JP6042099B2 - 細胞増殖抑制剤 - Google Patents
細胞増殖抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6042099B2 JP6042099B2 JP2012109981A JP2012109981A JP6042099B2 JP 6042099 B2 JP6042099 B2 JP 6042099B2 JP 2012109981 A JP2012109981 A JP 2012109981A JP 2012109981 A JP2012109981 A JP 2012109981A JP 6042099 B2 JP6042099 B2 JP 6042099B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- cell
- pluripotent stem
- xylose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims description 50
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 title claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 226
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 156
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 143
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 claims description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims 3
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 claims 2
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 72
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 43
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 33
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 33
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 32
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 30
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 28
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 19
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 15
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 14
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 14
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 14
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 14
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 12
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241001103870 Adia Species 0.000 description 7
- 125000000214 D-xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 7
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 7
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 description 4
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- -1 pentose monosaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710082837 Ice-structuring protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 1
- 101710107540 Type-2 ice-structuring protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WISUUJSJSA-N aldehydo-L-xylose Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 229930195726 aldehydo-L-xylose Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 238000002701 cell growth assay Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
発明の分野
本発明は、キシロースを有効成分とする細胞増殖抑制剤、および該細胞増殖抑制剤を用いた細胞の増殖制御方法に関する。
本発明は、キシロースを有効成分とする細胞増殖抑制剤、および該細胞増殖抑制剤を用いた細胞の増殖制御方法に関する。
背景技術
生物学では、人為的に生体外で培養する培養細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系や再生医療および細胞療法において広く用いられている。その細胞の有する性状を一定に維持するためには、継代を行うことにより培地中にて細胞を増殖し続ける必要がある。しかしながら、初代培養細胞や有限細胞系などの継代回数に制限（寿命）のある株化していない細胞では、継代を行うことによってその細胞の性状が変化することが多い。
生物学では、人為的に生体外で培養する培養細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系や再生医療および細胞療法において広く用いられている。その細胞の有する性状を一定に維持するためには、継代を行うことにより培地中にて細胞を増殖し続ける必要がある。しかしながら、初代培養細胞や有限細胞系などの継代回数に制限（寿命）のある株化していない細胞では、継代を行うことによってその細胞の性状が変化することが多い。
そのため、培養細胞を中〜長期間、その性状を一定に維持する場合には、凍結保存を行うのが一般的である。しかしながら、霊長類、特にヒトのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような凍結・解凍に弱い細胞では、凍結保存を行うことによる細胞へのダメージが大きい。
また、増殖スピードの速い細胞や遅い培養細胞の場合、それらを使用する際、所望の細胞濃度に調整することは難しく、熟練が必要であった。一時的に細胞の環境温度を４℃など低温に変化させることにより細胞増殖を抑える方法も知られているが、維持できる時間は数時間単位であった。
さらに、培養細胞の中でもＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞では、継代を行うことによってそれら細胞の有する性状の一つである未分化性（分化能）を失うことが知られている。そこで、未分化性を維持するために、マウスＥＳ細胞の場合は、例えばＬＩＦ（白血病抑制因子）を添加する必要があった。また、霊長類ＥＳ細胞の場合は、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行う必要があった（特開２００７−２２８８１５号公報（特許文献１）参照）。しかしながら、これら未分化維持因子は高価なものが多く、またフィーダー細胞との共存下培養は煩雑なものであった。
したがって、凍結保存以外の方法で、細胞を継代する必要なく、その有する性状を維持したまま、簡便に細胞の増殖制御をする方法が求められている。
凍結保存以外の方法として、例えば、特開２００８−１０４４０７号公報（特許文献２）には、還元糖を含む細胞保存液を用いた冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着生細胞の保存方法が開示されている。しかしながら、この方法では低温での冷蔵が必須であり、保存できる細胞の種類も限られていた。また、この文献には、キシロースを用いることについては何ら記載されていない。
キシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）は、糖鎖の構成糖の一つであり、細胞間のコミュニケーションなど生体内において重要な役割を担っている。また、キシロースは、木質系バイオマスに豊富に含まれることが知られており、未利用資源として様々な分野での利用用途の拡大が求められている。しかしながら、培養細胞の分野では、細胞がキシロースをエネルギーとして利用できないと考えられているため、キシロースは用いられてこなかった。
本発明者らは、以前に、各種糖質（グルコース、キシロース、ガラクトースなど）によるマウスＥＳ細胞への影響を確認し、キシロースのマウスＥＳ細胞での未分化を維持できる可能性を報告している（横山忠幸ら,「各種糖含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の増殖及びＥＢ形成への影響」, 第７回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.7, pp.239, 2008（非特許文献１）、横山忠幸ら,「Ｘｙｌｏｓｅ含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の未分化維持に関する有効性の検討」, 第８回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.8, pp.221, 2009（非特許文献２））。
しかしながら、これらの文献では、マウスＥＳ細胞の未分化性以外の性状については、何ら記載されていない。中でも増殖能については、キシロース培地での３日間培養による細胞数がグルコース培地のものより少なかったことが報告されているのみであり、キシロース培地から通常培地に置換した場合の増殖能については何ら報告されていない。また、キシロースの利用は、発明者らが知る限り、マウスＥＳ細胞以外の細胞に関しては、何ら報告されていない。
横山忠幸ら,「各種糖含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の増殖及びＥＢ形成への影響」, 第７回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.7, pp.239, 2008
横山忠幸ら,「Ｘｙｌｏｓｅ含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の未分化維持に関する有効性の検討」, 第８回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.8, pp.221, 2009
本発明者らは、今般、細胞培養において、一般的な培地に含まれるグルコースをキシロースに代替した培地を用いると、細胞がグルコース以外の糖類をエネルギーとして利用できないため生存できないと考えられていたにもかかわらず、１週間を超える長い期間、通常の培養温度で、生存を維持でき、かつ、細胞増殖を抑えることができることを見出した。また、キシロース培地で細胞増殖を抑えた後に、通常のグルコース培地に置換したところ、初めからグルコース培地で培養した細胞と同レベルまで短期間で増殖できることを見出し、細胞に生存に影響する重大な障害を与えることなく、細胞の増殖を制御することに成功した。さらに、多能性幹細胞の場合には、未分化性と多能性とを保持したまま、細胞の増殖を制御することに成功した。
よって本発明は、細胞増殖抑制剤を提供すること、および該細胞増殖抑制剤を用いた細胞の増殖制御方法を提供することを目的とする。
本発明による細胞増殖抑制剤は、キシロースを有効成分とする。
本発明の一つの態様によれば、前記した剤において、細胞は多能性幹細胞である。
本発明の一つの態様によれば、前記した剤において、細胞はガン細胞である。
本発明の一つの態様によれば、本発明による細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞培養用培地が提供される。
本発明の一つの態様によれば、本発明による細胞増殖抑制剤を含んでなる、多能性幹細胞維持用培地であって、キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない、多能性幹細胞維持用培地が提供される。
本発明の一つの態様によれば、本発明による培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。
本発明の一つの態様によれば、本発明による多能性幹細胞維持用培地を使用して細胞を維持することによって、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、多能性幹細胞の維持方法が提供される。
本発明の細胞増殖抑制剤によれば、通常の培養条件下において、細胞の性状を維持したまま、細胞の増殖を抑制することができる。このため、本発明による細胞増殖抑制剤は、凍結保存をするまでもない、細胞の短期間保存および維持に極めて有用である。
また、本発明による細胞の増殖制御方法は、通常の培地と、本発明の細胞増殖抑制剤を含んでなる培地とを置換する操作のみを行うため、熟練を要さず、大変簡便である。さらに本発明に用いられるキシロースは、未利用資源であるため、培養コストを低減することができる。
さらに、細胞が多能性幹細胞の場合には、本発明の増殖抑制剤を含んでなる培地を使用すると、多能性幹細胞の増殖を抑制しながら細胞を維持するのと共に、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行わなくても、細胞の未分化性と全能性とを保持することができる。したがって、凍結に弱い多能性幹細胞であっても、短期間であれば、凍結保存するのと同じように、未分化性と全能性とを保持したまま、多能性細胞を維持することができる。
細胞増殖抑制剤
本発明による細胞増殖抑制剤は、前記したように、キシロースを有効成分とする。
本発明による細胞増殖抑制剤は、前記したように、キシロースを有効成分とする。
キシロースは、木質系バイオマスに多く存在し、木糖とも呼ばれる五炭糖の単糖である。本発明に用いられるキシロースは、天然に多く存在するＤ−キシロースであってもよいし、合成により調製されるＬ−キシロース、ＤＬ−キシロースであってもよい。本発明で用いられるキシロースは、好ましくは、Ｄ−キシロースである。
本発明において、「有効成分」とは、本発明の目的である細胞増殖抑制作用を奏する上で必要とされる成分のことを意味する。ここで、細胞増殖抑制作用とは、細胞の生存を維持し、かつ、細胞増殖を抑えることを意味する。細胞増殖を抑制することによって、細胞を保存することができる。
本明細書において細胞とは、人為的に生体外で培養することができる細胞を意味し、例えば、多能性幹細胞、ガン細胞、株化細胞、初代培養細胞、および有限細胞系が包含される。本発明に用いられる細胞は、細胞増殖性が著しく高く、未分化性などの形質を保持する必要がある点で、好ましくは多能性幹細胞である。
本発明に用いられる多能性幹細胞とは、自分と同じ細胞を作る自己複製能と、組織や臓器を構成する他種類の細胞に分化する多分化能とを有する細胞のことを意味する。
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性ガン細胞（ＥＣ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）が包含される。また、多能性幹細胞は、動物、昆虫などを由来とするものが含まれうるが、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類由来のものである。本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
ここで「多能性」とは、多分化能とも言い換えることができるが、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力、および外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する少なくともそれぞれ一種の分化細胞に分化しうる性質をいい、生殖細胞への分化能も包含されうる。なお、分化細胞は、将来、体内の組織や臓器を構成する多種類の細胞に分化しうる。多能性を有するか否かは、例えば、ＰＡ６フィーダー細胞と多能性細胞とを共存下培養を行い、神経細胞に誘導されるか否かを評価すること、または各種分化マーカーの発現により判断することができる。
「未分化性」とは、まだ特定の細胞系列に分化していないことを意味し、幹細胞の階層的には比較的上位に位置する幹細胞が有する性状である。未分化性を有するか否かは、未分化細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１を測定することにより判断することができる。
本発明に用いられるガン細胞とは、ガン由来の細胞を意味する。例えば、膵腺ガン由来細胞、乳腺ガン由来細胞、肝ガン由来細胞などが挙げられる。具体的には、Ｐａｎｃ１、Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２またはＭＣＦ７などが挙げられる。
本発明に用いられる株化細胞とは、不死化した細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ；セルライン）を意味する。例えば、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞などが挙げられる。本発明の増殖抑制剤を用いることにより、無駄な継代を省くことができる。
本発明に用いられる初代培養細胞とは、生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞を意味する。本発明に用いられる有限細胞系とは、継代回数に制限（寿命）のある継代培養細胞を意味する。本発明の増殖抑制剤を用いることにより、性状の変化しやすい初代培養細胞や有限細胞系を、維持、保存することができる。
本発明の増殖抑制剤は、生命活動を休止した状態での物質応答性試験や臨床検査に利用することが期待される。
本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞培養用培地が提供される。
ここで「細胞培養用培地」とは、上記細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、細胞の生存に影響する重大な障害を与えることなく、その細胞の性状を保持したまま、細胞を一定数、一定期間生存させることを可能とするものである。細胞培養用培地は、粉末状であっても、液体状であってもよい。
本発明の細胞培養用培地におけるキシロースの含有量は特に制限はなく、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類などに応じて、適宜変更することができる。培地におけるキシロースの含有量は、通常の基礎培地のグルコース量と同量であってもよく、好ましくは１．０〜１０．０ｇ／Ｌ、より好ましくは１．０〜５．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは３．０〜４．５ｇ／Ｌである。なお、本発明による培地中におけるキシロースの含有量が少量であっても、本発明は十分な効果を示すことができるが、キシロースは毒性がなく、水溶性にも優れるため、通常は多量に添加しても問題は実質的に生じない。
本発明に用いられる培地は、従来の細胞培養に用いられる培地中のグルコースをキシロースに置換することにより得られる。具体的には、培地中のグルコースをキシロースに置換した基礎培地に、必要に応じて、血清または血清代替物または他の成分を添加することにより得られる。
ここで、基礎培地としては、例えば、培地中のグルコースをキシロースに置換したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ培地、フィッシャー培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。
血清または血清代替物は、公知のものであればいずれのものも用いることができる。例えば、血清としては、ＦＢＳ、ＦＣＳなどが挙げられ、血清代替物としては、ＫＳＲなどが挙げられる。
他の成分としては、非必須アミノ酸、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
基礎培地に添加する血清もしくは血清代替物または他の成分は、好ましくは、膜処理により糖質を除去したものである。膜処理は、例えば、透析膜 ３６／３２（エーディア株式会社製）を用いることにより行うことができる。
また、本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞増殖剤を含んでなる、多能性幹細胞維持用培地であって、キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない多能性幹細胞維持用培地が提供される。
ここで「多能性幹細胞維持用培地」とは、上記多能性幹細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、未分化の多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞を一定数のまま、一定期間生存可能とするものである。
本発明の多能性幹細胞用培地は、キシロースを有効成分とする細胞増殖抑制剤を含んでなるため、多能性幹細胞用培地に必須の成分とされているキシロース以外の未分化維持因子（例えば、ＬＩＦ、フィーダー細胞由来の未分化維持因子）を実質的に含まなくても、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持することができる。
本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞培養用培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。
ここで「細胞の増殖制御」とは、所望の時期に細胞の増殖能を停止させ、細胞の生存に影響する重大な障害を細胞に与えることなくその細胞濃度を維持させ、その後所望の時期に細胞の増殖を再開させることを意味する。具体的には、細胞の増殖制御は、本発明の細胞培養用培地と、通常の細胞培養用培地とを置換することによって行うことができる。ここで、細胞によっては、増殖再開後の増殖スピードを、通常培養と同レベル、またはそれ以上にすることができる。
細胞の増殖制御は、通常の細胞培養温度および環境条件で行ってもよい。
細胞の増殖抑制期間は、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類、培養温度などに応じて、適宜変更することができる。例えば、培地中のグルコースをキシロースに置換したＤＭＥＭを用いて通常の培養条件にて培養した場合、少なくとも１ヵ月は細胞の増殖を抑制することが期待でき、好ましくは少なくとも２６日間、より好ましくは少なくとも２１日間、さらに好ましくは少なくとも１４日間、さらにより好ましくは少なくとも８日間は、細胞の増殖を抑制することができる。
本発明の一つの態様によれば、本発明の多能性幹細胞未分化維持用培地を使用して細胞を維持することによって、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、多能性幹細胞の維持方法が提供される。
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１：マウスＥＳ細胞での細胞増殖制御
（１）培地の調製
マウスＥＳ細胞（胚性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＳ培地（グルコースＥＳ培地）：
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１５容量％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１００μＭ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１０３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、１００μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明によるＥＳ培地（キシロースＥＳ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１５容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
（１）培地の調製
マウスＥＳ細胞（胚性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＳ培地（グルコースＥＳ培地）：
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１５容量％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１００μＭ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１０３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、１００μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明によるＥＳ培地（キシロースＥＳ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１５容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
（２）マウスＥＳ細胞の調製
マウスＥＳ細胞（１２９／ＳＶ系、Cell and Molecular Technologies, Philipsburg, NJ）は、０．１重量％ ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、株式会社サンプラテックより入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞（信州大学より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養されたものを用いた。培地は、上記グルコースＥＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
マウスＥＳ細胞（１２９／ＳＶ系、Cell and Molecular Technologies, Philipsburg, NJ）は、０．１重量％ ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、株式会社サンプラテックより入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞（信州大学より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養されたものを用いた。培地は、上記グルコースＥＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
（３）マウスＥＳ細胞の増殖抑制作用
ＥＳ細胞をＳＮＬフィーダー細胞上で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上にＥＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。
ＥＳ細胞をＳＮＬフィーダー細胞上で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上にＥＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。
コロニー形成後に、一方の培地を、キシロースＥＳ培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。
培養後８日目に、キシロースＥＳ培地で培養したＥＳ細胞コロニーは、培地をグルコースＥＳ培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコースＥＳ培地へ置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、それぞれの培地で培養したＥＳ細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ行った。
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、製品マニュアルに従って測定した。具体的には、９６ウェルプレートで培養した細胞の培地１００μＬを新鮮な培地に交換し、これに対してＭＴＴ試薬を１０μＬ添加後４時間インキュベートした。その後、生細胞が生成するホルマザン色素（青色）を、可溶化液（０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノール）を加えてピペッティングを数回行って溶解させ、プレートリーダーを用いて吸光波長５７０ｎｍとリファレンス波長６３０ｎｍを用いて測定した。生存率は、培養後０日目を１００％として、それぞれの平均値±標準偏差を算出した。結果を図１ＡおよびＢに示す。
ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、製品マニュアルに従って測定した。具体的には、９６ウェルプレートで培養した細胞の培地１００μＬを新鮮な培地に交換し、これに対してＭＴＴ試薬を１０μＬ添加後４時間インキュベートした。その後、生細胞が生成するホルマザン色素（青色）を、可溶化液（０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノール）を加えてピペッティングを数回行って溶解させ、プレートリーダーを用いて吸光波長５７０ｎｍとリファレンス波長６３０ｎｍを用いて測定した。生存率は、培養後０日目を１００％として、それぞれの平均値±標準偏差を算出した。結果を図１ＡおよびＢに示す。
（４）マウスＥＳ細胞の性状試験
上記（３）と同様に、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した６ウェルプレート（株式会社サンプラテックより入手）に、ＥＳ細胞を２．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。コロニー形成後に、一方の培地をキシロースＥＳ培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。培地交換は毎日行った。
上記（３）と同様に、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した６ウェルプレート（株式会社サンプラテックより入手）に、ＥＳ細胞を２．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。コロニー形成後に、一方の培地をキシロースＥＳ培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。培地交換は毎日行った。
それぞれのマウスＥＳ細胞コロニー形態の観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）および蛍光免疫染色による分化傾向の確認を行った。
コロニー形態の観察
培養後０日目、４日目、８日目のＥＳ細胞コロニーの形態を光学顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス株式会社製）で観察した。結果を図２に示す。
培養後０日目、４日目、８日目のＥＳ細胞コロニーの形態を光学顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス株式会社製）で観察した。結果を図２に示す。
遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡからＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡサンプルは、下記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、β−ａｃｔｉｎを用いて、増幅した（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ、タカラバイオ株式会社製）。
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡからＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡサンプルは、下記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、β−ａｃｔｉｎを用いて、増幅した（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ、タカラバイオ株式会社製）。
結果を図３に示す。結果から明らかなように、未分化マーカーの発現が確認された。
蛍光免疫染色
培養後８日目のＥＳ細胞を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３０分間固定した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを用いて透過処理を行い、１．５％正常ロバ血清または正常ヤギ血清で処理した。その後、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、４℃で一晩反応させ、洗浄後、二次抗体として、フルオレセインまたはＴＲＩＴＣ接合ＩｇＧで染色した。その後、ＤＡＰＩを用いて核染色した。結果を図４に示す。
培養後８日目のＥＳ細胞を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３０分間固定した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを用いて透過処理を行い、１．５％正常ロバ血清または正常ヤギ血清で処理した。その後、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、４℃で一晩反応させ、洗浄後、二次抗体として、フルオレセインまたはＴＲＩＴＣ接合ＩｇＧで染色した。その後、ＤＡＰＩを用いて核染色した。結果を図４に示す。
（５）ＥＢの形成
マウスＥＢ（胚様体）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＢ培地（グルコースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ、２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
本発明によるＥＢ培地（キシロースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜により除去した２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
マウスＥＢ（胚様体）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＢ培地（グルコースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ、２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
本発明によるＥＢ培地（キシロースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜により除去した２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
ＥＳ細胞をＳＮＬフィーダー細胞上で培養後、マウスＥＳ細胞コロニーのみを回収し、ハンギングドロップ法により、上記グルコースＥＢ培地およびキシロースＥＢ培地を用いて、ＥＢ（胚様体）を形成した。ここでグルコースＥＢ培地は、１０３Ｕ／ｍｌ ＬＩＦをさらに添加したグルコースＥＢ ＬＩＦ＋培地と、添加しないグルコースＥＢ ＬＩＦ−培地とを用いた。
培養後５日目にＥＢを回収した。回収したＥＢは、各ＥＢ培地を満たしたゼラチンコート細胞培養プレートでさらに培養し、回収後２１日間（培養後２６日間）、ＥＢ形態の観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光免疫染色による分化傾向の確認を行った。
ＥＢ形態の観察
回収後０日目、４日目、８日目（培養後５日目、９日目、１３日目）のＥＢの形態を光学顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。結果に示されるように、グルコースＥＢ培地を用いたものは、伸展したが、キシロースＥＢ培地を用いたものは形態の変化が少なかった。
回収後０日目、４日目、８日目（培養後５日目、９日目、１３日目）のＥＢの形態を光学顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。結果に示されるように、グルコースＥＢ培地を用いたものは、伸展したが、キシロースＥＢ培地を用いたものは形態の変化が少なかった。
遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）
回収後４日目、７日目、１４日目（培養後９日目、１２日目、１９日目）のＥＢについて、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、上記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、β−ａｃｔｉｎを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図６に示す。
回収後４日目、７日目、１４日目（培養後９日目、１２日目、１９日目）のＥＢについて、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、上記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、β−ａｃｔｉｎを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図６に示す。
蛍光免疫染色
回収後８日目、２１日目（培養後１３日目、２６日目）のＥＢについて、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ヤギ抗Ｓｏｘ１７（１：２００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、およびウサギ抗Ｎａｎｏｇ（１：２００，ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ Ｉｎｃ，横浜、日本）を用いる以外は、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、蛍光免疫染色を行った。
（６）ＥＳ細胞の神経細胞への分化誘導試験
神経系細胞へ分化誘導するために、ＳＮＬフィーダー細胞上で培養したＥＳ細胞を、マイトマイシンＣ処理したＰＡ６フィーダー細胞（理研ＢＲＣより入手）上に播種し、ＬＩＦを含まない上記グルコースＥＳ培地またはキシロースＥＳ培地で２１日間培養した。
回収後８日目、２１日目（培養後１３日目、２６日目）のＥＢについて、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ヤギ抗Ｓｏｘ１７（１：２００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、およびウサギ抗Ｎａｎｏｇ（１：２００，ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ Ｉｎｃ，横浜、日本）を用いる以外は、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、蛍光免疫染色を行った。
（６）ＥＳ細胞の神経細胞への分化誘導試験
神経系細胞へ分化誘導するために、ＳＮＬフィーダー細胞上で培養したＥＳ細胞を、マイトマイシンＣ処理したＰＡ６フィーダー細胞（理研ＢＲＣより入手）上に播種し、ＬＩＦを含まない上記グルコースＥＳ培地またはキシロースＥＳ培地で２１日間培養した。
培養から４、７、１４日目に、上記（４）と同様の方法で、グルコースＥＳ培地およびキシロースＥＳ培地それぞれのＥＳ細胞の形態観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光免疫染色を行った。ここで、ＲＴ−ＰＣＲでは、上記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ−６、β−ａｃｔｉｎを用いた。また蛍光免疫染色では、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｎａｎｏｇ（１：２００，ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ Ｉｎｃ，横浜、日本）、マウス抗神経クラスＩＩＩβ−チューブリン（クローンＴｕｊ１，１：５００，マウスＩｇＧ２ａ、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｌｅｙ，ＣＡ）、およびウサギ抗ＭＡＰ２（１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いた。結果を図８〜１０に示す。結果に示されるように、キシロースＥＳ培地では、ＥＳ細胞は神経細胞へ分化誘導されなかった。
例２：ヒトｉＰＳ細胞の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒトｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２０容量％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した２０容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（１）培地の調製
ヒトｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２０容量％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した２０容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（２）ヒトｉＰＳ細胞の調製
ヒトｉＰＳ細胞として、エーラスダンロス症候群患者由来の疾患ｉＰＳ細胞（信州大学より入手）（以下、「Ｐ−ｉＰＳ」という）を用いた。Ｐ−ｉＰＳ細胞は、０．１重量％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、サンプラテック株式会社より入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞（オリエンタル酵母工業株式会社より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培地は、上記グルコースｉＰＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
ヒトｉＰＳ細胞として、エーラスダンロス症候群患者由来の疾患ｉＰＳ細胞（信州大学より入手）（以下、「Ｐ−ｉＰＳ」という）を用いた。Ｐ−ｉＰＳ細胞は、０．１重量％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、サンプラテック株式会社より入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞（オリエンタル酵母工業株式会社より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培地は、上記グルコースｉＰＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
（３）ヒトｉＰＳ細胞の増殖抑制作用
Ｐ−ｉＰＳ細胞をＭＥＦフィーダー細胞上で培養後、０．２５重量％ トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IV（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｐ−ｉＰＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上に、Ｐ−ｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースｉＰＳ培地を用いて４日間培養して再度コロニーを形成させた。
Ｐ−ｉＰＳ細胞をＭＥＦフィーダー細胞上で培養後、０．２５重量％ トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IV（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｐ−ｉＰＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上に、Ｐ−ｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースｉＰＳ培地を用いて４日間培養して再度コロニーを形成させた。
コロニー形成後に、一方の培地をキシロースｉＰＳ培地に置換して培養した（「培養後０日目」とする）。
培養後８日目に、キシロースｉＰＳ培地で培養したＰ−ｉＰＳ細胞は、培地をグルコースｉＰＳ培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１１ＡおよびＢに示す。
例３：ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（２）ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）の増殖抑制作用
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｐａｎｃ１細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｐａｎｃ１細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＰａｎｃ１細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１２ＡおよびＢに示す。
また、培養後３日目の形態を光学顕微鏡で観察した。結果を図１３に示す。
例４：ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（２）ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）の増殖抑制作用
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＭｉａ−Ｐａ−Ｃａ２細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１４ＡおよびＢに示す。
例５：ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（１）培地の調製
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（２）ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）の増殖抑制作用
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７細胞）（ＥＣＡＣＣ）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＭＣＦ７細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７細胞）（ＥＣＡＣＣ）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＭＣＦ７細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＭＣＦ７細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１５ＡおよびＢに示す。
例６：マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（１）培地の調製
マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
（２）マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）の増殖抑制作用
ＳＮＬ細胞（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＳＮＬ細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
ＳＮＬ細胞（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＳＮＬ細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＳＮＬ細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１６ＡおよびＢに示す。
Claims (17)
- キシロースを有効成分として含んでなる、霊長類由来の多能性幹細胞維持用培地。
- 多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の多能性幹細胞維持用培地。
- 請求項１または２の培地を使用して、霊長類由来の多能性幹細胞を維持することを含んでなる、霊長類由来の多能性幹細胞の維持方法。
- 請求項１または２の培地を使用して細胞を維持することによって、霊長類由来の多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、霊長類由来の多能性幹細胞の維持方法。
- キシロースを有効成分とする、細胞増殖抑制剤。
- 細胞が、多能性幹細胞である、請求項５に記載の細胞増殖抑制剤。
- 多能性幹細胞が霊長類由来の多能性幹細胞である、請求項６に記載の細胞増殖抑制剤。
- 多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項６または７に記載の細胞増殖抑制剤。
- 細胞が、ガン細胞である、請求項５に記載の細胞増殖抑制剤。
- 請求項５〜９のいずれか一項に記載の細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞増殖抑制用細胞培養用培地。
- 請求項６〜８のいずれか一項に記載の細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞増殖抑制用多能性幹細胞維持用培地。
- キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない、請求項１１に記載の細胞増殖抑制用多能性幹細胞維持用培地。
- 多能性幹細胞が霊長類由来の多能性幹細胞である、請求項１１または１２に記載の細胞増殖抑制用多能性幹細胞維持用培地。
- 多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細胞増殖抑制用多能性幹細胞維持用培地。
- 請求項１、２および１０〜１４のいずれか一項に記載の培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法。
- 請求項１、２および１１〜１４のいずれか一項に記載の培地を使用して細胞を維持することによって、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、多能性幹細胞の維持方法。
- 霊長類がヒトである、請求項１、１２および１３に記載の培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012109981A JP6042099B2 (ja) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | 細胞増殖抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012109981A JP6042099B2 (ja) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | 細胞増殖抑制剤 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013236558A JP2013236558A (ja) | 2013-11-28 |
| JP2013236558A5 JP2013236558A5 (ja) | 2015-06-11 |
| JP6042099B2 true JP6042099B2 (ja) | 2016-12-14 |
Family
ID=49762211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012109981A Active JP6042099B2 (ja) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | 細胞増殖抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6042099B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021132539A1 (ja) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | 株式会社 ブルボン | 細胞増殖抑制剤 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150335010A1 (en) | 2014-05-21 | 2015-11-26 | Bourbon Corporation | Maintenance medium for primate pluripotent stem cells |
-
2012
- 2012-05-11 JP JP2012109981A patent/JP6042099B2/ja active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021132539A1 (ja) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | 株式会社 ブルボン | 細胞増殖抑制剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013236558A (ja) | 2013-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102453717B1 (ko) | 원시 장 내배엽 세포 및 그 제작 방법 | |
| JP5938726B2 (ja) | 多能性幹細胞の分化誘導効率を改善するための方法及び培地 | |
| JP6581655B2 (ja) | 多能性幹細胞由来ケラチノサイトの生成およびケラチノサイト培養の維持 | |
| WO2012117333A1 (en) | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof | |
| US20190382721A1 (en) | Method for preparing pluripotent stem cells | |
| US20120142103A1 (en) | Method for inducing differentiation into epithelial progenitor cell/stem cell population and corneal epithelial cell population from induced pluripotent stem cells | |
| US20130084267A1 (en) | Method for stem cell differentiation | |
| US11814652B2 (en) | Pluripotent stem cell differentiation-promoting agent | |
| US20220348878A1 (en) | Cell proliferation inhibitor | |
| EP2985340A1 (en) | Method for culturing hepatoblast-like cells and culture product thereof | |
| CN111778205B (zh) | 人心肌细胞分离试剂、培养基、分离方法和培养方法 | |
| JP6042099B2 (ja) | 細胞増殖抑制剤 | |
| CN111019886B (zh) | 新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系 | |
| JP5620905B2 (ja) | 多能性幹細胞及び心筋細胞以外の分化細胞に対する細胞死誘導方法 | |
| US9883669B2 (en) | Maintenance medium for primate pluripotent stem cells | |
| JP2011152111A (ja) | 多能性幹細胞培養用培地 | |
| EP3864137A1 (en) | Compositions and methods for cell culture | |
| KR102359675B1 (ko) | 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물 | |
| KR102198705B1 (ko) | 줄기세포의 증식 및 전능성 증진용 조성물 | |
| JP2024024550A (ja) | 未分化幹細胞の細胞死誘導剤、及び分化細胞の純化方法 | |
| KR101838176B1 (ko) | 퓨린계 화합물을 포함하는 정원줄기세포 배양용 배지 조성물 및 이의 용도 | |
| dos Santos Pina | Integrated expansion and cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells in 2D and 3D conditions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150415 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150415 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160311 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160510 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161014 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161109 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6042099 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |