WO2021132539A1 - 細胞増殖抑制剤 - Google Patents

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佐季子 滝澤
俊介 藤本
美恵子 ▲高▼坂
克典 佐々木
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株式会社 ブルボン
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Definitions

  • the present disclosure relates to a cell proliferation inhibitor containing glutamic acid, and a cell proliferation control method using the same.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-104407 states that adherent cells are preserved under refrigerated conditions using a cell preservation solution containing a reducing sugar. The method is disclosed. However, this method requires refrigeration at a low temperature, and the types of cells that can be stored are limited.
  • Xylose is one of the constituent sugars of sugar chains and plays an important role in the living body such as communication between cells.
  • xylose is known to be abundantly contained in woody biomass, and it is required to expand its use in various fields as an unused resource.
  • JP-A-2007-228815 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-104407 Patent No. 6042099
  • Tadayuki Yokoyama et al. "Effects on mouse ES cell proliferation and EB formation in various sugar-containing environments", 7th Annual Meeting of the Japanese Society of Regenerative Medicine, Abstracts, Vol.7, pp.239, 2008 Tadayuki Yokoyama et al., "Study of efficacy for maintenance of undifferentiated mouse ES cells in Xylose-containing environment", 8th Annual Meeting of the Japanese Society of Regenerative Medicine, Abstracts, Vol.8, pp.221, 2009
  • the present disclosures can easily proliferate cells of a wide range of primate cells such as fibroblasts and mesenchymal stem cells while maintaining their properties. I found that I could control it. The present disclosure is based on such findings.
  • the cell proliferation inhibitor comprises glutamic acid.
  • a method for controlling cell growth comprising maintaining cells using the medium according to the present disclosure.
  • cell proliferation inhibitor of the present disclosure cell proliferation can be suppressed while maintaining the cell properties under normal culture conditions.
  • the growth inhibitor of the present disclosure can be advantageously used in suppressing cell proliferation while suppressing cell death. Therefore, the cell proliferation inhibitor according to the present disclosure is extremely useful for short-term storage and maintenance of cells, not to mention cryopreservation.
  • the cell proliferation control method according to the present disclosure is very simple without requiring skill because it only performs an operation of replacing the normal medium with the medium containing the cell proliferation inhibitor of the present disclosure.
  • the medium containing the cell proliferation inhibitor of the present disclosure is used to maintain the cell while suppressing the proliferation of the pluripotent stem cell and to maintain the undifferentiated state.
  • the undifferentiated cells and totipotency of the cells can be maintained without adding the cells or culturing the cells in the coexistence of the feeder cells. Therefore, even pluripotent stem cells that are vulnerable to freezing can be maintained for a short period of time while retaining their undifferentiated state and totipotency, similar to cryopreservation. it can.
  • Cell proliferation inhibitor comprises glutamic acid, as described above.
  • the cell proliferation inhibitor according to the present disclosure contains glutamic acid as an active ingredient.
  • the "active ingredient” means an ingredient required for exerting the cell proliferation inhibitory action which is the object of the present disclosure.
  • the cell proliferation inhibitory action means maintaining cell survival and suppressing cell proliferation. Cells can be preserved by suppressing cell proliferation.
  • the cell proliferation inhibitor according to the present disclosure is used together with xylose as described above.
  • Xylose is a monosaccharide of pentacarbon sugar, which is abundant in woody biomass and is also called wood sugar.
  • the xylose used in the present disclosure may be naturally abundant D-xylose, or synthetically prepared L-xylose or DL-xylose.
  • the xylose used in the present disclosure is preferably D-xylose.
  • the cells include fibroblasts, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells, cancer cells, established cells, primary cultured cells, and finite cell lines.
  • the cells used in the present disclosure are preferably fibroblasts, mesenchymal stem cells or pluripotent stem cells in that they have extremely high cell proliferation and need to retain traits such as undifferentiated cells, and more preferably.
  • Fibroblasts are one of the cells that make up connective tissue and include cells that produce dermal components such as collagen, elastin, and hyaluronic acid.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells derived from mesodermous tissue (mesoderm).
  • Mesenchymal stem cells are cells capable of differentiating into cells belonging to the mesenchymal system, and are expected to be applied to regenerative medicine such as reconstruction of bone, blood vessels, and myocardium.
  • Mesenchymal stem cells can be classified according to the tissue to be collected, and examples thereof include bone marrow-derived stem cells and adipose tissue-derived stem cells.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ cells (EG cells), embryonic cancer cells (EC cells), and adult pluripotent stem cells. (APS cells) are included. Further, the pluripotent stem cells may include those derived from animals, insects and the like, but are preferably derived from mammals, and more preferably derived from primates. The pluripotent stem cells used in the present disclosure are preferably ES cells or iPS cells.
  • pluripotency can be rephrased as pluripotency, but it has the ability to differentiate into any differentiated cell belonging to ectoderm, mesodermal, and endoderm, and ectoderm, mesodermal, and endoderm. It refers to the property of being able to differentiate into at least one kind of differentiated cell belonging to the above, and can also include the ability to differentiate into germ layer.
  • differentiated cells can differentiate into various types of cells that constitute tissues and organs in the body. Whether or not it has pluripotency is determined by, for example, culturing PA6 feeder cells and pluripotent cells in coexistence and evaluating whether or not they are induced by nerve cells, or by expressing various differentiation markers. can do.
  • Undifferentiated means that the cells have not yet differentiated into a specific cell lineage, and are the properties of stem cells that are relatively higher in the hierarchy of stem cells. Whether or not it has undifferentiated state can be determined by measuring undifferentiated cell markers such as Oct3 / 4, Nanog, and Rex-1.
  • the cancer cell used in the present disclosure means a cell derived from cancer.
  • pancreatic adenocarcinoma-derived cells, mammary gland cancer-derived cells, liver cancer-derived cells and the like can be mentioned.
  • Specific examples thereof include Panc1, Mia-Pa-Ca2 and MCF7.
  • the cell line used in the present disclosure means an immortalized cell line (cell line).
  • cell line For example, STO cells, SNL cells and the like can be mentioned.
  • the growth inhibitor of the present disclosure useless passage can be omitted.
  • the primary cultured cell used in the present disclosure means a cell in which a tissue or cell collected from a living body is first seeded and cultured.
  • the finite cell line used in the present disclosure means a subcultured cell having a limited number of passages (lifespan).
  • the cell proliferation inhibitor of the present disclosure is expected to be used for substance responsiveness tests and clinical tests in a state where vital activity is suspended.
  • a cell culture medium containing the cell proliferation inhibitor of the present disclosure is provided.
  • the "cell culture medium” means a culture medium or a composition thereof suitable for culturing the cells, and retains the properties of the cells without seriously impairing the survival of the cells. As it is, it enables a certain number of cells to survive for a certain period of time.
  • the cell culture medium may be in the form of powder or in the form of liquid.
  • the content of glutamic acid in the cell culture medium can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured, the purpose of culture, the type of basal medium, and the like.
  • the content of glutamic acid in the basal medium can be, for example, 0.5 ⁇ M or more, preferably 0.5 ⁇ M to 10 mM, more preferably 0.5 mM to 10 mM, still more preferably 1 to 10 mM, still more preferably 5 mM to. It is 8 mM, more preferably 8 mM.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • ⁇ -MEM ⁇ -modified Eagle's minimum essential medium in which glucose in the medium is replaced with xylose
  • Ham F12 medium Ham F12 medium
  • MCDB medium Ham F12 medium
  • MCDB medium Ham F12 medium
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 medium and the like
  • DMEM is preferable.
  • the content of xylose in the cell culture medium is not particularly limited, and can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured, the purpose of culture, the type of basal medium, and the like.
  • the content of xylose in the medium may be the same as the amount of glucose in a normal basal medium, and may be, for example, 0.1 to 10.0 g / L, but preferably 0.5 to 10. It is 0 g / L, more preferably 0.5 to 5.0 g / L, still more preferably 0.8 to 5.0 g / L, still more preferably 0.8 to 3.5 g / L.
  • the present disclosure can show a sufficient effect, but since xylose is not toxic and has excellent water solubility, it is usually added in a large amount. However, the problem does not occur substantially.
  • the cell culture medium is preferably used without glucose addition from the viewpoint of suppressing cell proliferation caused by glucose. Therefore, according to one embodiment, the cell culture medium is substantially free of glucose.
  • xylose When xylose is introduced into the medium, it is preferable to introduce xylose by substituting xylose for glucose in the medium used for conventional cell culture.
  • Serum or serum substitute or other components may be added to the medium as needed. Any known serum or serum substitute can be used.
  • the serum includes FBS, FCS and the like, and the serum substitute includes KSR and the like.
  • Other components include non-essential amino acids, pH adjusters, etc.
  • the serum or serum substitute or other component added to the medium is preferably one from which sugar has been removed by membrane treatment.
  • the membrane treatment can be performed by using, for example, a dialysis membrane 36/32 (manufactured by EIDIA Co., Ltd.).
  • the cell culture medium is preferably used as a cell maintenance medium.
  • the "cell maintenance medium” means a culture medium or a composition thereof suitable for culturing the above cells, and undifferentiated and pluripotent of undifferentiated cells and collagen production of fibroblasts. It allows cells to survive for a certain period of time while maintaining a certain number of cells while retaining traits such as ability.
  • the cell maintenance medium of the present disclosure contains the cell proliferation inhibitor, it does not need to substantially contain undifferentiated maintenance factors other than glutamic acid and xylose, which are essential components of the cell medium. It can retain the properties of cells. Therefore, according to one aspect of the present disclosure, the medium of the present disclosure comprises a cell proliferation inhibitor and is substantially free of undifferentiated maintenance factors other than glutamic acid and xylose. Examples of undifferentiated maintenance factors other than glutamic acid and xylose include bFGF (basic fibroblast growth factor), LIF, and feeder cell-derived components.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • LIF feeder cell-derived components
  • a method for controlling cell proliferation which comprises using the cell maintenance medium of the present disclosure to maintain cells.
  • cell proliferation control means to stop the proliferation ability of a cell at a desired time, maintain the cell concentration without causing serious damage to the cell survival, and then at a desired time. It means resuming cell proliferation.
  • cell proliferation control can be performed by substituting the cell maintenance medium of the present disclosure with a normal cell culture medium.
  • the growth speed after resumption of growth can be set to the same level as or higher than that in normal culture.
  • Cell proliferation control may be performed under normal cell culture temperature and environmental conditions.
  • the cell growth suppression period can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured, the purpose of culture, the type of basal medium, the culture temperature, and the like.
  • DMEM in which glucose in the medium is replaced with xylose is used as the cell maintenance medium of the present disclosure and cultured under normal culture conditions
  • cell proliferation can be expected to be suppressed for at least one month, which is preferable.
  • the cell maintenance medium may be exchanged during the growth suppression period. By exchanging the medium, amino acids and protein components in the medium can be replenished even during long-term culture, so that there is an advantage that the properties of cells can be maintained.
  • (1) to (8) are provided.
  • a cell proliferation inhibitor comprising glutamic acid.
  • the cell maintenance medium according to (5) which further contains xylose.
  • a method for controlling cell proliferation which comprises maintaining cells using the medium according to any one of (5) to (7).
  • Glutamic acid addition test (1) Preparation of medium The basal medium for cell culture was prepared so as to have the following composition.
  • DMEM basal medium (hereinafter, also referred to as "w / Glc") (Glucose content 1.0 g / L, xylose content 0 g / L)
  • w / Glc Dulbecco's modified Eagle's medium
  • each component is made into 10% by volume dialysis FBS (GE Healthcare), 50 U / mL penicillin, and 50 ⁇ g / mL streptomycin (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amount of addition was adjusted.
  • Xylose DMEM basal medium (hereinafter, also referred to as "w / Xy") (Glucose content 0 g / L, xylose content 1.0 g / L)
  • modified DMEM M-DMEM, obtained from Cell Science Laboratory Co., Ltd.
  • dialysis FBS 50 U / mL penicillin, and 50 ⁇ g / mL streptomycin (Fuji).
  • the amount of each component added was adjusted so as to be film Wako Pure Medicine), and w / Xy was obtained.
  • Glucose-free DMEM basal medium (hereinafter, also referred to as "w / o Glc") (Glucose content 0 g / L, xylose content 0 g / L) 10% by volume dialysis FBS, 50 U / mL penicillin, and 50 ⁇ g / mL streptomycin (Fuji Film sum) with respect to modified DMEM (M-DMEM, obtained from Cell Science Laboratory Co., Ltd.) from which glucose in DMEM basal medium was removed. The amount of each component added was adjusted so as to be (photopure drug), and w / o Glc was obtained.
  • DMEM basal medium was replaced with a desired cell maintenance medium and cultured (referred to as "0 day after culture”). No medium exchange was performed during the culture period.
  • a DMEM basal medium was used instead of the cell maintenance medium to confirm the cell growth inhibitory effect in the same procedure as above.
  • human fibroblasts or human mesenchymal stem cells were used. Even if they were present, cell proliferation was confirmed while cell death was hardly confirmed.
  • Example 2 During the culture period, the same culture test as in Example 1 was performed except that the medium was changed every 3 days.
  • the number of cells for each culture day is shown in Tables 1 and 2 below.
  • Table 1 shows the results when human fibroblasts were used, and Table 2 shows the results when human mesenchymal stem cells were used.
  • the number of cells is an average value of 3 wells of the number of cell counts measured by the following method.
  • the culture supernatant of the cultured cells was removed by suction, washed with PBS, and then the cells were detached with 0.1% trypsin / 1 mM EDTA solution (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Medium was added to stop the reaction of the exfoliant solution, cells were collected, and cell counting was performed with a Countess TM II Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific).
  • the cell proliferation inhibitor of the present disclosure containing glutamic acid can suppress cell proliferation.
  • the cell proliferation inhibitor of the present disclosure is used in combination with xylose, cell proliferation can be remarkably suppressed, and cell proliferation can be suppressed for a longer period of time. Therefore, it can be said that the cell proliferation inhibitor according to the present disclosure is extremely useful for short-term storage and maintenance of cells, not to mention cryopreservation.

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Abstract

本開示は、グルタミン酸を含んでなる細胞増殖抑制剤、およびそれを用いた細胞の増殖制御方法に関する。

Description

細胞増殖抑制剤 関連出願の参照
　本特許出願は、２０１９年１２月２７日に出願された日本国特許出願２０１９－２３９５７２号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本開示は、グルタミン酸を含んでなる細胞増殖抑制剤、およびそれを用いた細胞の増殖制御方法に関する。
　生物学では、人為的に生体外で培養する培養細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系や再生医療および細胞療法において広く用いられている。その細胞の有する性状を一定に維持するためには、継代を行うことにより培地中にて細胞を増殖し続ける必要がある。しかしながら、初代培養細胞や有限細胞系などの継代回数に制限（寿命）のある株化していない細胞では、継代を行うことによってその細胞の性状が変化することが多い。
　そのため、培養細胞を中～長期間、その性状を一定に維持する場合には、凍結保存を行うのが一般的である。しかしながら、霊長類細胞のような凍結・解凍に弱い細胞では、凍結保存を行うことによる細胞へのダメージが大きい。
　また、増殖スピードの速い細胞や遅い培養細胞の場合、それらを使用する際、所望の細胞濃度に調整することは難しく、熟練が必要であった。一時的に細胞の環境温度を４℃など低温に変化させることにより細胞増殖を抑える方法も知られているが、維持できる時間は数時間単位であった。
　さらに、培養細胞の中でも幹細胞では、継代を行うことによってそれら細胞の有する性状の一つである未分化性（分化能）を失うことが知られている。そこで、未分化性を維持するために、マウスＥＳ細胞の場合は、例えばＬＩＦ（白血病抑制因子）を添加する必要があった。また、霊長類ＥＳ細胞の場合は、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行う必要があった（特開２００７－２２８８１５号公報（特許文献１）参照）。しかしながら、これら未分化維持因子は高価なものが多く、またフィーダー細胞との共存下培養は煩雑なものであった。
　したがって、凍結保存以外の方法で、細胞を継代する必要なく、その有する性状を維持したまま、簡便に細胞の増殖制御をする方法が求められている。
　凍結保存以外の方法として、例えば、特開２００８－１０４４０７号公報（特許文献２）には、還元糖を含む細胞保存液を用いた冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着性細胞の保存方法が開示されている。しかしながら、この方法では低温での冷蔵が必須であり、保存できる細胞の種類も限られていた。
　キシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）は、糖鎖の構成糖の一つであり、細胞間のコミュニケーションなど生体内において重要な役割を担っている。また、キシロースは、木質系バイオマスに豊富に含まれることが知られており、未利用資源として様々な分野での利用用途の拡大が求められている。
　本開示者らは、以前に、各種糖質（グルコース、キシロース、ガラクトースなど）によるマウスＥＳ細胞への影響を確認し、キシロースのマウスＥＳ細胞での未分化を維持できる可能性を報告している（横山忠幸ら，「各種糖含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の増殖及びＥＢ形成への影響」， 第７回日本再生医療学会総会 抄録集， Vol.7， pp.239, 2008（非特許文献１）、横山忠幸ら，「Ｘｙｌｏｓｅ含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の未分化維持に関する有効性の検討」， 第８回日本再生医療学会総会 抄録集， Vol.8， pp.221， 2009（非特許文献２））。
　また、本開示者らは、多能性幹細胞の細胞培養において、一般的な培地に含まれるグルコースをキシロースに代替した培地を用いると、細胞がグルコース以外の糖類をエネルギーとして利用できないため生存できないと考えられていたにもかかわらず、１週間を超える長い期間、通常の培養温度で、生存を維持でき、かつ、細胞増殖を抑えることができることを報告している（特許文献３）。
　しかしながら、線維芽細胞や間葉系幹細胞等をはじめとする広範な霊長類細胞について性状を維持したまま、簡便に細胞の増殖制御をする方法を提供することは依然として重要な課題である。
特開２００７－２２８８１５号公報 特開２００８－１０４４０７号公報 特許６０４２０９９号
横山忠幸ら，「各種糖含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の増殖及びＥＢ形成への影響」， 第７回日本再生医療学会総会 抄録集， Vol.7， pp.239， 2008 横山忠幸ら，「Ｘｙｌｏｓｅ含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の未分化維持に関する有効性の検討」， 第８回日本再生医療学会総会 抄録集， Vol.8， pp.221， 2009
　本開示者らは、今般、特定のアミノ酸を細胞増殖抑制剤として用いると、線維芽細胞や間葉系幹細胞等をはじめとする広範な霊長類細胞について性状を維持したまま、簡便に細胞の増殖制御しうることを見出した。本開示は、かかる知見に基づくものである。
　よって本開示は、細胞増殖抑制剤を提供すること、およびそれを用いた細胞の増殖制御方法を提供することを目的とする。
　本開示の一つの実施態様によれば、細胞増殖抑制剤は、グルタミン酸を含んでなる。
　本開示の一つの態様によれば、本開示による培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。
　本開示の細胞増殖抑制剤によれば、通常の培養条件下において、細胞の性状を維持したまま、細胞の増殖を抑制することができる。また、本開示の増殖抑制剤は、細胞の死滅を抑制しつつ、細胞の増殖を抑制する上で有利に利用することができる。このため、本開示による細胞増殖抑制剤は、凍結保存をするまでもない、細胞の短期間保存および維持に極めて有用である。
　また、本開示による細胞の増殖制御方法は、通常の培地と、本開示の細胞増殖抑制剤を含んでなる培地とを置換する操作のみを行うため、熟練を要さず、大変簡便である。
　さらに、細胞が多能性幹細胞の場合には、本開示の細胞増殖抑制剤を含んでなる培地を使用すると、多能性幹細胞の増殖を抑制しながら細胞を維持するのと共に、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行わなくても、細胞の未分化性と全能性とを保持することができる。したがって、凍結に弱い多能性幹細胞であっても、短期間であれば、凍結保存するのと同じように、未分化性と全能性とを保持したまま、多能性細胞を維持することができる。
グルタミン酸の添加量を調節した細胞維持用培地（キシロースＤＭＥＭ基礎培地、グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地）にてヒト線維芽細胞を培養した際の顕微鏡観察による結果を示す（培養９日目の位相差像、倍率１００倍）。 グルタミン酸の添加量を調節した細胞維持用培地（キシロースＤＭＥＭ基礎培地、グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地）にてヒト間葉系幹細胞を培養した際の顕微鏡観察による結果を示す（培養９日目の位相差像、倍率１００倍）。 グルタミン酸８ｍＭを添加して調節した細胞維持用培地（キシロースＤＭＥＭ基礎培地、グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地）にてヒト間葉系幹細胞を培養した際の顕微鏡観察による結果を示す（培養１２日目の位相差像、倍率１００倍）。
発明の具体的説明
細胞増殖抑制剤
　本開示による細胞増殖抑制剤は、前記したように、グルタミン酸を含んでなる。
　好ましい態様によれば、本開示による細胞増殖抑制剤は、グルタミン酸を有効成分とする。本開示において、「有効成分」とは、本開示の目的である細胞増殖抑制作用を奏する上で必要とされる成分のことを意味する。ここで、細胞増殖抑制作用とは、細胞の生存を維持し、かつ、細胞増殖を抑えることを意味する。細胞増殖を抑制することによって、細胞を保存することができる。
　本開示による細胞増殖抑制剤は、前記したように、キシロースと共に使用される。
　キシロースは、木質系バイオマスに多く存在し、木糖とも呼ばれる五炭糖の単糖である。本開示に用いられるキシロースは、天然に多く存在するＤ－キシロースであってもよいし、合成により調製されるＬ－キシロース、ＤＬ－キシロースであってもよい。本開示で用いられるキシロースは、好ましくは、Ｄ－キシロースである。
　本明細書において細胞とは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、ガン細胞、株化細胞、初代培養細胞、および有限細胞系が包含される。本開示に用いられる細胞は、細胞増殖性が著しく高く、未分化性などの形質を保持する必要がある点で、好ましくは線維芽細胞、間葉系幹細胞または多能性幹細胞であり、より好ましくは線維芽細胞または間葉系幹細胞である。
　線維芽細胞は、結合組織を構成する細胞の1つであり、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸といった真皮の成分を作り出す細胞を包含する。
　間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞への分化能を発揮しうる細胞であり、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。間葉系幹細胞は、採取する組織に応じて分類することができ、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞等が挙げられる。
　多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性ガン細胞（ＥＣ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）が包含される。また、多能性幹細胞は、動物、昆虫などを由来とするものが含まれうるが、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類由来のものである。本開示に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
　ここで「多能性」とは、多分化能とも言い換えることができるが、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力、および外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する少なくともそれぞれ一種の分化細胞に分化しうる性質をいい、生殖細胞への分化能も包含されうる。なお、分化細胞は、将来、体内の組織や臓器を構成する多種類の細胞に分化しうる。多能性を有するか否かは、例えば、ＰＡ６フィーダー細胞と多能性細胞とを共存下培養を行い、神経細胞に誘導されるか否かを評価すること、または各種分化マーカーの発現により判断することができる。
　「未分化性」とは、まだ特定の細胞系列に分化していないことを意味し、幹細胞の階層的には比較的上位に位置する幹細胞が有する性状である。未分化性を有するか否かは、未分化細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ－１を測定することにより判断することができる。
　本開示に用いられるガン細胞とは、ガン由来の細胞を意味する。例えば、膵腺ガン由来細胞、乳腺ガン由来細胞、肝ガン由来細胞などが挙げられる。具体的には、Ｐａｎｃ１、Ｍｉａ－Ｐａ－Ｃａ２またはＭＣＦ７などが挙げられる。
　本開示に用いられる株化細胞とは、不死化した細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ；セルライン）を意味する。例えば、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞などが挙げられる。本開示の増殖抑制剤を用いることにより、無駄な継代を省くことができる。
　本開示に用いられる初代培養細胞とは、生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞を意味する。本開示に用いられる有限細胞系とは、継代回数に制限（寿命）のある継代培養細胞を意味する。本開示の増殖抑制剤を用いることにより、性状の変化しやすい初代培養細胞や有限細胞系を、維持、保存することができる。
　本開示の細胞増殖抑制剤は、生命活動を休止した状態での物質応答性試験や臨床検査に利用することが期待される。
　本開示の一つの態様によれば、本開示の細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞培養用培地が提供される。
　ここで「細胞培養用培地」とは、上記細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、細胞の生存に影響する重大な障害を与えることなく、その細胞の性状を保持したまま、細胞を一定数、一定期間生存させることを可能とするものである。細胞培養用培地は、粉末状であっても、液体状であってもよい。
　細胞培養用培地におけるグルタミン酸の含有量は、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類などに応じて、適宜変更することができる。基礎培地におけるグルタミン酸の含有量は、例えば、０．５μＭ以上とすることができ、好ましくは０．５μＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭ～１０ｍＭ、さらに好ましくは１～１０ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ～８ｍＭ、さらに好ましくは８ｍＭである。
　ここで、基礎培地としては、例えば、培地中のグルコースをキシロースに置換した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、α改変型イーグル最小必須培地（α－ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ培地、フィッシャー培地、およびＲＰＭＩ－１６４０培地等が挙げられるが、ＤＭＥＭが好ましい。
　また、細胞培養用培地におけるキシロースの含有量は特に制限はなく、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類などに応じて、適宜変更することができる。培地におけるキシロースの含有量は、通常の基礎培地のグルコース量と同量であってもよく、例えば、０．１～１０．０ｇ／Ｌとすることができるが、好ましくは０．５～１０．０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～５．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～５．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８～３．５ｇ／Ｌである。なお、本開示による培地中におけるキシロースの含有量が少量であっても、本開示は十分な効果を示すことができるが、キシロースは毒性がなく、水溶性にも優れるため、通常は多量に添加しても問題は実質的に生じない。
　また、細胞培養用培地は、グルコースによる細胞増殖を抑制する観点からは、グルコース不添加で使用することが好ましい。したがって、一つの態様によれば、細胞培養用培地はグルコースを実質的に含有しない。
　キシロースを培地中に導入する場合、キシロースは、従来の細胞培養に用いられる培地中のグルコースをキシロースに置換することにより導入することが好ましい。
　培地には、必要に応じて、血清または血清代替物または他の成分を添加してもよい。血清または血清代替物は、公知のものであればいずれのものも用いることができる。例えば、血清としては、ＦＢＳ、ＦＣＳなどが挙げられ、血清代替物としては、ＫＳＲなどが挙げられる。
　他の成分としては、非必須アミノ酸、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
　培地に添加する血清もしくは血清代替物または他の成分は、好ましくは、膜処理により糖質を除去したものである。膜処理は、例えば、透析膜 ３６／３２（エーディア株式会社製）を用いることにより行うことができる。
　また、細胞培養用培地は、好ましくは細胞維持用培地として使用される。ここで「細胞維持用培地」とは、上記細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、未分化の細胞の未分化性、分化多能性や、線維芽細胞のコラーゲン産生能などの形質を保持しつつ、細胞を一定数のまま、一定期間生存可能とするものである。
　本開示の細胞維持用培地は、上記細胞増殖抑制剤を含んでなるため、細胞用培地に必須の成分とされている、グルタミン酸およびキシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まなくても、細胞の性状を保持することができる。したがって、本開示の一つの態様によれば、本開示の培地は、細胞増殖抑制剤を含んでなり、グルタミン酸およびキシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない。グルタミン酸およびキシロース以外の未分化維持因子としては、例えば、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＬＩＦ、フィーダー細胞由来成分等が挙げられる。
　また、本開示の一つの態様によれば、本開示の細胞維持用培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。
　ここで「細胞の増殖制御」とは、所望の時期に細胞の増殖能を停止させ、細胞の生存に影響する重大な障害を細胞に与えることなくその細胞濃度を維持させ、その後所望の時期に細胞の増殖を再開させることを意味する。具体的には、細胞の増殖制御は、本開示の細胞維持用培地と、通常の細胞培養用培地とを置換することによって行うことができる。ここで、細胞によっては、増殖再開後の増殖スピードを、通常培養と同レベル、またはそれ以上にすることができる。
　細胞の増殖制御は、通常の細胞培養温度および環境条件で行ってもよい。
　細胞の増殖抑制期間は、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類、培養温度などに応じて、適宜変更することができる。例えば、本開示の細胞維持用培地として、培地中のグルコースをキシロースに置換したＤＭＥＭを用いて通常の培養条件にて培養した場合、少なくとも１ヵ月は細胞の増殖を抑制することが期待でき、好ましくは少なくとも２６日間、より好ましくは少なくとも２１日間、さらに好ましくは少なくとも１４日間、さらにより好ましくは少なくとも８日間は、細胞の増殖を抑制することができる。
　なお、細胞維持用培地は、増殖抑制期間中は、培地交換を行ってもよい。培地交換を行うことにより、長期培養時であっても、培地中のアミノ酸やタンパク質成分等を補充できるので、細胞の性質を維持できるという利点がある。
　また、本開示の一つの態様によれば、以下の（１）～（８）が提供される。
（１）グルタミン酸を含んでなる、細胞増殖抑制剤。
（２）キシロースと共に使用するための、（１）に記載の細胞増殖抑制剤。
（３）上記細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞および多能性幹細胞から選択されるものである、（１）または（２）に記載の細胞増殖抑制剤。
（４）上記細胞が、ヒト細胞である、（１）～（３）のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
（５）グルタミン酸を０．５μＭ以上含んでなる、細胞維持用培地。
（６）キシロースをさらに含んでなる、（５）に記載の細胞維持用培地。
（７）グルタミン酸およびキシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない、（５）または（６）に記載の細胞維持用培地。
（８）（５）～（７）のいずれかに記載の培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法。
　以下、実施例により本開示を詳細に説明する。
　なお、特段の記載のない限り、本開示の単位および測定方法は、日本工業規格（ＪＩＳ）の規定に従う。また、特段の記載のない限り、「部」、「％」はそれぞれ、「質量部」、「質量％」を意味し、温度は摂氏を意味する。
　グルタミン酸添加試験
（１）培地の調製
　細胞培養用基礎培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
　ＤＭＥＭ基礎培地（以下、「ｗ／Ｇｌｃ」ともいう。）
　（グルコース含有量１．０ｇ／Ｌ、キシロース含有量０ｇ／Ｌ）
　ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；株式会社細胞科学研究所）において、１０容量％　透析ＦＢＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、５０Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン（富士フィルム和光純薬）となるように各成分の添加量を調整した。
　細胞維持用培地
　（ｉ）キシロースＤＭＥＭ基礎培地（以下、「ｗ／Ｘｙ」ともいう。）
　（グルコース含有量０ｇ／Ｌ、キシロース含有量１．０ｇ／Ｌ）
　ＤＭＥＭ基礎培地中のグルコースをＤ－キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ－ＤＭＥＭ，株式会社細胞科学研究所より入手）において、１０容量％　透析ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン（富士フィルム和光純薬）となるように各成分の添加量を調整し、ｗ／Ｘｙを得た。
　（ｉｉ）グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地（以下、「ｗ／o Ｇｌｃ」ともいう。）
　（グルコース含有量０ｇ／Ｌ、キシロース含有量０ｇ／Ｌ）
　ＤＭＥＭ基礎培地中のグルコースを除去した変法ＤＭＥＭ（Ｍ－ＤＭＥＭ，株式会社細胞科学研究所より入手）に対して、１０容量％　透析ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン（富士フィルム和光純薬）となるように各成分の添加量を調整し、ｗ／o Ｇｌｃを得た。
（２）細胞
　ヒト線維芽細胞の調製
　ヒト線維芽細胞（カタログ番号ＣＣ－２５１１）をゼラチンコートした細胞培養ディッシュ（１００ｍｍカルチャーディッシュ、株式会社サンプラテックより入手）にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養されたものを用いた。培地は、ＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
　ヒト間葉系幹細胞の調製
　ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製、カタログ番号ＰＴ－５００６）を１０μｇ／ｍｌＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）でコートした細胞培養ディッシュ（１００ｍｍカルチャーディッシュ、株式会社サンプラテックより入手）にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養されたものを用いた。培地は、ＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
（３）細胞の増殖抑制作用確認試験
例１
　細胞を培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、細胞を回収し、１２ウェルプレート（Corning株式会社より入手）上に細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記ＤＭＥＭ基礎培地を用いて一晩培養した。
　ＤＭＥＭ基礎培地を、所望の細胞維持用培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。培養期間中、培地交換は行わなかった。
　さらに、細胞培養用の基礎培地に１ｍＭ、５ｍＭまたは８ｍＭのグルタミン酸を添加する以外、上記と同様の培養試験を行った。
　細胞の状態観察
　培養後９日目の細胞を位相差顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製、倍率１００倍）で観察した。
　ヒト線維芽細胞を用いた場合の結果は図１に示される通りであった。
　キシロースＤＭＥＭ基礎培地（ｗ／Ｘｙ）では、グルタミン酸の濃度が高くなるに従い、死滅細胞の数が減少しかつ細胞増殖が抑制されていることが観察された。特にグルタミン酸濃度が、１～８ｍＭの範囲では、死細胞はほとんど観察されなかった。
　グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地（ｗ／o Ｇｌｃ）においても、グルタミン酸の濃度が高くなるに従い、死細胞の数が減少しかつ細胞増殖が抑制されていることが観察された。
　また、ヒト間葉系幹細胞を用いた場合の結果は図２に示される通りであり、ヒト線維芽細胞を用いた場合と同様の傾向が観察された。
　キシロースＤＭＥＭ基礎培地（ｗ／Ｘｙ）では、グルタミン酸の濃度が高くなるに従い、死細胞の数が減少しかつ細胞増殖が抑制されていることが観察された。特にグルタミン酸濃度が、５～８ｍＭの範囲では、死細胞はほとんど観察されなかった。
　グルコース不含ＤＭＥＭ基礎培地（ｗ／o Ｇｌｃ）においても、グルタミン酸の濃度が高くなるに従い、死細胞の数が減少しかつ細胞増殖が抑制されていることが観察された。
　ｗ／Ｘｙでは、ｗ／o Ｇｌｃと比較して、細胞の状態は良好であり、死細胞の数量は大幅に少ないことが観察された。
　なお、対照試験として細胞維持用培地に代えてＤＭＥＭ基礎培地を用いて上記と同様の手順で細胞の増殖抑制作用確認試験を行ったところ、ヒト線維芽細胞またはヒト間葉系幹細胞のいずれを用いた場合も、細胞の死滅はほとんど確認されない一方で、細胞の増殖が確認された。
例２
　培養期間中、３日ごとに培地を交換した以外は、例１と同様の培養試験を行った。
　培養日数毎の細胞数を下記表１および表２に示す。表１は、ヒト線維芽細胞を用いた場合の結果であり、表２は、ヒト間葉系幹細胞を用いた場合の結果である。なお、細胞数は、以下の方法で測定したセルカウント数の３ウェルの平均値である。
　培養後の細胞の培養上清を吸引除去し、ＰＢＳを用いて洗浄後、０．１％　トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（富士フィルム和光純薬）を用いて細胞を剥離した。培地を加えて剥離液の反応を停止させ、細胞を回収し、ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭＩＩ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてセルカウントを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から、ヒト線維芽細胞においては、ｗ／Ｇｌｃ培地を用いたコントロール試験に対して、グルタミン酸を添加することにより、６日後まで細胞の増殖を抑制できた。また、ｗ／Ｇｌｃ培地の代わりに、ｗ／Ｘｙ培地を用いると、細胞増殖の抑制効果は顕著であり、より長期にわたって細胞の増殖を抑制できた。一方、ｗ／Ｇｌｃ培地の代わりに、ｗ／o　Ｇｌｃ培地を用いた場合、ｗ／Ｘｙ培地とは異なり１２日後以降の細胞数が顕著に少なく、細胞死が発生していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から、ヒト間葉系幹細胞においては、ｗ／Ｇｌｃ培地を用いたコントロール試験に対して、グルタミン酸を添加することにより、１８日後まで細胞の増殖を抑制できることが確認できた。また、ヒト線維芽細胞と同様に、ｗ／Ｇｌｃ培地の代わりに、ｗ／Ｘｙ培地を用いると、細胞増殖の抑制効果が顕著であった。さらに、ｗ／Ｇｌｃ培地の代わりに、ｗ／o　Ｇｌｃ培地を用いた場合、図３に示すように、ｗ／Ｘｙ培地とは異なり、細胞の周囲が白くなる割合が多く、細胞の状態が悪化していた。
　グルタミン酸を含んでなる本開示の細胞増殖抑制剤は、細胞の増殖を抑制することができる。そして、本開示の細胞増殖抑制剤は、キシロースと併用することにより、細胞の増殖を顕著に抑制でき、より長期にわたって細胞の増殖を抑制することができる。
　よって、本開示による細胞増殖抑制剤は、凍結保存をするまでもない、細胞の短期間保存および維持に極めて有用といえる。

Claims (8)

  1. 　グルタミン酸を含んでなる、細胞増殖抑制剤。
  2. 　キシロースと共に使用するための、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
  3. 　前記細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞および多能性幹細胞から選択されるものである、請求項１または２に記載の細胞増殖抑制剤。
  4. 　前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞増殖抑制剤。
  5. 　グルタミン酸を０．５μＭ以上含んでなる、細胞維持用培地。
  6. 　キシロースをさらに含んでなる、請求項５に記載の細胞維持用培地。
  7. 　グルタミン酸およびキシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない、請求項５または６に記載の細胞維持用培地。
  8. 　請求項５～７のいずれか一項に記載の培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法。
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