CN113069440A - 甲状腺素的新的应用、培养多能干细胞的方法和培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物新应用的技术领域,具体而言,涉及甲状腺素的新的应用、培养多能干细胞的方法和培养基。甲状腺素在制备治疗胚胎发育迟缓或发育不全的药物中的应用。甲状腺素可以促进胚胎发育,继而可以制备治疗胚胎发育迟缓或者胚胎发育不全的药物,也可以提升多能干细胞的生长速率、稳定性、代谢水平和分化等,继而可以用于制备实现上述功效的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及药物新应用的技术领域,具体而言,涉及甲状腺素的新的应用、培养多能干细胞的方法和培养基。
背景技术
人多能干细胞(hPSCs)具有向所有细胞类型分化的潜能,对研究人类胚胎发育过程研究,疾病模型研究,药物筛选及细胞治疗中有重要作用。传统人多能干细胞的培养技术包括小规模平板贴壁培养及大规模悬浮培养。对于人多能干细胞平板贴壁培养,细胞扩增速度快,但是由于表面限制,在高密度培养下细胞生长及存活受到抑制,同时不适合大规模工业化细胞培养,大规模细胞培养往往采用细胞悬浮培养技术。在细胞悬浮培养的过程中,细胞生长速度远远慢于贴壁生长的细胞。如何在hPSCs高密度培养过程中提高细胞存活,以及加速大规模悬浮培养过程中的生长速度将成为关键。
此外,甲状腺素在胚胎发育早期对胚胎着床及早期发育过程存在至关重要作用,甲状腺素已经广泛存在于多用含有血清的培养基中,然而甲状腺素在这些培养基中对细胞的影响却鲜有研究。因此研究甲状腺素对hPSCs的生长及分化的影响对改进细胞培养基,同时研究甲状腺素功能有重要意义。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供甲状腺素的新的应用、培养多能干细胞的方法和培养基。本发明提供一种甲状腺素的新的应用,其可以促进胚胎发育,继而可以制备治疗胚胎发育迟缓或者胚胎发育不全的药物,也可以提升多能干细胞的生长速率、稳定性、代谢水平和分化等,继而可以用于制备实现上述功效的试剂。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供一种甲状腺素在制备治疗胚胎发育迟缓或发育不全的药物中的应用。甲状腺素可以促进早期胚胎发育,促进胚外层细胞的分化,继而可以用于制备治疗胚胎发育不全或者胚胎发育迟缓的药物,即此应用中的药物是用于疾病的治疗。
第二方面,本发明提供一种甲状腺素在制备以下任意一种试剂中的应用;
(1)促进多能干细胞的生长速率;
(2)促进多能干细胞的稳定性;
(3)促进多能干细胞的代谢水平;
(4)促进多能干细胞的定向分化。
上述第二方面涉及的试剂可以不作为药物使用,而作为实验过程中采用的试剂,例如,新药研发过程中的细胞实验采用的试剂或者药物的理论(包括药物作用机理以及毒副作用等)研究过程中采用的调控多能干细胞的调控试剂。当其不作为药物使用时,则并不限定必须对应相关的疾病,而可以作为试验过程是实验试剂应用。
在可选的实施方式中,促进人多能干细胞的稳定性的试剂包括提升多能干细胞在传代过程中的存活率的试剂;
优选地,促进多能干细胞的代谢水平的试剂包括提升线粒体活性的试剂和提高细胞糖酵解能力的试剂;
优选地,促进多能干细胞的定向分化包括促进多能干细胞向胚胎外层分化。
在可选的实施方式中,促进多能干细胞的分化包括促进胚外层标记基因的表达的试剂、促进BMP4诱导的胚外层的分化的试剂、促进CGB的表达的试剂和促进CGB阳性细胞的比例的试剂中的至少一种;
优选地,胚外层标记基因包括CGA、CGB、GATA2、GCM1和TROP2中的至少一种。
第三方面,本发明提供一种用于培养多能干细胞的培养基,其包括甲状腺素和基础培养基体系。
在可选的实施方式中,所述基础培养基体系为E8培养基;具体地,E8的成分包括DMEM/F12,L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l),sodium selenium(14μg/l),FGF2(100ng/mL),insulin(19.4ug/ml),NaHCO3(543ug/ml)and transferrin(10.7mu/ml)和TGFβ1(2ng/ml)。
优选地,所述基础培养基体系包括含有FGF2的基础培养基,FGF2在基础培养基中的含量为100ng/ml。
在可选的实施方式中,添加的甲状腺素的浓度为30uM;
优选地,甲状腺素在培养基中的浓度为5-500nM,优选地,甲状腺素在培养基中的浓度为500nM。
第四方面,本发明提供一种培养多能干细胞的方法,包括,在基础培养基体系内加入甲状腺素进行培养。
在可选的实施方式中,培养包括正常贴壁培养、悬浮培养或高密度培养,此处的高密度培养是密度为90%以上的培养
在可选的实施方式中,所述甲状腺素为甲状腺素T3。
本发明具有以下有益效果:本发明提供一种甲状腺素的新的应用,其可以促进胚胎发育,继而可以制备治疗胚胎发育迟缓或者胚胎发育不全的药物,也可以提升多能干细胞的生长速率、稳定性、代谢水平和分化等,继而可以用于制备实现上述功效的试剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的检测结果图;
图2为本发明实验例2提供的检测结果图;
图3为本发明实验例3提供的检测结果图;
图4为本发明实验例4提供的检测结果图;
图5本发明实验例5提供的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供甲状腺素新的应用,具体地,发明人发现甲状腺素可以促进早期胚胎发育,促进胚外层细胞的分化,继而可以用于制备治疗胚胎发育不全或者胚胎发育迟缓的药物。具体地,可以促进早期胚胎发育,促进胚外层细胞的分化。
同时,甲状腺素还可以提升多能干细胞的生长速率、稳定性、代谢水平和分化等,继而可以在培养多能干细胞时,提升其存活率,使得多能干细胞能够大规模生长。具体地,甲状腺素可以提升多能干细胞在传代过程中的存活率、提升线粒体活性的试剂和提高细胞糖酵解能力、促进胚外层标记基因(例如,CGA、CGB、GATA2、GCM1和TROP2)的表达的试剂、促进BMP4诱导的胚外层的分化的试剂、促进CGB的表达的试剂和促进CGB阳性细胞的比例,继而最终使得该甲状腺能够作为实现上述功效的试剂使用。
进一步地,本发明实施例提供一种用于培养多能干细胞的培养基,其包括甲状腺素和基础培养基体系。
该基础培养基是可以对多能干细胞进行正常贴壁培养,悬浮培养和高密度培养的培养基。例如可以是E8培养基(常规的E8培养基含有FGF2),也可以是含有FGF2的其他基础培养基,FGF2在基础培养基中的含量为100ng/ml,例如是含有100ng/ml的E8培养基。
进一步地,添加的甲状腺素的浓度为30uM,且甲状腺素在该培养基内的终浓度为5-500nM,优选为500nM。培养基内甲状腺素在上述浓度范围内能够进一步有利于甲状腺素发挥其功效,提升多能干细胞的生长速率、稳定性、代谢水平和分化等。而添加的甲状腺素的浓度并不仅仅限于30uM,此仅为本发明实施例的举例,添加的甲状腺素浓度可以为其他浓度,只要其能使得甲状腺素在该培养基内的终浓度为5-500nM即可。其中,一般是将甲状腺素溶于DMEM/F12中,而后得到对应浓度的甲状腺素溶液。
进一步地,本发明实施例提供一种培养多能干细胞的方法,包括,在基础培养基体系内加入甲状腺素进行培养。该培养可以是正常贴壁培养、悬浮培养液可以是高密度培养。添加的甲状腺素的浓度为30uM,且甲状腺素在该培养多能干细胞的培养基内的浓度为5-500nM,优选为500nM。且该基础培养基体系为可以对多能干细胞进行悬浮培养或高密度培养的培养基。例如可以是含有100ng/mL FGF2的E8培养基。同时,培养多能干细胞的条件例如温度、湿度和二氧化碳浓度等为现有常规培养多能干细胞的条件,例如,在37℃恒温的含有5%CO2的培养箱中培养。
同时,本发明实施例提供的甲状腺素为人甲状腺素T3。采用该甲状腺素T3能进一步保证其功效。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实验例1
甲状腺素T3促进人多能干细胞在悬浮培养过程中的生长速度
方法:人多能干细胞的悬浮培养借助培养基的空间优势,使细胞摆脱贴壁培养的平面限制,增加培养基的利用率,有助于多能干细胞的大规模工业化培养。然而在悬浮培养的实践中,发现细胞的生长速度相对于贴壁培养大大减缓,在本实验例中,以实验室小规模培养为例,证明甲状腺素T3在人多能干细胞悬浮培养过程中的作用。具体实验条件为含有5%CO2,37℃恒温培养,实验基础培养基为E8培养基(成分为:DMEM/F12,L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l),sodium selenium(14μg/l),FGF2(100ng/mL),insulin(19.4ug/ml),NaHCO3(543ug/ml)and transferrin(10.7mu/ml),TGFβ1(2ng/ml))。实验过程首先用stemcell公司生产的aggrewell平板制取人多能干细胞悬浮培养的胚状体,具体方法参照aggrewell使用说明书,使用TrypLE消化细胞并进行传代,每孔aggrewell接种1*106个细胞,培养基为E8+10μM Y27632,24h后换E8培养基并去掉Y27632。在去掉Y27632 24h以后使用12mLE8培养基从aggrewell中收集悬浮胚状体,并平均分配至24孔板中,每孔最终含有500μL细胞悬浮液。而后在人多能干细胞500μL悬浮培养过程中分别加入不同量甲状腺素T3使其在培养基的终浓度分别为5000nM,1500nM,500nM,150nM,50nM及0nM,培养96h后对细胞使用TrypLE消化处理,并使用流式细胞仪计算细胞数量。
检测结果参见图1,根据图1可知,添加500nM的甲状腺素T3可以明显促进人多能干细胞在悬浮培养体系中的生长速度,说明甲状腺素T3可以作为促进人多能干细胞生长速度的试剂。
实验例2
甲状腺素T3促进人多能干细胞在贴壁培养过程中培养的稳定性
方法:参照实验例1中甲状腺素T3的浓度,在细胞贴壁培养过程中加入含500nM甲状腺素T3的E8培养基,在37℃5%CO2的培养箱中培养。而后参照之前甲状腺浓度范围,测试5-500nM甲状腺素对高密度培养干细胞的凋亡分子抑制作用。随后采用优选的含500nM甲状腺素E8培养基分别检测细胞在高密度培养后的传代存活效率,正常密度克隆效率,细胞传代稳定性及多能性的影响。
检测结果参见图2,其中,图2中A为细胞凋亡分子caspase3/7的免疫荧光实验结果图,图2中B不同浓度T3对细胞凋亡分子caspase3/7影响的流式细胞分选图。图2中C显示T3对多能干细胞高密度培养后的传代存活效率的影响,图2中D-E为正常密度培养的多能干细胞克隆效率的影响,图2中F显示多能干细胞传代稳定性,图2中G为多能干细胞多能性标记基因NANOG,OCT4,SOX2表的影响,图2中H为多能干细胞多能标记蛋白NANOG的免疫荧光实验结果图。
根据图2中A可知在培养过程中加入含500nM甲状腺素T3的E8培养基,可以显著降低人多能干细胞在高密度下的细胞凋亡;根据图2中B可知在培养过程中加入含有5-500nM甲状腺素的E8培养基均可以降低人多能干细胞在高密度下的细胞凋亡,其中500nM为优选浓度。根据图2中C可知在培养过程中加入含500nM甲状腺素T3的E8培养基,显著提高人多能干细胞在高密度传代过程中的存活效率;根据图2中D-E可知,在含有500nM甲状腺素T3的E8培养基中培养的人多能干细胞,可以显著提高克隆试验中的克隆效率;根据图2中F可知,用含有500nM甲状腺素T3的E8培养基培养人多能干细胞,可以保证细胞正常扩增;根据图2中G可知,用含有500nM甲状腺素T3的E8培养基培养人多能干细胞,可以保证细胞的多能性基因表达;根据图2中H可知,用含有500nM甲状腺素T3的E8培养基培养人多能干细胞,可以保证多能性细胞的纯度及正常形态。
实验例3
甲状腺素T3促进人多能干细胞的代谢水平
方法:(1)人多能干细胞在含有500nM的甲状腺素T3的E8培养基中培养两天后,利用Seahorse细胞代谢分析平台的线粒体压力测试,检测甲状腺素T3对人多能干细胞线粒体的影响。
(2)人多能干细胞在含有500nM的甲状腺素T3的E8培养基中培养两天后,利用Seahorse细胞代谢分析平台的糖酵解测试,检测甲状腺素T3对人多能干细胞的糖酵解影响。
检测结果参见图3,其中图3中A为线粒体压力测试结果图,图3中B为糖酵解测试结果图。
根据图3中A可知,甲状腺素T3可以提高基础呼吸(Basal)以及ATP生成,从而提高线粒体活性。根据图3中B可知,甲状腺素T3可以提高细胞的糖酵解能力。说明甲状腺素T3可以作为促进人多能干细胞代谢水平的试剂。
实验例4
甲状腺素T3在无FGF2的培养基中促进人多能干细胞的生长速度及维持细胞多能性
方法:在人多能干细胞培养过程中,分别加入0ng/ml,1ng/ml,10ng/ml和100ng/ml的FGF2,对比含与不500nM甲状腺素T3,在培养3代后对细胞多能性基因Nanog的影响、对细胞形态的影响以及对细胞周期的影响。其中,培养过程中采用的基础培养基为去除FGF2的E8培养基,培养条件为常规细胞培养条件,含有5%CO2的37℃恒温细胞培养箱。
检测结果参见图4,其中,图4中A为培养3代后对细胞多能性标记基因NANOG和OCT4表达的影响图;图4中B为培养3代后对细胞形态及多能性蛋白NANOG的影响图;图4中C为甲状腺素T3对FGF2通路蛋白pERK1/2磷酸化WB图;图4中D为甲状腺素T3在无FGF2培养基中对细胞增殖的影响图;图4中E为甲状腺素T3在无FGF2培养基中对细胞周期的影响图。
根据图4中A和B可知,甲状腺素T3可以在低浓度FGF2的存在下维持人多能干细胞的多能性。根据图4中C可知,在含有500nM的甲状腺素T3时相对于不含T3的培养条件,甲状腺素T3可以在E7(不含FGF2)及E8培养基中增强ERK1/2磷酸化。根据图4中D结果显示,E8培养基中去掉FGF2减缓了细胞生长速度,在不含FGF2的培养基中添加终浓度为500nM的甲状腺素T3可以加速细胞生长。图4中E结果也说明了在不含FGF2的基础培养基条件下加入甲状腺素T3可以促进细胞S周期比例,促进细胞生长。说明甲状腺素T3可以作为促进人多能干细胞生长速度及维持细胞多能性的试剂,甲状腺素可以增强培养基中FGF2调控通路的作用。
实验例5
甲状腺素T3对胚外层细胞的分化的影响
方法:在诱导胚外层分化过程中,基础条件与正常细胞培养条件类似,为含有5%CO2的37℃恒温细胞培养箱,具体分化培养基为E8培养基去除FGF2,同时添加BMP4并使其终浓度为20ng/mL。分化方法为在正常多能干细胞传代第二天,当细胞密度达到10-20%后,加入含有BMP4的分化培养基分化6天,其中每两天换液一次。
(1)在BMP4诱导的胚外层细胞分化过程中,在分化培养基中加入甲状腺素T3,使培养基中甲状腺素的终浓度达到500nM,分化6天后检测胚外层标记基因的表达。
(2)在BMP4诱导的细胞分化过程中加入500nM的甲状腺素T3,分别在2,4,6天收集细胞RNA并检测胚外层标记基因CGB的表达。
(3)在BMP4诱导的胚外层细胞分化过程中,加入500nM的甲状腺素T3,分化6天后利用免疫荧光技术检测胚外层标记蛋白CGB的表达。
(4)在BMP4诱导的胚外层细胞分化过程中,加入500nM的甲状腺素T3,分化6天后利用流式细胞术分析CGB阳性细胞比例。
检测结果参见图5,其中图5中A为胚外层标记基因的表达的检测结果图,图5中B为胚外层标记基因CGB的表达的检测结果图,图5中C为免疫荧光技术检测胚外层标记蛋白CGB的表达的检测结果图,图5中D为流式细胞术分析CGB阳性细胞比例的结果图。
根据图5中A可知,甲状腺素T3可以明显促进胚外层标记基因CGA、CGB、GATA2、GCM1、TROP2的表达;根据图5中B可知,甲状腺素T3可以促进BMP4诱导的胚外层的分化;根据图5中C可知,甲状腺素T3可以明显促进CGB的表达,根据图5中D可知,甲状腺素T3可以明显促进CGB阳性细胞的比例,说明甲状腺素T3可以作为促进多能干细胞的分化,也说明甲状腺素T3促进早期胚胎发育,促进胚外层细胞的分化,继而可以用于制备治疗胚胎发育不全或者胚胎发育迟缓的药物。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种甲状腺素在制备治疗胚胎发育迟缓或发育不全的药物中的应用。
2.一种甲状腺素在制备以下任意一种试剂中的应用;
(1)促进多能干细胞的生长速率;
(2)促进多能干细胞的稳定性;
(3)促进多能干细胞的代谢水平;
(4)促进多能干细胞的定向分化。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,促进人多能干细胞的稳定性的试剂包括提升多能干细胞在传代过程中的存活率的试剂;
优选地,促进多能干细胞的代谢水平的试剂包括提升线粒体活性的试剂和提高细胞糖酵解能力的试剂;
优选地,促进多能干细胞的定向分化包括促进多能干细胞向胚胎外层分化。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,促进多能干细胞的分化包括促进胚外层标记基因的表达的试剂、促进BMP4诱导的胚外层的分化的试剂、促进CGB的表达的试剂和促进CGB阳性细胞的比例的试剂中的至少一种;
优选地,胚外层标记基因包括CGA、CGB、GATA2、GCM1和TROP2中的至少一种。
5.一种用于培养多能干细胞的培养基,其特征在于,其包括甲状腺素和基础培养基体系。
6.根据权利要求5所述的用于培养多能干细胞的培养基,其特征在于,所述基础培养基体系为E8培养基;
优选地,所述基础培养基体系包括含有FGF2的基础培养基,FGF2在基础培养基中的含量为100ng/ml。
7.根据权利要求5所述的用于培养多能干细胞的培养基,其特征在于,甲状腺素在培养基中的浓度为5-500nM,优选地,甲状腺素在培养基中的浓度为500nM,优选地,添加的甲状腺素的浓度为30uM。
8.一种培养多能干细胞的方法,其特征在于,包括,在基础培养基体系内加入甲状腺素进行培养。
9.根据权利要求8所述的培养多能干细胞的方法,其特征在于,培养包括正常贴壁培养、悬浮培养和高密度培养。
10.根据权利要求8所述的培养多能干细胞的方法,其特征在于,所述甲状腺素为甲状腺素T3。
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