CN102449139A - 对多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法 - Google Patents

对多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法 Download PDF

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Abstract

本发明课题在于，开发一种不改变基因且对胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡但不对心肌细胞诱导细胞死亡的方法。本发明通过对多能性干细胞、非心肌细胞的培养条件添加未确认到物质毒性和细胞死亡诱导作用的物质，从而构建了非常有效地对心肌细胞以外的细胞诱导细胞死亡的方法，由此明确了不改变基因也能够解决上述课题。

Description

对多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法
技术领域
本发明涉及一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，其为与由胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞诱导分化出心肌细胞时的心肌细胞的纯化有关的手段。
背景技术
成体中的心肌细胞已经丧失增殖活性，为了治疗重症心肌梗塞、心肌症等疾患而不得不依赖心脏移植。然而，现状却是心脏供体不足的问题无法克服，找到心脏移植以外的治疗方法已成为当务之急。对此，预计在体外制作并纯化心肌细胞用其充当疾患治疗时心肌细胞的补充是用于救助不得不依赖心脏移植的心脏疾患患者的最有希望的方法。
作为用于获得心肌细胞的方法，已知的是使干细胞(例如胚胎干细胞、各种成体干细胞(adult stem cell))分化后使用的方法、由胎儿取得的方法等。例如在使用小鼠的多能性干细胞的情况下从培养液去除抑制分化的因子(饲养细胞、白血病抑制因子(LIF)等)、在人的多能性干细胞的情况下从培养液去除抑制分化的因子(饲养细胞、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)等)，由此形成细胞块(胚状体)，从而可以积极地引发向心肌细胞的分化，这作为使干细胞分化的方法是已知的。
体外的由干细胞分化为心肌细胞的方式部分承袭了活体内的生理发育阶段，尤其是就发育初期的事件而言，在由受精卵细胞发生的生理发育和体外的分化方式之间共通点很多。就体外分化为心肌细胞的系谱而言，与生理发育同样地，首先是干细胞分化为未分化的中胚层细胞，其一部分分化为编程性心肌细胞(前心脏中胚层)后，分化为心肌细胞。
多能性干细胞是具有分化为构成脏器的所有细胞的能力的细胞，因此使其仅分化为心肌细胞在技术上较为困难。另一方面，由于将所有多能性干细胞一齐诱导至分化阶段也非常困难，因此胚状体中残存有未分化的干细胞是非常常见的。
如上所述，在体外诱导干细胞分化为心肌细胞时，所有干细胞的情况下，均产生作为副产物的心肌细胞以外的细胞以及残存未分化的细胞等对临床应用遗留下有害性质。尤其是残存的未分化的细胞由于具有增殖活性且能分化为多种细胞，因此若治疗时移植至活体的细胞中残存未分化的细胞，则该未分化的细胞形成畸胎瘤的危险性极高。由这样的理由出发，难以将含有对多能性干细胞进行诱导分化而制作的心肌细胞的细胞群直接移植至活体而用于治疗。因此，为了安全地使用多能性干细胞来源的心肌细胞进行治疗、获得理想的治疗效果，需要找到彻底去除未分化的多能性干细胞且高度纯化心肌细胞的方法(即，去除心肌细胞以外的细胞的方法)。
目前，已知的纯化心肌细胞的方法是，预先在干细胞的基因(基因组)中导入某些标记基因(例如GFP)的方法(非专利文献1)。然而，这样的方法需要改变基因组，方法自身存在伦理上的问题且在细胞癌化率变化等安全性方面伴随着无法预测的巨大风险(非专利文献2)。此外，还报道了采用改变基因的方法作为积极地去除未分化的多能性干细胞的方法(非专利文献3)。另一方面，报道了使用已知具有细胞死亡诱导作用的神经酰胺类比较特异地对胚胎干细胞诱导细胞死亡的方法(非专利文献4)。然而，该方法中，用神经酰胺类处理后进行培养的细胞组中残留了多达相当于多能性干细胞(OCT阳性细胞)未被处理(对照)时的1/3的量的多能性干细胞，并非是充分的去除方法。此外，对于人胚胎干细胞的去除而言，仅仅记载了发现发生细胞凋亡的细胞，而未记载能进行充分的去除。此外，还报道了使用具有细胞毒性的抗体的方法(非专利文献5)，该方法中记载了在抗体处理后仍残存20％左右的胚胎干细胞。进而，就抗体的治疗性处理而言，利用该方法时存在避免抗原性等制约。由此，在诱导细胞死亡的公知方法中，能够用于心肌疾患的治疗的心肌细胞的纯化方法还具有改善的余地，期待一种效率更好的新的细胞死亡诱导方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Muller M，et al.，FASEB J.2000；14：2540-2548
非专利文献2：Schroder AR，et al.，Cell.2002；110：521-529
非专利文献3：Schuldiner M，et al.，Stem Cells 2003；21，257-265
非专利文献4：Bieberich E et al.，J Cell Biol.2004；167：723-734
非专利文献5：CHOO AB，et al.，Stem Cells 2008；26：1454-1463.
发明内容
发明要解决的问题
本发明课题在于，开发一种不改变基因且对胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡但不对心肌细胞诱导细胞死亡的方法。此外，本发明课题还在于利用这样的方法开发一种由多能性干细胞制作没有畸胎瘤的危险性的安全且高纯度的心肌细胞的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过对多能性干细胞、非心肌细胞的培养条件添加未确认到物质毒性(physical toxicity)和细胞死亡诱导作用的物质，从而构建了以短时间且非常有效地对心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，由此明确了不改变基因也能够解决上述课题。该方法由于不对心肌细胞诱导细胞死亡，因此也是有效的心肌细胞纯化方法。
具体而言，本发明明确了：通过用具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而提供引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞进入细胞死亡的方法，由此能够解决上述课题。即，本申请发明具体涉及以下事项。
(1)一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，其为用具有370mOsm/k
g以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞进入细胞死亡的方法。
(2)根据上述(1)所述的方法，用高渗液的培养进行2小时以上。
(3)根据上述(1)或(2)所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液是通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制得的。
(4)根据上述(3)所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1～1M的糖质。
(5)根据上述(3)或(4)所述的方法，糖质是糖醇类、糖类、或甜菜碱类。
(6)根据上述(5)所述的方法，糖醇类、糖类、或甜菜碱类选自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸组成的组。
(7)根据上述(4)所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1～0.6M的丙三醇。
(8)根据上述(7)所述的方法，培养进行10小时以上。
(9)根据上述(1)～(8)中任意一项所述的方法，用高渗液培养细胞群后，返回至具有200～300mOsm/kg的通常渗透压的培养液中进一步进行培养。
发明的效果
根据本发明的方法，通过对含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群进行处理，能够有效地去除细胞群中的未分化的多能性干细胞和非心肌细胞，且仅心肌细胞能够存活，因此能够有效地浓缩纯化心肌细胞。
附图说明
图1表示胚胎干细胞(ES细胞)来源的心肌细胞和残存的未分化胚胎干细胞的免疫染色。
图2表示在混入了胚胎干细胞来源的心肌细胞和残存的胚胎干细胞的培养体系中的甘露糖醇处理。
图3表示对甘露糖醇处理后的细胞中的Nkx2.5和Oct-3/4的免疫染色。
图4表示0.45M的甘露糖醇对小鼠胚胎干细胞的细胞死亡诱导作用。
图5表示甘露糖醇对绒猴胚胎干细胞的作用。使用线粒体膜电位敏感性色素TMRM对该细胞的生死进行了判定。
图6表示甘露糖醇对绒猴胚胎干细胞的效果。
图7表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的作用(FACS解析)。
图8表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的效果(即刻)。
图9表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的效果(5小时后)。
图10表示人胚胎干细胞胚状体的甘露糖醇处理。
图11表示人胚胎干细胞细胞胚状体由于甘露糖醇处理所致的Oct-3/4阳性细胞的死灭。
图12表示甘露糖醇对人诱导多能性干细胞(iPS细胞)的作用(FACS解析)。
图13表示甘露糖醇以外的各种糖质对人胚胎干细胞的细胞死亡诱导作用。
图14表示丙三醇对人胚胎干细胞来源的心肌、非心肌细胞的作用。
图15表示用含有0.2M甘露糖醇的培养液处理了48小时或7
2小时的细胞的状态。下半部分表示各个集落的放大像，图中示意出代表性的细胞形态。
具体实施方式
本发明人等发现了如下事实：对含有胚胎干细胞、心肌细胞、非心肌细胞的混合细胞系使用溶解了高浓度的甘露糖醇的高渗液时，通过暴露于高渗液，胚胎干细胞和非心肌细胞容易发生细胞死亡。对该见解，更详细地研究了甘露糖醇浓度、在甘露糖醇中的暴露时间与胚胎干细胞及非心肌细胞的细胞死亡间的关系，结果获知：在低浓度的甘露糖醇中长时间暴露可有效地对胚胎干细胞和非心肌细胞诱导细胞死亡，在几乎饱和的浓度即1M下短时间即可诱导胚胎干细胞的细胞死亡。
同时获知，在所有浓度下均存在既是引起胚胎干细胞和非心肌细胞发生细胞死亡的浓度、时间又不会对由胚胎干细胞分化出的心肌细胞诱导细胞死亡的条件。由此，基于那样的条件进行培养的本发明的方法为有效地去除胚胎干细胞和非心肌细胞的方法，同时也是有效的心肌细胞浓缩纯化的方法。
因此，本发明的一个方式中，提供一种用具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有未分化的多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞进入细胞死亡的方法。
据称，对于小鼠胚胎干细胞而言，在使用胚状体形成法诱导分化时，在分化诱导开始后3～6天的胚状体中包含中胚层乃至编程性心肌细胞。此外，出现心肌细胞是在分化开始后第7天(人的胚胎干细胞的情况下是第10天)。胚状体中除上述以外还包含未分化细胞、内皮上皮样细胞、神经细胞等。对构成胚状体的细胞进行更详细研究的话，构成胚状体的细胞群中，7～8成为心肌细胞以外的分化细胞，其中有时还包含未分化的胚胎干细胞。这些杂细胞旺盛地增殖，随着时间的经过其存在比例将增加。本发明人等发现，通过使具有这样的细胞构成的胚状体在培养液中暴露于适当范围的高渗透压下，从而引起胚状体中残存的胚胎干细胞、心肌细胞以外的分化细胞发生细胞死亡。此外，本发明人等发现，即使在该条件下培养时，心肌细胞也不出现细胞死亡，通过置换为生理性渗透压培养液可恢复自主搏动。
在本发明的方法中，作为细胞的供给源，只要是含有心肌细胞的细胞群，则可以是任意的供给源来源的细胞群，例如可以使用包含使用公知的心肌细胞诱导条件由多能性干细胞(包括胚胎干细胞(ES细胞)、活体干细胞、诱导多能性干细胞(iPS细胞)等)分化获得的心肌细胞的细胞群、胎儿组织来源的细胞群，来实施本发明的方法。含有如上所述地由多能性干细胞分化获得的心肌细胞的细胞群中，除了多能性干细胞来源的心肌细胞以外，还可以含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞。
本发明的方法特征在于，用具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液培养该细胞群。本发明的方法中使用的渗透压对心肌细胞以外的细胞(多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞)诱导细胞死亡，但不对心肌细胞诱导细胞死亡。这样的渗透压为370mOsm/kg以上、优选370mOsm/kg～1600mOsm/kg、更优选370mOsm/kg～1000mOsm/kg、进而优选480mOsm/kg～1000mOsm/kg、最优选700mOsm/kg～1000mOsm/kg。与通常体外培养条件下的渗透压为200～300mOsm/kg左右(也称为通常的渗透压或生理性渗透压)相比，这些值是非常高的，在该条件下培养时心肌细胞以外的细胞会死灭。
使用通过对培养液添加糖质而制作的具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液时，本发明的方法特征在于，在该高渗液中的培养进行2小时以上、优选2～72小时、更优选2～48小时、进而优选2～24小时、最优选4～12小时。
本发明的方法中，能够仅对包括人ES细胞、iPS细胞在内的未分化的多能性干细胞、或心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的条件由高渗液的渗透压程度和细胞在高渗液下的暴露时间的关系决定。即，与用于诱导心肌细胞而使用的细胞物种无关，高渗液的渗透压越高则细胞在高渗液下的暴露时间可以越短，另一方面，若将高渗液的渗透压设定为较低则需要相应地延长细胞在高渗液下的暴露时间。
本发明的方法中，在高渗液中暴露细胞群时可以引导心肌细胞以外的细胞(未分化的多能性干细胞或非心肌细胞)进入细胞死亡(即，诱导细胞死亡或提供细胞死亡的信号)。这样被引导进入细胞死亡的细胞在高渗液中发生细胞死亡或在由高渗液返回至通常的培养液后发生细胞死亡。
本发明的方法中的细胞死亡由于是使细胞暴露于生理性应激而诱导的，因此不会对幸存细胞带来基因性的损伤，可以仅对目标细胞以外的细胞诱导细胞死亡，从这点来说与通过直接给基因带来损伤的物理性条件(放射线应激、氧化应激等)、化学性条件(化合物应激)来诱导细胞死亡相比是非常优选的。其原因在于，就能耐受生理性应激而幸存的细胞而言，通过返回至去除了用于诱导其细胞死亡的生理性应激的培养条件，能够再次恢复原本的细胞机能，发挥正常的机能。该特征非常易于利用在将离体制备的组织或构成组织的细胞移植至体内而进行再生的医疗现场中。
本发明中言及具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液时，是指不影响细胞的代谢、仅使渗透压为370mOsm/kg以上的高渗液，例如作为例子可以列举出通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制备的高渗液。作为本申请发明中可以使用的糖质的例子，可列举出不影响细胞的代谢且可以提高培养液的渗透压的糖质，即作为可以添加到本发明的培养液中的糖质的例子，可以列举出例如糖类(单糖类、寡糖类、多糖类)、粘多糖类、氨基糖苷类、糖醇类或甜菜碱类，但并非限定于此。更具体而言，可以列举出表1所述的物质。
表1
Figure BDA0000114456510000101
进而，使用山梨糖醇(糖醇类)、三甲基甘氨酸(甜菜碱类)等生理上与成体内的渗透压调节相关的物质时也能看到本申请发明的效果，因此可以使用作为有机渗透压调节物质(organic osmolytes)的甜菜碱、牛磺酸、肌醇、甘油磷酯酰胆碱(glycerophosphocholine)等。
在通过对培养液添加糖质而制作具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液时，高渗液特征在于含有0.1～1M(mol/L)的糖质，优选含有0.1～0.6M的糖质。糖质浓度(mol/L)和渗透压(mOsm/kg)的关系可以近似成几乎直线性关系、含有0.1M的糖质的高渗液相当于具有约370mOsm/kg的渗透压的高渗液，含有1M的糖质的高渗液相当于具有约1300～1600mOsm/kg的渗透压的高渗液。
但是，当糖质为丙三醇时，高渗液特征在于，含有0.1～0.6M的丙三醇，优选含有0.1～0.5M的丙三醇，特征在于在该高渗液中培养10小时以上、例如10～24小时、优选10～18小时。
就使用各糖质制作高渗液时的糖质浓度和渗透压的关系而言，代表性糖质的上述关系示于以下的表中。
表2糖质浓度和渗透压(实测值)
  浓度(M)   0   0.45   0.6   0.9
  丙三醇   258   706   869   1232
  葡萄糖   258   758   939   1336
  甘露糖   258   717   875   1234
  蔗糖   258   779   988   1496
  木糖醇   258   779   940   1230
  山梨糖醇   258   748   922   1289
  甜菜碱   258   763   965   1421
本发明的方法中，优选在用具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液培养细胞群而对多能性干细胞、非心肌细胞诱导细胞死亡后，返回至具有通常的渗透压(即，200～300mOsm/kg的渗透压)的培养液进一步进行培养。当在本发明的方法中使用的高渗液中进行培养时，心肌细胞不发生细胞死亡但有时短暂性地停止搏动。然而，即使是这种情况下，通过返回至通常渗透压的培养液中，可以再次开始搏动，发挥出心肌细胞的机能。此外，还存在虽然在高渗液中接到了细胞死亡的信号但表面上看来依然存活的细胞。也是为了从培养中去除这样的细胞而优选返回至具有通常的渗透压的培养液中进一步进行培养。
本发明的方法在实施例所调查的所有细胞(即，小鼠来源的胚胎干细胞、绒猴来源的胚胎干细胞、人来源的胚胎干细胞、人来源的iPS细胞)中均能够显示同样的结果。由于本发明的方法不依赖于动物物种，因此表明本发明的方法能够适用于从小鼠到人的所有哺乳动物来源的细胞。进而，由于不论是胚胎干细胞还是诱导多能性干细胞均能够利用本发明的方法实现目的，因此表明，不论是未对多能性干细胞进行基因操作的干细胞(例如胚胎干细胞)还是进行了基因操作的干细胞(例如iPS细胞)均能够应用本发明的方法。
具体说明例如将本发明的方法应用于含有由胚胎干细胞或iPS细胞分化得到的心肌细胞的细胞群的方法。首先，在分化用的培养液(例如由α-MEM(Minimum Essential Medium，最小必需培养基)(SIGMA)、10％FBS(EQUITEC BIO)、100单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)构成的培养液)中通过悬滴法等悬浮培养胚胎干细胞或iPS细胞，进行适当的心肌分化诱导，形成含有心肌细胞的胚状体。分化出心肌细胞后再经过2天以上的成熟期，接着将用于培养胚状体的培养液更换成含有甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖或木糖醇0.1～1M的无血清α-MEM培养液或无血清D-MEM培养液(即，高渗液)，进而在作为高渗液的培养液下暴露规定的时间。这样暴露于高渗液时，可以对心肌细胞以外的细胞(未分化的多能性干细胞或非心肌细胞)诱导细胞死亡，或提供细胞死亡的信号。
暴露在高渗液下的培养结束后，将处理后的细胞更换成通常渗透压的培养液，进一步继续培养，从而仅心肌细胞能够选择性地存活在培养条件中。还可以根据需要利用通过酶处理进行的细胞分散、培养液的更换、离心分离等方法中的任意一种或组合来洗涤细胞，从而积极地去除发生细胞死亡的非心肌细胞。
根据本发明的方法，对含有心肌细胞和包括未分化细胞在内的心肌细胞以外的细胞这两者的细胞群进行高渗液下的暴露时，可以对细胞群所含的心肌细胞以外的细胞中的90％以上、优选95％以上、进而优选98％以上、最优选100％的细胞诱导细胞死亡。
实施例
通过以下的实施例更详细地说明本发明。然而，以下的实施例是本发明的例示，并非意在限定本发明。
实施例1：胚胎干细胞来源的心肌细胞和残存的未分化胚胎 干细胞的免疫染色
本实施例目的在于，确认在由干细胞形成含有心肌细胞的细胞块(胚状体)时的、细胞块(胚状体)中的心肌细胞和未分化细胞的混存状态。
小鼠胚胎干细胞(细胞株名EB3，Nat Genet 2000；24：372-376)由独立行政法人·理化学研究所的丹羽仁史博士惠赠。对该小鼠胚胎干细胞，使用现有方法(Bader A，et al.，Differentiation 2001，68，p31-43)(即，使用培养液[α-MEM(Minimum Essential Medium，最小必需培养基)(SIGMA)、10％FBS(EQUITEC BIO)、100单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)]通过悬滴法，每株EB将75个胚胎干细胞以细胞块的形态共计培养7天的方法)分化出含有心肌细胞的细胞块后，将胚状体粘着在上述培养皿上，在37℃、5％CO2的条件下培养3～5天。
用4％多聚甲醛将获得的胚状体固定，用0.1％Triton X 100使细胞膜半可溶化。用4％BSA溶液进行封闭，分别以针对据称在发育最初期的编程性心肌细胞中表达的Nkx2.5的抗体(山羊抗Nkx2.5抗体(Santacruz公司No.N-19))、和针对已知对维持小鼠胚胎干细胞的未分化能力发挥重要作用的转录因子Oct-3/4的抗体(小鼠抗Oct-3/4单克隆抗体、BD Transduction Laboratories公司No.084720)作为一抗，用封闭液稀释100倍后，在4℃下渗透12小时。洗涤4次后，将作为针对各抗体的二抗的、用Alexa Flow488标记的驴抗山羊抗体(Molecular Probe公司)和TRITC标记的兔抗小鼠抗体(DAKO公司)均稀释至1/200后，在室温下渗透1小时。洗涤后，使用含有作为核DNA染色试剂的DAPI(Molecular probe公司)的溶液在室温下进行5分钟核染色，洗涤后在荧光显微镜下观察。结果如图1所示。图1中，就2个胚状体((a)和(b))而言，左上表示Oct-3(红色)，右下表示Nkx2.5(绿色)，右上表示在Oct-3(红色)和Nkx2.5(绿色)的重叠像上进一步重叠DAPI染色(蓝色)的图像，且左下表示相位差像。
如图1所示，可以明确的是，在胚状体(a)和(b)两者中，Oct-3/4阳性的未分化细胞和Nkx2.5阳性的心肌细胞共存在一个胚状体内部。
实施例2：在混入了胚胎干细胞来源的心肌细胞和残存的胚 胎干细胞的培养体系中的糖质(糖醇类)处理
本实施例目的在于，确认对于含有由胚胎干细胞形成的心肌细胞的细胞块(胚状体)进行糖质(糖醇类)处理后的、心肌细胞的培养状态和其以外的细胞的培养状态。
通过实施例1所述的方法使小鼠来源的胚胎干细胞形成胚状体，使其分化至含有编程性心肌细胞(前心脏中胚层)的阶段。通过将所得的胚状体小心翼翼地进行消化酶处理(胰蛋白酶、胶原酶)以防带来细胞损伤，从而使其部分分散，再次对其贴壁培养。在继续培养5天时，如图2所示，变成自主搏动的心肌细胞的团块(红线所包围的细胞群)、具有胚胎干细胞样的细胞形态的细胞群(黄线所包围的细胞群)以及其它细胞群混存的状态(参照图2的(a))。
接着，将该混合培养的培养液更换为含有0.45M(相当于约720mOsm/kg)的甘露糖醇和ITS{胰岛素(10mg/L)、转铁蛋白(5.5mg/L)、亚硒酸钠(6.7mg/L)}(GIBCO公司)的无血清α-MEM培养液，培养36小时。其结果是，在该阶段大多数细胞已经呈典型的细胞死亡。然后，将培养液更换成含有20％胎牛血清的α-MEM培养液，继续培养，结果1～2天后心肌细胞恢复自主搏动。另一方面，培养盘中含有以形成单层方式铺展存在的未分化细胞(胚胎干细胞)(参照图2的(a)右下)，心肌细胞以外的细胞几乎完全死灭(参照图2的(b))。
对于该图2所示的培养，通过与实施例1同样的方法对Nkx2.5和Oct-3/4进行免疫染色，结果如图3所示。图3中，左下表示的是左上所示的相位差像的方形所包围的部分的细胞的、Nkx2.5抗体染色(绿色)，右上表示的是左上所示的相位差像的方形所包围的部分的细胞的、DAPI染色(蓝色)，右下表示的是左上所示的相位差像的方形所包围的部分的细胞的、Nkx2.5抗体染色(绿色)和DAPI染色(蓝色)的重叠像。该结果表明，获得的细胞中，98％以上为Nkx2.5阳性的心肌细胞(参照图3左下和右下)，不存在Oct-3/4阳性的未分化细胞。
实施例3：糖质(糖醇类)对小鼠胚胎干细胞的细胞死亡诱 导作用
本实施例目的在于，确认用糖质(糖醇类)处理小鼠胚胎干细胞后的干细胞的存活状态。
就线粒体膜电位而言，死细胞会失去该膜电位，因此在检测出作为存活指标的膜电位并通过发出荧光的线粒体膜电位敏感性试剂TMRM(Molecular Probes公司)进行染色时，该试剂来源的荧光信号在活细胞中较高，在死细胞中变低。
利用该特性，将通过实施例1所述的方法培养的胚胎干细胞在含有甘露糖醇0.45M(相当于约720mOsm/kg)和1μM TMRM的α-MEM培养液中培养0h(起始)、3h、6h、20h后，对收集的胚胎干细胞进行洗涤，然后进行FACS解析，基于线粒体膜电位敏感性试剂TMRM的荧光强度确认干细胞的存活状态，并示于图4。图4中，就0h(起始)、3h、6h、20h的各FACS解析结果而言，点图中记载的存在于边界线更上部的细胞是活细胞，点图中记载的边界线更下部的细胞表示死细胞。
如图4所示，处理前(起始)几乎全部为活细胞，甘露糖醇处理3小时后约90％的细胞死亡，处理6小时后98％死亡，处理20小时后所有细胞均死灭(图4)。
实施例4：糖质(糖醇类)对绒猴胚胎干细胞的细胞死亡诱 导作用
本实施例的目的在于，确认用糖质(糖醇类)处理绒猴胚胎干细胞后的干细胞的存活状态。
绒猴胚胎干细胞由财团法人实验动物中央研究所获得(Stem Cells.2005Oct；23(9)：1304-13)。基本的培养方法也按照该文献。即，使用通过丝裂霉素C处理而失去增殖活性的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)进行绒猴胚胎干细胞的未分化维持培养。作为培养液，使用的是KO-DMEM(GIBCO)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mM β-巯基乙醇(2-ME，Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和8ng/ml重组人白血病抑制因子(LIF，C hemicon)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech)。传代时，使用0.1％III型胶原酶(Wortington)在37℃下处理10分钟而使E S集落分离。
传代后使用TE(0.25％胰蛋白酶(GIBCO)和1mM EDTA)将细胞分散至散开后，按照文献(Watanabe K，et al.，Nat Biotechnol.，2007，25：681-686，Epub 2007May 27)选择性加入10μM的Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂(Y27632)抑制细胞死亡。同时用50nM TMRM对活细胞的线粒体进行染色。
制作将该染色细胞在含有甘露糖醇0.45M(相当于约720mOsm/kg)的α-MEM培养液中处理2小时的细胞样品，制作在不含甘露糖醇的α-MEM培养液中处理2小时的细胞样品作为对照。在FACS解析前，对照中细胞彼此粘着形成细胞块，因此再次进行TE处理，制成散开的细胞。然后，对用甘露糖醇处理2小时的细胞和对照细胞分别用FACS基于TMRM的荧光强度解析线粒体膜电位的有无，确认干细胞的存活状态，并示于图5。由其结果可知，与对照(图5的(a))相比，通过用甘露糖醇处理2小时，几乎所有细胞的膜电位均消失(图5的(b))。
进而，同时对用甘露糖醇处理2小时的细胞和对照细胞拍摄染色后细胞的照片(图6的(a))。接着，将这些细胞分别使用培养液〔KO-DMEM(GIBCO)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mM β-巯基乙醇(2-ME，Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和8ng/ml重组人白血病抑制因子(LIF，Chemicon)〕贴壁培养5天，结果对照细胞(即未用甘露糖醇处理的细胞)中发现很多存活的细胞(图6的(b)的下半部分)。然而，暴露于甘露糖醇的细胞中完全没有发现存活的细胞(图6的(b)的上半部分)。
实施例5：糖质(糖醇类)对人胚胎干细胞的细胞死亡诱导 作用
本实施例的目的在于，确认用糖质(糖醇类)处理人胚胎干细胞后的干细胞的存活状态。
人胚胎干细胞由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心(National BioResource Project的ES细胞中心)获得(文献：Suemori H，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.345，2006，p.926-932)。基本的培养方法也按照上述文献。即，使用通过丝裂霉素C处理而失去增殖活性的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)进行人胚胎干细胞的未分化维持培养。作为培养液，使用的是F12/DMEM(1∶1)(SIGMA、制品号D6421)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.1mM β-巯基乙醇(2-ME，Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech)。传代时，使用0.1％III型胶原酶(Wortington)在37℃下处理10分钟而使胚胎干细胞集落分离。
传代后使用TE(0.25％胰蛋白酶(GIBCO)和1mM EDTA)将细胞分散至散开后，按照文献(Watanabe K，et al.，Nat Biotechnol.，2007，25：681-686，Epub 2007May 27)加入10μM的ROCK抑制剂(Y27632)抑制细胞死亡。同时用50nM TMRM对活细胞的线粒体进行染色。
制作将该染色细胞在含有甘露糖醇0.45M(相当于约720mOsm/kg)的α-MEM培养液中处理2、3或4小时的细胞样品，制作在不含甘露糖醇的α-MEM培养液中处理2小时的细胞样品作为对照。在FACS解析前，对照中细胞彼此粘着形成细胞块，因此再次对两者进行同样的胰蛋白酶和EDTA处理而使细胞分散。对用甘露糖醇处理2、3或4小时的细胞和对照细胞分别用FACS基于TMRM的荧光强度解析线粒体膜电位的有无，确认干细胞的存活状态，并示于图7。由其结果可知，与对照(图7的(a))相比，通过用甘露糖醇处理2小时，几乎所有细胞的膜电位均消失(图7的(b))。
进而，对用甘露糖醇处理2小时的细胞和对照细胞拍摄TMRM染色后细胞的照片(图8)。未用甘露糖醇处理的细胞(图8上半部分)由于细胞间粘着而形成自身集块，但用甘露糖醇处理过的细胞(图8下半部分)则为保持分散的状态(图8)。
接着，将这些细胞分别使用培养液[F12/DMEM(1∶1)(SIGMA、制品号D6421)、20％KO-SERUM(GIBCO)、1.6mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.1mM β-巯基乙醇(2-ME，Sigma)、100IU/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、和重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech)]贴壁培养5天，结果对照细胞(即未用甘露糖醇处理的细胞)中发现很多存活的细胞(图9上半部分)。然而，暴露于甘露糖醇的细胞中完全没有发现存活的细胞(图9下半部分)。
实施例6：糖质(糖醇类)对人胚胎干细胞来源的胚状体中 残存的干细胞的细胞死亡诱导作用和心肌细胞的浓缩
本实施例目的在于，确认对含有由人胚胎干细胞形成的心肌细胞的细胞块(胚状体)进行糖质(糖醇类)处理后的、心肌细胞的培养状态和其以外的细胞的培养状态。
对人胚胎干细胞进行传代操作后，在培养液[α-MEM(Minimum Essential Medium，最小必需培养基)(SIGMA)、10％FBS(EQUITEC BIO)、100单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)]中悬浮培养从而诱导胚状体。从分化开始(悬浮培养开始)起经过第14天～第18天，具有自主搏动能力的细胞分化出来，通过其它途径确认这些细胞为心肌细胞。
分化开始后经过3个月的胚状体依然维持着自主搏动能力。用0.1％胶原酶(Wortington公司)和0.1％胰蛋白酶(DIFCO公司)对它们进行部分性酶处理，制成细小的细胞块。将其分成2部分，对于一方添加甘露糖醇0.45M(相当于约720mOsm/kg)处理2小时，对于另一方，仅加入与进行甘露糖醇处理时相同量的生理渗透压溶液Ads缓冲液(116.4mM NaCl、5.4mM KCl、5.6mM葡萄糖、10.9mM NaH2PO4、405.7μM MgSO4、20mM Hepes、pH7.3)处理2小时，将其作为对照(contol)组。处理后，两细胞组均用含有10％胎牛血清的DMEM溶液贴壁培养3天。
3天后在显微镜下观察它们，结果在培养对照组的细胞的盘中，发现很多集落，所述集落由被认为是核相对于细胞质所占面积大的未分化细胞的细胞群构成。然而，在培养实施了甘露糖醇处理的细胞的盘中，完全看不到这些细胞群。
另一方面，在培养实施了甘露糖醇处理的细胞的盘中，自主搏动的细胞群、自主搏动的单细胞粘着或悬浮。对这些细胞，使用分别特异性针对作为胚胎干细胞的标记的核内转录因子Oct-3/4蛋白质和作为心肌细胞标记的核内转录因子Nkx2.5蛋白质的2种抗体(小鼠抗Oct-3/4单克隆抗体、BD Transduction Laboratories公司No.084720、和山羊抗Nkx2.5抗体、Santacruz公司No.N-19)作为一抗，通过与实施例1同样的实验步骤对上述Oct-3/4蛋白质和Nkx2.5蛋白质的表达进行解析。上述分成2部分的样品中的对照组的结果示于图10，用甘露糖醇处理2小时的实验组的结果示于图11。图10的上半部分表示心肌细胞，下半部分表示胚胎干细胞。
由该结果可知，对照中观察到很多的胚胎干细胞样集落为Oct-3/4阳性，认为其为胚胎干细胞(图10下半部分)。此外，用0.45M(相当于约720mOsm/kg)甘露糖醇进行处理中观察到的自主搏动细胞为Nkx2.5阳性，鉴定为心肌细胞(图11的(a))。上述结果强烈暗示甘露糖醇处理对于未分化干细胞能够诱导细胞死亡，对心肌细胞未显示出显著毒性(图10、图11)。
由此表明，本处理方法是一种在人胚胎干细胞中也能够对干细胞有效地诱导细胞死亡的方法。另一方面，由于还显示出不会对心肌细胞诱导细胞死亡，因此表明还可以用作浓缩心肌细胞的方法。在甘露糖醇处理后1周内，使用免疫组织化学方法研究存活细胞的种类和数量，结果通过与对照细胞(非处理组)对比，存活细胞的大半为Nkx2.5阳性心肌细胞，几乎观察不到Oct-3/4阴性的细胞(图11的(b))。
实施例7：糖质(糖醇类)对人诱导多能性干细胞(iPS细 胞)的细胞死亡诱导作用
本实施例的目的在于，确认用糖质(糖醇类)处理人诱导多能性干细胞(iPS细胞)后的iPS细胞的存活状态。
人iPS细胞由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心(National BioResource Project的ES细胞中心)获得。基本的培养方法与人胚胎干细胞相同，通过与实施例5所述的方法同样的方法进行培养。传代后，用TE(0.25％胰蛋白酶(GIBCO)和1mM EDTA)将细胞分散至散开，按照文献(Watanabe K，et al.，Nat.Biotechnol.，2007，25：681-686，Epub 2007May 27)加入10μM ROCK抑制剂(Y27632)抑制细胞死亡。同时用50nM TMRM对活细胞的线粒体进行染色。
制作将该染色细胞在含有甘露糖醇0.45M(相当于约720mO sm/kg)的α-MEM培养液中处理2小时的细胞样品，制作在不含甘露糖醇的α-MEM培养液中处理2小时的细胞样品作为对照。在FACS解析前，对照样品中细胞彼此粘着形成细胞块，因此再次对两者进行同样的胰蛋白酶和EDTA处理而使细胞分散后，用FACS基于TMRM的荧光强度解析线粒体膜电位的有无，确认干细胞的存活状态，并示于图12。由其结果可知，与对照(图12的(a))相比，通过用甘露糖醇处理2小时，几乎所有细胞的膜电位均消失(图12的(b))。认为这些细胞与人胚胎干细胞时同样死灭。
实施例8：各种糖质(糖醇类、糖类、甜菜碱类)对人胚胎 干细胞的细胞死亡诱导作用
本实施例的目的在于，确认用甘露糖醇以外的糖质(糖醇类、糖类、甜菜碱类)处理人胚胎干细胞后的干细胞的存活状态。
对于人胚胎干细胞，除了代替甘露糖醇而添加各种糖质(糖醇类：山梨糖醇、木糖醇，糖类：蔗糖、葡萄糖，甜菜碱类：三甲基甘氨酸)0.45M(相当于约750～780mOsm/kg)并处理2小时以外，用与实施例5同样的实验方法观察线粒体膜电位的变化。由其结果可知，与对照(图13的(a))相比，通过2小时的处理所有细胞的膜电位均消失(图13的(b)～(f))。
实施例9：各种糖质(糖醇类、糖类、甜菜碱类)对人胚胎 干细胞来源的胚状体中残存的干细胞的细胞死亡诱导作用和心 肌细胞的浓缩
本实施例目的在于，确认用甘露糖醇以外的糖质(糖醇类、糖类、甜菜碱类)对含有由人胚胎干细胞形成的心肌细胞的细胞块(胚状体)进行处理后的、心肌细胞的培养状态和其以外的细胞的培养状态。
对人胚胎干细胞进行传代操作后，在培养液[α-MEM(Minimum Essential Medium，最小必需培养基)(SIGMA)、10％FBS(EQUITEC BIO)、100单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)]中悬浮培养从而诱导胚状体。从分化开始(悬浮培养开始)起经过第14天～第18天，具有自主搏动能力的细胞分化出来，通过其它途径确认这些细胞为心肌细胞。
分化开始后经过3个月的胚状体依然维持着自主搏动能力。用0.1％胶原酶(Wortington公司)和0.1％胰蛋白酶(DIFCO公司)对它们进行部分性酶处理，制成细小的细胞块。将其分成2部分，对于一方添加0.45M(相当于约700～780mOsm/kg)和0.6M(相当于约850～1000mOsm/kg)的糖质(糖醇类：山梨糖醇、木糖醇、丙三醇，糖类：蔗糖、葡萄糖，甜菜碱类：三甲基甘氨酸)处理12小时，对于另一方，仅加入与进行糖质处理时相同量的生理渗透压溶液Ads缓冲液(116.4mM NaCl、5.4mM KCl、5.6mM葡萄糖、10.9mM NaH2PO4、405.7μM MgSO4、20mM Hepes、pH7.3)处理2小时，将其作为对照(control)组。处理后，两细胞组均用含有10％胎牛血清的DMEM溶液培养12小时。
12小时后在显微镜下观察它们，结果在培养对照群细胞的盘中，发现很多被认为是核比细胞质所占面积大的未分化细胞的、细胞群所构成的集落。然而，在培养实施了糖质处理的细胞的盘中，完全看不到它们的细胞群。另一方面，在培养实施了糖质处理的细胞的盘中，自主搏动的细胞群、自主搏动的单细胞粘着或悬浮。
实施例10：糖质(糖醇类)对人胚胎干细胞来源的胚状体 中残存的干细胞的细胞死亡诱导作用的组织学解析
本实施例目的在于，确认用糖质(糖醇类)对含有由人胚胎干细胞形成的心肌细胞的细胞块(胚状体)进行处理后的、心肌细胞在培养条件下的细胞形态。
对于用丙三醇0.45M(相当于约710mOsm/kg)和丙三醇0.6M(相当于约870mOsm/kg)处理10小时的人胚胎干细胞来源的分化细胞样品，研究在培养条件下的形态。其结果表明，心肌细胞以外的分化细胞基本死灭。该细胞死亡诱导效果在暴露于丙三醇中10小时以上时更显著(图14)。
由上述结果可以明确，用丙三醇长时间处理时能有效地对多能性干细胞(胚胎干细胞/iPS细胞)和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡。
实施例11：低浓度糖质(甘露糖醇)对小鼠胚胎干细胞的 细胞死亡诱导作用
本实施例的目的在于，确认用低浓度的甘露糖醇处理小鼠胚胎干细胞后的干细胞的存活状态。
将用实施例1所述的方法培养的胚胎干细胞在含有甘露糖醇0.2M(相当于约480mOsm/kg)的α-MEM培养液中培养48小时、72小时后，通过细胞的粘着、非粘着和形态的观察来确认干细胞的存活状态，并示于图15。
如图15所示，48小时处理后几乎所有集落均从培养皿脱离，显示细胞死亡所特有的形态。72小时后这种情况更显著，细胞完全死灭。48小时处理时的照片(48h)和72小时处理时的照片(72h)中所示的散开的点为一个细胞。观察到的块状物为来源于ES细胞的集落的死细胞块。下半部分示出示典型的放大像。
进而与实施例1所述的方法同样地用培养液[α-MEM(Minimum Essential Medium，最小必需培养基)(SIGMA)、10％FBS(EQUITEC BIO)、100单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)]通过悬滴法，每株EB将75个小鼠胚胎干细胞以细胞块的形态共计培养7天，从而分化出含有心肌细胞的细胞块后，将胚状体粘着在上述培养皿上，在37℃、5％CO2的条件下培养3～5天。对于含有通过该培养而分化诱导、贴壁培养的心肌细胞的小鼠胚状体，进行最长72小时的0.2M甘露糖醇处理时，72小时后心肌细胞以外的细胞几乎全部死灭，心肌细胞选择性存活，确认对心肌细胞以外的分化细胞诱导了细胞死亡。
产业上的可利用性
根据本发明的方法，通过对含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群进行处理，能够有效地去除细胞群中的胚胎干细胞和非心肌细胞，同时仅心肌细胞能够存活，由此能够有效地浓缩和纯化心肌细胞。

Claims (9)

1.一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞诱导细胞死亡的方法，其用具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞进入细胞死亡。
2.根据权利要求1所述的方法，用高渗液的培养进行2小时以上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液是通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制得的。
4.根据权利要求3所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1～1M的糖质。
5.根据权利要求3或4所述的方法，糖质是糖醇类、糖类、或甜菜碱类。
6.根据权利要求5所述的方法，糖醇类、糖类、或甜菜碱类选自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸组成的组。
7.根据权利要求4所述的方法，具有370mOsm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1～0.6M的丙三醇。
8.根据权利要求7所述的方法，培养进行10小时以上。
9.根据权利要求1～8中任意一项所述的方法，用高渗液培养细胞群后，返回至具有200～300mOsm/kg的通常渗透压的培养液中进一步进行培养。
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