JP6333378B2 - 新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地 - Google Patents

Description

本発明は、未分化幹細胞除去および心筋細胞の純化精製のために使用することができる培地を提供することに関する。

成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しているため、重症な心筋梗塞、心筋症等の疾患では、従来より心臓移植に頼らざるを得ない状況が続いていた。しかし、近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性を有する幹細胞についての研究が進んで来たことから、これらの多能性を有する幹細胞を分化・誘導して心筋細胞を作製し、そのような誘導された心筋細胞を移植医療において使用することが可能になりつつある。

しかしながら、非生理的条件（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件）における心筋細胞の分化の様式は、生理的発生と同じく、先ず未分化な中胚葉細胞が形成され、その一部が予定心筋細胞（前心臓中胚葉）を経た後、心筋細胞へと分化するが、多能性を有する幹細胞は、基本的に臓器を構成する全ての細胞に分化可能であるため、分化・誘導の操作のみによって心筋細胞という一種類の細胞にのみ分化させることは技術的に困難である。また、非生理的条件（ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件）では、全ての多能性を有する幹細胞に対して目的の分化を惹起することは難しく、誘導後にも一部に未分化幹細胞が残存することがある。

このように、体外において幹細胞から心筋細胞への分化を誘導する場合、全ての多能性を有する幹細胞は、心筋細胞以外の細胞を副産物として産生してしまうことや未分化幹細胞を残存させるという、移植を含む臨床応用に対して有害な性質が残ってしまう。特に、残存してしまう未分化幹細胞は、増殖活性を有しかつ多種類の細胞に分化できることから、治療に際して生体に移植された細胞の中に未分化幹細胞が残存すれば、この未分化幹細胞から奇形腫が形成される危険性がきわめて高い（非特許文献１（Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７４３−７４５，２００９））。このような理由から、多能性幹細胞に分化誘導を行って作製された心筋細胞を含有する細胞集団を、そのまま生体に移植し治療に用いることは困難である。従って、多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた治療を安全に実行し、理想的な治療効効果を得るために、未分化の多能性幹細胞を完全に排除し、かつ高度に心筋細胞を精製する方法（即ち、心筋細胞以外の細胞を除去する方法）を見出すことが必要である。

これまでに、未分化幹細胞を培養条件中で選択的に除去する方法が報告されている（非特許文献２（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１３ １２，ｐｐ．１６７−１７９）、非特許文献３（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５，４３５−４３９，２００９））、非特許文献４（Ｓｈｉｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４，１９，１−１５）。非特許文献２においては、オレイン酸がヒトの未分化多能性幹細胞の維持に重要であることが見出され、この条件を逆に利用して、ヒトの未分化多能性幹細胞内でのオレイン酸の生合成を阻害することにより、ヒトの未分化多能性幹細胞を選択的に除去することができることが明らかにされた。また、非特許文献３においては、マウスの胚性幹細胞（胚性幹細胞）が、トレオニン以外の他のアミノ酸を除いた培養液中ではコロニー形成を行うことができたにもかかわらず、トレオニンを除いた培養液中ではコロニー形成を行うことができないことが明らかにされ、トレオニンを除いた培養液中で培養することにより、マウスの未分化胚性幹細胞を選択的に除去することができることが明らかにされた。非特許文献４においては、ヒト多能性幹細胞においては、マウス胚性幹細胞におけるトレオニンの役割をメチオニンが担っており、メチオニンを除いた培養液中では未分化幹細胞が死滅あるいは分化するため、ヒト未分化幹細胞を選択的に除去することができることが明らかにされた。

しかし、これらの文献で明らかになった方法では、未分化多能性幹細胞を除去することはできるものの、心筋細胞以外の分化を誘導された非心筋細胞については、除去する事ができなかった。さらに非特許文献３および非特許文献４では、タンパク合成する際に非常に重要な必須アミノ酸を除去しているため、生き残った目的の細胞における影響も危惧される。

そのため、本発明の発明者の研究グループでは、タンパク合成する際に非常に重要な必須アミノ酸ではなく、他から合成・供給される可能性のある非必須アミノ酸に注目し、多能性を有する幹細胞から心筋細胞を分化・誘導する際に分化・誘導されずに残存してしまう未分化幹細胞だけではなく、心筋細胞を分化・誘導する際に副産物として産生される心筋細胞以外の細胞も効率的に除去することを目的として、研究を行ってきた。その中で、心筋細胞が有するもののその他の細胞が有さない種々の生理学的特徴を見出し、それらの特徴を利用して、非心筋細胞や未分化幹細胞から、心筋細胞のみを選抜する方法を開発してきた。

特許文献１：心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法；及び心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法（ＷＯ２００６／０２２３７７）；
特許文献２：低血清条件、低糖条件、低栄養条件、低カルシウム条件、弱酸性ｐＨ条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件、および／またはピルビン酸添加条件の培養液中で胚性幹細胞由来の心筋細胞を培養することにより、効率的且つ高度に心筋細胞を選択・精製できること（ＷＯ２００７／０８８８７４）；
特許文献３：多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法（ＷＯ２００９／０１７２５４）；
特許文献４：物質的な毒性や細胞死誘導作用が認められていない物質を多能性幹細胞や非心筋細胞の培養条件に対して添加することにより、非常に効率的に心筋細胞以外の細胞に対して細胞死を誘導する方法（ＷＯ２０１０／１１４１３６）；そして
特許文献５：培養液中の培養心筋細胞に対して電位感受性蛍光色素を接触させ、培養液中にビタミンＥ及び／又はコレステロールを添加し、電位感受性蛍光色素の電位依存性又はイオン強度変化依存性の蛍光強度変化を測定することを特徴とする、培養心筋細胞の活動電位を測定する方法（ＷＯ２０１１／０５２８０１）。

この中で特に、特許文献２において、心筋細胞が、細胞培養の条件としては一般的に厳しいと考えられている条件（低糖条件、低血清条件、弱酸性ｐＨ条件、低カルシウム条件、低栄養条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件、ピルビン酸添加条件、などの条件）の下での培養に対して耐性が高く、心筋細胞以外の細胞（すなわち、非心筋細胞や未分化幹細胞）は細胞死するが、心筋細胞は生存することにより、結果的に心筋細胞を選抜することができることを示した。そして、マウスの多能性を有する幹細胞を使用した検討において、特にこれらの条件のうち、低糖条件および乳酸添加条件を使用することが、最も効率的に心筋細胞の選抜に寄与することから、低糖条件および乳酸添加条件をヒトの多能性を有する幹細胞由来の心筋細胞の選抜に際しても使用することができるかどうかについて、検討を行った。

しかしながら、ヒトの多能性を有する幹細胞由来の心筋細胞に関する研究において、低糖条件および乳酸添加条件の培養条件では、未分化幹細胞の除去および心筋細胞の選別に関しては可能であるものの、未分化幹細胞除去に時間がかかること、および臨床応用では数億個の細胞を扱うため未分化幹細胞の混入確率が高くなってしまうことから、より完全により短時間に未分化幹細胞を除去できる系が求められていた。

細胞は、その生存にかかるエネルギーの主たる部分を、グルコースの異化反応に基づいて種々の機構によりＡＴＰを生成することにより獲得している。グルコースの異化反応に基づいてＡＴＰを生成するまでの経路は、細胞内に取り込んだグルコースをピルビン酸にまで分解するプロセスである解糖系、ピルビン酸の分解により生じたアセチルＣｏＡを使用して回路を回転させるＴＣＡ回路（クエン酸回路）、そして解糖系およびＴＣＡ回路において生成されるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、そしてＦＡＤＨ_２を利用してＡＴＰを生成する電子伝達系、が主たるものとして知られている。

一般的に細胞は、環境からグルコースを取り込むことを前提として、エネルギー獲得を行なっている。このようなエネルギー獲得の場合には、解糖系が活性化されており、グルコースを解糖系で分解することに基づいて、ＴＣＡ回路（クエン酸回路）、電子伝達系を介してエネルギー獲得を行なっている。そして、急激にエネルギーを必要とする場面では、解糖系を最大限利用した嫌気的呼吸によりエネルギーを得ているため、ピルビン酸の生成が消費を上回り、乳酸発酵経路が活性化されることとなる。そして逆に、乳酸をピルビン酸に戻す逆反応は、相対的に活発化されていない。

ＷＯ２００６／０２２３７７ ＷＯ２００７／０８８８７４ ＷＯ２００９／０１７２５４ ＷＯ２０１０／１１４１３６ ＷＯ２０１１／０５２８０１

Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７４３−７４５，２００９ Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１３ １２，ｐｐ．１６７−１７９ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５，４３５−４３９，２００９ Ｓｈｉｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４，１９，１−１５

上述したように、特許文献２にあげられる低糖条件および乳酸添加条件での培養については、条件によっては、生残する非心筋細胞あるいは未分化幹細胞がわずかに存在する場合があるため、より短時間で未分化幹細胞を除去でき、結果的により完全に非心筋細胞あるいは未分化幹細胞に対して細胞死を誘導することができ、かつ心筋細胞のみを選抜することができる、新たな条件を見出すことが求められた。

この様な課題を解決するため、本件出願において、未分化幹細胞に細胞死を生じさせるために使用される細胞培養液であって、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないものを提供し、併せてこの細胞培養液中で培養することにより、未分化幹細胞に細胞死を誘導する方法もまた提供する。本件出願においてはさらに、心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液であって、脂肪酸、乳酸又はピルビン酸を添加した、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないものを提供し、併せてこの細胞培養液中で、心筋細胞と非心筋細胞の混合物を培養することにより、心筋細胞を選択的に選抜する方法もまた提供する。

本発明の第一の態様により、未分化幹細胞に細胞死を生じさせるために使用される細胞培養液を提供することができ、その細胞培養液を使用して単純に細胞培養を行うことのみにより、簡便に未分化幹細胞に対して細胞死を誘導することができる。また、本発明の第二の態様により、心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液を提供することができ、その細胞培養液を使用して単純に細胞培養を行うことのみにより、簡便にヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞を含む多能性を有する幹細胞などの未分化幹細胞や、後述する心筋細胞以外の分化細胞、株化細胞に対して細胞死を誘導することができ、結果的に心筋細胞を選択的に選抜することができる。

図１は、２．５×１０^５個のヒト胚性幹細胞を３日間培養した際に消費される培地中アミノ酸およびグルコース濃度の変化を示す。細胞に曝露させる前のｄａｙ ０でのアミノ酸およびグルコース濃度を１００％とした。 図２は、ヒト胚性幹細胞を、様々な条件（グルコースを含む／含まない、乳酸を添加した／添加しないおよび図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件）の下で培養した場合のヒト胚性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を観察した結果を示す。 図３は、ヒト胚性幹細胞を、様々な条件（グルコースを含む／含まない、乳酸を添加した／添加しない、および図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件）の下で培養した場合のヒト胚性幹細胞における生死を観察した結果を示す。 図４は、ヒト人工多能性幹細胞を、様々な条件（グルコースを含む／含まない、乳酸を添加した／添加しない、および図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件）の下で培養した場合のヒト人工多能性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を観察した結果を示す。 図５は、ヒト胚性幹細胞を、グルコースを含まず、かつ、様々なアミノ酸を含まない条件の下で培養した場合のヒト人工多能性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を観察した結果を示す。 図６は、ラット新生仔心筋細胞を、様々な条件（グルコースを含む／含まない、乳酸を添加した／添加しないおよび図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件）の下で培養した場合の新生仔心筋細胞における生死を観察した結果を示す。 図７は、ヒト人工多能性幹細胞から２次元心筋分化誘導した細胞集団を乳酸を添加した、グルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）または乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）条件で培養した場合の写真である。 図８は、図７で得られた細胞塊を、０．２５％トリプシンＥＤＴＡにより分散処理した後、フィブロネクチンコート培養皿にて培養したところ、心筋細胞のみが生存していることを示した図である。Ｂ，α−Ａｃｔｉｎｉｎ陽性心筋細胞はほとんどがＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ陽性の心筋細胞であった。Ｃ，乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）により純化精製した後にはＴｒａ１−６０陽性の未分化幹細胞が全く残存していないことを確認した。 図９は、心筋分化誘導後あるいは純化精製後の残存未分化幹細胞をＱＰＣＲにより評価した結果である。グルタミンを含有する乳酸を添加したグルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）により純化精製した場合には、Ｌｉｎ２８が検出されているが、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）により純化精製した後にはＬｉｎ２８が全く検出されないことを確認した。 図１０は、グルコース及びグルタミンを含まない培養条件下におけるラット新生仔心筋細胞およびヒト胚性幹細胞における乳酸代謝の違いを示したものである。培地中に^１３Ｃでラベル化した乳酸を投与し、ＴＣＡサイクルおよびグルタミン酸における代謝産物を定量化することにより、乳酸がどのように代謝されているかを解析することができる。Ａは乳酸関連の代謝マップを示す。ＴＣＡサイクル内の乳酸由来代謝産物の総量は有意に心筋細胞で多いことが明らかとなった。さらに、２−オキソグルタル酸およびグルタミン酸においても心筋細胞において^１３Ｃが有意に多く検出された。これは、心筋細胞においてグルタミン酸の生合成に乳酸がより多く寄与していることを示すデータである。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１ 図１１は、ヒト人工多能性幹細胞分化誘導後の細胞群について、トロポニンＴ陽性細胞の割合をＦＡＣＳにより解析した結果を示す図である。 図１２は、ヒト胚性幹細胞を、様々な条件（グルコースを含まない、グルタミンを含む／含まない、α−ケトグルタル酸を含む／含まない、及びピルビン酸を添加した／添加しない条件）の下で培養した場合のヒト胚性幹細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を観察した結果を示す。 図１３は、ラット新生仔心筋細胞を様々な条件（グルコースを含まない、グルタミンを含む／含まない、ピルビン酸を添加した／添加しない、乳酸を添加した／添加しない条件）で培養した場合の新生仔心筋細胞の生死を観察した結果を示す。 図１４Ａは、残存未分化幹細胞の検出方法（Ｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１４）の検出精度の結果を示す。図１４Ｂは、心筋分化誘導後あるいは純化精製後の残存未分化幹細胞を図１４Ａの方法により評価した結果である。乳酸を添加したグルタミンを含むがグルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ＋，Ｌａｃ^＋）により純化精製した場合には、未分化幹細胞の検出マーカーであるＴＲＡ１−６０が検出されたが、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）により純化精製した後にはＴＲＡ１−６０が全く検出されなかった。 図１５は、ヒト胚性幹細胞由来の非心筋細胞（増殖型）をグルコース及びグルタミンを含まない条件及び、グルコース及びグルタミンを含まず乳酸を添加した条件で培養した場合の細胞の生死を示す。 図１６は、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）に、アスコルビン酸（２５ｍｇ／Ｌ）又はアルブミン（０．１％）を添加した培地でヒト人工多能性幹細胞を培養した後の細胞群の観察結果を示す図である。 図１７は、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）に、アスコルビン酸（２５ｍｇ／Ｌ）又はアルブミン（０．１％）を添加した培地でヒト人工多能性幹細胞由来の非心筋細胞を培養した後の細胞群の観察結果を示す図である。 図１８は、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）に、アスコルビン酸（２５ｍｇ／Ｌ）又はアルブミン（０．１％）を添加した培地でヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を培養した後の細胞群の観察結果を示す図である。 図１９は、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）に、アスコルビン酸（２５ｍｇ／Ｌ）又はアルブミン（０．１％）を添加した培地でヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を７４４時間培養した後の細胞群の観察結果を示す図である。

解糖系はほとんどの生物に存在する、グルコースがピルビン酸または乳酸まで嫌気的に分解される代謝経路で、根幹的エネルギー獲得系である。動物の体内においては、グルコースがＡＴＰのγ−リン酸基でリン酸化され、またはグリコーゲン分解により、グルコース６−リン酸が生成される反応に始まり、それが順次代謝され、フルクトース１，６−ビスリン酸を経て、トリオースリン酸に開裂し、ＡＴＰを生成しつつ、ピルビン酸に至る。この間、グルコース１ｍｏｌあたり全体としてＡＴＰ２ｍｏｌを生成し、２ｍｏｌのＮＡＤ^＋を還元し、２ｍｏｌのＮＡＤＨを生成する。この代謝経路の最終産物ピルビン酸は、乳酸に変化して細胞外に放出されるか、ミトコンドリア内に移行して、クエン酸回路の基質になる。

トリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路、あるいはクエン酸回路）は、糖、脂肪酸、多くのアミノ酸などの炭素骨格を最終的に完全酸化するための代謝回路であり、例えば解糖系を見た場合、解糖系の最終産物であるピルビン酸の分解から生じたアセチルＣｏＡは、オキサロ酢酸と縮合してクエン酸を生じ、順次（ｃｉｓ−アコニット酸）、イソクエン酸になった後、脱水的脱炭酸をうけ、２−オキソグルタル酸になる。さらに、脱水素的脱炭酸、ＣｏＡの脱離、脱水素、加水、脱水素などの反応を順次受けて、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、りんご酸を経てオキサロ酢酸に至る。回路の１回転により、アセチルＣｏＡのアセチル基は完全酸化され、１分子のアセチルＣｏＡの分解により、２分子のＣＯ２の放出、３分子のＮＡＤＨの生成、１分子の還元型ＦＡＤの生成、そして１分子のＧＴＰの生成をすることになる。

しかしながら、ＴＣＡ回路は単なる分解過程ではなく、糖・アミノ酸・脂肪酸の各代謝系の切換えの調節点でもあり、同化代謝における重要な出発点になる。例えば、解糖がある程度進行すれば、クエン酸などの濃度が高まり、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを活性化し、ＴＣＡ回路自体の回転はある限度内に抑えられ、アセチルＣｏＡは脂肪酸合成の方向に振り向けられる。また、例えば、オキサロ酢酸からはアスパラギン酸が作られる。このように、ＴＣＡ回路の中間体は、様々な有機物の生合成のために奪われるため、ＴＣＡ回路が１回転する際に再生されるオキサロ酢酸の量は通常は減少することになる。そのため、ＴＣＡ回路の順調な回転を維持するためには、別個にオキサロ酢酸を補給する系が必要であり、例えば、アラニンとグリシン、システイン、セリン、そしてトレオニンがピルビン酸に分解される系とともに、ピルビン酸をピルビン酸カルボキシラーゼにより分解することによりオキサロ酢酸を供給する系、アスパラギン酸をトランスアミナーゼでアミノ転移してオキサロ酢酸を生じる系、フェニルアラニンおよびチロシンを分解してフマル酸を生じる系、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、プロリンをグルタミン酸に分解した後、グルタミン酸をグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって酸化されて２−オキソグルタル酸を供給する系、などの系がこれに当たる。

動物の細胞内におけるエネルギー獲得系は、上述した解糖系およびＴＣＡ回路の種々の脱水素反応によって生じた水素および電子は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ_２などの電子供与体によりミトコンドリアに運搬され、ミトコンドリア内膜にある酸化還元系の一連の酸化還元酵素（複合体）や電子伝達体（各種シトクロムなど）に受け渡し、これらの物質で構成される電子伝達系を経て、酸素を還元し水を生じる。この際に、Ｈ^＋が膜を介して一方向的に運搬され、Ｈ^＋の電気化学ポテンシャル差が形成され、これを用いて最終的にＡＴＰなどの高エネルギーリン酸結合が合成される。

本発明の発明者らは、特許文献２にあげられる既知の種々の培養条件では生残する非心筋細胞あるいは未分化幹細胞がわずかに存在するため、より完全かつ短時間で非心筋細胞あるいは未分化幹細胞に対して細胞死を誘導することができ、かつ心筋細胞のみを選抜することができる、新たな条件を見出すことを目的として鋭意研究を行なった。

まず、新鮮な培養液と細胞培養後の培養液との間でのアミノ酸濃度を測定することにより、ヒト多能性幹細胞における消費が活発なアミノ酸を調べた。その結果、ヒト多能性幹細胞においては総じて、セリン（Ｓｅｒ）の消費量、グルタミン（Ｇｌｎ）の消費量、アルギニン（Ａｒｇ）の消費量、シスチン（Ｃｙｓ２）の消費量が非常に多いことがわかった。また、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）の消費量も比較的多いことも明らかとなった（図１）。ただし、非特許文献３および非特許文献４のように、タンパク合成する際に非常に重要な必須アミノ酸を含まない場合は、生き残った目的の細胞における影響も危惧されるため、他から合成・供給される可能性のある非必須アミノ酸に注目して研究を行った。

そして、グルコースの存在下にて、ヒトの胚性幹細胞あるいはヒト人工多能性幹細胞を種々のアミノ酸条件の下で培養したところ、グルコース（Ｇｌｕｃ）が存在するにも関わらず、セリン（Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、あるいはアルギニン（Ａｒｇ）を含まない細胞培養液で培養することにより、ヒト胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞のコロニー数が低下することがわかった（図２Ａおよび図４Ａ）。そして、ヒト胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞のコロニー数に対する、これらのアミノ酸を含まない培養条件の効果を確認したところ、グルコースを含まない培養条件においてはグルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）およびグリシン（Ｇｌｙ）、アルギニン（Ａｒｇ）の順で強力な効果を有していたことも明らかになった（図３Ｂ）。

これらの結果に基づいて、本発明においては、培養液中のアミノ酸組成のうち、グルタミンを含まないこと（Ｇｌｎ⁻）により、ヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞を含む多能性を有する幹細胞などの未分化幹細胞や、後述する心筋細胞以外の分化細胞、に対して細胞死を誘導することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の第一の態様において、アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない、細胞培養液（Ｇｌｎ⁻）の発明を提供する。本発明の第一の態様における細胞培養液は、前述した知見に基づいて、セリンおよび／またはグリシン（Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻）を含まないことをさらなる特徴としてもよく、そしてアルギニンを含まないこと（Ａｒｇ⁻）をさらなる特徴としてもよいものである。具体的に列挙すると：
・アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、およびセリンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻）；

アミノ酸組成のうち、グルタミン、およびグリシンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびグリシンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、およびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・アミノ酸組成のうち、グルタミン、セリン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
等を使用することができる。

これらのアミノ酸は、いずれも従来技術の項において記載した糖代謝およびＴＣＡ回路と関連性を有しているアミノ酸であり、グルタミンは、グルタミン酸に分解された後、さらにグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって酸化されて２−オキソグルタル酸となり、ＴＣＡ回路に導入される。また、セリンおよびグリシンはピルビン酸に分解された後、ピルビン酸カルボキシラーゼにより分解することによりオキサロ酢酸となり、ＴＣＡ回路に導入される。

本願発明の第一の態様における上述した本願発明の細胞培養液は、血清や血清代替品を含まない培養液であり、グルタミン、セリンおよび／またはグリシン、またはアルギニンなどの特定のアミノ酸の条件以外の条件については、一般的な細胞培養液（例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（例えば、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳ］）、ＲＰＭＩ培養液（例えば、ＲＰＭＩ １６４０など）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲ１など）と同様の組成とすることができる。

本発明の発明者等の検討に基づいて、上述した様な特殊なアミノ酸組成を有する細胞培養液は、未分化幹細胞や、後述する心筋細胞以外の分化細胞に対して、細胞死を生じさせるために使用することができる。しかしながら、さらに効率的に、これらの細胞に対して細胞死を生じさせたい場合には、上記アミノ酸組成の条件に加えて、糖類を含まない低糖条件（Ｇｌｕｃ⁻）を使用することができる。

ここで、「未分化幹細胞」という場合、本願発明の即する技術分野において一般的に使用される多能性を有する幹細胞または複数分化能を有する幹細胞を意味し、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などの胚性幹細胞に類似した形質を有するその他の全ての多能性を有する幹細胞、および哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、などに含まれる複数分化能を有する幹細胞が含まれる。この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現、又はテラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成能やキメラマウス形成能といった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。本発明においては、未分化幹細胞は、多能性を有する幹細胞であることが好ましい。

これらの細胞は、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの未分化幹細胞が有する特有の細胞マーカーを有することによって定義することもできる。

多能性を有する幹細胞から心筋細胞を調製する場合、心筋細胞への分化が進行するにつれて、未分化中胚葉、心臓中胚葉（または予定心筋細胞）を経て心筋細胞に分化すると考えられている。したがって、本発明において「心筋細胞」と言う場合、未分化な幹細胞から心筋細胞への分化・誘導が開始された細胞を全て包含する概念であり、上述した未分化中胚葉、心臓中胚葉（または予定心筋細胞）を経て心筋細胞を全て包含する。ここで、未分化中胚葉とは、未分化中胚葉に特異的なＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質の発現が認められる細胞を意味する。心臓中胚葉（または予定心筋細胞）とは、Ｍｅｓｐ−１等の心臓への分化が開始された中胚葉に特異的なタンパク質の発現が認められ、かつ同一細胞においてＮｋｘ２．５やアクチニン等の心筋細胞特異的タンパク質の発現を未だ認めない細胞であって、その後にさらなる誘導を行うことを必要とせず、専ら心筋細胞へ分化する能力を有する細胞を意味する。そして、心筋細胞とは、生きた細胞の場合には自律拍動を行っている細胞のことを意味し、固定後は、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、アクチニンなどのマーカーを発現する細胞を意味する。

胎児期には、血中脂肪酸濃度が０．１ｍＭ以下で、乳酸濃度が５〜７ｍＭであり、心筋細胞は乳酸を主なエネルギー源としている（Ｔｏｈｙａｍａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３；１２：１２７−１３７）。出生後には、血中脂肪酸濃度が０．２〜０．４ｍＭに上昇し、また、乳酸濃度は０．５ｍＭに低下し、心筋細胞は脂肪酸を主なエネルギー源にするようになる（Ｌｏｐａｓｃｈｕｋ ＧＤ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９１；２６１：Ｈ１６９８−１７０５、Ｗｅｒｎｅｒ ＪＣ ｅｔ ａｌ．，１９８７；２２：５５２−５５６、Ｍｅｄｉｎａ ＪＭ．，Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｎａｔｅ．１９８５；４８：２３７−２４４、Ｌｏｐａｓｃｈｕｋ ＧＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０；５６：１３０−１４０）。また、出生後の心筋細胞は、虚血や圧負荷などのストレスがかかると、遺伝子発現パターンが胎児型のパターンに変化して、胎児期の心筋細胞のように乳酸を主なエネルギー源に使用することができるようになる。「心筋細胞」は、一般的に、他の細胞とは異なり、グルコースの代わりに乳酸、ピルビン酸及び脂肪酸をエネルギー源として利用できるという特徴を共通して有している。そして、他の細胞は有しておらず、心筋細胞のみが共通して有するそのような特徴を利用することにより、本発明を用いて心筋細胞を精製できる。このため、本発明に使用する「心筋細胞」は、その細胞の由来や取得手段により限定されない。例えば、多能性を有する幹細胞を分化・誘導して得られた「心筋細胞」、ヒトの胎児、新生児及び成体から採取した「心筋細胞」、哺乳類に属する動物の新生仔、胎仔及び成体から採取した「心筋細胞」、並びに、非心筋の分化細胞から直接分化させて（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）得た「心筋細胞」なども含まれる。

本発明において、「株化細胞」という場合、細胞培養条件下において自己複製することができる不死化された細胞のことを意味する。

本発明において、細胞培養液中から特定のアミノ酸（セリン、グリシン、グルタミン、あるいはアルギニン）および／または糖類を「含まない」という場合、これらの特定のアミノ酸や糖類を培養液中に全く含まないものであることが究極的であるが、本願発明の目的を達成することができる限りにおいて、培養液中から１００％除去されていることまでは要求されず、これらのアミノ酸のいずれかが微量培養液中に含まれるとしても、許容される。許容されるこれらの特定のアミノ酸あるいは糖類の量は、未分化幹細胞や、非心筋細胞、株化細胞などは増殖することができず細胞死を誘導される培養条件であることを特徴として規定することができる。例えば、一般的に細胞培養において使用される市販の培養液に含まれるそれぞれのアミノ酸量または糖類の量を、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満とした細胞培養液を使用する。例えば、
・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅを０．０４２ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅを０．０３ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを０．５８４ｇ／Ｌ、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ・ＨＣｌを０．８４ｇ／Ｌまたは０．０８４ｇ／Ｌ、そして糖類（Ｄ−グルコース）を４．５〜１０ｇ／Ｌ、を含む培養液；
・Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅを０．０２１０２または０．０１０５ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅを０．０１５０１４ｇ／Ｌ又は０．００７５１ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを０．１４６０〜２９２２ｇ／Ｌ、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ・ＨＣｌを０．４２１４または０．２１１ｇ／Ｌ、そして糖類（Ｄ−グルコース）を１．２６〜１．８０２ｇ／Ｌ、を含む培養液；
・ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅを０．０３〜０．３ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｉｎｅを０．０１〜０．１ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを０．３ｇ／Ｌ、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅを０．２〜２ｇ／Ｌ、そして糖類（Ｄ−グルコース）を２．０〜２０．０ｇ／Ｌ、を含む培養液；
である。したがって、特定のアミノ酸および／または糖類を「含まない」と言う場合、上述した細胞培養において一般的に使用する培養液の組成に基づいて、これらのアミノ酸量または糖類の量を１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満とする。なお、ここで、糖類という場合、培養液中の糖類（すなわち、多糖、単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノースなど）全てを包含する概念である。

上述した本発明の第一の態様に基づいて、本発明の発明者等は、アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液中で培養することにより、あるいは、アミノ酸組成のうち、グルタミンに加えてセリンおよびグリシンを含まない細胞培養液中で培養することにより、あるいはアミノ酸組成のうち、アルギニンをさらに含まない細胞培養液中で培養することにより、未分化幹細胞に細胞死を誘導することができることから、結果として、未分化幹細胞に細胞死を誘導するための方法を開示することができる。

本発明の第一の態様において、未分化幹細胞に細胞死を誘導するため、上記特定のアミノ酸を含まない条件下にて、細胞培養を１２時間〜３６０時間、好ましくは２４〜２４０時間、より好ましくは４８〜１２０時間、継続する。

上述したように、特許文献２にあげられる様々な心筋細胞培養条件をヒトの細胞に対して適用する場合に、条件によっては、生残する非心筋細胞あるいは未分化幹細胞がわずかに存在する場合があるため、本発明の発明者らはついで、特許文献２において明らかにした心筋細胞の選択的取得のための培養条件の知見に対して、本発明の第一の態様において得られた未分化幹細胞に対して細胞死を誘導する培養条件に関する知見を組み合わせることにより、心筋細胞をより効率的に取得できるかどうかを検討した。

その結果、特許文献２にあげられる種々の培養時条件の中から、低糖条件、かつ、心筋細胞がエネルギー源とすることのできる乳酸、ピルビン酸又は脂肪酸を添加した条件の培養条件と、本願明細書において明らかになった上述したような未分化幹細胞に対して細胞死を生じさせる培養条件とを組み合わせることにより、ヒトにおいても心筋細胞をより効率的に取得することができることを明らかにした。

これらの結果に基づいて、本発明においては、培養液の条件として、乳酸、ピルビン酸又は脂肪酸を添加した、糖類を含まない条件の下、培養液中のアミノ酸組成のうち、グルタミンを含まないこと（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、又は、Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）により、ヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞を含む多能性を有する幹細胞などの未分化幹細胞や、心筋細胞以外の分化細胞に対して細胞死を誘導することができ（図２Ｂ、図３Ｂ、および図４Ｂ）、結果として心筋細胞のみを選択的に取得することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

なお、Ｃｙｓ２、およびＭｅｔの消費量が比較的多いことを考慮し、乳酸を添加した、糖類を含まない条件の下（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻）、これらのアミノ酸のいずれかを含まない培地を使用して、未分化幹細胞（ヒト胚性幹細胞）が死滅するかどうかを検討した。その結果、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）の場合と比較して、乳酸を添加した、グルコース及びＣｙｓ２を含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｃｙｓ２⁻）、および、乳酸を添加した、グルコース及びＭｅｔを含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｍｅｔ⁻）の細胞死誘導活性は、対照として使用した、乳酸を添加した、グルコース及びトレオニンを含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｔｈｒ⁻）と同程度の細胞死誘導活性しか有さないことが明らかになり、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）の細胞死誘導活性が際だっていることが明らかになった（図５）。この結果は、非特許文献３および非特許文献４で示される未分化幹細胞におけるトレオニンやメチオニンに比べて、グルコースおよびグルタミンを含まない培地が、残存する未分化幹細胞の除去能力に、より優れていることを示唆するものである。

したがって、本発明の第二の態様において、乳酸、ピルビン酸又は脂肪酸を添加した（Ｌａｃｔａｔｅ^＋又はＰｙｒ^＋）、グルコースを含まず（Ｇｌｕｃ⁻）、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないこと（Ｇｌｎ⁻）を特徴とする、細胞培養液の発明を提供する。本発明の第二の態様における細胞培養液は、セリンおよび／またはグリシン（Ｓｅｒ⁻；Ｇｌｙ⁻）を含まないことをさらなる特徴としてもよく、そしてアルギニンを含まないこと（Ａｒｇ⁻）をさらなる特徴としてもよいものである。具体的に列挙すると：
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびセリンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびグリシンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびグリシンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・乳酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびセリンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびグリシンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびグリシンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・ピルビン酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液（Ｐｙｒ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｓｅｒ⁻、Ｇｌｙ⁻、Ａｒｇ⁻）；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびセリンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびグリシンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびグリシンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、およびアルギニンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリンおよびアルギニンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液；
・脂肪酸添加、低糖条件、かつアミノ酸組成のうち、グルタミン、セリン、グリシンおよびアルギニンを含まない細胞培養液；
等を使用することができる。

本発明の細胞培養液に、アスコルビン酸又はアルブミン、あるいはこれら両方を添加してもよい。アスコルビン酸やアルブミンを添加しても、細胞培養液の細胞死誘導活性に影響を与えることがない。

本願発明の第二の態様における上述した細胞培養液は、血清や血清代替品を含まない培養液であり、乳酸、ピルビン酸及び脂肪酸、グルコース、グルタミン、セリンおよび／またはグリシンアミノ酸、またはアルギニンなどの特定のアミノ酸の条件以外の条件については、一般的な細胞培養液（例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（例えば、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳ］）、ＲＰＭＩ培養液（例えば、ＲＰＭＩ １９４０など）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲ１など）と同様の組成とすることができる。

本発明の発明者等の検討に基づいて、上述した様な特殊なアミノ酸組成を有する細胞培養液は、未分化幹細胞や、心筋細胞以外の分化細胞、株化細胞に対しては細胞死を生じさせるが、心筋細胞には細胞死を誘導しない。その結果として、本発明の第二の態様における細胞培養液は、心筋細胞と非心筋細胞の混合物から、心筋細胞を選択的に選抜するために使用することができる。

本発明において、細胞培養液に対して乳酸を添加するという場合、使用する細胞培養液に対して、乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）を０．１〜１０ｍＭとなるように添加したもののことをいう。また、細胞培養液に対してピルビン酸を添加するという場合、使用する細胞培養液に対して、ピルビン酸（Ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）を０．１〜１０ｍＭとなるように添加したもののことをいう。細胞培養液に対して脂肪酸を添加するという場合、使用する細胞培養液に対して、中鎖脂肪酸（炭素数が５〜１２個の脂肪酸）や長鎖脂肪酸（炭素数が１２個より多い脂肪酸）を添加したもののことをいう。例えば、オレイン酸、リノール酸及びパルミチン酸等の０．０５〜０．５ｍＭとなるように添加することができる。

一方、その他の成分について、細胞培養液中から特定のアミノ酸（セリン、グリシン、グルタミン、あるいはアルギニン）および／または糖類を「含まない」という場合、全く含まないものであることが究極的であるが、本願発明の目的を達成することができる限りにおいて、培養液中から１００％除去されていることまでは要求されない。

上述した本発明の第二の態様に基づいて、本発明の発明者等は、乳酸、ピルビン酸又は脂肪酸を添加し、グルコースを含まないことに加えて、アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液中で培養することにより、あるいは、アミノ酸組成のうち、グルタミンに加えてセリンおよびグリシンを含まない細胞培養液中で培養することにより、あるいはアミノ酸組成のうち、アルギニンをさらに含まない細胞培養液中で培養することにより、非心筋細胞に細胞死を誘導することができることから、結果として、心筋細胞と非心筋細胞の混合物を培養することにより、非心筋細胞に細胞死を誘導し、結果として心筋細胞を選択的に選抜する方法を開示することができる。本発明において、非心筋細胞という場合、心筋細胞および将来的に心筋細胞になることが分化・誘導されている細胞以外のすべての細胞を包含しており、例えば、未分化幹細胞、非心筋の分化細胞、または株化細胞が含まれる。

本発明の第二の態様において、非心筋細胞に細胞死を誘導するため、上記特定のアミノ酸を含まない条件下にて、細胞培養を１２時間〜３６０時間、好ましくは２４〜２４０時間、より好ましくは４８〜１２０時間、継続する。

本発明の細胞培養液に、アスコルビン酸又はアルブミン、あるいはこれら両方を添加してもよい。アスコルビン酸やアルブミンを添加しても、細胞培養液の細胞死誘導活性心筋細胞の精製精度に影響を与えることなく、心筋細胞を６００時間以上の培養することができる。

本明細書の以下において、実施例を提示する。これらの実施例は、本発明を説明することを目的とするものであり、どのような形式であれ本発明を限定することを目的とするものでない。

実施例１：細胞の培養
本実施例においては、未分化幹細胞（胚性幹細胞および人工多能性幹細胞）の培養、分化細胞の培養、ならびに未分化幹細胞から心筋細胞への分化培養、を行った。

ヒト胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞）は、国立大学法人・京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター中辻憲夫教授から入手し、ヒト人工多能性幹細胞は、国立大学法人・京都大学ｉＰＳ細胞研究所山中伸弥教授から入手した。このヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞を、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ ３５４２７７）を用いて未分化維持培養を行った。培養液はｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ｃａｔ １１８７５−１１９）を用いた。未分化維持培養液に関してはｍＴｅＳＲ１の他に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）など、フィーダーフリー用の培地として一般的に使用されているものであれば使用可能である。またマトリックスとして、マトリゲルの他に、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やｉＭａｔｒｉｘ−５１１（Ｔａｋａｒａ ｎｏ．８９２００１）などがあり、その他のフィーダーフリー用のマトリックスとして一般的に使用されているものであれば使用可能である。

植え継ぎに際しては、ＣＴＫ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｅｐｒｏ ＣＥＬＬ）、３７℃５分にてヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のコロニーを分離した。細胞の分散処理に関してはＣＴＫ ｓｏｌｕｔｉｏｎ以外にＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｎｏ．１１１０５０１）やＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ／Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も使用可能である。

未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導は、今回の実験で用いている心筋分化誘導法は
・心筋分化にあたり、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞が５０〜９０％コンフルエントになったところで、ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７（インスリンなし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ｏｒ Ｗａｋｏ）６μＭを添加したものに培地を交換した（Ｄａｙ ０）。
・Ｄａｙ １〜Ｄａｙ ２は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・次いで、Ｄａｙ ３〜Ｄａｙ ５は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地に、さらにＩＷＰ２ ５μＭあるいはＩＷＲ−１（Ｓｉｇｍａ Ｉ０１６１）５μＭを添加した培地で培養を行った。
・さらに、Ｄａｙ ６〜Ｄａｙ ７は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・そして、Ｄａｙ ８以降は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（＋）培地で培養を行った（Ｌｉａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１３，８，１６２−１７５）。Ｄａｙ ８〜Ｄａｙ １１の段階で、拍動する心筋細胞を確認することができた。

培養液中の糖を限りなく含まない条件にするために、ＰＢＳで２回洗浄し（Ｇｌｕｃ⁻）、最終的に乳酸（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｔ １２９−０２６６６）４ｍＭを加えたＤ−ＭＥＭ培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋条件）中で、グルタミン存在下（Ｇｌｎ^＋）またはグルタミン非存在下（Ｇｌｎ⁻）の下で、３〜４日間培養を行った。乳酸濃度は１〜１０ｍＭの範囲で調整する必要がある。本実施例においては、４ｍＭの乳酸を添加した。

実施例２：培養条件下での培養未分化幹細胞のアミノ酸要求性
本実施例においては、未分化幹細胞としてヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞を使用して、未分化幹細胞が培養条件下においてどの様なアミノ酸要求性を持っているのかを調べた。

ヒト胚性幹細胞において、特に消費が活発な非必須アミノ酸および準必須アミノ酸を調べるために、培地中のアミノ酸濃度を測定した。具体的には、細胞毎に１．５×１０^６個の細胞を３．５ｃｍのシャーレ中で培養し、その後、細胞培養開始前の培養液組成と、細胞培養後の培養液組成を解析した。

アミノ酸分析は新保ら（Ｓｈｉｍｂｏ，Ｋ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９，２３，１４８３−１４９２）のシステムに従い実施した。細胞培養後上清は１．５ｍＬチューブにとり、測定時までマイナス８０℃で保存した。サンプルはタンパク質除去処理を実施後、ＡＰＤＳ試薬で誘導体化を実施して分析装置にかけた。各サンプル中のアミノ酸濃度は検量線に用いて算出した。分析した３７アミノ酸は以下の通り：グリシン（Ｇｌｙ）、サルコシン（Ｓａｒ）、アラニン（Ａｌａ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、β−イソアミノ酪酸（ｂ−ＡｉＢＡ）、α−アミノ酪酸（ａ−ＡＢＡ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、タウリン（Ｔａｕ）、ヒドロキシプロリン（ＨｙＰｒｏ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、α−アミノアジピン酸（ａ−ＡＡＡ）、ヒドロキシリジン（ＨｙＬｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、１−メチルヒスチジン（１ＭｅＨｉｓ）、３−メチルヒスチジン（３ＭｅＨｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、シスタチオニン（ｃｙｓｔｈｉ）、カルノシン（Ｃａｒ）、アンセリン（Ａｎｓ）、シスチン（Ｃｙｓ２）、アラニン−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）、グリシン−グルタミン（Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）。

セリン、アルギニン、シスチン、グルタミンについて特に培養時間に応じて培地中の濃度が著しく低下することがわかった。

次に、様々な条件のもとで培養を行った場合の細胞の生存を、細胞が有するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を、ＳｔｅｍＴＡＧ^ＴＭアルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ ８６−Ｒ）で発色する細胞を生細胞として確認する方法で、ヒト胚性幹細胞（図２）およびヒト人工多能性幹細胞（図４）において、様々なアミノ酸条件に対する反応性を調べた。

高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに（図２Ａおよび図４Ａ、「Ｇｌｕｃ^＋条件」）、グルタミン、セリン、グリシン、アルギニンの４つのアミノ酸を含まない培地、およびＤＭＥＭの基本組成から上述の１つずつのアミノ酸（セリンのみ、セリン・グリシンのみ、アルギニンのみ、グルタミンのみ）を含まない培地を作製した（それぞれ、「Ｓｅｒ⁻」「Ｓｅｒ⁻Ｇｌｙ⁻」「Ａｒｇ⁻」「Ｇｌｎ⁻」）。上記培養条件にてヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞を約４８時間培養した後、ＡＬＰ染色を行ったところ、グルコースが存在するにも関わらず、セリンを含まない条件（Ｓｅｒ⁻）、セリン・グリシンを含まない条件（Ｓｅｒ⁻Ｇｌｙ⁻）、グルタミンを含まない条件（Ｇｌｎ⁻）、アルギニンを含まない条件（Ａｒｇ⁻）にて細胞培養を行うことにより、ヒト胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞のコロニー数が低下することがわかった。しかし、４８時間でもＡＬＰ陽性の未分化コロニーは多く認められた（図２Ａ、図４Ａ）。

次に、グルコースを含まないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸（４ｍＭ）を添加し（図２Ｂおよび図４Ｂ、「Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋条件」）、ＤＭＥＭの基本組成のうちセリン、グリシン、アルギニン、グルタミンの４つのアミノ酸を含まない培地、およびＤＭＥＭの基本組成のうち上述の１つずつのアミノ酸（セリンのみ、セリン・グリシンのみ、アルギニンのみ、グルタミンのみ）を含まない培地（それぞれ、「Ｓｅｒ⁻」「Ｓｅｒ⁻Ｇｌｙ⁻」「Ａｒｇ⁻」「Ｇｌｎ⁻」）を作製した。上記培養条件にてヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞を約４８時間培養した後、ＡＬＰ染色を行ったところ、グルコースを含まないＤＭＥＭ組成から４つのアミノ酸を含まない群およびグルコースを含まないＤＭＥＭ組成からグルタミンのみを含まない群（Ｇｌｎ⁻）では、ヒト胚性幹細胞あるいは人工多能性幹細胞のＡＬＰ陽性コロニー数が２４時間でほぼ消失し、４８時間で完全に消失することがわかった（図２Ｂ、図４Ｂ）。

図１において、ヒトの胚性幹細胞において、Ｃｙｓ２、およびＭｅｔの消費量が比較的多いことを考慮し、乳酸を添加した、糖類を含まない条件の下（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻）、これらのアミノ酸のいずれかを含まない培地を使用して、未分化幹細胞（ヒト胚性幹細胞）が生存できるかどうかを検討した。培養液としては、グルコースを含まないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸（４ｍＭ）を添加し（「Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋条件」）、このＤＭＥＭの基本組成から上述の１つずつのアミノ酸（グルタミンのみ、シスチンのみ、メチオニンのみ、トレオニンのみ）を含まない培地（それぞれ、「Ｇｌｎ⁻」「Ｃｙｓ２⁻」「Ｍｅｔ⁻」「Ｔｈｒ⁻」）を作製・使用し、細胞をそれぞれの培地を使用して２４時間培養した後、細胞が有するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を、ＳｔｅｍＴＡＧ^ＴＭアルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ ８６−Ｒ）で発色させ、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。その結果、グルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｎ⁻）の場合と比較して、Ｃｙｓ２を含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｃｙｓ２⁻）およびＭｅｔを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｍｅｔ⁻）の細胞死誘導活性は、対照として使用したトレオニンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｔｈｒ⁻）と同程度の細胞死誘導活性しか有さないことが明らかになり、グルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｎ⁻）の細胞死誘導活性が際だっていることが明らかになった（図５）。この結果は、非特許文献３および非特許文献４で示される未分化幹細胞におけるトレオニンやメチオニンに比べて、グルコースおよびグルタミンを含まない培地がより残存未分化幹細胞除去能力に優れていることを示唆するものである。

実施例３：様々な培養液条件に対する細胞の反応性
本実施例においては、未分化幹細胞または心筋細胞を様々な培養液条件中で培養した場合に、細胞の生存率がどの様に変化するかを明確にした。

本実施例において使用する培養液として、グルコースを含まないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸（４ｍＭ）を添加し（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ^＋）または乳酸を添加しない（Ｇｌｕｃ⁻、Ｌａｃｔａｔｅ⁻）いずれかの条件に、さらに、アルギニン、グルタミン、セリン、グリシンの４つのアミノ酸のうちの１つ（アルギニンのみ、グルタミンのみ、セリンのみ、またはグリシンのみ）を含まない条件を追加した培地（それぞれ、「Ａｒｇ⁻」「Ｇｌｎ⁻」「Ｓｅｒ⁻」「Ｇｌｙ⁻」）を作製した。上記培養条件にて未分化幹細胞（ヒト胚性幹細胞）またはラット新生仔心筋細胞を約２４時間培養した後、生細胞・死細胞同時染色キット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）による染色を行い、撮像するとともに（図３Ａおよび図６Ａ）、細胞生存率をカウントした（図３Ｂおよび図６Ｂ）。

未分化幹細胞（ヒト胚性幹細胞）を使用して、図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件の下で培養した場合の未分化幹細胞における生死を観察し、細胞生存率を測定した結果を図３に示す。この結果、未分化幹細胞の場合には、乳酸を添加するかしないかに関わらず、グルタミンを含まない培地（「Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻」または「Ｌａｃｔａｔｅ⁻、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻」）において、生存率が顕著に低下することが明らかになった（図３）。

一方、ラット新生仔心筋細胞を使用して、同様の方法で、図１で消費の多かった様々な非必須アミノ酸を含まない条件の下で培養した場合の心筋細胞における生死を観察し、細胞生存率を測定した結果を図６に示す。この結果、新生仔心筋細胞の場合には、乳酸を添加することにより、グルタミンを含まない培地（Ｌａｃｔａｔｅ^＋、Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）の場合であっても、生存率を顕著に改善すること、すなわち、乳酸の添加に基づいて、グルタミンを含まない条件（Ｇｌｎ⁻）により生じる細胞死誘導活性が、低減されることが明らかになった（図６）。

実施例４：培養条件下での人工多能性幹細胞から心筋細胞への分化・誘導
本実施例は、ヒト人工多能性幹細胞から心筋細胞への分化・誘導の手順を明確にすることを目的として行われた。
・心筋分化にあたり、ヒト人工多能性幹細胞が５０〜９０％コンフルエントになったところで、ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７（インスリンなし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ｏｒ Ｗａｋｏ）６μＭを添加したものに培地を交換した（Ｄａｙ ０）。
・Ｄａｙ １〜Ｄａｙ ２は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・次いで、Ｄａｙ ３〜Ｄａｙ ５は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地に、さらにＩＷＰ２ ５μＭあるいはＩＷＲ−１ ５μＭを添加した培地で培養を行った。
・さらに、Ｄａｙ ６〜Ｄａｙ ７は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・そして、Ｄａｙ ８以降は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（＋）培地で培養を行った（Ｌｉａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１３，８，１６２−１７５）。Ｄａｙ ８〜Ｄａｙ １１の段階で、拍動する心筋細胞を確認することができた（図４Ａ）。

培養液中の糖が実質的に含まれないようにするために、ＰＢＳで２回洗浄し（Ｇｌｕｃ⁻）、最終的に乳酸（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｔ １２９−０２６６６）４ｍＭを加えたＤ−ＭＥＭ培養液（Ｌａｃｔａｔｅ^＋条件）中で、グルタミン存在下（Ｇｌｎ^＋）またはグルタミン非存在下（Ｇｌｎ⁻）で、３〜４日間培養を行った。乳酸濃度は１〜１０ｍＭの範囲で調整する必要がある。本実施例においては、４ｍＭの乳酸を添加した。

実施例５：培養条件下での心筋分化細胞のアミノ酸要求性
本実施例においては、ヒト人工多能性幹細胞から分化・誘導された心筋細胞を使用して、心筋分化細胞が、培養条件下において、どの様なアミノ酸要求性を持っているのかを調べた。

糖存在条件（図７Ａ）、グルコースを含まず乳酸添加培地（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１３ １２：１２７−３７）（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）（図７Ｂ）、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）（図７Ｃ）にて３日間培養した後で、免疫染色した写真を図７に示す。

免疫染色では、細胞を４％パラフォルムアルデヒドにて１５から３０分間固定した後、細胞核についてはＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および横紋構造については抗αアクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ）とＡｌｅｘａ５４６ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、蛍光を検出した。

３日間の培養後の免疫写真では、グルコースを含まない乳酸添加培地（グルタミンあり）（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）では、ＤＡＰＩで染色された細胞核に対して、心筋マーカーであるαアクチニン陰性の細胞がわずかに認められたのに対して（図７Ｂ）、乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）では、ＤＡＰＩで染色された細胞核に対して、１００％近い細胞がαアクチニン陽性の細胞であった（図７Ｃ）。

この結果は、グルタミンを含む培養条件（図７Ｂ）においては、心筋細胞以外の細胞がわずかに生存していたのに対して、グルタミンを含まない培養条件（図７Ｃ）においては、心筋細胞は生存していたものの、心筋細胞以外の細胞（未分化幹細胞、非心筋細胞）は細胞死を誘導されて、完全に存在しなくなったことを示している。

糖代謝の経路との関連でこの様な差異が生じた機序を予想すると、一般の細胞（未分化幹細胞や非心筋細胞）では、糖代謝の一連の流れにおいて、解糖系からのピルビン酸供給経路、グルタミンからのグルタミン酸を経由したα−ケトグルタル酸供給経路が、細胞の生存に大きく寄与しているものの、乳酸からのピルビン酸供給経路は、一般的に非常に寄与度が低い状態に維持されている。これに対して、心筋細胞においては、解糖系からのピルビン酸供給経路、グルタミンからのグルタミン酸を経由したα−ケトグルタル酸供給経路、だけでなく、乳酸からのピルビン酸供給経路も心筋細胞の生存に対して実質的な寄与をしていることが予想された。

そしてこの結果、ヒト胚性幹細胞あるいはヒト人工多能性幹細胞から誘導された心筋細胞（未分化幹細胞や非心筋細胞を含む状態）を、乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない培養条件下（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）にて培養することにより、乳酸を添加したグルコースを含まない培養条件下（グルタミンあり）（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）で培養する際に比べて短時間で効率よく心筋細胞を選択的に取得することができることが判明した（図７Ｂ）。

乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）にて４日間培養した後の心筋細胞塊を、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡにて分散し、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした培養皿に播き、免疫染色したものが図８である。免疫染色では、４％パラフォルムアルデヒドにて固定後、抗αアクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗トロポニンＩ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、抗Ｔｒａ１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。ここで、αアクチニンは心筋細胞特異的マーカー、トロポニンＩもまた心筋細胞特異的マーカー、そしてＴｒａ１−６０は多能性幹細胞特異的マーカーである。

その結果、ＤＡＰＩで核染色されたほとんどすべての細胞が、αアクチニン陽性、トロポニンＩ陽性であることがわかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。細胞が心筋細胞であるかどうかを確認するため、αアクチニンとトロポニンＩの重ね合わせ染色をしたところ、αアクチニンでの染色細胞とトロポニンＩでの染色細胞とが完全に一致した（図８Ｃ）。一方、残存未分化幹細胞を確認するために、Ｔｒａ１−６０陽性細胞を確認したところ、全ての細胞がＴｒａ１−６０陰性であった（図８Ｄ右上）。これにより、未分化幹細胞が完全に除去されていることを確認した。

実施例６：残存未分化幹細胞の検出
残存未分化幹細胞の検出方法のなかで、感度の高い方法としてＬｉｎ２８の遺伝子発現をＱ−ＰＣＲによって定量化する方法が報告されている（ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１２；７（５）：ｅ３７３４２）。乳酸を添加したグルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）と乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）においてヒト人工多能性幹細胞から分化・誘導された心筋細胞を各々４日間純化精製したものからｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。１８Ｓにてｎｏｒｍａｌｉｚｅした結果、乳酸を添加したグルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）ではＬｉｎ２８が発現していたのに対して乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）では全く発現していなかった（図９）。この結果からも乳酸を添加したグルコースを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ａｌｌ^＋，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）に比べて乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻，Ｇｌｎ⁻，Ｌａｃｔａｔｅ^＋）において未分化幹細胞除去能が優れていることが示された。

実施例７：グルコース及びグルタミンを含まない培地培養下での心筋細胞における乳酸フラクソーム（代謝流速）解析
本実施例においては、グルコース及びグルタミンを含まない培養条件下において、心筋細胞がどのように乳酸を代謝し、生存しているのか、についてのメカニズムをキャピラリー電気泳動および質量分析を使用して検討した。

ヒト胚性幹細胞および新生児ラット心筋細胞において、培養液を、４ｍＭの［^１３Ｃ］−標識乳酸（Ｉｓｏｔｅｃ）を添加した改変グルコース不含ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。１時間後に、これらの細胞を１０％マンニトール（Ｗａｋｏ）中で洗浄し、そして内部標準（カチオンについては２００μＭのＬ−メチオニンスルホン、そしてアニオンについては２００μＭのＭＥＳ）を含有するメタノール中に回収した。細胞および培養液を回収し、エアプレッシャーポンプを付属したＡｇｉｌｅｎｔキャピラリー電気泳動システム、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ質量選択検出器質量分析計、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズアイソクラチック高速液体クロマトグラフィーポンプ、Ｇ１６０３Ａ Ａｇｉｌｅｎｔキャピラリー電気泳動および質量分析計アダプターキット、およびＧ１６０７Ａ Ａｇｉｌｅｎｔキャピラリー電気泳動および質量分析計スプレイヤーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、キャピラリー電気泳動および質量分析を行なった。数値は、細胞数に対して補正した。心筋細胞において、ＴＣＡサイクル内代謝産物が有意に多く検出された（図１０Ａ，Ｂ）。その一方で、胚性幹細胞では、これらの代謝産物はごくわずかにしか見られなかった（図１０Ｂ）。このことから、胚性幹細胞を含めた非心筋細胞と比較して、心筋細胞において、外来性の乳酸が、ＴＣＡサイクルを介してより効率的に代謝されていることが示唆された。驚くべきことに、心筋細胞において［^１３Ｃ］が２−オキソグルタル酸およびグルタミン酸において有意に多く検出された（図１０Ｃ，Ｄ）。これらの結果は、乳酸がＴＣＡサイクルを利用したＡＴＰ産生において大きく寄与していることを示すだけではなく、培地中にグルタミンおよびグルタミン酸を含まない条件でも、乳酸が２−オキソグルタル酸およびグルタミン酸の生合成に寄与し、補っていることにより心筋細胞が生存可能であることが示唆された。

実施例８：ヒト人工多能性幹細胞を分化誘導してえた細胞群を、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない条件で培養する効果
ヒト人工多能性幹細胞を、実施例４と同様の方法によりヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を心筋細胞に分化誘導した。得られた細胞群（ｈｉＰＳＣ−ＣＭｓ）を純化精製するために、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）で５日間培養した。

乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）で培養を開始してから２日目及び、５日目の細胞群をＦＡＣＳで解析した。結果を図１１に示す。ＦＡＣＳ上、２日目の細胞群中のトロポニンＴ陽性細胞は９３．５％、５日目の細胞群中のトロポニンＴ陽性細胞は９８．７％であった。

このことから、心筋細胞のエネルギー源として乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）で培養した場合に、心筋細胞を精製できることがわかった。

実施例９：ピルビン酸を添加したグルタミンを含まない培養条件下における、未分化幹細胞及び心筋細胞の生存の可否
本実施例では、ピルビン酸を添加した、グルタミンを含まない培養条件下における、未分化幹細胞としてのヒト胚性幹細胞、及び、心筋細胞としてのラット新生仔心筋細胞の生存の可否について調べた。

グルコースを含まないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、ＤＭＥＭの基本組成のアミノ酸のすべてを含む培地（「Ｇｌｕｃ⁻、ＡＬＬ^＋」条件）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まない培地（「Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻」条件）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まず、α−ケトグルタル酸を４ｍＭ含む培地（「Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、ＤＭ−αＫＧ^＋」）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まず、ピルビン酸を２ｍＭ含む培地（「Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｐｙｒ^＋」）を作製した。ヒト胚性幹細胞をそれぞれの培地を使用して４８時間培養した。その後、ヒト胚性幹細胞が有するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を、ＳｔｅｍＴＡＧ^ＴＭアルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ ８６−Ｒ）で発色させ、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した（図１２）。その結果、α−ケトグルタル酸を含む培地では、ＡＬＰ陽性の未分化コロニーは多く認められたが、ピルビン酸を添加した培地ではＡＬＰ陽性の未分化コロニーは認められなかった。このことから、グルタミン酸を含まない条件では、ピルビン酸を添加しても短時間で死滅することがわかった。

次に、ラット新生仔心筋細胞を使用して、グルコースを含まないＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、ＤＭＥＭの基本組成のアミノ酸のすべてを含む培地（Ｇｌｕｃ⁻、ＡＬＬ^＋）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まず、ピルビン酸を２ｍＭ添加した培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｐｙｒ^＋）、ＤＭＥＭの基本組成のうちグルタミンを含まず、乳酸を４ｍＭ添加した培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）を作製した。ヒト胚性幹細胞をそれぞれの培地を使用して４８時間培養した後、生細胞・死細胞同時染色キット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）による染色を行い、撮像した（図１３）。緑が生細胞、赤が死細胞を示している。グルコース及びグルタミンを含まない条件では、乳酸及びピルビン酸を添加しない条件下で培養した心筋細胞と比較して、心筋細胞のエネルギー源としての乳酸又はピルビン酸を添加した条件下で培養した心筋細胞は、生存率が顕著に高かった。このことから、ピルビン酸の添加により、グルタミンを含まない条件（Ｇｌｎ⁻）による心筋細胞に対する細胞死誘導活性が低減されることが明らかになった。

実施例１０：残存未分化幹細胞の検出
ｌａｍｉｎｉｎ−５２１及びＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を組み合わせて用いる、他の残存未分化幹細胞の検出方法（Ｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１４）の検出感度を調べた。培養液をｍＴｅＳＲ１、足場材としてｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ社製）を使用した場合の未分化幹細胞検出感度を評価した。まず、ＨＥＫ２９３細胞の細胞群に、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を混入させた条件（０％）及び、０．１％、０．０１％又は０．００１％の割合で混入させた条件で撮像した（図１４Ａ）。０．００１％の割合でヒト人工多能性幹細胞を混入させた場合にもヒト人工多能性幹細胞が検出できたことから、この方法によって０．００１％の割合で混入する未分化幹細胞まで検出可能であることが確認できた。

そして、ヒト人工多能性幹細胞由来の分化細胞に残存する未分化幹細胞を評価した。まず、実施例４の方法により、ヒト人工多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導して撮像した（図１４Ｂ）。そして、同条件で分化誘導した細胞群を純化精製するために、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸を添加し、グルコースを含まずグルタミンを含む条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ^＋、Ｌａｃ^＋）又は、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ、Ｌａｃ^＋）で４日間培養した後、撮像した（図１４Ｂ）。純化精製前の細胞群、及び、４ｍＭの乳酸を添加した、グルコースを含まず４ｍＭのグルタミンを含む条件下（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ^＋、Ｌａｃ^＋）で純化精製した細胞群にはＴＲＡ１−６０陽性細胞が観察された。これに対し、乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない条件下（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）で純化精製した細胞群には、ＴＲＡ１−６０陽性細胞が観察されなかった。

このことから、乳酸を添加したグルコース及びグルタミンを含まない条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）では、残存未分化幹細胞は０．００１％未満であることがわかった。

実施例１１：増殖性の非心筋細胞に対する細胞死誘導活性
本実施例では、グルタミンを含まない培養条件による、増殖性の非心筋細胞に対する細胞死誘導活性について調べた。

ヒト胚性幹細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，ｂＦＧＦ不含）条件で２週間培養し、心筋細胞が含まれない、増殖性の非心筋細胞の細胞群を得た。この細胞群には、線維芽細胞や心筋細胞以外の分化細胞が含まれる。この細胞群を、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、グルコースを含まず、４ｍＭのグルタミンを含む条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ^＋）で４８時間培養した後観察したところ、生存細胞が認められた（図１５）。これに対し、増殖性非心筋細胞を、４ｍＭの乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない条件（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）で４８時間培養した後観察したところ、生存細胞は全く認められず、完全に死滅していた（図１５）。

このことから、乳酸を添加した、グルコース及びグルタミンを含まない条件では、増殖型の非心筋細胞を死滅させることができることがわかる。近年、細胞移植後の腫瘍形成の原因として未分化幹細胞だけでなく、未熟な増殖性細胞も関与していることが報告されている（Ｎｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１５）が、本手法により未分化幹細胞のみならず、増殖性細胞も短時間で死滅させることが可能である。

実施例１２：精製用培地に添加可能な化合物
本実施例では、精製用培地に、心筋細胞にとって栄養素となる化合物を添加した場合に、未分化幹細胞や非心筋の分化細胞は生存せず、心筋細胞がより長期間生存する条件を探索した。

ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組成をベースに、乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地（Ｇｌｕｃ⁻、Ｇｌｎ⁻、Ｌａｃ^＋）に、アスコルビン酸（２５ｍｇ／Ｌ）又はアルブミン（０．１％）を添加した培地をそれぞれ作製した。

次に、作製した培地でヒト人工多能性幹細胞を培養した。培養開始から２４時間後に観察すると、いずれの培地でもヒト人工多能性幹細胞は死滅していた（図１６）。

次に、ヒト人工多能性幹細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，ｂＦＧＦ不含）条件で２週間培養し、心筋細胞が含まれない、増殖性の非心筋細胞の細胞群を得た。得られた細胞群を作製した培地で培養した。培養開始から４８時間後には、細胞は死滅した（図１７）。

次に、実施例４と同様の方法によりヒト人工多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導した。得られた細胞塊をアスコルビン酸又はアルブミンを添加した培地で培養したところ、６００時間培養後も心筋細胞が生存していた（図１８）。

さらに培養を続けて７４４時間培養後に観察したところ、いずれの条件においても、依然として拍動する心筋細胞が多く認められた。次に、死細胞染色用蛍光色素ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）を用いて染色して観察した（図１９）。アスコルビン酸及びアルブミンを添加していない条件（添加（−））と比較すると、アスコルビン酸又はアルブミンを添加した条件のほうが、生細胞が多く認められた。 以上の結果から、アスコルビン酸又はアルブミンを添加した、心筋細胞のエネルギー源として乳酸を添加し、グルコース及びグルタミンを含まない培地を用いて、心筋細胞を精製することは可能であることがわかった。また、この培地を用いれば、心筋細胞をより長期間生存させることができることがわかった。

本発明の第一の態様により、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まない細胞培養液を調製することにより、未分化幹細胞に細胞死を生じさせるために使用される細胞培養液を提供することができる。この第一の態様の細胞培養液を使用して単純に細胞培養を行うことのみにより、簡便に未分化幹細胞に対して細胞死を誘導することができる。また、本発明の第二の態様により、乳酸、ピルビン酸、又は脂肪酸を添加するが、糖類（グルコース）を含まず、そしてアミノ酸組成のうちグルタミンを含まない細胞培養液を調製することにより、心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液を提供することができる。この第二の態様の細胞培養液を使用して単純に細胞培養を行うことのみにより、簡便にヒトの胚性幹細胞や人工多能性幹細胞を含む多能性を有する幹細胞などの未分化幹細胞や、心筋細胞以外の分化細胞、株化細胞に対して細胞死を誘導することができ、結果的に心筋細胞を選択的に選抜することができる。

Claims (24)

1. アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まないことを特徴とする、未分化幹細胞に細胞死を生じさせるために使用される細胞培養液。
2. アミノ酸組成のうち、セリンおよびグリシンを含まないことをさらなる特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液。
3. アミノ酸組成のうち、アルギニンを含まないことをさらなる特徴とする、請求項１または２に記載の細胞培養液。
4. 未分化幹細胞が、多能性を有する幹細胞または複数分化能を有する幹細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養液。
5. アミノ酸組成のうち、グルタミンを含まない細胞培養液中で培養することにより、未分化幹細胞に細胞死を誘導する方法。
6. 未分化幹細胞が、多能性を有する幹細胞または複数分化能を有する幹細胞である、請求項５に記載の方法。
7. 細胞培養液が、アミノ酸組成のうち、セリンおよびグリシンをさらに含まないものである、請求項５または６に記載の方法。
8. 細胞培養液が、アミノ酸組成のうち、アルギニンをさらに含まないものである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
9. 上記特定のアミノ酸を含まない条件下にて、細胞培養を１２時間〜３６０時間継続する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
10. 乳酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする、心筋細胞と非心筋細胞の混合物から心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液。
11. ピルビン酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする、心筋細胞と非心筋細胞の混合物から心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液。
12. 脂肪酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする、心筋細胞と非心筋細胞の混合物から心筋細胞を選択的に選抜するために使用される細胞培養液。
13. アミノ酸組成のうち、セリンおよびグリシンを含まないことをさらなる特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の細胞培養液。
14. アミノ酸組成のうち、アルギニンを含まないことをさらなる特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の細胞培養液。
15. 非心筋細胞が、未分化幹細胞、心筋細胞以外の分化細胞、および株化細胞を含む細胞である、請求項１０〜１４のいずれかに記載の細胞培養液。
16. アスコルビン酸又はアルブミンを添加した、請求項１０〜１５のいずれかに記載の細胞培養液。
17. 乳酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする細胞培養液中で、心筋細胞と非心筋細胞の混合物を培養することを含む、心筋細胞を選択的に選抜する方法。
18. ピルビン酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする細胞培養液中で、心筋細胞と非心筋細胞の混合物を培養することを含む、心筋細胞を選択的に選抜する方法。
19. 脂肪酸を添加し、糖類を含まず、アミノ酸組成のうちグルタミンを含まないことを特徴とする細胞培養液中で、心筋細胞と非心筋細胞の混合物を培養することを含む、心筋細胞を選択的に選抜する方法。
20. 非心筋細胞が、未分化幹細胞、非心筋の分化細胞、または株化細胞である、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 細胞培養液が、アミノ酸組成のうち、セリンおよびグリシンをさらに含まないものである、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 細胞培養液が、アミノ酸組成のうち、アルギニンをさらに含まないものである、請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 上記特定のアミノ酸を含まない条件下にて、細胞培養を１２時間〜３６０時間継続する、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
24. アスコルビン酸又はアルブミンを添加した、請求項１７〜２３のいずれかに記載の方法。