의 성장에 필요한 일반적인 무기 염, 아미노산 및 비타민을 포함하는 혈청-함유, 글루코스-함유 배양 배지에서 배양함으로써 상피모양 형태를 갖는 생존 세포의 군집을 확장시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
특히, 성숙한 간세포는 저온보호제의 존재하에 혈청-함유 배양 배지에 냉동되고 이어서 단계 (i)에 따른 배양 전에 해동되는 방법에 의해 분리된다.
WO 2006/126236에 기재된 인간 비-타원형 간 줄기/전구 세포의 특징 규명 및 이들의 제조 방법은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.
본 발명에서 HLSC의 사용은 많은 이유로 바람직하다: 1) 이들은 비교적 분리하고 팽창시키기 용이하며, 2) 이들은 치료학적 용도를 위한 적합한 수의 세포를 제공하게 하는 정도의 증식을 특징으로 하며, 3) 이들은 자가로 사용될 수 있고, 4) 윤리적 염려를 회피한다. 게다가, 간 및 췌장은 공통의 배아 기원을 공유하며, 발달되는 간은 성체 췌장과 유사한 전사 특징을 나타내는 것으로 입증되었다 (Bose B et al. Cell Biol Int. 2012; 36(11): 1013-20). 그러나, 다중-양이온 물질이 HLSC 이외의 기타 성체 줄기 세포의 응집 및 분화를 촉진하는데 효과적일 것으로 예상되기 때문에, 본 발명의 범위는 단지 HLSC의 사용에만 국한되는 것이 아니며, 이는 임의의 성체 줄기 세포 타입의 사용을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 수득된 췌장섬-유사 세포 구조물은 종래 기술의 방법에 의해 제조된 기타 섬-유사 세포 구조물에서 관찰되지 않은 형태학적 및 기능적 특징의 독특한 조합을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 또한 첨부된 청구범위에 규정된 바와 같은 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물을 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물은 유리하게는 자연-발생 인간 췌장섬에 필적하는 50 내지 250 μm, 바람직하게는, 50 내지 200 μm의 직경을 특징으로 한다. 이는 또한, 30 내지 200 μm, 바람직하게는 50 내지 130 μm의 범위의 IEQ/100 ILS로서 표현된 부피, 및 심지어 더욱 유리하게는, 인간 췌장섬에 의해 일반적으로 발현되는 췌장 호르몬, 즉, 인슐린, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴 및 그렐린 모두를 단백질 수준으로 발현하는 능력을 또한 특징으로 한다.
본 설명의 문맥상, IEQ/100 ILS는 100개 섬 (ILS)으로 표준화된 150 μm의 평균 직경의 섬 등가물 (IEQ)이다. 통상적인 프로토콜에 따르면, 췌장으로부터 분리되고 이식을 위해 사용된 섬의 IEQ는 하기와 같이 측정된다. 췌장으로부터 분리된 현탁된 섬은 전체 섬 등가물 (즉, 전체 섬 부피)을 측정하기 위해 수 및 크기 (직경) 둘 모두에서 평가된다. 섬 직경 평가는 50 μm로부터 >350 μm까지 50 μm 직경 범위 증분을 감안하며, 전체 부피에 현저하게 기여하지 않는 < 50 μm 직경은 감안하지 않는다. 상대적 전환 계수는 전체 섬 수를 150 μm (IEQ)의 평균 직경의 섬 등가물 (IEQ)로 전환시키는데 편리하게 사용된다.
췌장으로부터 분리된 현탁된 섬은 이들의 순도 정도를 기반으로 하여 다양한 층으로 분리된다. 이어서 최종 생성물의 각 층으로부터의 섬 샘플이 분석된다: 이어서 표준화된 방법을 사용하여 섬의 총 수 및 IEQ가 섬의 개수, 순도 및 크기를 기반으로 하여 계산된다. 본 발명의 상황에서 섬-유사 구조물이 플레이트에 부착되는 배양된 세포로부터 수득되기 때문에, 본 발명자들은 실험 당 무작위로 선택된 200개 10x 현미경 사진을 분석함으로써 섬-유사 구조물의 개수 및 직경 둘 모두를 평가하고, 결과를 % ±SD (도 12A) 및 100개 섬으로 표준화된 IEQ (도 12C)로서 표현하였다.
상기 설명된 특징 덕분에, 본 발명에 따른 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물은 임상 적용 예컨대, 췌장섬 이식에 의한 당뇨 치료 방법 및 시험관내 적용 예컨대, 췌장섬 세포에 의한 하나 이상의 췌장 호르몬의 발현을 촉진할 수 있는 물질을 식별하거나 췌장섬 세포에 대한 세포독성 효과를 발휘할 수 있는 물질을 식별하기 위한 스크리닝 방법 둘 모두에 사용하기에 특히 적합하다.
하기 실시예는 다중-양이온 물질로서 프로타민을 사용한 본 발명에 따른 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물로의 HLSC의 분화를 더욱 상세히 기술한다. 그러나, 실시예는 본 발명의 목적 및 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
1. HLSC 배양 및 팽창
1.1 HLSC의 분리, 특성 규명 및 배양
HLSC 세포주를 간 절제술을 겪은 환자의 건강한 간 조직으로부터 분리하고 종래 기술된 바와 같이 특징 규명하였다 (Mohamad Buang ML et al. Arch Med Res. 2012; 43(1): 83-8). 구체적으로, HLSC를 75 cm3 배양 플라스크에 씨딩하고 3 대 1 비율의 α-최소 필수 배지 및 내피 세포 기본 배지-1을 함유하며, L-글루타민 2 mM, 페니실린 100 UI/ml/스트렙토마이신 100 μg/ml 및 10% 소태아혈청이 보충된 배지 (표 1 참조)에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 습화된 5% CO2 인큐베이터에서 유지하였다.
1.2 HLSC의 분리
최대
Figure 112016068218781-pct00001
80% 컨플루언스가 되면, 세포 분리를 유도하기 위해 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃에서 약 5 분 동안 트립신-EDTA 1X와 인큐베이션하였다. 후속하여 트립신 활성을 L-글루타민 2 mM, 페니실린 100 UI/ml/스트렙토마이신 100 μg/ml 및 10% 소태아혈청이 보충된 RPMI를 첨가함으로써 중화시켰다. 이어서, 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리에 의해 채집하고, 현탁액을 제거하고 펠렛을 배양 배지에 재현탁시키고 5개의 75 cm3 배양 플라스크에 나누었다.
1.3 세포의 저온보존
단락 1.2에 기술된 바와 같이 최대
Figure 112016068218781-pct00002
80% 컨플루언시의 세포를 분리하고, 원심분리에 의해 채집하였다. 세포를 계수하고, 바이알 당 106 세포를 저온보존하였다. 세포 펠렛을 90% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 함유하는 1 ml 용액에 재현탁시키고, 사전-냉각된 저온바이알/s에 넣었다. 저온바이알을 -80℃에서 밤새 냉동시킨 후 -196℃에서의 액체 질소 컨테이너에 넣었다.
1.4 저온보존된 세포의 해동
냉동된 HLSC의 바이알을 액체 질소 탱크로부터 제거하고 37℃로 사전 가온된 물의 비이커에 넣었다. 세포 현탁액이 완전히 해동되면, 이를 10 ml의 멸균 배지가 든 멸균된 50 ml 팔콘 튜브에 넣고 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁시키고 3개의 75 cm3 배양 플라스크에 나누고, 습화된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 부착되게 방치하였다. 배지를 다음날 교체하였다.
2. 섬-유사 구조물로의 HLSC 분화
12X103/cm2 밀도의 HLSC를 10% 소태아혈청, 글루코스 11.6 mM, 프로타민 클로라이드 10 μg/ml, L-글루타민 2 mM 및 페니실린 100 UI/ml/스트렙토마이신 100 μg/ml가 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM으로 구성된 분화 배양 배지 1 (표 1 참조)에서 25 cm3 배양 플라스크 또는 페트리 디쉬 100 x 20 mm에 씨딩하였다. 세포를 배지의 교체 없이 습화된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4일의 기간 동안 위치시켰다. 5일째에, 배지를 10% FBS, 글루코스 11.6 mM, L-글루타민 2 mM 및 페니실린 100 UI/ml/스트렙토마이신 100 μg/ml가 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM으로 구성된 분화 배양 배지 2 (표 3 참조)로 대체하였다. 후속하여 배지를 매 격일 마다 교체하였다. 2 내지 4일 이내에, 세포는 섬-유사 구조물의 구성화를 시작하는 것으로 예상되며, 14-18일 후에 최대 수에 도달하였다 (도 1).
HLSC 배양 배지
최종 농도 부피 (ml)
최종 부피 250
α-MEM 165
EBM 55
FBS 10% 25
페니실린 10000 UI/ml/스트렙토마이신 10 mg/ml 100 UI/ml/100 ug/ml 2.5
글루타민 200 mM 2 mM 2.5
HLSC 분화 배지 1
최종 농도 부피 (ml)
최종 부피 250
RPMI 1640 또는 DMEM 216.85
FBS 10% 25
페니실린/스트렙토마이신 100 UI/ml/100 ug/ml 2.5
글루타민 200 mM 2 mM 2.5
글루코스 1M 11.6 mM 2.9
프로타민 10 mg/ml 10 ug/ml 0.25
HLSC 분화 배지 2
최종 농도 부피 (ml)
최종 부피 250
RPMI 또는 DMEM 217.1
FBS 10% 25
페니실린/스트렙토마이신 100 UI/ml/100 ug/ml 2.5
글루타민 200 mM 2 mM 2.5
글루코스 1M 11.6 mM 2.9
수득된 결과는 첨부된 도면에서 묘사되며, 이의 내용은 본원에서 하기 간략하게 설명된다.
도 1: 기본 배양 배지 (A) 및 프로타민 (B-D)을 갖는 분화 배지에서의 배양 후 HLSC를 보여주는 대표적인 20x 현미경사진. 24h 후, 세포는 형태가 변화되며 크기 및 수 둘 모두가 점진적으로 증가되는 작은 클러스터를 형성하기 시작하였으며 (B), 이는 18일의 배양 기간 후 최대 수에 도달하였다 (C). (D) 18일의 배양 기간 후 섬-유사 구조물을 보여주는 40x 현미경사진. (E) 18일의 배양 후 25 cm3 배양 플라스크 당 섬-유사 구조물의 총 수를 보여주는 그래프. (F) 18일의 배양 후 섬-유사 구조물의 평균 ± SD 수를 나타내는 그래프 (n=10).
도 2-8: 14일의 배양 후 면역형광에 의해 섬-유사 구조물 특징 규명을 보여주는 대표적인 사진: 섬-유사 구조물은 PDX-1과 NgN3 (도 2), 인슐린과 글루카곤 (도 3), C-펩티드와 GLUT-2 (도 4), 소마토스타틴 (도 5), 그렐린과 PP (도 6), 콜라겐 IV (도 7)와 폰 빌레브란드 인자 (도 8) 둘 모두에 대해 양성적으로 염색된다.
도 9: 14일 배양 후에 섬-유사 구조물 분해 후 섬-유사 구조물 (트립신 1X)의 면역형광 특징 규명을 보여주는 대표적인 사진.
도 10: 임플란트 전 및 후 13일째에 비-당뇨병 SCID 마우스 (실선, CTRL), 스트렙토조토신-유발된 (5일 동안 55 mg/kg/day) 당뇨병 SCID 마우스 (점선, DM) 및 신피막 아래 HLSC 유래된 섬-유사 구조물 임플란트 (5000 IEQ/kg)를 수용한 스트렙토조토신-유발된 당뇨병 SCID 마우스(파선, DM+ILS)에서 혈당 및 인간 C-펩티드 수준 둘 모두를 보여주는 그래프. 당뇨병 마우스와 비교하여, 섬-유사 구조물 임플란트를 수용한 당뇨병 마우스는 혈당 수준이 현저하게 감소하였다. 이는 임플란트를 수용하지 않은 당뇨병 SCID 마우스 및 당뇨병이 없는 SCID 마우스 둘 모두에서 검출불가능한 것으로 유지된, 인간 C-펩티드의 수반되는 증가와 병행된다.
도 11: 48시간 동안 FBS 10% (F), FBS 10% + 글루코스 11.6 mM (FG) 또는 FBS 10% + 글루코스 11.6 mM + 프로타민 클로라이드 10 μg/ml (FGP)이 보충된 RPMI 또는 DMEM 기반 배지에서 HLSC 배양 후 섬-유사 구조물 (ILS) 형성을 보여주는 그래프.
도 12: FBS 10% + 글루코스 11.6 mM + 프로타민 클로라이드 10 μg/ml가 보충된 RPMI 기반 배지에서 14일 배양 후 HLSC로부터 유래된 섬-유사 구조물의 크기 분포 (A), 평균 ± SD 직경 (B) 및 IEQ/100 ILS (C)를 보여주는 그래프.
도 13: 글루코스는 섬-유사 구조 (ILS) 형성에 영향을 끼치지 않으나 (A), 유도된 내분비물 특징화 및 인슐린/글루카곤 발현에서 중요한 역할을 수행한다 (B). A. 다양한 글루코스 농도 (6, 11.6 및 28 mM)의 부재 또는 존재하에 프로타민 클로라이드 10 ug/ml (P)가 보충된 RPMI/DMEM에서 배양 (4일) 후 섬-유사 구조물 형성을 보여주는 대표적 사진 및 그래프. B. 글루코스 1 또는 25 mM를 갖는 RPMI-기반 배지에서 PDX-1, NgN3, 인슐린 및 글루카곤 발현을 보여주는 대표적인 사진.
도 14: 폴리-리신 분화 배지에서 세포 배양된 PDX-1, NgN3, GLUT-2, C-펩티드, 글루카곤 및 소마토스타틴의 발현을 보여주는 대표적인 사진.

Claims (20)

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  7. 다중-양이온 물질을 포함하는 제 1 분화 액체 세포 배양 배지에서 성체 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 다중-양이온 물질이 프로타민의 가용성 염을 포함하는, 구형의 췌장섬-유사 세포 구조물을 제조하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 다중-양이온 물질을 포함하는 제 1 분화 액체 세포 배양 배지에서 성체 줄기 세포를 배양하는 상기 단계가 2 내지 4 일의 기간 동안 수행되는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 7항에 있어서, 프로타민의 가용성 염이 프로타민 설페이트 또는 프로타민 하이드로클로라이드인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 프로타민 설페이트 또는 프로타민 하이드로클로라이드가 5 내지 20 mM의 범위 내에 포함되는 농도로 존재하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제 7항에 있어서, 다중-양이온 물질을 포함하는 제 1 분화 액체 세포 배양 배지를 다중-양이온 물질을 포함하지 않는 제 2 분화 액체 세포 배양 배지로 대체하고, 완전히 분화된 세포가 수득될 때까지 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 다중-양이온 물질을 포함하지 않는 제 2 분화 액체 세포 배양 배지에서 배양하는 단계가 적어도 2일의 기간 동안 수행되는 방법.
  15. 제 7항에 있어서, 성체 줄기 세포가 인간 간 줄기 세포인 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE058155T2 (hu) 2010-05-12 2022-07-28 Prokidney Bioaktív vesesejtek
WO2020035480A1 (en) 2018-08-16 2020-02-20 Unicyte Islet Ag Viable pancreatic islet-like cell structures and a method of preparing thereof
EP3816276A1 (en) 2019-10-31 2021-05-05 Unicyte Islet AG Viable pancreatic islet-like cell structures and a method of preparing thereof
CN113637630B (zh) * 2020-05-11 2024-03-29 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种胰岛样细胞团及其制法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517248A (zh) * 2011-12-30 2012-06-27 中日友好医院 一种体外诱导胰岛样结构形成的方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006135A1 (en) * 1988-01-11 1989-07-13 Amylin Corporation Treatment of type 2 diabetes mellitus
WO1998008934A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6129911A (en) 1998-07-10 2000-10-10 Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner Liver stem cell
DK2048228T3 (en) 1999-01-19 2016-05-09 Univ North Carolina Human liver progenitors
US7456017B2 (en) 1999-10-01 2008-11-25 University Of North Carolina At Chapel Hill Processes for clonal growth of hepatic progenitor cells
WO2001039784A1 (en) * 1999-12-06 2001-06-07 The General Hospital Corporation Pancreatic stem cells and their use in transplantation
DE60229242D1 (de) 2001-05-16 2008-11-20 Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad Verfahren zum nachweis und zur trennung undifferenzierter leberzellen mit dlk
EP1264879A1 (en) * 2001-06-08 2002-12-11 Leadd B.V. Isolation of a cluster of cells from an isolated organ using magnetic particle
JP2005506074A (ja) 2001-10-18 2005-03-03 イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換
GB2399823B (en) * 2001-12-07 2006-02-15 Geron Corp Islet cells from primate pluripotent stem cells
US20030162290A1 (en) * 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US7413897B2 (en) 2002-03-15 2008-08-19 University Of North Carolina At Chapel Hill Primitive and proximal hepatic stem cells
CN1536075A (zh) * 2003-04-09 2004-10-13 中国人民解放军军事医学科学院野战输 一种诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法
AU2004262864A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-17 Unilever Plc Food product comprising phytosterols
US20050074876A1 (en) 2003-10-03 2005-04-07 Inserm Bipotential liver cell lines from wild-type mammalian liver tissue
US7485434B2 (en) * 2005-04-04 2009-02-03 The Salk Institute For Biological Studies Method for screening compounds for those that modulate transducers of regulated CREB activity
US7507581B2 (en) * 2005-04-05 2009-03-24 Synthecon, Inc. Inhibition of pancreatic islet aggregation
WO2006126219A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Fresenius Medical Care Deutschland G.M.B.H. Liver progenitor cells
WO2007039986A1 (ja) * 2005-10-05 2007-04-12 Osaka University 脂肪組織由来細胞から膵内分泌細胞を得る方法
CN101356264B (zh) * 2005-12-21 2014-05-14 鲁汶大学 分离的肝脏干细胞
US7716503B2 (en) 2006-12-14 2010-05-11 Inventec Corporation Extension card incorporating power management device
JP5196522B2 (ja) * 2007-06-27 2013-05-15 国立大学法人東北大学 移植用膵島の評価方法
ES2409180T3 (es) * 2007-10-15 2013-06-25 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Uso de microvesículas (MVS), para preparar un medicamento que tiene actividad de adyuvante en el trasplante de células endoteliales, particularmente en el tratamiento de la diabetes mediante el trasplante de islotes pancreáticos,y método relacionado
GB0800524D0 (en) 2008-01-14 2008-02-20 Univ Brighton Cell culture system
WO2009116087A1 (en) * 2008-03-15 2009-09-24 Smt. G R Doshi And Smt. K M Mehta Institute Of Kidney Diseases And Research Centre Human adipose derived insulin making mesenchymal stem cells for treating diabetes mellitus
CN101550406B (zh) 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
CN101603027A (zh) * 2008-06-12 2009-12-16 西北农林科技大学 体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
AU2010211428B2 (en) * 2009-02-03 2015-09-03 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells.
CN102433300A (zh) * 2011-11-25 2012-05-02 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517248A (zh) * 2011-12-30 2012-06-27 中日友好医院 一种体外诱导胰岛样结构形成的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11453863B2 (en) 2022-09-27
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