ES2967942T3 - Generación de células beta funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas - Google Patents

Generación de células beta funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a la generación de células beta funcionales a partir de progenitores endocrinos derivados de células madre pluripotentes humanas. La presente invención también se refiere a células beta funcionales producidas mediante dichos métodos y usos de dichas células beta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Generación de células beta funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para generar células beta maduras funcionales a partir de células madre pluripotentes humanas derivadas de progenitoras endocrinas.
Antecedentes de la invención
El trasplante de células de los islotes se ha usado para tratar pacientes diabéticos de tipo 1 que muestran una homeostasis superior de la glucosa en comparación con la terapia de insulina, pero esta terapia se encuentra limitada por las donaciones de órganos. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tales como células madre embrionarias humanas (hESC) pueden proliferar infinitamente y diferenciarse en muchos tipos de células, que incluyen células beta (BC) y pueden abordar la escasez de islotes donantes. Los protocolos para diferenciar hPSC en endodermo definitivo (DE), células de endodermo pancreático (PE) y progenitoras endocrinas (EP) in vitro se han proporcionado en los documentos WO2012/175633, WO2014/033322 y WO2015/028614 respectivamente. Es difícil fabricar BC secretoras de insulina que respondan a la glucosa in vitro a partir de hPSC. La mayoría de los protocolos resultan en células productoras de insulina que fallan en recapitular el fenotipo de las BC ya que también coexpresan otras hormonas tal como el glucagón y no responden a la estimulación con glucosa.
Rezania, A. y otros “Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells” Nature Biotechnology 32, 1121-1133 (2014) y Pagliuca, F.W. y otros “Generation of Functional Human Pancreatic p Cells In Vitro” Cell 159(2), 428-439, 9 de octubre de 2014, reportó la diferenciación in vitro de hESC en células secretoras de insulina. Mediante el uso de estudios de incubación estática, las células de ambos grupos fueron sensibles a la estimulación con glucosa, lo que muestra un aumento de aproximadamente 2 veces en la producción de insulina después de la estimulación con glucosa. Sin embargo, esta respuesta varió cualitativa y cuantitativamente a partir de la de las células beta adultas primarias. En comparación, se reporta que el índice de estimulación de islotes humanos es de dos a diez o más alto (Shapiro, J. A. M. y otros “Islet Transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen” New England Journal of Medicine 343, 230-238, 27 de julio (2000).
Las BC derivadas de células madre reportadas también fallaron en mostrar una respuesta de insulina a la glucosa en un ensayo dinámico de perfusión de células y son, por tanto, funcionalmente inmaduros con relación a las BC humanas primarias.
Se desconoce un protocolo eficiente para fabricar BC maduras funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de hPSC que puedan responder a la glucosa en un ensayo dinámico de perfusión celular. Es fundamental mejorar los protocolos actuales para generar BC maduras completamente funcionales para un producto celular más consistente similar a los islotes humanos para obtener un resultado predecible después del trasplante, así como también para propósitos de detección in vitro.
Resumen
La presente invención se refiere a métodos mejorados para la generación de células beta maduras funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas. La presente invención también se refiere a células beta completamente diferenciadas que responden a la glucosa. La presente invención se refiere adicionalmente a células beta maduras funcionales obtenibles por los métodos de la presente invención. La presente invención se refiere adicionalmente al uso médico de dichas células entre otros en el tratamiento de la diabetes tipo I. La presente invención también puede resolver problemas adicionales que serán evidentes a partir de la descripción de las modalidades ilustrativas. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el enfoque de detección donde las células madre embrionarias humanas indiferenciadas (hESC) se diferenciaron en Endodermo Definitivo (DE) y se volvieron a sembrar en matraces T75, donde las células se diferenciaron adicionalmente en Endodermo Pancreático (PE) y Progenitor Endocrino (EP). La etapa 1 de selección de células beta (BC) se inició en la etapa EP y continuó por 4-7 días, y se analizó mediante monitoreo qlCC y/o citometría de flujo de número de células NKX6.1+/INS+/GCG-. La etapa 2 de selección de BC se inició al final de la etapa 1 de selección de BC y continuó por un período de 3-7 días en cultivos en suspensión 3D mediante la disociación en células individuales al final de la etapa 1 de BC y se reagruparon a conglomerados en el agitador orbital a 50 rpm. Las células se analizaron mediante GSIS estática y/o dinámica, contenido de proteínas INS, ICC, y qPCR.
La Figura 2 muestra el efecto de los compuestos sobre la expresión de INS+/NKX6.1+/GCG- en el día 4 de la etapa 1 de BC que se midió mediante citometría de flujo (FC).
La Figura 3 muestra el efecto aditivo cuando se combinan impulsos durante la etapa 1 de BC en el número de células INS+/NKX6.1+.
La Figura 4 muestra estudios de temporización del método de la etapa 1 de BC.
La Figura 5 muestra el efecto de los compuestos que se añaden por 7 días durante el método de la etapa 2 de BC en GSIS estática.
La Figura 6 A muestra la presencia de células secretoras de insulina que responden a la glucosa en el día 3 de la etapa 2 de BC.
La Figura 6 B muestra la presencia de células secretoras de insulina que responden a la glucosa en el día 7 de la etapa 2 de BC.
La Figura 7 muestra la funcionalidad de células beta derivadas de hESC demostrado por la liberación de insulina mediada por glucosa dependiente de la dosis y la sulfonilurea de manera dinámica.
La Figura 8 muestra células beta funcionales inducidas por un protocolo robusto a partir de líneas celulares pluripotentes independientes.
La Figura 9 muestra genes específicos de células beta expresados en células beta derivadas de células madre en el día 9 de la etapa 2 de BC.
La Figura 10 muestra el enriquecimiento de marcadores de células beta mediante la clasificación de células INS+/NKX6.+.
La Figura 11 muestra que los ratones diabéticos trasplantados con células beta derivadas de células madre que muestran una rápida disminución de la glucosa en sangre y una reversión de la diabetes.
La Figura 12 muestra la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) de células trasplantadas.
La Figura 13 muestra que las células beta derivadas de células madre protegen frente a la hiperglicemia después del tratamiento con estreptozotocina.
La Figura 14 muestra altos niveles de péptido-C humano circulante en ratones trasplantados.
Descripción
Los inventores de la presente invención han realizado extensas selecciones de molécula pequeña e identificado un método novedoso y simple de dos etapas que genera células beta (BC) maduras funcionales a partir de la etapa progenitora endocrina derivada de células madre pluripotentes humanas. La primera etapa del protocolo (etapa 1 de BC) induce una alta fracción de células doblemente positivas para INS+ y NKX6.1+ y solo pocas células positivas para GCG. La segunda etapa del protocolo (etapa 2 de BC) genera BC maduro funcional que responde fuertemente a desafíos repetidos de glucosain vitro.Es importante destacar que las células BC derivadas de hPSC responden a desafíos repetidos de glucosa /- Exendina-4 en un ensayo de perfusión dinámico. El BC maduro funcional resultante también responde a aumento en los niveles de glucosain vivo3 semanas después del trasplante a la cápsula renal de ratones no diabéticos.
Los inventores de la presente invención han descubierto que la administración de ácido gamma-aminobutírico (GABA)in vivodespués del trasplante de células puede potenciar potencialmente el efecto funcional de BC trasplantadas. La población de BC completamente funcional resultante se puede usar como un producto de BC en basein vitropara estudiar la función de BC humanas, compuestos de selección para regular la secreción de insulina, el procesamiento de proteínas de insulina, la secreción de insulina y mecanismo, estudios GSIS, señalización del influjo de calcio, destrucción autoinmunitaria de BC, y diferenciación trans de BC. A lo largo de esta solicitud los términos método o protocolo o proceso se pueden usar indistintamente.
En una modalidad, las células obtenibles por el método de acuerdo con la invención son células productoras de insulina, opcionalmente junto con células diferenciadas hacia células productoras de glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y/o grelina. Como se usa en la presente descripción, "células productoras de insulina" se refiere a células que producen y almacenan o secretan cantidades detectables de insulina. Las "células productoras de insulina" pueden ser células individuales o colecciones de células.
En otra modalidad, la población de células que comprende las células pancreáticas se obtiene a partir de una población de células somáticas. En algunos aspectos, la población de células somáticas se ha inducido para diferenciarse en una célula madre tipo embrionaria (ES, por ejemplo, una pluripotente). Tales células diferenciadas también se denominan células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
En otra modalidad, la población de células que comprende células pancreáticas se obtiene a partir de células madre embrionarias (ES, por ejemplo, pluripotentes). En algunos aspectos, la población de células que comprende células pancreáticas son células pluripotentes tales como células tipo ES.
En otra modalidad, la población de células que comprende células pancreáticas son células madre diferenciadas embrionarias (ES o pluripotentes). La diferenciación tiene lugar en cuerpos embrionarios y/o en cultivos celulares en monocapa o sus combinaciones.
En otra modalidad, la población de células es una población de células madre. En algunos aspectos, la población de células es una población de células madre diferenciadas al linaje endocrino pancreático.
Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad en el nivel de célula individual tanto para autorrenovarse como diferenciarse para producir células de la progenie, que incluyen células progenitoras autorrenovables, progenitoras no renovables y finalmente diferenciadas. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarsein vitroen células funcionales de diversos linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como también para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y para contribuir sustancialmente a la mayoría, sino a todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos.
Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotentes, que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todas dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico en particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitoras oligopotentes restringidas a las células sanguíneas y todos los tipos de células y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes y (5) unipotentes, que significa que son capaces de dar lugar a un linaje de células individuales (por ejemplo, células madre espermatogénicas).
Como se usa en la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación" se refiere a un proceso donde las células progresan de un estado indiferenciado a un estado diferenciado, de un estado inmaduro a un estado menos inmaduro o de un estado inmaduro a un estado maduro. Por ejemplo, las células pancreáticas embrionarias indiferenciadas tempranas son capaces de proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1, NKX6.1, y PTF1a. Las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y sí secretan altos niveles de hormonas endocrinas pancreáticas o enzimas digestivas. Por ejemplo, las células beta completamente diferenciadas secretan insulina a altos niveles en respuesta a la glucosa. Los cambios en la interacción y maduración celular ocurren a medida que las células pierden marcadores de células indiferenciadas o ganan marcadores de células diferenciadas. La pérdida o ganancia de un marcador único puede indicar que una célula ha "madurado o diferenciado completamente." El término "factor de diferenciación" se refiere a un compuesto que se añade a las células pancreáticas para potenciar su diferenciación a células endocrinas maduras que también contienen células beta productoras de insulina. Los factores de diferenciación ilustrativos incluyen factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de queratinocitos, exendina-4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento similar a insulina 1, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y péptido similar a glucagón 1. En algunos aspectos, la diferenciación de las células comprende cultivar las células en un medio que comprende uno o más factores de diferenciación.
Como se usa en la presente descripción, "células madre pluripotentes humanas" (hPSC) se refiere a células que se pueden derivar de cualquier fuente y que son capaces, bajo condiciones apropiadas, de producir progenie humana de diferentes tipos de células que son derivadas de las 3 capas germinales (endodermo, mesodermo, y ectodermo). hPSC puede tener la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad y/o la capacidad para formar células identificables de las tres capas germinales en cultivo de tejidos. En la definición de células madre pluripotentes humanas se incluyen células embrionarias de varios tipos que incluyen células madre derivadas de blastocisto humano (hBS) que en 30 publicaciones con frecuencia se denominan como células madre embrionarias humanas (hES), (ver, por ejemplo, Thomson y otros (1998), Heins y otros (2004), así como también células madre pluripotentes inducidas (ver, por ejemplo, Yu y otros. (2007); Takahashi y otros. (2007)). Los varios métodos y otras modalidades que se describen en la presente descripción pueden requerir o utilizar hPSC de una variedad de fuentes, con la condición de que las células no se obtengan por medio de un proceso en el que se destruyan embriones humanos. El hPSC adecuado se puede obtener a partir de líneas celulares establecidas y/o células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS).
Como se usa en la presente descripción, “hiPSC” se refiere a células madre pluripotentes humanas inducidas.
Como se usa en la presente descripción, el término “célula madre derivada de blastocito” se denomina célula BS, y la forma humana se denomina “células hBS”. En la bibliografía las células se denominan con frecuencia células madre embrionarias, y más específicamente, células madre embrionarias humanas (hESC). Sin embargo, se concibe adicionalmente que cualquier célula madre pluripotente humana se puede usar en la presente invención, que incluye células adultas diferenciadas que se reprograman a células pluripotentes mediante, por ejemplo, el tratamiento de células adultas con determinados factores de transcripción, tales como OCT4, SOX2, NANOG, y LIN28 como se describe en Yu, y otros (2007); Takahashi y otros (2007) y Yu y otros (2009).
El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) que se proporciona en la presente descripción, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de cualquier otra manera. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva se debe interpretar como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención. Lista de abreviaturas
AA: Activina A
BC: Células Beta
bFGF: factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF2)
D'Am: Protocolo D'Amour (Kroon y otros, 2008)
DAPT: Éster de N-[(3,5-Difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil]glicina-1,1-dimetiletilo
DE: endodermo definitivo
DZNep: 3-Deazaneplanocina A
EP: Progenitor Endocrino
FC: Citometría de flujo
GABA: ácido gamma-aminobutírico
GSIS: secreción de insulina estimulada con glucosa
hESC: células madre embrionarias humanas
hIPSC: células pluripotentes inducidas humanas
hPSC: células madre pluripotentes humanas
KOSR: reemplazo de suero inactivado
PE: Endodermo Pancreático
ARN: ácido ribonucleico
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PS: estriada primitiva
Ejemplos
En general, el proceso de diferenciación de hPSC a células beta maduras funcionales pasa a través de varias etapas. Un método ilustrativo para generar células beta funcionales a partir de hPSC in vitro se describe en la Figura 1.
Ejemplo de Referencia 1: Preparación de células progenitoras endocrinas
Las hESC (SA121) se cultivaron en medio DEF (Cellectis) suplementado con 30 ng/mlbFGF (Peprotech #100-18B) y 10 ng/ml de nogina (Peprotech #120-10C).
Para los cultivos adherentes, las hESC se diferenciaron en DE en matraces T75 mediante el uso de un protocolo en base a Chir99021 y Activina A en el documento WO2012/175633. El DE se tripsinizó mediante el uso de Tryple Select (Invitrogen #12563-029) y se volvieron a sembrar como células individuales en RPMI1640 suplementado con 100 ng/ml de Activina A (Peprotech #120-14E), B27 al 2 % (Invitrogen #17504-044) y PEST al 0,1 % (Gibco#15140) en matraces T75 a 200 K/cm2. Las células de DE se dejaron unir y diferenciar en PE mediante el uso de un protocolo en base a LDN, AM508 en el documento WO 2014/033322 seguido de un protocolo EP de cuatro días en el documento WO2015/028614.
Para producir un gran número de células beta, se utilizó un sistema de cultivo escalable en base a suspensión mediante la diferenciación de conglomerados de hESC en DE en matraces agitadores en incubadoras Multitron Standard (Infors) como cultivos en suspensión (1 millón/ml) a 70 RPM mediante el uso de un protocolo en base a Chir99021 y Activina A en el documento WO2012/175633 sin que requiera de una etapa para volverlo a sembrar. Las células de DE se diferenciaron adicionalmente en PE mediante el uso de un protocolo en base a en LDN, AM508 en el documento WO 2014/033322 con la siguiente ligera modificación: No se añade LDN en el día 4-10 de la PE. A la generación de PE le siguió un protocolo EP de cuatro días WO2015/028614.
Ejemplo 2: Detección de factores que inducen la coexpresión de INS+/NKX6.1+ durante la etapa 1 de BC Como una primera etapa hacia la generación de células beta maduras completamente funcionales, se seleccionaron los factores para generar números máximos de células INS+/NKX6.1+ inmaduras (selección de la etapa 1 de BC). La selección de la etapa 1 de BC se inició en la etapa EP mediante el uso de una biblioteca de inhibidores de cinasas, reguladores epigenéticos, redox y lípidos bioactivos suplementados con algunos compuestos en base a publicaciones (en total 650 compuestos de interés) que se añaden sobre RPMI1640 B27 al 2 % Nicotinamida 10mM.
Los compuestos se seleccionaron por su capacidad para inducir BC inmaduras doblemente positivas para NKX6.1 y INS+ y pocas células positivas para GCG dentro de un período de 7 días. El cambio del medio se realizó diariamente. Las células se fijaron el día 4 y el día 7 de la etapa 1 de BC y se analizaron para determinar la expresión de INS NKX6.1 y GCG mediante el uso de citometría de flujo (ver Tabla 1 y Figura 2). Brevemente, las células se dispersaron en una suspensión de células individuales mediante la incubación con TrypLE Express a 37° C por 10 min. Las células se resuspendieron en paraformaldehído al 4 %, se lavaron en PBS seguido de la incubación con anticuerpos primarios durante toda la noche y entonces con anticuerpos secundarios por 1 hora. Las hPSC diferenciadas coexpresaron el péptido-C+/NKX6-1+ con pocas células que expresan la hormona celular a, glucagón (Figura 2). Cuando se cuantifica mediante citometría de flujo, el 48 % de las células coexpresaron péptido-C+/NKX6-1, más de lo que se reportó previamente con células beta derivadas de células madre (referencia Melton, Kieffer).
Tabla 1. Análisis FC del método de la etapa 1 de BC en el día 7 de BC
#1:DZNEP 1uM Alk5i 10 |jM 10 ug/ml de heparina
Los pulsos identificados en una selección primaria se combinaron entonces individualmente y se añadieron sobre el medio de la etapa 1 de BC (ver Tabla 2 y Figura 3). El tiempo de los estudios reveló que la etapa 1 de BC tiene una duración óptima de 4-7 días en base a la expresión de ARNm de Ins y Gcg (ver Figura 4).
Tabla 2: muestra los compuestos de impacto en el medio de la etapa 1 de BC
Ejemplo 3: Generación de células beta secretoras de insulina sensibles a la glucosa a partir de la etapa 1 de BC La característica funcional clave de una célula beta madura completamente funcional es su capacidad para realizar la secreción de insulina estimulada con glucosa (GSIS). Se seleccionaron los factores en la etapa 2 de BC que pudieran inducir células beta funcionales a partir de las células INS+/NKX6.1+ inmaduras a partir de la etapa 1 de BC.
La etapa 2 de selección de BC se realizó en cultivos en suspensión. Para los cultivos adherentes, las células en matraces T75 se tripsinizaron al final de la etapa 1 de BC mediante el uso de Tryple Select y se transfirieron las células a placas Petri de 9 cm de baja unión en suspensión con medio RPMI1640 (Gibco#61870) que contenía KOSR al 12 % (ThermoFisher#10828028) y PEST al 0,1 %, Gibco#15140.
Los efectos de los compuestos seleccionados se probaron entonces por un período de 7 días para la inducción de células que responden a la glucosa en una configuración de GSIS estática (ver Figura 5). Brevemente, los conglomerados celulares se muestrearon e incubaron durante toda la noche en medio de glucosa 2,8 mM para eliminar la insulina residual. Los conglomerados se lavaron dos veces en tampón Krebs, se incubaron en tampón Krebs 2,8 mM por 30 min, y se recolectó el sobrenadante. Entonces los conglomerados se incubaron en tampón Krebs de glucosa 16 mM por 30 min y se recolectó el sobrenadante. Esta secuencia se repitió. Finalmente, los conglomerados se incubaron en tampón Krebs que contenía glucosa 2,8 mM por 30 min y entonces se recolectó el sobrenadante. Las muestras de sobrenadante que contenían insulina secretada se procesaron mediante el uso de ELISA de insulina humana (Mercodia).
Los impulsos que se identificaron en una selección primaria entonces se combinaron individualmente y se añadieron sobre el medio KOSR al 12 % para generar el protocolo óptimo de la etapa 2 de BC de 7 días (ver Tabla 3).
Tabla 3: muestra los compuestos de impacto en el medio de la etapa 2 de BC
Ejemplo 4: Ensayo de perfusión para evaluar la secreción dinámica de insulina humana in vitro
Las células beta maduras se definen funcionalmente por su rápida respuesta a la glucosa elevada. La secreción de insulina humana mediante células beta al final de la etapa 2 de BC se midió como respuestas repetidas a la glucosa 20 mM ± 1 |<j>M de exendina-4 o ± del compuesto antidiabético de sulfonilurea Tolbutamida dentro de un sistema de perfusión.
Brevemente, los grupos de 300 conglomerados de conglomerados celulares derivados de hESC o hiPSC seleccionados a mano se suspendieron con perlas (Bio-Rad #150-4124) en cámaras plásticas del SISTEMA DE PERFUSIÓN Biorep (Biorep # PERI-4.2). Bajo condiciones controladas de temperatura y CO2, las células se perfundieron a 0,5 ml min-1 con un tampón de Krebs. Antes de la recolección de la muestra, las células se equilibraron bajo condiciones basales (glucosa 2 mM) por 1 h. Durante la perfusión, las células se expusieron a desafíos repetidos con glucosa 20 mM ± 1<j>M de exendina-4 o ± Tolbutamida 100<j>M. Al final de la perfusión, las células se expusieron a agentes de elevación de cAMP por encima de la glucosa 20 mM. La secreción de insulina se midió mediante un ELISA de insulina humana (Mercodia).
Mediante el análisis de perfusión, nuestras células beta derivadas de células madre exhibieron una liberación rápida y robusta de insulina con una 1ra y 2da fase de secreción de insulina que se sincronizó altamente con los cambios en las concentraciones de glucosa (ver Figura 6). El análogo de GLP-1 exendina-4 aumentó el nivel de secreción de insulina en las células beta derivadas de hPSC. Es importante destacar que se observó la presencia de células secretoras de insulina que responden a la glucosa por al menos 4 díasin vitrocomo se midió en el día 3 (Figura 6A) y el día 7 (Figura 6B) de la etapa 2 de BC.
Otro ejemplo de análisis de perifusión de nuestras células beta derivadas de células madre en el día 7 de la etapa 2 de BC demostró un efecto aditivo significativo de la sulfonilurea tolbutamida sobre la secreción de insulina (Figura 7). La robustez del protocolo se demuestra mediante la inducción de células beta funcionales a partir de líneas celulares pluripotentes independientes (ver Figura 8). Estos datos demuestran colectivamente la superioridad del protocolo para generar células beta derivadas de células madre que muestran la dinámica de liberación de insulina estimulada por glucosa que se midió mediante la perfusión en comparación con los informes anteriores (Rezania, 2014; Paglucia, 2014 y la reseña de Johnson-J, 2016 Diabetologia).
Ejemplo 5: El análisis de expresión génica mostró un alto nivel de similitudes de las células beta derivadas de células madre con el material de islotes humanos
Se recolectaron conglomerados de células diferenciados en el día 7 de BC de la etapa 2 o islotes humanos y se purificó ARN mediante el uso del estuche de RNeasy de Qiagen (número de catálogo/ID: 74134). La calidad se evaluó mediante el uso del estuche de ARN 6000 Nano y el instrumento Bianalyser 2100 (Agilent). 100 ng de ARN se sometieron a un ensayo de nCounter de acuerdo con las instrucciones de la tecnología Nanostring. La Figura 9 muestra el perfil de expresión de genes asociados a células beta de islotes humanos y células beta generadas a partir de hiPSC y dos líneas hESC diferentes. El análisis de expresión génica mostró que las células beta derivadas de células madre tenían una semejanza molecular cercana a los islotes humanos.
El análisis de expresión génica adicional de las células INS+/NKX6.1+ derivadas de células madre específicas se realizó mediante clasificación de células FACS. Antes de la clasificación en el instrumento BD FACSARIA fusionTM, los conglomerados celulares se disociaron y tiñeron para la separación de las células vivas y muertas mediante el uso de un colorante IR cercano (Thermo Scientific). Después de la fijación y la permeabilización, las células se tiñeron mediante el uso de los marcadores intracelulares NKX6.1 y el péptido-C. El ARN se purificó mediante el uso del estuche de FFPE RNeasy (QIAGEN) y la calidad se evaluó mediante el uso del estuche de ARN 6000 Nano y el instrumento Bianalyser 2100 (Agilent). La Figura 10 muestra el enriquecimiento de genes de madurez de células beta clave después de la clasificación de células para células doblemente positivas NKX6.1/CPEP. Los datos de nanocadena se normalizaron a la población celular sin clasificar.
Ejemplo 6: Células beta derivadas de células madre a partir de la función de la etapa 2 después del trasplante Para evaluar la funcionalidad in vivo, se trasplantaron células beta derivadas de células madre del día 3-10 de la etapa 2 de BC a un modelo de diabetes de ratón inducido por estreptozotocina. En resumen, la diabetes se induce en ratones scid-beige inmunodeprimidos (Taconic) mediante el uso de dosis múltiples bajas (5x70 mg/kg) de estreptozotocina (STZ), los ratones ayunan 4 horas antes de la dosificación de STZ. Los ratones se monitorean durante las siguientes semanas con respecto a la glucosa en sangre, el peso corporal y la HbA1c. La diabetes se considera cuando la glucosa en sangre se encuentra constantemente por encima de 16 mM.
En completa anestesia y analgesia, los ratones diabéticos se trasplantan con 5 x 106 células beta derivadas de células madre embrionarias humanas (población sin clasificar) bajo la cápsula renal. El riñón se expone a través de una pequeña incisión a través de la piel y el músculo del lado trasero izquierdo del animal, una bolsa entre el parénquima del riñón y la cápsula se crea cuando se inyectan los grupos celulares. La pared abdominal y la piel se cierran y se permite que el ratón se recupere.
La función de las células se monitorea durante las próximas semanas con respecto a la glucosa en sangre, el peso corporal, la HbA1c y la secreción de péptido-C/insulina humana. Nuestras células beta derivadas de células madre resultaron en una rápida reversión de la diabetes dentro de las dos primeras semanas después del trasplante (Figura 11), más rápidamente que los reportes anteriores (Rezania, 2014). Es importante destacar que todos los ratones con menos de 85 % de peso corporal recibieron inyecciones diarias con insulina, es decir, el grupo control diabético no trasplantado. El desafío in vivo de las células trasplantadas con glucosa demostró la funcionalidad in vivo de nuestras células beta derivadas de células madre con mejor aclaramiento de glucosa que los ratones control y un aumento del nivel de péptido-C humano circulante dentro de los 60 minutos de la inyección de glucosa (Figura 12). En otro modelo de diabetes, se trasplantaron 5 millones de células diferenciadas a la cápsula renal de ratones SCID/Beige no diabéticos. Estos ratones se trataron entonces con estreptozotocina 8 semanas después del trasplante. La Figura 13 demuestra que los ratones trasplantados previamente se encontraban protegidos de la hiperglicemia posterior a la administración de estreptozotocina frente a los ratones control no trasplantes, mientras que la eliminación del injerto resultó en una rápida hiperglicemia en los ratones (ver la Figura 13). Se midieron altos niveles de péptido-C humano circulante en todos los ratones trasplantados desde el primer punto de datos y hasta el final del estudio (ver Figura 14).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la generación de células beta maduras funcionales a partir de progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas que comprende la etapa de (1) cultivar las células progenitoras endocrinas derivadas de células madre en un medio que comprende el inhibidor de histona metiltransferasa EZH2, el inhibidor de la vía de señalización de TGF-beta, heparina y nicotinamida en medio basal, para obtener células beta inmaduras doblemente positivas para INS+ y NKX6.1+.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de la histona metiltransferasa EZH2 es 3-Deazaneplanocina A (DZNep).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de la vía de señalización de TGF-beta es Alk5iII.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa (1) en combinación con uno o más agentes adicionales seleccionados del grupo que consiste en inhibidor de gamma-secretasa, agentes elevadores de cAMP, activador de la vía de señalización de la hormona tiroidea y sus combinaciones.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de gamma-secretasa es DAPT.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el agente elevador de cAMP es dbcAMP.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el activador de la vía de señalización de la hormona tiroidea es T3.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el agente adicional es DAPT en combinación con T3 o dbcAMP.
9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células progenitoras endocrinas derivadas de células madre se cultivan en la etapa (1) durante 1-4 días.
10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa (2) de cultivar células beta obtenidas en la etapa (1) con GABA, en combinación con uno o más agentes adicionales.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el agente adicional es Alk5iII.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el agente adicional es T3.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el agente adicional Alk5iII se encuentra en combinación con T3.
14. Una composición de cultivo celular que comprende:
- células progenitoras endocrinas derivadas de células madre pluripotentes humanas y/o células beta inmaduras doblemente positivas para INS+ y NKX6.1
- un medio de cultivo celular como se define en la etapa 1 del método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8.
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