KR101656761B1

KR101656761B1 - 다능성 줄기 세포 및 심근 세포 이외의 분화성 세포에 대해 세포사멸을 유도하는 방법

Info

Publication number: KR101656761B1
Application number: KR1020117022135A
Authority: KR
Inventors: 후미유키 핫토리; 게이이치 후쿠다
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤; 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2016-09-12
Also published as: WO2010114136A1; KR20110134417A; EP2415862A4; RU2551778C2; EP2415862B1; US8735152B2; IL215328A0; CA2755887A1; CN102449139B; AU2010232148B2; RU2011143857A; SG174980A1; US20120094383A1; AU2010232148A1; CA2755887C; EP2415862A1; CN102449139A; JP5620905B2; BRPI1012715A2; JPWO2010114136A1

Abstract

유전자 변형없이도, 배아 줄기 세포나 유도성 다능성 줄기 세포 등의 다능성 줄기 세포와 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 분화성 세포에서 세포 사멸을 유도하지만, 심근 세포에서는 세포 사멸을 유도하지 않는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 물질적인 독성 또는 세포 사멸 유도 작용이 인지되지 않은 물질을 다능성 줄기 세포나 비-심근 세포의 배양 조건에 첨가하여, 매우 효율적인 심근 세포 이외의 세포에 대한 세포 사멸 유도 방법을 구축함으로써, 유전자를 변형시키지 않으면서도 상기 과제를 해결할 수 있다.

Description

다능성 줄기 세포 및 심근 세포 이외의 분화성 세포에 대해 세포사멸을 유도하는 방법{METHOD FOR INDUCING CELL DEATH IN PLURIPOTENT STEM CELLS AND DIFFERENTIATED CELLS OTHER THAN CARDIAC MYOCYTES}

본 발명은 배아 줄기 세포나 유도성 다능성 줄기 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 분화 유도시 심근 세포의 정제 수단으로서, 다능성 줄기 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 분화성 세포에 대해 세포사멸을 유도하는 방법에 관한 것이다.

성체의 심근 세포는 증식 활성이 없어, 중증 심근경색, 심근증 등의 질환의 치료는 심장 이식에 의존하고 있다. 그러나, 현 상황에서는, 심장의 도우너 부족 문제가 해결되지 않고 있어, 심장 이식이 아닌 다른 치료 방법의 개발이 시급히 요구되고 있다. 이에, 심근 세포를 체외에서 제조 및 정제하여, 질환 치료시 이를 심근 세포의 보충으로서 이용하는 방법이, 심장 이식에 의존하지 않으면 안되는 심장 질환자를 구제하기 위한 가장 유망한 방법인 것으로 예상되고 있다.

심근 세포를 수득하기 위한 방법으로는 줄기 세포(예, 배아 줄기 세포나 여러가지 성체 줄기 세포)를 분화시켜 사용하는 방법, 태아로부터 입수하는 방법 등이 알려져 있다. 예컨대, 마우스의 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우에는, 분화를 억제하는 인자(피더 세포, 백혈병 억제 인자(LIF) 등)를, 사람의 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우에는, 분화를 억제하는 인자(피더 세포, 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF) 등)를, 배양액(culture media)으로부터 제거하고 세포괴(배상체: embryoid body)를 형성시킴으로써, 적극적으로 심근 세포로의 분화를 야기하는 방법이, 줄기 세포의 분화 방법으로 알려져 있다.

체외에서 줄기 세포로부터 심근 세포로의 분화 양상은, 생체내 생리적인 발생 단계를 일부 모방하는데, 특히 발생 초기에 이루어지는 현상들과 관련하여, 수정란 세포에서 이루어지는 생리적 발생 양상과 시험관내 분화 양상 간에 많은 공통점이 있다. 체외 심근 세포로의 분화 계보는, 생리적 발생과 동일하게, 먼저 줄기 세포가 미분화된 중배엽 세포로 분화되고, 그 일부가 심근 세포로 예정된 세포(전-심장 중배엽)로 분화된 후, 심근 세포로 분화된다.

다능성 줄기 세포는 장기를 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있는 세포이기 때문에, 이를 심근 세포로만 분화시키는 것은 기술적으로 어렵다. 또한, 모든 다능성 줄기 세포를 동시에 분화 단계로 유도하는 것도 매우 어렵기 때문에, 줄기 세포가 배상체내에 미분화된 상태로 잔존하는 경우가 많이 있다.

따라서, 체외에서 줄기 세포를 심근 세포로 분화 유도하는 경우, 모든 줄기 세포가 부산물로서 심근 세포 이외의 다른 세포를 생성하거나 또는 일부 세포가 미분화된 상태로 잔존할 수 있다는 점에서, 임상적 적용에 유해한 문제를 수반한다. 특히, 잔존하는 미분화 세포는 증식 활성을 가지고 있고 매우 다양한 종류의 세포로 분화가능하므로, 치료에 사용된 생체 이식 세포들 중에 미분화 세포가 잔존하게 된다면 이 미분화 세포로부터 기형종이 발생될 위험성이 매우 높다. 이러한 이유로, 다능성 줄기 세포의 분화 유도를 통해 제조한 심근 세포가 포함된 세포 집단을 그대로 생체내 이식하여 치료에 사용하기 곤란하다. 따라서, 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 이용한 치료를 안전하게 실행하여, 이상적인 치료 효과를 달성하기 위해서는, 미분화된 다능성 줄기 세포를 완전히 배제시켜 고도로 심근 세포를 정제하는 방법(즉, 심근 세포 이외의 세포를 제거하는 방법)의 개발이 필요하다.

현재, 심근 세포의 정제 방법으로는 미리 줄기 세포의 유전자(게놈)에 특정 마커 유전자(예, GFP)를 도입하는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌 1). 그러나, 이러한 방법에는 게놈의 변형이 요구되는데, 그 자체가 윤리적으로 문제가 되며, 또한 세포의 발암율 변화 등과 같이 안정성에 예측하기 어려운 심각한 위험성을 수반한다(비특허 문헌 2). 미분화된 다능성 줄기 세포를 적극적으로 제거하는 방법으로, 유전자 변형을 이용하는 방법이 보고되어 있다(비특허 문헌 3). 또한, 세포 사멸 유도 작용을 하는 것으로 알려져 있는 세라미드계를 사용하여, 배아 줄기 세포에 비교적 특이적인 방식으로 세포 사멸을 유도하는 방법도 보고되어 있다(비특허 문헌 4). 그러나, 이 방법은, 세라미드계로 처리한 후 배양한 세포군에, 무처리 세포군(대조군)에서의 다능성 줄기 세포와 비교하여, 다능성 줄기 세포가 1/3 수준으로 잔존하기 때문에, 충분한 제거 방법이 되지 못한다. 또한, 사람의 배아 줄기 세포의 제거와 관련해서도, 세포 자살을 일으킨 세포가 발견되었다는 것만 기재되어 있을 뿐, 충분한 제거가 이루어졌다는 언급은 없다. 또한, 세포 독성이 있는 항체를 이용하는 방법도 보고되어 있는데(비특허 문헌 5), 이 방법의 경우, 항체 처리 후에도 약 20%의 배아 줄기 세포가 잔존하는 것으로 기술되어 있다. 아울러, 항체의 치료적 처리와 관련하여, 항원성의 회피 등과 같이, 상기 방법을 이용하는데에는 제약이 따른다. 따라서, 세포 사멸을 유도하는 공지의 방법은 심근 질환의 치료에 이용가능한 심근 세포의 정제 방법으로 사용하기에는 개선의 여지가 있으며, 또한 효율이 양호한 새로운 세포 사멸 유도 방법이 요구되고 있다.

Muller, M. et al., FASEB J. 2000; 14: 2540-2548 Schroder, A.R. et al., Cell 2002; 110: 521-529 Schuldiner, M. et al., Stem Cells 2003; 21: 257-265 Bieberich, E. et al., J. Cell Biol. 2004; 167: 723-734 CHOO, A.B. et al., Stem Cells 2008; 26: 1454-1463

본 발명은 유전자를 변형하지 않으며, 배아 줄기 세포나 유도성 다능성 줄기 세포 등의 다능성 줄기 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 분화 세포에서는 세포 사멸을 유도하지만, 심근 세포에서는 세포 사멸을 유도하지 않는 방법의 개발을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 상기한 방법에 따라 기형종 발생 위험이 없고 안전한 고순도의 심근 세포를 다능성 줄기 세포로부터 제조하는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 연구를 거듭한 결과, 물질적인 독성 또는 세포 사멸 유도 작용이 인지되지 않은 물질을 다능성 줄기 세포나 비-심근 세포용 배양 조건에 첨가하여, 단시간에 매우 효율적으로 심근 세포 이외의 분화 세포에 대해 세포 사멸을 유도하는 방법을 구축함으로써, 유전자 변형 없이도 상기 과제를 해결할 수 있음을 확인하였다. 이러한 방법은 심근 세포에 대해서는 세포 사멸을 유도하지 않기 때문에, 효율적인 심근 세포의 정제 방법이 된다.

구체적으로는, 본 발명은 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 분화 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 세포 집단을, 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액 중에서 배양함으로써, 다능성 줄기 세포와 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 분화 세포에 대해 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공하며, 이로써 전술한 과제를 해결할 수 있음이 명확해졌다. 즉, 본 발명은 구체적으로는 이하의 사항에 관한 것이다.

(1) 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포 이외의 다른 세포 및 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포를 포함하는 세포 집단을, 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가지는 고삼투압 용액 중에서 배양함으로써, 다능성 줄기 세포와 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포 이외의 다른 세포에 대해 세포 사멸을 유도하는 방법.

(2) 고삼투압 용액 중에서의 배양을 2시간 이상 수행하는, 상기 (1)에 기재된 방법.

(3) 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액은 배양액에 당질(탄수화물)을 첨가함으로써 제조된 것인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가지는 고삼투압 용액은 0.1∼1 M의 당질을 포함하는 것인, 상기 (3)에 기재된 방법.

(5) 당질이 당 알코올류, 당류 또는 베타인류인 것인, 상기 (3) 또는 (4)에 기재된 방법.

(6) 당 알코올류, 당류, 또는 베타인류가 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세롤, 슈크로스, 글루코스 및 트리메틸글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 (5)에 기재된 방법.

(7) 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가지는 고삼투압 용액은 0.1∼0.6 M의 글리세롤을 포함하는 것인, 상기 (4)에 기재된 방법.

(8) 배양은 10시간 이상 수행되는 것인, 상기 (7)에 기재된 방법.

(9) 세포 집단을 고삼투압 용액에서 배양한 후, 200∼300 mOsm/kg의 통상 삼투압의 배양액으로 복귀시켜 더욱 배양하는, 상기 (1)∼(8) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

본 발명의 방법에 따라, 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포 이외의 다른 분화 세포 및 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포를 포함하는 세포 집단을 처리함으로써, 세포 집단내 미분화된 다능성 줄기 세포와 비-심근 세포를 효율적으로 제거하고, 동시에 심근 세포를 선택적으로 생존시킬 수 있으며, 따라서, 심근 세포를 효율적으로 농화 및 정제할 수 있다.

도 1은 배아 줄기 세포(ES 세포) 유래의 심근 세포와 잔존하는 미분화된 배아 줄기 세포의 면역 염색 결과를 보여준다.
도 2는 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포와 잔존하는 배아 줄기 세포가 혼재된 배양 시스템에 대한 만니톨 처리 결과를 보여준다.
도 3은 만니톨 처리 후 세포에서의 Nkx 2.5 및 Oct-3/4 항체를 이용한 면역 염색 결과를 보여준다.
도 4는 마우스 배아 줄기 세포에 대한 0.45 M 만니톨의 세포 사멸 유도 작용을 보여준다.
도 5는 마모셋 배아 줄기 세포에 대한 만니톨 작용을 보여준다. 미토콘드리아 막 전위 감수성 색소 TMRM를 사용하여 생사를 판정하였다.
도 6은 마모셋 배아 줄기 세포에 대한 만니톨 효과를 보여준다.
도 7은 사람 배아 줄기 세포에 대한 만니톨 효과(FACS 분석)을 보여준다.
도 8은 사람 배아 줄기 세포에 대한 만니톨 효과(직후)를 보여준다.
도 9는 사람 배아 줄기 세포에 대한 만니톨 효과(5시간 후)를 보여준다.
도 10은 사람 배아 줄기 세포의 배상체에 대한 만니톨 처리 결과를 보여준다.
도 11은 사람 배아 줄기 세포 세포의 배상체에 만니톨 처리로 인한 Oct-3/4양성 세포의 사멸을 보여준다.
도 12는 사람으로부터 유도성 다능성 줄기 세포(iPS 세포)에 대한 만니톨의 작용(FACS 분석)을 보여준다.
도 13은 만니톨을 제외한 다른 다양한 당질에 의한, 사람 배아 줄기 세포에 대한 세포 사멸 유도 작용을 보여준다.
도 14는 사람 배아 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포 및 비-심근 세포에 대한 글리세롤의 작용을 보여준다.
도 15는 0.2 M 만니톨이 포함된 배양액에서 48시간 또는 72시간 처리한 세포의 상태를 보여준다. 하단은 각 콜로니의 확대 사진으로, 대표적인 세포 형태를 도시한다.

본 발명자들은 배아 줄기 세포 뿐만 아니라 심근 세포 및 비-심근 세포를 포 함하는 혼합 세포 시스템에 고농도의 만니톨이 용해된 고삼투압 용액을 적용하면, 고삼투압 용액에 노출시, 배아 줄기 세포 및 비-심근 세포에서 세포 사멸이 발생되기 쉽다는 사실을 발견하였다. 이러한 발견에 대해, 보다 상세하게, 만니톨 농도 또는 만니톨 노출 시간과 배아 줄기 세포 및 비-심근 세포의 세포 사멸과의 관련성을 검토한 결과, 저농도의 만니톨에서는 장시간 노출시 효과적으로 배아 줄기 세포 및 비-심근 세포의 세포 사멸이 유도되고, 거의 포화 농도인 1 M에서는 단시간에 배아 줄기 세포의 세포 사멸이 유도됨을 확인하였다.

동시에, 만니톨의 전체 농도 범위에서, 배아 줄기 세포와 비-심근 세포에 대한 사멸이 유발되지만, 배아 줄기 세포로부터 분화된 심근 세포에서는 세포 사멸이 유도되지 않는, 농도 및 시간 조건이 있다는 것을 확인하였다. 즉, 이러한 조건하에서 배양을 수행하는 본 발명의 방법은, 효율적인 배아 줄기 세포 및 비-심근 세포의 제거 방법인 동시에 효율적인 심근 세포의 농화 및 정제 방법이다.

따라서, 본 발명은, 일 구현예에서, 미분화된 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 다른 분화 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 세포 집단을, 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액에서 배양함으로써, 다능성 줄기 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 다른 분화 세포에서 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다.

마우스 배아 줄기 세포로부터 배상체 형성법을 이용하여 분화를 유도하는 경우, 분화 유도 개시 후 3∼6일째의 배상체에 중배엽 또는 심근 세포로 예정된 세포가 포함되어 있는 것으로 여겨진다. 또한, 심근 세포의 출현 시기는 분화 개시 후 7일째(사람의 배아 줄기 세포의 경우에는 10일째)이다. 배상체에는 상기한 것 외에도 미분화 세포, 내피 표피 유사 세포, 신경 세포 등이 포함되어 있다. 배상체를 구성하는 세포를 보다 상세하게 검토하면, 배상체를 구성하는 세포 집단 중 70∼80%가 심근 세포 이외의 다른 분화 세포인데, 여기에 미분화된 배아 줄기 세포가 포함되기도 한다. 이들 오염 세포(contaminating cell)는 활발하게 증식하며, 시간 경과에 따라 존재율이 증가된다. 본 발명자들은 이러한 세포 구성의 배상체를 배양액 중에서 적절한 범위의 고삼투압에 노출시켰을 때, 배상체내에 잔존하는 배아 줄기 세포나 심근 세포 이외의 다른 분화 세포에서 세포 사멸이 발생됨을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 이러한 조건에서 배양하더라도 심근 세포에서는 세포 사멸이 발생되지 않으며, 생리적 삼투압을 가진 배양액으로 교체하였을 때 자율 박동이 재개됨을 확인하였다.

본 발명의 방법에서, 세포의 공급원은 심근 세포가 포함된 세포 집단이라면 어떠한 공급원으로부터 유래된 세포 집단이라도 가능하며, 예컨대 다능성 줄기 세포(배아 줄기 세포(ES 세포), 성체 줄기 세포, 유도성 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등이 포함됨)로부터, 공지된 심근 세포 유도 조건을 사용하여 분화시킨 심근 세포를 포함하는 세포 집단을 이용하거나, 배아 조직으로부터 유래된 세포 집단을 이용하여, 본 발명의 방법을 실시할 수 있다. 이와 같이 하여 다능성 줄기 세포로부터 분화시킨 심근 세포를 포함하는 세포 집단에는, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포 외에도, 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포 이외의 다른 분화 세포가 포함될 수 있다.

본 발명의 방법은, 이러한 세포 집단을, 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 사용되는 삼투압은 심근 세포를 제외한 다른 세포(다능성 줄기 세포 및 심근 세포 이외의 분화 세포)에 대해서는 세포 사멸을 유도하지만, 심근 세포에서는 세포 사멸을 유도하지 않는 삼투압이다. 이러한 삼투압은 370 mOsm/kg 이상, 바람직하게는 370 mOsm/kg∼1600 mOsm/kg, 보다 바람직하게는 370 mOsm/kg∼1000 mOsm/kg, 보다 더 바람직하게는 480 mOsm/kg∼1000 mOsm/kg, 가장 바람직하게는 700 mOsm/kg∼1000 mOsm/kg이다. 통상적으로 시험관내 배양 조건에서의 삼투압이 약 200∼300 mOsm/kg(통상 또는 생리학적 삼투압이라 함)임을 감안하면, 상기한 수치는 매우 높은 수치이며, 이 조건 하에서 배양하면 심근 세포를 제외한 다른 세포들은 모두 사멸하게 된다.

배양액에 당질을 첨가하여 제조한 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액을 사용하는 경우, 본 발명의 방법은, 상기 고삼투압 용액 중에서 2시간 이상, 바람직하게는 2∼72시간, 보다 바람직하게는 2∼48시간, 보다 더 바람직하게는 2∼24시간, 가장 바람직하게는 4∼12시간 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 사람 ES 세포나 iPS 세포를 포함하는 미분화된 다능성 줄기 세포 또는 심근 세포 이외의 다른 분화 세포에서만 세포 사멸을 유도할 수 있는 조건은, 고삼투압 용액의 삼투압 정도와 세포의 고삼투압 용액 노출 시간 간의 상관관계에 따라 결정된다. 즉, 심근 세포의 유도에 사용되는 세포 종은 관련없으며, 고삼투압 용액의 삼투압이 높으면 높을 수록 세포의 고삼투압 용액 노출 시간은 짧아지며, 고삼투압 용액의 삼투압이 낮게 설정될 수록 그에 따라 세포의 고삼투압 용액 노출 시간은 길게 설정되어야 한다.

본 발명의 방법에서, 고삼투압 용액에 세포 집단을 노출시키면, 심근 세포를 제외한 다른 세포(미분화된 다능성 줄기 세포 또는 비-심근 세포)에서 세포 사멸을 유도(즉, 세포 사멸이 유도되거나 또는 세포 사멸 신호가 부여됨)할 수 있다. 이렇게 세포 사멸이 유도된 세포는 고삼투압 용액 중에서 세포 사멸되거나, 또는 고삼투압 용액에서 통상의 배양액으로 복귀된 후에 사멸된다.

본 발명의 방법에서, 세포 사멸은 세포를 생리학적인 스트레스에 노출시키는 것에 의해 유도되므로, 살아 남은 세포에 유전적인 손상을 초래하지 않으면서 목적한 세포를 제외한 다른 세포에서만 세포 사멸을 유도할 수 있다는 점에서, 직접 유전자에 손상을 가하는 물리적인 조건(방사선 스트레스나 산화 스트레스 등)이나 화학적인 조건(화합물 스트레스)에 의한 세포 사멸 유도보다 더 바람직하다. 보다 구체적으로는, 생리학적인 스트레스를 견디고 살아 남은 세포는, 세포 사멸을 유도하기 위한 생리학적인 스트레스를 제거한 배양 조건으로 복귀시키면, 다시 원래의 세포 기능을 회복하여, 정상적인 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 특징은, 생체외에서 제조된 조직 또는 조직을 구성하는 세포를 체내 이식하는 재생 의료 현장에, 이용하기 매우 용이한 특징이다.

본 발명에서 "370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액"은 세포의 대사에 영향을 미치지 않고, 삼투압만 370 mOsm/kg 이상인 고삼투압 용액을 의미하며, 예컨대 배양액에 당질(탄수화물)을 첨가하여 제조한 것을 예로 들 수 있다. 본 발명에 이용가능한 당질의 예로는, 세포의 대사에 영향을 미치지 않으면서 배양액의 삼투압을 높일 수 있는 당질, 즉 본 발명의 배양액 중에 첨가할 수 있는 당질의 예로는, 예를 들어, 당류(단당류, 올리고당류, 다당류), 글리코사미노글리칸류, 아미노글리코시드류, 당 알코올류 또는 베타인류를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 표 1에 기재된 물질을 들 수 있다.

당질 (탄수화물)
분류 (대분류)	분류 (소분류)	구성물질의 예
단당류	트리오스	케토트리오스(디하이드록시아세톤), 알도트리오스(글리세르알데하이드)
	테트로스	케토테트로스(에리트룰로스), 알도테트로스(에리트로스, 트레오스)
	펜토스	케토펜토스(리불로스, 자일룰로스)
		알도펜토스(리보스, 아라비노스, 크실로스, 리소스)
		데옥시당(데옥시리보스)
	헥소스	케토헥소스(사이코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스)
		알도헥소스(알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스)
		데옥시사카라이드(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)
	헵토스	세도헵툴로스
올리고당류	이당류	슈크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 투라노스, 셀로바이오스)
	삼당류	라피노스, 멜레지토스, 말토트리오스
	사당류	아카르보스, 스타키오스
	그외 올리고당	프럭토올리고당(FOS), 갈락토올리고당(GOS), 만난올리고당(MOS)
다당류	다당류	글리코겐, 스타치(아밀로스, 아밀로펙틴), 셀룰로스, 덱스트린, 글루칸(β1,3-글루칸)
		프럭토스: 프럭탄(이눌린, 레반 β2->6)
		N-아세틸글로코사민: 키틴
글리코사미노글리칸류		헤파린, 콘드로이틴 설페이트, 히알루로난, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트
아미노글리코시드류		카나마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 네오마이신, 파로모마이신, 어프라마이신, 젠타미신, 네틸미신, 아미카신
당 알코올류		에리트리톨, 글리세롤, 이소말토락티톨, 말티톨, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, D-트레이톨, L-트레이톨, D-아라비니톨, L-아라비니톨, 리비톨(아도니톨), D-이디톨, 갈락티톨(둘시톨), 볼레미톨, 퍼세이톨
베타인류		카르니틴, 트리메틸글리신(베타인)

또한, 소르비톨(당 알코올류), 트리메틸글리신(베타인류) 등의, 생리적으로 생체내에서 삼투압 조절과 관련있는 물질을 사용하는 경우에도, 본 발명의 효과가 인정되므로, 유기 삼투압 조절 물질(organic osmolyte)로서 베타인, 타우린, 이노시톨, 글리세로포스포콜린(glycerophosphocholine) 등을 사용할 수 있다.

배양액에 당질을 첨가하여 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액을 제조하는 경우, 고삼투압 용액에 0.1∼1 M(mol/L)의 당질, 바람직하게는, 0.1∼0.6 M의 당질이 포함되는 것을 특징으로 한다. 당질 농도(mol/L)와 삼투압(mOsm/kg)의 상관관계는 거의 직선형 관계에 가까울 수 있어, 0.1 M의 당질이 포함된 고삼투압 용액은 약 370 mOsm/kg의 삼투압을 가진 고삼투압 용액이며, 1 M의 당질이 포함된 고삼투압 용액은 약 1300∼1600 mOsm/kg의 삼투압을 가진 고삼투압 용액이다.

단, 당질이 글리세롤인 경우에는, 고삼투압 용액에 0.1∼0.6 M의 글리세롤, 바람직하게는 0.1∼0.5 M의 글리세롤이 포함되는 것을 특징으로 하고, 이러한 고삼투압 용액 중에서 10시간 이상, 예를 들면 10∼24시간, 바람직하게는 10∼18시간 배양하는 것을 특징으로 한다.

각각의 당질을 사용하여 고삼투압 용액을 제조하는 경우의, 당질 농도와 삼투압의 상관관계를 대표적인 당질을 들어 아래 표에 나타낸다.

당질 농도와 삼투압(실측치)

농도(M)	0	0.45	0.6	0.9
글리세롤	258	706	869	1232
글루코스	258	758	939	1336
만니톨	258	717	875	1234
슈크로스	258	779	988	1496
자일리톨	258	779	940	1230
소르비톨	258	748	922	1289
베타인	258	763	965	1421

본 발명의 방법에서, 세포 집단을 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가지는 고삼투압 용액에서 배양하여, 다능성 줄기 세포나 비-심근 세포에 대해 세포 사멸을 유도한 후, 통상의 삼투압(즉, 200∼300 mOsm/kg의 삼투압)을 가진 배양액으로 복귀시켜 추가로 배양하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용되는 고삼투압 용액에서 배양하면, 심근 세포에서는 세포 사멸이 일어나지 않지만, 일시적으로 박동이 정지되는 경우가 있다. 그러나, 이런 경우에도, 통상의 삼투압을 가진 배양액으로 복귀시키면, 다시 박동이 개시되어, 심근 세포로서 기능할 수 있다. 또한, 고삼투압 용액 중에서 세포 사멸 신호를 받았지만 외관상 여전히 생존하고 있는 것처럼 보이는 세포도 있다. 이러한 세포를 배양된 세포 집단에서 제거하기 위해, 세포 집단을 통상의 삼투압을 가진 배양액으로 복귀시켜, 더욱 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은, 실시예에서 조사한 모든 세포(즉, 마우스 유래의 배아 줄기 세포, 마모셋 유래의 배아 줄기 세포, 사람 유래의 배아 줄기 세포, 사람 유래의 iPS 세포)들에서 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 본 발명의 방법은 동물 종에 의존되지 않았으므로, 본 발명의 방법은 마우스에서부터 사람에 이르는 모든 포유동물 유래의 세포에 적용할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 배아 줄기 세포 및 유도성 다능성 줄기 세포에서도 본 발명의 방법을 이용하여 목적을 달성할 수 있는 것으로 확인되어, 다능성 줄기 세포가 유전자 조작이 행해지지 않은 줄기 세포(예, 배아 줄기 세포)이거나 유전자 조작이 행해진 줄기 세포(예, iPS 세포)인 것과는 무관하게, 적용가능한 것으로 보인다.

예를 들어, 본 발명의 방법을 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 분화된 심근 세포를 포함하는 세포 집단을 대상으로 하여 구체적으로 설명한다. 먼저, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포를 분화용 배양액(예, α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO)으로 이루어지는 배양액)에서, 행잉-드롭법 등으로 부유 배양하여 심근 세포로 적절하게 분화 유도함으로써, 심근 세포를 포함하는 배상체를 형성시킨다. 심근 세포로 분화 후, 2일 이상의 추가적인 성숙 기간을 거친 다음, 배상체 배양용 배양액을 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 슈크로스 또는 자일리톨이 0.1∼1 M로 포함된 무혈청 α-MEM 배양액 또는 무혈청 D-MEM 배양액(즉, 고삼투압 용액)으로 교체하여, 소정 시간 동안 고삼투압 용액인 배양액에 추가로 노출시킨다. 이렇게 고삼투압 용액에 노출시켜, 심근 세포 이외의 세포(미분화된 다능성 줄기 세포 또는 비-심근 세포)에 세포 사멸을 유도하거나 또는 세포 사멸 신호를 부여할 수 있다.

고삼투압 용액에 노출시키는 배양을 종료한 다음, 처리한 세포를 통상의 삼투압을 가진 배양액으로 교환하여 추가로 계속 배양하면, 심근 세포만 선택적으로 배양 조건에서 생존하게 할 수 있다. 필요에 따라, 효소 처리에 의한 세포의 분산화, 배양액의 교환 또는 원심분리 등의 방법들 중 어느 하나 또는 이들 조합을 이용한 세포 세정에 의해, 세포 사멸이 발생된 비-심근 세포를 적극적으로 제거할 수도 있다.

본 발명의 방법에 따라, 심근 세포 및 미분화 세포를 포함하는 비-심근 세포 둘다를 포함하는 세포 집단을 고삼투압 용액에 노출시키면, 세포 집단에 포함된 비-심근 세포 중 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 세포를 사멸되게 유도할 수 있다.

실시예

본 발명을 아래 실시예를 들어 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시한 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

실시예 1: 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포와 잔존하는 미분화 배아 줄기 세포의 면역염색

본 실시예에서는 줄기 세포로부터 심근 세포를 포함하는 세포괴(배상체)를 형성시킨 경우, 세포괴(배상체)내 심근 세포와 미분화 세포의 혼재된 상태를 확인하고자 하였다.

마우스 배아 줄기 세포(세포주 명칭 EB3, Nat Genet 2000; 24:372-376)는 독립 행정법인 이화학 연구소의 니와 히토시 박사의 호의로 제공받았다. 이 마우스 배아 줄기 세포는, 기존의 방법(Bader A, et al., Differentiation 2001, 68, p31-43)(즉, 배양액[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO)]을 이용하여, EB 당 75개의 배아 줄기 세포를 행잉-드롭법에 의해, 세포괴로서 총 7일간 배양하는 방법)에 따라, 심근 세포를 포함하는 세포괴로 분화시킨 다음, 배상체를 상기 배양디쉬에 접착시켜, 37℃, 5% 이산화탄소의 조건 하에서 3∼5일간 배양하였다.

수득한 배상체를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 0.1% Triton X100을 처리하여 세포막을 반-가용화하였다. 4% BSA 용액으로 블록킹한 다음, 발생 최초기에 심근 세포로 예정된 세포에서 발현되는 것으로 여겨지는 Nkx 2.5에 대한 항체(염소 항-Nkx2.5 항체(Santacruz 사; No. N-19)와, 마우스 배아 줄기 세포의 미분화능 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 공지된 전사 인자 Oct-3/4에 대한 항체(마우스 항-Oct-3/4 단일 클론 항체, BD Transduction Laboratories 사, No.084720)를, 각각 1차 항체로서 블록킹 용액으로 100배 희석한 다음, 4℃에서 12시간 동안 침투시켰다. 4번 세정한 후, 각각의 항체에 대한 2차 항체로서 Alexa Flow 488로 표지된 당나귀 항-염소 항체(Molecular Probe 사)와 TRITC로 표지된 토끼 항-마우스 항체(DAKO 사)를 모두 1/200로 희석한 후, 실온에서 1시간동안 침투시켰다. 세정한 후, 핵 DNA 염색 시약인 DAPI(Molecular probe 사)가 포함된 용액을 사용하여, 실온에서 5분간 핵 염색한 다음, 세정한 후 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 결과는 도 1에 나타낸다. 도 1의, 2개의 배상체 (a) 및 (b)에서, 좌측 위: Oct-3(적색), 우측 아래: Nkx2.5(녹색), 우측 위: Oct-3(적색)과 Nkx2.5(녹색)을 중첩시킨 것으로, 이미지에 DAPI 염색(청색)을 추가로 중첩시킨 것, 및 좌측 아래: 위상차 이미지를 각각 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 배상체 (a) 및 (b)는 각각, 하나의 배상체내에 Oct-3/4 양성인 미분화 세포와 Nkx 2.5 양성인 심근 세포가 공존하는 것으로 판명되었다.

실시예 2: 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포와 잔존하는 배아 줄기 세포가 혼재된 배양 시스템에 있어서 당질(당 알코올류)의 처리

본 실시예에서는 배아 줄기 세포로부터 형성된 심근 세포를 포함하는 세포괴(배상체)에 당질(당 알코올류)을 처리한 후, 심근 세포의 배양 상태와 다른 세포의 배양 상태를 확인하는 것을 목적으로 하였다.

마우스 유래의 배아 줄기 세포를 실시예 1에 기재된 방법을 통해 배상체로 형성시키고, 이를 심근 세포로 예정된 세포(전-심장 중배엽)가 포함된 단계로 분화시켰다. 수득한 배상체를, 세포 손상을 야기하지 않도록 주의하면서 소화 효소(트립신, 콜라게나제)로 처리하여 부분적으로 분산시킨 다음, 다시 접착 배양을 실시하였다. 5일간 계속 배양한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 자율 박동을 나타내는 심근 세포의 집단(적색선으로 둘러싸인 세포 집단), 배아 줄기 세포형의 세포 형질을 가진 세포 집단(노란색선으로 둘러싸인 세포 집단), 및 그 외의 세포 집단이 혼재된 상태가 된다(도 2(a) 참조).

다음으로, 이러한 혼성 배양물의 배양액을 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨)의 만니톨과 ITS{인슐린(10 mg/L), 트랜스페린(5.5 mg/L), 소듐 셀레나이트(6.7 mg/L)}(GIBCO 사)이 포함된 무혈청 α-MEM 배양액으로 교체하여, 36시간 동안 배양하였다. 그 결과, 이 단계에서, 이미 대다수의 세포가 전형적인 세포 사멸 신호들을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 그 후, 배양액을 20% 소 태아 혈청이 포함된 α-MEM 배양액으로 교환하여 계속 배양한 결과, 1∼2일 이후에 심근 세포의 자율 박동이 회복되었다. 반면, 배양 디쉬 상에 단층을 형성하며 확산되어 있는 미분화 세포(배아 줄기 세포)(도 2(a) 우측 하단 참조)를 비롯하여, 심근 세포를 제외한 다른 비-심근 세포들은 거의 모두 사멸한 것으로 확인되었다(도 2(b) 참조).

도 2에 도시한 배양물을 실시예 1과 동일한 방법으로 Nkx 2.5 및 Oct-3/4에 대해 면역염색하였고, 그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서, 좌측 상단의 위상차 이미지에서 사각으로 둘러싸인 세포에 대해, 좌측 하단에 Nkx 2.5 항체 염색 결과(녹색)를, 우측 상단에 DAPI 염색 결과(청색)를, 그리고 우측 하단에 Nkx 2.5 항체 염색 결과(녹색)와 DAPI 염색 결과(청색)를 중첩시킨 이미지로서 각각 나타낸다. 그 결과, 수득된 세포의 98% 이상이 Nkx 2.5 양성인 심근 세포이고(도 3 좌측 하단과 우측 하단 참조), Oct-3/4 양성인 미분화 세포는 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3: 마우스 배아 줄기 세포에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 마우스 배아 줄기 세포를 당질(당 알코올류)로 처리한 후 줄기 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

미토콘드리아의 막 전위는 죽은 세포에서는 소멸되기 때문에, 생존의 지표가 되는 막 전위 검출시 형광을 발하는 미토콘드리아 막 전위 감수성 시약, 즉 TMRM(Molecular Probes 사)으로 염색하였을 때, 이 시약으로부터 발생되는 형광 신호는 생존 세포에서는 높고, 죽은 세포에서는 낮다.

이러한 특성을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 배양한 배아 줄기 세포를 만니톨 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨) 및 1 μM TMRM이 포함된 α-MEM 배양액에서, 0 (Pre), 3시간, 6시간, 20시간 동안 배양한 다음, 회수한 배아 줄기 세포를 세정하고, FACS 분석하여, 미토콘드리아 막 전위 감수성 시약 TMRM의 형광 강도에 따라 줄기 세포의 생존 상태를 확인하였고, 이를 도 4에 나타내었다. 도 4에서, 0 (Pre), 3시간, 6시간, 20시간 배양물 각각에 대한 FACS 분석 결과로서, 점 그래프에서 경계선 위쪽의 세포는 살아있는 세포이고, 경계선 아래쪽의 세포는 죽은 세포이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 처리 전(Pre)에는 거의 모든 세포가 살아있었지만, 3시간의 만니톨 처리 후에는 약 90%가 사멸하였고, 6시간 처리 후에는 98%가, 20시간 처리 후에는 세포 모두가 사멸하였다(도 4).

실시예 4: 마모셋 배아 줄기 세포에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 마모셋의 배아 줄기 세포에 당질(당 알코올류)을 처리한 후 줄기 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

마모셋의 배아 줄기 세포는, 재단법인 실험동물 중앙 연구소로부터 입수하였다(Stem Cells. 2005 Oct; 23(9): 1304-13). 기본적인 배양 방법 역시 상기 문헌에 기술된 방법에 따라 행하였다. 즉, 마모셋 배아 줄기 세포의 미분화 상태를 유지하는 배양은, 미토마이신 C의 처리에 의해 증식이 불활성화된 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblast; MEF)를 사용하여 행하였다. 배양액으로는, KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트, 및 8 ng/ml 재조합 사람 백혈병 저해 인자(LIF; Chemicon) 또는 재조합 사람 염기성 섬유모포 증식 인자(bFGF; Peprotech)를 사용하였다. 계대시 0.1% III 콜라게나제(Wortington)를 사용하여, 37℃에서 10분간 처리함으로써, ES 콜로니를 분리하였다.

계대 후, TE(0.25% 트립신(GIBCO) 및 1 mM EDTA)를 사용하여 세포를 각각 분산시킨 다음, 문헌(Watanabe K, et al., Nat Biotechnol., 2007, 25: 681-686, Epub 2007 May 27)에 따라, 선택적 Rho-관련 키나제(ROCK) 저해제(Y27632)를 10 μM로 첨가하여, 세포 사멸을 억제하였다. 동시에, 50 nM TMRM를 사용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하였다.

염색한 세포 중 일부는 만니톨 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨)이 포함된 α-MEM 배양액에서 2시간 처리하여, 세포 샘플을 제작하고, 염색한 세포의 나머지는 만니톨이 첨가되지 않은 α-MEM 배양액에서 2시간 처리하여, 대조군 세포 샘플을 제작하였다. FACS로 분석하기 전에, 대조군의 경우, 세포들이 서로 접착되어 세포괴를 형성하고 있어, 다시 TE로 처리하여 세포를 각각 분산시켰다. 그 후, 만니톨 2시간 처리한 세포와 대조군 세포를, 각각, TMRM의 형광 강도에 따라, FACS에 의해, 미토콘드리아 막 전위 유무를 분석하여, 줄기 세포의 생존 상태를 확인하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 그 결과, 대조군(도 5(a))과 비교하여, 만니톨을 2시간 처리하는 경우 거의 모든 세포에서 막 전위가 소실되는 것으로 확인되었다(도 5(b)).

또한, 동시에, 만니톨 2시간 처리한 세포와 대조군 세포에 대해, 염색된 세포의 사진을 촬영하였다(도 6(a)). 이어, 이들 세포를 각각 5일간 배양액[KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트, 및 8 ng/ml 재조합 사람 백혈병 저해 인자(LIF; Chemicon)]에서 접착 배양한 결과, 대조군 세포(즉, 만니톨 미처리 세포)에서는 다수의 생존 세포가 발견되었다(도 6(b) 하단). 그러나, 만니톨에 노출시킨 세포에서는 생존 세포를 전혀 관찰할 수 없었다(도 6(b) 상단).

실시예 5: 사람 배아 줄기 세포에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 사람 배아 줄기 세포에 당질(당 알코올류)을 처리한 후 줄기 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

사람 배아 줄기 세포는 쿄토 대학의 재생 의과학연구소 부속 줄기 세포 의학 연구 센터(국립 생물 자원 프로젝트에 따른 ES 세포 센터)로부터 입수하였다(문헌: Suemori H, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 345, 2006, p. 926-932). 기본적인 배양 방법은 상기 문헌에 따라 실시하였다. 즉, 사람 배아 줄기 세포를, 미토마이신 C 처리에 의해 증식 불활성화한 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblast; MEF)를 사용하여 미분화 상태를 유지하도록 배양하였다. 배양액은, F12/DMEM(1:1)(SIGMA, 제품 번호 D6421), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.1 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트 및 재조합 사람 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF; Peprotech)를 사용하였다. 계대시에는 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 사용하여, 37℃에서 10분 처리함으로써, 배아 줄기 세포의 콜로니를 분리하였다.

계대 후, TE(0.25% 트립신(GIBCO) 및 1 mM EDTA)를 사용하여 세포를 개별 분산시킨 다음, 문헌(Watanabe K, et al., Nat Biotechnol., 2007, 25: 681-686, Epub 2007 May 27)에 따라, ROCK 저해제(Y27632) 10 μM를 첨가하여, 세포 사멸을 억제하였다. 동시에, 50 nM TMRM을 사용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하였다.

이렇게 염색한 세포는, 일부는 만니톨 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨)이 포함된 α-MEM 배양액에서 2, 3 또는 4시간 처리하여, 세포 샘플로 제작하고, 또 일부는 만니톨이 첨가되지 않은 α-MEM 배양액에서 2시간 처리하여, 대조군 세포 샘플로 제작하였다. FACS로 분석하기 전에, 대조군의 경우, 세포들이 서로 접착되어 세포괴를 형성하고 있어, 양 그룹들에 대해 동일하게 트립신과 EDTA 처리를 실시하여, 세포를 분산시켰다. 그 후, 만니톨 2, 3 또는 4시간 처리한 세포와 대조군 세포를, 각각, TMRM의 형광 강도에 따라, FACS에 의해, 미토콘드리아 막 전위 유무를 분석하여, 줄기 세포의 생존 상태를 확인하였으며, 이를 도 7에 나타내었다. 그 결과, 대조군(도 7(a))과 비교하여, 만니톨을 2시간 처리하는 경우 거의 모든 세포에서 막 전위가 소실되는 것으로 확인되었다(도 7(b)).

또한, 만니톨 2시간 처리한 세포와 대조군 세포에 대해 TMRM 염색된 세포의 사진을 촬영하였다(도 8). 만니톨 무처리 세포(도 8 상단)는 세포간 접착을 통해 자가-응집괴를 형성하고 있었지만, 만니톨 처리 세포(도 8 하단)는 분산된 상태로 있었다(도 8).

이어서, 이들 세포를 각각 5일간 배양액[F12/DMEM(1:1)(SIGMA, 제품 번호 D6421), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.1 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트, 및 재조합 사람 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF; Peprotech)]를 사용하여 접착 배양한 결과, 대조군 세포(즉 만니톨 무처리 세포)에서 다수의 생존 세포가 발견되었다(도 9 상단). 그러나, 만니톨에 노출시킨 세포에서는 생존 세포를 전혀 볼 수 없었다(도 9 하단).

실시예 6: 사람 배아 줄기 세포 유래의 배상체내 잔존하는 줄기 세포에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용 및 심근 세포의 농화

본 실시예에서는 사람 배아 줄기 세포로부터 형성된 심근 세포를 포함하는 세포괴(배상체)에 당질(당 알코올류)을 처리한 후, 심근 세포의 배양 상태와 다른 세포의 배양 상태를 확인하고자 하였다.

사람의 배아 줄기 세포를 계대 조작한 후, 배양액[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA), 10%FBS(EQUITEC BIO), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO)]에서 부유 배양하여 배상체를 유도하였다. 분화 개시(부유 배양 개시)로부터 14일째 내지 18일째에, 자율 박동성을 가진 세포가 분화되었으며, 이 세포는 별도로 심근 세포임을 확인하였다.

분화 개시한 지 3개월 경과 후, 배상체는 여전히 자율 박동성을 유지하였다. 이에 부분적으로 0.1% 콜라게나제(Wortington사) 및 0.1% 트립신(DIFCO사)에 의한 효소 처리를 수행하여, 미세한 세포괴로 분산시켰다. 이를 2개로 분할하여, 한쪽에는 만니톨 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨)을 첨가하여 2시간 처리하고, 다른 한쪽에 대조(컨트롤)군으로서 만니톨 처리군과 동량의 생리적 삼투압 용액 Ads buffer(116.4 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 5.6 mM 덱스트로스, 10.9 mM NaH₂PO₄, 405.7 μM MgSO₄, 20 mM Hepes, pH7.3) 만 첨가하여 2시간 처리하였다. 처리 후, 양쪽 세포군 모두 10% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM 용액에서 3일간 접착 배양하였다.

3일 후, 이를 현미경 하에서 관찰하였는데, 대조군 세포를 배양한 디쉬에서는 세포질 대비 핵의 점유 면적이 큰 미분화 세포로 여겨지는 세포 집단으로 이루진 콜로니가 다수 발견되었다. 그러나, 만니톨 처리한 세포를 배양한 디쉬에서는 이러한 세포 집단은 전혀 발견되지 않았다.

만니톨 처리한 세포를 배양한 디쉬에서는, 대신에 자율 박동하는 세포 집단이나 자율 박동하는 단세포가 접착 또는 부유하고 있었다. 이들 세포를, 배아 줄기 세포의 마커이며 핵내 전사 인자인 Oct-3/4 단백질과, 심근 세포 마커이며 핵내 전사 인자인 Nkx 2.5 단백질의 발현에 대해, 각각에 대한 특이적인 2종의 항체(마우스 항 Oct-3/4단일 클론 항체, BD Transduction Laboratories 사 No.084720, 및 염소 항 Nkx 2.5 항체, Santacruz 사 No.N-19)를 1차 항체로 사용하여, 실시예 1과 동일한 실험 단계에 따라 분석하였다. 상기 2개로 분할한 샘플들 중 대조군의 결과는 도 10에, 만니톨을 2시간 처리한 실험군의 결과는 도 11에, 각각 나타낸다. 도 10에서 상단은 심근 세포이고, 하단은 배아 줄기 세포이다.

그 결과, 대조군에서 다수 발견된 배아 줄기 세포형 콜로니는 Oct-3/4 양성이므로, 배아 줄기 세포인 것으로 추측된다(도 10 하단). 또한, 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당함) 만니톨을 처리하였을 때 발견된 자율 박동 세포는 Nkx 2.5 양성이었으며, 심근 세포로 동정되었다(도 11(a)). 이들 결과로부터 만니톨 처리가 미분화 줄기 세포에 세포 사멸을 유도하지만, 심근 세포에 대해서는 현저한 독성을 나타내지 않는다는 것이 강하게 시사되었다(도 10, 도 11).

또한, 본 처리 방법은 사람 배아 줄기 세포에서도, 줄기 세포에 대해 효율적으로 세포 사멸을 유도하는 방법인 것으로 확인되었다. 반면, 심근 세포에 대해서는 세포 사멸을 유도하지 않으므로, 심근 세포의 농화 방법으로서 이용할 수 있는 것으로 확인되었다. 만니톨 처리 후 1주일째에, 면역 조직 화학적 방법을 이용하여 생존 세포의 종류와 수를 검토한 결과, 대조군의 세포(무처리군)와는 대조적으로, 생존 세포는 대부분 Nkx2.5 양성인 심근 세포이었으며, Oct-3/4 음성인 세포는 거의 발견되지 않았다(도 11(b)).

실시예 7: 사람 유도성 다능성 줄기 세포(iPS 세포)에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 사람의 유도성 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 당질(당 알코올류) 처리한 후 iPS 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

사람의 iPS 세포는 쿄토 대학 재생 의과학연구소 부속 줄기세포 의학연구센터(국립 생물자원 프로젝트에 따른 ES 세포센터)로부터 입수하였다. 기본적인 배양 방법은 사람 배아 줄기 세포에서와 동일하며, 실시예 5에 기재한 방법과 동일한 방법으로 배양하였다. 계대 후, TE(0.25% 트립신(GIBCO)과 1 mM EDTA)를 사용하여 세포를 개별 분산시키고, 문헌(Watanabe K, et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25: 681-686, Epub 2007 May 27)에 따라 ROCK 저해제(Y27632)를 10 μM 가하여 세포 사멸을 억제하였다. 동시에, 50 nM TMRM을 사용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하였다.

이 염색한 세포로, 만니톨 0.45 M(약 720 mOsm/kg에 해당됨)이 포함된 α-MEM 배양액에서 2시간 처리한 세포의 샘플과, 만니톨이 첨가되지 않은 α-MEM 배양액에서 2시간 처리한 세포의 샘플인 대조군을 각각 제조하였다. FACS 분석 전에, 대조군 샘플의 경우 세포가 서로 접착하여 세포괴를 형성하고 있어, 다시 양쪽 샘플에 동일하게 트립신과 EDTA를 처리하여 세포를 분산시킨 후, TMRM의 형광 강도에 따라, FACS에 의해, 미토콘드리아 막 전위 유무를 분석하여, 줄기 세포의 생존 상태를 확인하였으며, 그 결과는 도 12에 나타낸다. 그 결과, 대조군(도 12(a))과 비교하여, 만니톨을 2시간 처리하면 거의 모든 세포에서 막 전위가 소멸됨을 확인하였다(도 12(b)). 이들 세포는, 사람 배아 줄기 세포의 경우와 동일하게 사멸한 것으로 생각되었다.

실시예 8: 사람의 배아 줄기 세포에서의 여러가지 당질(당 알코올류, 당류, 베타인류)에 의한 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 사람의 배아 줄기 세포에 만니톨 이외의 다른 당질(당 알코올류, 당류, 베타인류)을 처리한 후 줄기 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

사람의 배아 줄기 세포에 만니톨 대신에 여러가지 당질(당 알코올류: 소르비톨, 자일리톨, 당류: 슈크로스, 글루코스, 베타인류: 트리메틸 글리신) 0.45 M(약 750∼780 mOsm/kg에 해당됨)을 2시간 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 실험 방법을 이용하여, 미토콘드리아의 막 전위 변화를 관찰하였다. 그 결과, 대조군(도 13(a))과 비교하여, 2시간 처리시 모든 세포에서 막 전위의 소실이 확인되었다(도 13(b)∼(f)).

실시예 9: 사람의 배아 줄기 세포 유래의 배상체내 잔존하는 줄기 세포에 대한 여러가지 당질(당 알코올류, 당류, 베타인류)의 세포 사멸 유도 작용 및 심근 세포의 농화

본 실시예에서는 사람 배아 줄기 세포로 형성된 심근 세포를 포함하는 세포괴(배상체)에 만니톨이 아닌 다른 당질(당 알코올류, 당류, 베타인류)을 처리한 후 심근 세포의 배양 상태와 다른 세포의 배양 상태를 확인하고자 하였다.

사람의 배아 줄기 세포를 계대 조작한 후, 배양액[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO)]에서 부유 배양하여 배상체로 유도하였다. 분화 개시(부유 배양 개시) 시점으로부터 14일째 내지 18일째에, 자율 박동성을 가진 세포가 분화되었고, 이를 별도로 심근 세포임을 확인하였다.

분화 개시 후 3개월 후에도 배상체는 여전히 자율 박동성을 유지하고 있었다. 이를 0.1% 콜라게나제(Wortington 사) 및 0.1% 트립신(DIFCO 사)으로 부분적으로 효소 처리하여, 미세한 세포괴로 분산시켰다. 이를 2개로 분할하여, 한쪽에는 0.45 M(약 700∼780 mOsm/kg에 해당됨) 및 0.6 M(약 850∼1000 mOsm/kg에 해당됨)의 당질(당 알코올류: 소르비톨, 자일리톨, 글리세롤, 당류: 슈크로스, 글루코스, 베타인류: 트리메틸글리신)을 첨가하여 12시간 처리하였고, 다른 한쪽에는 대조(컨트롤)군으로서 당질을 처리한 군과 동량의 생리적 삼투압 용액 Ads buffer(116.4 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 5.6 mM 덱스트로스, 10.9 mM NaH₂PO₄, 405.7μM MgSO₄, 20 mM Hepes, pH7.3) 만을 가하여 2시간 처리하였다. 처리 후, 양쪽 세포군 모두 10% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM 용액에서 12시간 배양하였다.

12시간 경과 후, 이들을 현미경 하에서 관찰한 바, 대조군의 세포를 배양하는 디쉬에서는 세포질에 비해 핵의 점유 면적이 높은 미분화 세포로 보이는 세포 집단으로 이루어진 콜로니가 다수 발견되었다. 그러나, 당질 처리한 세포를 배양한 디쉬에서는, 이들 세포 집단은 전혀 발견되지 않았다. 당질 처리한 세포를 배양한 디쉬에는, 대신에 자율 박동하는 세포 집단이나 자율 박동하는 단세포가 접착 또는 부유 상태로 있었다.

실시예 10: 사람의 배아 줄기 세포 유래의 배상체내 잔존하는 줄기 세포에 대한 당질(당 알코올류)의 세포 사멸 유도 작용의 조직학적 분석

본 실시예에서는 사람의 배아 줄기 세포로부터 형성된 심근 세포를 포함하는 세포괴(배상체)에 당질(당 알코올류)을 처리한 후 심근 세포의 배양 조건 하에서의 세포 형태를 확인하고자 하였다.

글리세롤 0.45 M(약 710 mOsm/kg에 해당됨) 및 0.6 M(약 870 mOsm/kg에 해당됨)을 10시간 처리한, 사람의 배아 줄기 세포 유래의 분화 세포 샘플에 대해, 배양 조건 하에서의 형태를 검토하였다. 그 결과, 심근 세포를 제외한 분화성 세포 대부분은 사멸한 것으로 나타났다. 이러한 세포 사멸 유도 효과는 글리세롤에 10시간 이상 노출하였을 때 현저하였다(도 14).

상기한 결과로부터, 글리세롤은 장시간 처리시 효과적으로 다능성 줄기 세포(배아 줄기 세포/iPS 세포) 및 심근 세포 이외의 분화 세포에 대해 세포 사멸을 유도할 수 있는 것으로 판명되었다.

실시예 11: 마우스 배아 줄기 세포에 대한 저농도 당질(만니톨)의 세포 사멸 유도 작용

본 실시예에서는 마우스의 배아 줄기 세포에 저농도의 만니톨을 처리한 후 줄기 세포의 생존 상태를 확인하고자 하였다.

실시예 1에 기재한 방법으로 배양한 배아 줄기 세포를, 만니톨 0.2 M(약 480 mOsm/kg에 해당함)이 포함된 α-MEM 배양액에서 48시간 또는 72시간 동안 배양한 후, 세포의 접착, 비접착 및 형태 관찰을 통해 줄기 세포의 생존 상태를 확인하였고, 그 결과를 도 15에 나타낸다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 48시간 처리 후, 이미 거의 모든 콜로니가 배양 디쉬에서 탈착되어 세포 사멸의 특징적인 형태를 보였다. 72시간 후에도 역시 이러한 상황이 보다 현저해졌고, 세포는 완전히 사멸하였다. 48시간 처리한 경우의 사진(48 h)과 72시간 처리한 경우의 사진(72 h)에 나타낸, 분산된 점이 1개의 세포이다. 덩어리로서 보이는 것은 ES 세포의 콜로니로부터 유래된 죽은 세포괴이다. 하단에 전형적인 확대 사진을 나타내었다.

또한, 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게, 배양액[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA), 10% FBS(EQUITEC BIO), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO)]를 사용하여, EB 당 75개의 마우스 배아 줄기 세포를 행잉-드롭 방법으로 세포괴로서 총 7일간 배양함으로써, 심근 세포를 포함하는 세포괴로 분화시킨 다음, 배상체를 상기 배양 디쉬에 접착시켜, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 3∼5일간 배양하였다. 이러한 배양에 의해 분화 유도되고, 접착 배양된 심근 세포를 포함하는 마우스 배상체에, 만니톨 0.2 M을 최장 72시간 처리한 바, 72시간 후 심근 세포를 제외한 다른 세포는 거의 모두 사멸하고 심근 세포만 선택적으로 생존하고 있어, 심근 세포를 제외한 다른 분화 세포에서는 세포 사멸이 유도되었음이 검증되었다.

본 발명의 방법에 의해 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 제외한 다른 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 세포 집단을 처리함으로써, 세포 집단내 배아 줄기 세포와 비-심근 세포를 효율적으로 제거하고, 동시에, 심근 세포만 생존시킬 수 있어, 심근 세포를 효율적으로 농화 및 정제할 수 있다.

Claims

다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 비-심근 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 심근 세포를 포함하는 세포 집단을, 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액에서 배양하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포 및 다능성 줄기 세포 유래의 비-심근 세포에 대해 세포 사멸을 유도하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고삽투압 용액에서의 배양은 2시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액은 배양액에 당질(탄수화물)을 첨가함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액은 0.1 내지 1 M의 당질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 당질은 당 알코올류, 당류 또는 베타인류인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 당 알코올류, 당류 또는 베타인류는 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세롤, 슈크로스, 글루코스 및 트리메틸글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 370 mOsm/kg 이상의 삼투압을 가진 고삼투압 용액은 0.1 내지 0.6 M의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 배양은 10시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 집단을 고삼투압 용액에서 배양한 후, 200∼300 mOsm/kg의 통상 삼투압의 배양액으로 복귀시켜 추가로 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.