WO2013183571A1 - 人工多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する方法 - Google Patents

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祐樹 近藤
岳洋 岩尾
民秀 松永
幸美 吉橋
直樹 宮田
孝禎 鈴木
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公立大学法人名古屋市立大学
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem (iPS) into hepatocytes and use thereof.
  • iPS induced pluripotent stem
  • JP 2010-75631 A Special table 2011-529329 gazette
  • the main methods for inducing differentiation of iPS cells into hepatocytes use humoral factors such as growth factors (see, for example, Non-Patent Documents 2, 4, 8, and 9), but are insufficient in terms of differentiation efficiency. Moreover, it is a problem that it is very expensive. Therefore, it is desired to use a low-molecular compound that is inexpensive and easy to handle as a differentiation-inducing factor. In order to meet such a demand, the present invention aims to provide a novel method and its use for efficiently inducing differentiation of iPS cells into hepatocytes.
  • the present inventors focused on inexpensive valproic acid with little difference between lots and decided to examine its possibility as a differentiation inducing factor. Specifically, the influence on differentiation into hepatocytes was examined. As a result of detailed investigations, it was found that valproic acid is extremely effective in enhancing differentiation efficiency and acquiring functions in inducing differentiation of iPS cells into hepatocytes. In addition, important and interesting findings were obtained regarding the time of use (period of addition to the medium).
  • Valproic acid is a typical drug used for epilepsy, and its main action, ⁇ -aminobutyric acid (GABA) transaminase inhibitory action, exerts anticonvulsant action by increasing the amount of GABA at inhibitory synapses.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • HDAC histone deacetylase
  • Patent Document 2 there is a report that valproic acid increases the establishment efficiency of iPS cells.
  • Patent Document 2 the effect of valproic acid on iPS cell differentiation was unclear.
  • the facts clarified by the present inventors can promote the application and practical application of iPS cells, and the significance thereof is great.
  • a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells into hepatocytes comprising the following steps (1) and (2): (1) a step of differentiating induced pluripotent stem cells into endoderm-like cells; (2) A step of differentiating endoderm-like cells obtained in step (1) into hepatocyte-like cells, wherein at least one is present in the presence of a histone deacetylase inhibitor and / or under oxidative stress loading conditions. The step of culturing the part.
  • the histone deacetylase inhibitor is a histone deacetylase 1 inhibitor.
  • step (2) comprises the following steps (2-1) and (2-2): (2-1) differentiating the endoderm-like cells obtained in step (1) into hepatoblast-like cells; (2-2) A step of differentiating the hepatoblast-like cell obtained in step (2-1) into a hepatocyte-like cell in the presence of a histone deacetylase inhibitor and / or oxidative stress load Performing at least a portion of the culture under conditions.
  • [7] Culturing in the presence of a histone deacetylase inhibitor and / or under oxidative stress load conditions is started by 168 hours after the start of step (2-2) and is continued for 24 hours to 312 hours The method according to [6].
  • Activin A is used as a differentiation-inducing factor in step (1)
  • DMSO is used as a differentiation-inducing factor in step (2-1)
  • hepatocyte growth factor as a differentiation-inducing factor in step (2-2)
  • the method according to one item. [10] The start of the culture period with the selective medium is between the 8th and 10th days from the start of step (1), [9] The method according to [9], wherein the end of the culture period using the selective medium is between the 15th and 20th days from the start of step (1). [11] The method according to [9], wherein the culture period using the selective medium is from day 9 to day 16 counted from the start of step (1).
  • a selective medium containing galactose as a sugar source, phenylalanine as a tyrosine source, and ornithine as an arginine source is used.
  • the addition concentration of FBS is 1% (v / v) to 10% (v / v).
  • a method for evaluating the metabolism of a test substance comprising the following steps (i) and (ii): (I) contacting the test substance with the hepatocyte-like cell according to [17]; (Ii) A step of measuring the metabolism of the test substance.
  • a method for evaluating the toxicity of a test substance comprising the following steps (i) and (ii): (I) contacting the test substance with the hepatocyte-like cell according to [17]; (Ii) A step of examining the state of the hepatocyte-like cells after step (i).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HGF hepatocyte growth factor
  • OSM oncostatin M
  • DEX dexamethasone Expression of each marker gene in hepatocyte-like cells.
  • CYP1A cytochrome P450-1A
  • CYP3A cytochrome P450-3A
  • CYP2B cytochrome P450-2D
  • CYP2D cytochrome P450-2D
  • UGT uridine diphosphate-glucuronyltransferase
  • SULT sulfate transferase
  • AAP acetaminophen
  • OHMZ 1'-hydroxymidazolam
  • OHBP hydroxybupropion
  • OHBF 1'-hydroxybufuralol
  • 7HC-Glu 7-hydroxycoumaring glucuronide
  • 7HC-Sul 7-hydroxycoumarin sulfate Effect of valproic acid on hepatocyte differentiation.
  • ALB albumin
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • TAT tyrosine-aminotransferase
  • PXR pregnane X receptor
  • CAR constitutive androstane receptor
  • FOXA2 forkhead transcription factor A2
  • UGT1A1 uridine diphosphate— Glucuronyltransferase 1A1 Effect of valproic acid on hepatocyte differentiation.
  • the expression level of the marker gene was compared and evaluated when differentiation was induced without using valproic acid (control) and when differentiation was induced using valproic acid (valproic acid).
  • the amount of marker gene in total RNA (adult and fetus) derived from human liver tissue is also shown.
  • CYP3A4, cytochrome P450-3A4; CYP3A5, cytochrome P450-3A5; CYP3A7, cytochrome P450-3A7; CYP2C19, cytochrome P450-2C19 The effect on the differentiation of hepatocytes by the difference in the addition time of valproic acid. The change in the expression level of the marker gene when the addition time of valproic acid was changed was examined. A case where differentiation was induced without using valproic acid was used as a control.
  • RNA derived from human liver tissue adult and fetus
  • RNA extracted from frozen human hepatocytes extracted immediately after thawing and 48 hours after thawing
  • ALB albumin
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • TAT tyrosine-aminotransferase
  • PXR pregnane X receptor Responsiveness to inducers due to differences in the timing of valproic acid addition.
  • the change in responsiveness to the inducing agent when the addition time of valproic acid was changed was examined.
  • L-15 special order medium E is a composition of commercially available L-15 medium, except for L-arginine, L-tyrosine, D-(+)-galactose, sodium pyruvate, L-ornithine, L-proline, glycerol, Insulin and dexamethasone are added.
  • Modified L15 medium is L-15 custom medium E supplemented with D-(+)-galactose, FBS, aprotinin, mercaptoethanol, sodium bicarbonate.
  • L15 control medium is L-15 custom medium E supplemented with L-arginine, L-tyrosine, D-(+)-glucose, FBS, aprotinin, mercaptoethanol, sodium bicarbonate.
  • the center and bottom six are human iPS cells differentiated with valproic acid.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS cells) into a hepatocyte lineage (hereinafter also referred to as “differentiation induction method of the present invention”).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • hepatocyte lineage hereinafter also referred to as “differentiation induction method of the present invention.
  • iPS cells are cells having pluripotency (pluripotency) and proliferative ability produced by reprogramming somatic cells by introduction of reprogramming factors. Artificial pluripotent stem cells exhibit properties similar to ES cells. Somatic cells used for the production of iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. Although the origin thereof is not particularly limited, preferably, somatic cells of mammals (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), particularly preferably human somatic cells are used. iPS cells can be prepared by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that an iPS cell production method developed in the future will be applied.
  • mammals eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats
  • iPS cell production The most basic method of iPS cell production is to introduce four factors, transcription factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, into cells using viruses (Takahashi K, Yamanaka S : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007).
  • Human iPS cells have been reported to be established by introducing four factors, Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007).
  • Three factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • lentiviruses (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), adenoviruses (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903 ), 945-949, 2008), plasmid (Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008), transposon vectors (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766- 770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), or Techniques using episomal vectors (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009) have been developed.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1, and Cript Etc. can be selected as an index.
  • the selected cells are collected as iPS cells.
  • IPS cells can also be provided from, for example, Kyoto University or RIKEN BioResource Center.
  • inducing differentiation means acting to differentiate along a specific cell lineage.
  • iPS cells are induced to differentiate into hepatocytes.
  • the differentiation induction method of the present invention is roughly divided into two stages of induction processes, ie, a process of differentiating iPS cells into endoderm-like cells (step (1)), and the resulting endoderm-like cells into hepatocyte-like cells. And a step of differentiating (step (2)).
  • iPS cells are cultured and differentiated into endoderm-like cells.
  • iPS cells are cultured under conditions that induce differentiation into endoderm-like cells.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as iPS cells differentiate into endoderm-like cells.
  • the cells are cultured in a medium supplemented with activin A according to a conventional method.
  • the concentration of activin A in the medium is, for example, 10 ng / ml to 200 ng / ml, preferably 20 ng / ml to 150 ng / ml.
  • serum or serum replacement Knockout serum replacement (KSR), etc.
  • Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum, and the like can also be used.
  • the amount of serum or serum replacement added is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • An inhibitor of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway eg, hexachlorophene, quercetin, Wnt3a, which is a Wnt ligand
  • Wnt3a which is a Wnt ligand
  • two-stage culture is performed as step (1).
  • the first stage culture is performed in a medium supplemented with serum, and KSR is used instead of serum in the subsequent second stage culture.
  • Adopting the two-stage culture in this way suppresses the growth of undifferentiated cells by the first-stage culture, proliferates the differentiated cells by the second-stage culture, and uses KSR to influence the difference between lots. It is preferable in terms of reducing
  • the period of step (1) (culture period) is, for example, 3 days to 10 days, preferably 4 days to 7 days.
  • the first stage culture period is, for example, 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days
  • the second stage culture period is, for example, 1 to 6 days. Days, preferably 2 to 4 days.
  • Step (2) Differentiation into hepatocyte-like cells>
  • HDAC histone deacetylase
  • step (2) Differentiation into hepatocyte-like cells
  • the cell population obtained through the step (1) or a part thereof is subjected to the step (2) without sorting.
  • step (2) may be carried out.
  • the endoderm-like cells may be selected with a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • HDAC histone deacetylase
  • a medium to which an HDAC inhibitor is added may be used.
  • HDAC inhibitors include valproic acid, trichostatin A, sodium butyrate, Vorinostat, NCC-149, NCH-47, NCH-51, MS-275, FK228, Apicidin, MGCD-0103 (T. Suzuki) et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 4809-4812).
  • a compound exhibiting inhibitory activity against HDAC1 which is one of the HDAC family, is used.
  • the compound examples are valproic acid, trichostatin A, sodium butyrate, NCH-47, NCH-51, and MS-275.
  • the addition concentration of the HDAC inhibitor may be determined by preliminary experiments or the like.
  • An example of the addition concentration (in the case of valproic acid) is 0.1 mM to 4 mM.
  • Oxidative stress loading conditions refers to conditions under which external oxidative stress is applied to cells.
  • An oxidative stress load state can be formed by adding hydrogen peroxide, a catalase inhibitor or a free radical generator to the medium.
  • catalase inhibitors sodium azide (NaN 3 ), hydrogen sulfide (H 2 S), hydrogen cyanide (HCN), hydroxyamine (NH 2 OH), 3-amino-1,2,4-triazole, free
  • radical generators are doxorubicin, adriamycin, mitomycin, pleomycin, neocartinostatin.
  • a preferable oxidative stress load condition (for example, an optimum concentration of hydrogen peroxide, a catalase inhibitor or the like) may be determined through preliminary experiments. In the preliminary experiment, it may be considered that excessive oxidative stress causes a decrease in cell viability, proliferation rate, activity, and the like.
  • the presence of the HDAC inhibitor and the oxidative stress loading condition are not mutually exclusive conditions. Therefore, culture conditions that satisfy both conditions may be employed. For example, when a compound having both an HDAC inhibitory action and an oxidative stress producing action such as valproic acid is used, both conditions are satisfied.
  • the culture conditions other than the above-described conditions characteristic of the differentiation induction method of the present invention may be those suitable for induction of differentiation into the hepatocyte lineage.
  • DMSO, HGF, FGF, BMP4, oncostatin M, dexamethasone, and the like are used to induce differentiation into the hepatocyte lineage.
  • the period of step (2) (culture period) is, for example, 7 to 40 days, preferably 10 to 30 days. Culturing in the presence of an HDAC inhibitor and / or under oxidative stress loading conditions is at least part of step (2), and the period is, for example, 1 day to 20 days, preferably 2 days to 7 days. If the culture period is too short, the expected effects (increased differentiation efficiency, promotion of acquisition of functions as hepatocytes) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is lowered.
  • hepatocyte marker expression can be determined or evaluated using indicators of hepatocyte marker expression, drug metabolic activity, and the like as indicators.
  • hepatocyte markers are albumin (ALB), ⁇ -fetoprotein (AFP), tyrosine-aminotransferase (TAT), and pregnane X receptor (PXR).
  • the cell surface markers that are characteristic of the target cells are used as indicators.
  • the cell population after culturing may be selected and sorted.
  • Drug metabolism activity can be evaluated by detection of drug metabolizing enzyme expression or drug metabolism assay.
  • drug-metabolizing enzymes are cytochrome P450-3A4 (CYP3A4), cytochrome P450-3A7 (CYP3A7), cytochrome P450-1A (CYP1A), cytochrome P450-3A (CYP3A), cytochrome P450-2B (CYP2B), cytochrome P450-2D, uridine Phosphate-glucuronyltransferase (UGT) and sulfate transferase (SULT).
  • CYP3A4 cytochrome P450-3A4
  • CYP3A7 cytochrome P450-7
  • cytochrome P450-1A CYP1A
  • cytochrome P450-3A cytochrome P450-3A
  • CYP2B cytochrome P450-2D
  • UTT uridine Phosphate-glucuronyltransferase
  • the step (2) is a two-stage culture, that is, the step (2-1) in which the endoderm-like cells obtained in the step (1) are differentiated into hepatoblast-like cells, and the step (2- The step (2-2) of differentiating the hepatoblast-like cells obtained in 1) into hepatocyte-like cells is performed.
  • a medium supplemented with dimethyl sulfoxide (DMSO) is used.
  • the amount of DMSO added is, for example, 0.01% to 5%, preferably 0.5% to 3%.
  • a medium supplemented with hepatocyte growth factor (HGF), oncostatin M and dexamethasone (DEX) is used.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • DEX dexamethasone
  • the amount of HGF added is, for example, 1 ng / mL to 20 ng / mL, preferably 2 ng / mL to 15 ng / mL
  • the amount of oncostatin M added is, for example, 2 ng / mL to 40 ng / mL, preferably 4 ng / mL to 30 ng / mL.
  • DEX added is, for example, 10 ⁇ 4 M to 10 ⁇ 9 M, preferably 10 ⁇ 5 M to 10 ⁇ 8 M.
  • the culture period of step (2-1) is, for example, 2 days to 14 days, preferably 3 days to 10 days.
  • the culture period of (2-2) is, for example, 3 days to 21 days, preferably 5 days to 15 days.
  • the culture in the presence of an HDAC inhibitor and / or under oxidative stress load is started, for example, by 168 hours (7 days) after the start of step (2-2), and then 24 hours (1 day). Continue for ⁇ 312 hours (13 days). Preferably, it starts by 168 hours (7 days) after the start of step (2-2) and continues for 48 hours (2 days) to 168 hours (7 days).
  • two-stage culture may be performed.
  • the first stage culture is performed under the above conditions (for example, using a medium supplemented with HGF, Oncostatin M and DEX), and the second stage culture includes, for example, HGF, Oncostatin M and DEX. Do not in serum-free medium. Adopting such a two-stage culture allows the cells to mature in the first stage culture and avoids the effects of cytokines on gene expression such as drug metabolizing enzymes in the second stage culture. preferable.
  • the period of the first stage culture is, for example, 3 days to 21 days, preferably 5 days to 14 days
  • the period of the second stage culture is, for example, 1 day to 7 days, preferably 2 days to 4 days. It is.
  • step (steps (1), (2), (2-1), (2-2)) constituting the present invention subculture may be performed midway.
  • the cells may be seeded at a cell density of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • ROCK inhibitor Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase
  • IMDM Iskov modified Dulbecco medium
  • HamF12 Ham F12 medium
  • D-MEM Dulbecco modified Eagle medium
  • Gibco, etc. Glasgow basic medium
  • a basic medium for culturing hepatocytes (Takara Bio Inc., Gibco Inc., etc.).
  • Two or more basic media may be used in combination.
  • components that can be added to the medium include bovine serum albumin (BSA), antibiotics, 2-mercaptoethanol, PVA, non-essential amino acids (NEAA), insulin, transferrin, and selenium.
  • BSA bovine serum albumin
  • NEAA non-essential amino acids
  • insulin transferrin
  • selenium selenium
  • cells are cultured two-dimensionally using a culture dish or the like, but three-dimensional culture using a gel-like culture substrate or a three-dimensional culture plate may be performed.
  • the culture period excluding the initial stage and the final stage of step (2) contains galactose as a sugar source (in other words, does not contain glucose) and contains phenylalanine as a tyrosine source (in other words,
  • the cells are cultured using a selection medium that does not contain tyrosine (for convenience of explanation, sometimes referred to as “selection medium 1” in order to distinguish from the selection medium 2 described later).
  • the culture using the selective medium typically starts from the 8th day (8th culture day) to the 10th day (10th culture day) counting from the start of the step (1).
  • the measurement is completed on the 15th day (15th day of culture) to 20th day (20th day of culture) from the start of the above.
  • the culture period using the selective medium is from the 9th day to the 16th day of the culture.
  • galactose is contained as a sugar source
  • phenylalanine is contained as a tyrosine source
  • ornithine is contained as an arginine source (in other words, arginine is not contained).
  • the selective medium 1 is switched to the selective medium 2 at a specific time, it is possible to further improve the purity of the finally obtained hepatocyte-like cells.
  • a specific example of the selective medium 1 is L-15 custom-made medium E to which galactose and arginine are added (see Examples described later).
  • a specific example of the selective medium 2 is a modified L15 medium (L15 custom medium E supplemented with galactose).
  • FBS fetal bovine serum
  • KSR knockout serum substitute
  • the concentration of galactose in the selective medium is, for example, 450 mg / L to 900 mg / L.
  • the FBS concentration is set low (specifically, for example, 1% (v / v)), in order to maintain or increase the survival rate / proliferation rate of cells differentiated into the hepatocyte lineage, the galactose concentration is relatively high. It is preferable to set (for example, 600 mg / L to 900 mg / L).
  • step (2) a part of step (2-1) is a medium supplemented with DMSO (selection medium is not used). And the remaining portion will be carried out in a selective medium supplemented with DMSO. Further, a part of the step (2-2) is carried out in a selective medium supplemented with HGF, Oncostatin M and DEX, and the subsequent part is a medium supplemented with HGF, Oncostatin M and DEX (selective medium is not used). Will be implemented.
  • the culture on the 9th day from the start of the step (1) is performed in the selective medium 1 added with DMSO, and the culture on the 10th to 12th days from the start of the step (1) is performed. Is performed in the selective medium 2 supplemented with DMSO, and the culturing on the 13th to 16th days from the start of the step (1) is performed in the selective medium 2 supplemented with HGF, oncostatin M and DEX.
  • the second aspect of the present invention relates to the use of hepatocyte-like cells prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • a cell preparation containing hepatocyte-like cells is provided.
  • the cell preparation of the present invention can be applied to the treatment of various liver diseases. In particular, utilization as a material for regeneration / reconstruction of impaired liver tissue (including dysfunction) is assumed. That is, contribution to regenerative medicine can be expected.
  • the cell preparation of the present invention can be prepared, for example, by suspending hepatocyte-like cells obtained by the method of the present invention in physiological saline, a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution) or the like.
  • 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 cells may be contained as a single dose so that a therapeutically effective amount of cells can be administered.
  • the content of the cells can be appropriately adjusted in consideration of the purpose of use, the target disease, the sex of the application target (recipient), age, weight, the state of the affected area, the state of the cells, and the like.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • serum albumin for the purpose of cell protection, antibiotics for the purpose of blocking bacterial contamination, and various components (vitamins for the purpose of cell activation, proliferation or differentiation induction, etc. , Cytokines, growth factors, steroids, etc.) may be included in the cell preparation of the present invention.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc. You may make it contain in the cell formulation of this invention.
  • hepatocyte-like cells prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • the metabolism of the test substance can be tested using hepatocyte-like cells. That is, the present invention provides a method for evaluating the metabolism of a test substance as one of uses of hepatocyte-like cells. In this method, (i) a step of contacting a test substance with hepatocyte-like cells obtained by the differentiation induction method of the present invention, and (ii) a step of measuring the metabolism of the test substance.
  • the “contact” in step (i) is typically performed by adding a test substance to the medium.
  • the timing of addition of the test compound is not particularly limited.
  • the test substance after culturing is started in a medium not containing the test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or may be started in a medium containing the test substance in advance.
  • the test substance is a protein, peptide, or the like
  • a “contact” state can be formed by introducing DNA encoding the test substance into hepatocyte-like cells using an expression vector or the like.
  • organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.)
  • Existing components or candidate components such as pharmaceuticals and nutritional foods are also preferable test substances.
  • test substance may be used as a test substance, and by adding two or more kinds of test substances at the same time, the interaction between the test substances, synergism, etc. may be investigated.
  • the test substance may be derived from a natural product or may be synthetic, in the latter case using, for example, a combinatorial synthesis technique. It is possible to construct a rate assay systems.
  • the period for contacting the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the contact may be performed in a plurality of times.
  • step (ii) the metabolism of the test substance is measured (step (ii)).
  • step (i) that is, after contact with the test substance, metabolism can be measured without a substantial time interval, or after a certain time (for example, 10 minutes to 5 hours) has elapsed.
  • Metabolism may be measured. Metabolism can be measured, for example, by detecting a metabolite. In this case, the expected metabolite is usually measured qualitatively or quantitatively using the culture solution after step (i) as a sample.
  • An appropriate measurement method may be selected according to the metabolite. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological method (eg, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) ) Etc. can be adopted.
  • FFA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • the metabolic amount of the test substance can be evaluated according to the amount of the metabolite.
  • a drug metabolizing enzyme eg, cytochrome, UGT
  • the expression of drug metabolizing enzymes can be assessed at the mRNA level or protein level. For example, when an increase in the mRNA level of the drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that “the test substance has been metabolized”. Similarly, when an increase in the activity of the drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that “the test substance has been metabolized”. Similarly to the case of determining a metabolite as an index, quantitative determination may be performed based on the expression level of a drug metabolizing enzyme.
  • the toxicity of the test substance can also be tested using hepatocyte-like cells prepared by the differentiation induction method of the present invention. That is, the present invention also provides a method for evaluating the toxicity of a test substance as one application of hepatocyte-like cells.
  • a step of contacting a test substance with a hepatocyte-like cell obtained by the differentiation induction method of the present invention and (ii) a step of examining the state of the hepatocyte-like cell after step (i) Do.
  • Step (i) is the same as the above-described assay (method for evaluating metabolism), and thus the description thereof is omitted.
  • step (ii) the state of the hepatocyte-like cells after contact with the test substance is examined, and the toxicity of the test substance is evaluated.
  • the state of hepatocyte-like cells can be grasped by measuring the survival rate, observing the cell morphology, measuring liver injury markers (GOT, GPT, etc.) in the culture medium, and the like. For example, when a decrease in the survival rate is recognized by contact with the test substance, it can be determined that “the test substance has liver toxicity”. Similarly, when abnormal cell morphology is observed due to contact with the test substance or when the amount of liver damage marker in the culture medium is increased, it can be determined that the test substance has hepatotoxicity. it can.
  • a quantitative determination may be made according to the degree of decrease in the survival rate or the amount of the liver injury marker.
  • it is determined whether the toxicity level of the test substance corresponds to a preset evaluation level (for example, toxicity levels 1 to 5).
  • Valproic acid is a typical drug used for epilepsy and exhibits ⁇ -aminobutyric acid (GABA) transaminase inhibitory action. It is known that valproic acid also has an HDAC inhibitory action and an oxidative stress producing action.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • Method (1) Cells Human iPS cells (iPS-51: Windy) are expressed in human fetal lung fibroblasts MRC-5, octamer binding protein 3/4 (OCT3 / 4), sex determining region Y-box 2 (SOX2), After introducing kruppel-like factor 4 (KLF4), v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) (c-MYC) using a pantropic retrovirus vector, human ES cell-like colonies are cloned, Granted by Dr. Akihiro Umezawa, National Center for Child Health and Development. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were used as feeder cells.
  • KLF4 kruppel-like factor 4
  • c-MYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
  • Human iPS cells were seeded on MEF (6 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish) treated with mitomycin C, and in a CO 2 incubator under 5% CO 2 /95% air conditions. Incubated at 0 ° C. Human iPS cells were subcultured at a split ratio of 1: 2 to 1: 3 after 3-5 days of culture. The medium was changed 48 hours after thawing of human iPS cells, and thereafter the medium was changed every day.
  • Y-27632 Rho-binding kinase inhibitor
  • Y-27632 Rho-binding kinase inhibitor
  • the cells were seeded in a 24-well plate or 96-well plate for cell culture coated with Matrigel (previously diluted 30-fold with a human iPS cell medium) from which growth factors had been removed.
  • RIF ⁇ mol / L rifampicin
  • 2 mmol / L valproic acid is added during differentiation (treatment from differentiation day 19 for 72 hours, differentiation day 13 for 168 hours, or differentiation day 13 for 312 hours), and the effect on differentiation into hepatocytes was examined.
  • RNA extraction Total ribonucleic acid (RNA) extraction
  • RNA was extracted according to the attached manual of RNeasy (registered trademark) Mini Kit (Qiagen) after completion of induction of differentiation of human iPS cells.
  • Real-Time RT-PCR Real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • SYBR registered trademark
  • Premix Ex Taq II Perfect Real Time
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • a reaction stop solution acetonitrile containing a quantitative internal standard substance
  • a reaction stop solution acetonitrile containing a quantitative internal standard substance
  • UPLC / MS / MS ultrahigh performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer
  • the measurement conditions were as follows. That is, a reverse phase column Acquity UPLC BEH C18 column (2.1 ⁇ 50 mm) was used, the mobile phase was water containing 0.025% formic acid and methanol containing 0.025% formic acid, and the flow rate was 0.8 mL / min.
  • the electrospray ionization method was used for the measurement of MS, the capillary voltage was set to 0.5 kV, and the ion source temperature was set to 150 ° C.
  • pregnane X receptor PXR
  • constitutive androstane receptor CAR
  • hepatocyte-like cells showed mRNA expression of nuclear receptors involved in the expression regulation of hepatocyte markers, drug metabolizing enzymes, and CYP3A4. Furthermore, since drug metabolism activity was detected by various CYPs, which are important phase I enzymes in drug metabolism, and UGT and SULT, which are second phase enzymes, human iPS cells are functional hepatocyte-like. It became clear that the cells were differentiated. In addition, the addition of valproic acid increased the mRNA expression level of the hepatocyte marker.
  • valproic acid is useful for enhancing the efficiency of differentiation or acquiring functions in the induction of differentiation from human iPS cells to hepatocytes.
  • the expression of hepatocyte markers increased when added for 72 hours from differentiation day 19 or 168 hours after differentiation day 13.
  • the expression of hepatocyte markers decreased. From this, it was considered that the treatment for a certain period of time at the stage of differentiation and maturation was better than the long-term exposure, that is, the addition period was important.
  • CYP3A CYP3A mRNA expression was induced by treatment with RIF, so cells after differentiation induction treatment (human iPS cell-derived hepatocytes) (Like cells) revealed that the responsiveness to RIF is similar to that of hepatocytes.
  • valproic acid has an HDAC inhibitory action and an oxidative stress producing action. It has been reported that HDAC1 inhibitor promotes cell growth suppression and differentiation induction by cell cycle arrest in human liver cancer cell line HepG2 (Yamashita Y, et al: Int J Cancer. 103 (5), 572-576, 2003) ). Considering the experimental results in consideration of this report, it is highly possible that differentiation into hepatocytes was promoted by the HDAC inhibitory effect of valproic acid. In addition, since oxidative stress causes cellular senescence, the oxidative stress producing action of valproic acid is thought to promote differentiation and maturation.
  • ⁇ Selective culture method of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes using modified L-15 medium Cells have various metabolic pathways and have the ability to synthesize necessary nutrients themselves. Among them, it has been clarified that there are hepatocyte-specific pathways among pathways related to sugar metabolism, amino acid metabolism and urea cycle. Since hepatocytes have the ability to synthesize glucose, tyrosine and arginine, if galactose, phenylalanine and ornithine are present in the medium, it is possible to synthesize and use the necessary nutrients from these.
  • Method (1) Cells Human iPS cells (iPS-51: Windy) are expressed in human fetal lung fibroblasts MRC-5, octamer binding protein 3/4 (OCT3 / 4), sex determining region Y-box 2 (SOX2), After introducing kruppel-like factor 4 (KLF4), v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) (c-MYC) using a pantropic retrovirus vector, human ES cell-like colonies are cloned, Granted by Dr. Akihiro Umezawa, National Center for Child Health and Development. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were used as feeder cells.
  • KLF4 kruppel-like factor 4
  • c-MYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
  • Human fetal hepatocytes (HFL) used in this study are primary hepatocytes mixed with 6 fetal livers of about 13 weeks of gestation, and obtained by the US Applied Cell Biology Research Institute for research based on informed consent. We obtained through Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. that the growth up to the fifth passage was confirmed by the company.
  • Human lung fibroblasts (HFLung) are Japanese 11-week-old fetal lung-derived normal fibroblasts HFL-III: RCB0523, which were obtained from the RIKEN BioResource Center Cell Bank.
  • FBS fetal bovine serum
  • L-Glu 2 mmol / L L-glutamine
  • NEAA non-essential amino acid
  • 100 units / mL penicillin G 100 ⁇ g / mL Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing streptomycin was used.
  • EDTA trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid
  • Cell Banker 1 was used as the MEF stock solution.
  • DMEM Ham's F-12 containing fibroblast growth factor (bFGF) was used.
  • Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) containing 1 mg / mL collagenase IV, 0.25% trypsin, 20% KSR, 1 mmol / L calcium chloride was used as the human iPS cell detachment solution.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • KSR 1 mmol / L calcium chloride
  • Human iPS cells were seeded on MEF (6 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish) treated with mitomycin C and cultured in a CO 2 incubator under 5% CO 2 /95% air conditions. Incubated at 0 ° C. Human iPS cells were subcultured at a split ratio of 1: 2 to 1: 3 after 3-5 days of culture. For human iPS cells, the medium was changed 48 hours after thawing and thereafter daily.
  • Y-27632 Rho binding kinase inhibitor
  • KO-DMEM knockout DMEM
  • FBS concentration and galactose concentration were divided into 8 groups, and the optimum conditions for differentiation into hepatocytes were examined (FIG. 10).
  • RNA was extracted, and the mRNA expression level of a gene specifically expressed in hepatocytes was analyzed by a real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR) method. Purity was also evaluated by observing the proportion of albumin (ALB) positive cells, which are liver cell markers, by immunofluorescence staining.
  • ALB albumin
  • RNA total ribonucleic acid
  • cDNA Reverse transcription reaction Complementary DNA
  • Real-Time RT-PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time), using cDNA as a template, and the reaction was performed according to the attached manual. The results were corrected using glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as an endogenous control.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • ALB fluorescence immunostaining Cells used for immunostaining were cultured on a cover glass. After culturing, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, and subjected to membrane permeation treatment at -20 ° C for 5 minutes with methanol precooled to -20 ° C for 1 hour or more before use. % Blocking was performed using skim milk at room temperature for 20 minutes. After that, the primary antibody is a mouse anti-human ALB antibody (abcam; 1: 200) overnight at 4 ° C, and the secondary antibody is an Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG antibody (Invitrogen; 1: 500). The reaction was allowed to proceed at room temperature for 60 minutes. Nuclear staining was performed by treating 0.2 ⁇ g / mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 5 minutes at room temperature in the dark.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • Hepatocyte-specific enzyme expression As described above, a specific enzyme for metabolizing and synthesizing nutrients is expressed in hepatocytes (FIG. 11). First, in order to set the selection period using the modified L-15 medium, whether these enzymes are expressed in hepatocytes differentiated from human iPS cells, and how their expression levels change over time investigated. Cells were collected on the 5th to 12th and 25th days after the start of differentiation, and the expression levels of each enzyme were analyzed by the Real-Time RT-PCR method. As a result, galactose was converted to galactose monophosphate and converted into glucose.
  • the expression level of the enzyme is increasing toward the 10th day of differentiation, it is considered that galactose is added to the medium as a sugar source instead of glucose, and the period before the 10th day of differentiation is suitable when no tyrosine is added. It was.
  • argininosuccinate synthase 1 ASS1
  • argininosuccinate lyase ASL
  • OTC ornithine transcarbamylase
  • modified L-15 medium During the differentiation process from human iPS cells to hepatocytes, changes in the expression level of enzymes involved in the synthesis pathway of nutrients that exist specifically in hepatocytes are evident over time. Therefore, the cultivation of modified L-15 medium and the timing of addition of nutrients were examined next.
  • the modified L-15 medium culture period and nutrient addition period were divided into 6 groups, and the serum added to the medium was further divided into FBS group and KSR group to differentiate into hepatocytes.
  • FBS group and KSR group FBS group and KSR group
  • modified L-15 medium Hepatocytes have the ability to release glucose out of the cells. Therefore, by culturing using the modified L-15 medium, glucose synthesized from galactose is released into the medium, and there is a possibility that differentiated cells other than hepatocytes can be used.
  • the FBS used in this laboratory contained about 100 mg / 100 mL of glucose. Therefore, in order to make the purity of human iPS cell-derived hepatocytes higher, modified L-15 medium was used at time S2, and combinations of FBS and galactose concentrations were examined.
  • the F group FBS 2%, galactose 450 mg / L
  • the G group compared to the group with the highest expression level in the previous experiment (S2 group for the addition time study, A group in this experiment)
  • the CYP3A4 increased mRNA expression level by about 3 times (FIG. 14).
  • the H group FBS 1%, galactose 450 mg / L
  • a decrease in the CYP3A4 mRNA expression level was observed.
  • the F group or G group showed no significant change in the hepatic HFL, but the fibroblast HFLung showed a decrease in the number of cells when observed under the microscope. (FIG. 16).
  • This result also suggested that human iPS cell-derived hepatocytes can be obtained with high purity by adding FBS and galactose to the modified L-15 medium in an appropriate concentration combination and culturing.
  • Valproic acid has various actions and activities ( ⁇ -aminobutyric acid aminotransferase inhibitory action, sodium channel inhibitory action, calcium channel inhibitory action, etc.) in addition to the HDAC inhibitory action.
  • Various compounds ⁇ -aminobutyric acid aminotransferase inhibitor, sodium channel inhibitor, calcium channel inhibitor, sodium channel / calcium channel inhibitor, considering the possibility that actions other than HDAC inhibitory action promoted differentiation into hepatocytes. The effect when using the agent was examined (see FIG. 17). As shown in FIG.
  • ⁇ Differentiation induction of various human iPS cell lines The effectiveness of this differentiation induction method was verified using various human iPS cell lines.
  • the culture method and culture conditions were the same as when iPS-51: Windy strain (# 51) was used.
  • the iPS cells used for the study are as follows. # 11 and # 16 were provided by the National Center for Child Health and Development. # 11 (JCRB1327 (cell number), Dotcom (cell name)) # 16 (NIHS0604 (cell number), Fetch (cell name))
  • hepatocyte-like cells can be easily and efficiently prepared from iPS cells.
  • Hepatocyte-like hepatocytes are useful in various assays such as metabolic assays and toxicity assays. Also, it is expected to be used as an active ingredient of cell preparations for treating various liver diseases or as a material for regenerative medicine.

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Abstract

【課題】人工多能性幹細胞を肝細胞へ効率的に分化誘導するための新規な方法及びその用途を提供することを目的とする。 【解決手段】人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程と、該工程で得られた内胚葉様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を実施する工程によって、人工多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する。

Description

人工多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する方法
　本発明は人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem：iPS）を肝細胞へ分化誘導する方法及びその用途に関する。本出願は、２０１２年６月８日に出願された日本国特許出願第２０１２－１３１２４０号及び２０１２年１１月９日に出願された日本国特許出願第２０１２－２４７０１０号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　医薬品開発の薬物動態試験において実験動物が多用されているが、種差があるため結果をヒトへ外挿することが困難である。一方、ヒト初代肝細胞や凍結肝細胞ではロット間差が大きく、良質の肝細胞を安定して入手することが難しく、これが研究の障害となっている。ヒト人工多能性幹（iPS）細胞は2007年に山中らによって樹立された。このヒトiPS細胞は、1998年にThomsonらによって樹立されたヒト胚性幹（embryonic stem：ES）細胞と同様な、多分化能とほぼ無限の増殖能をもつ細胞である。ヒトiPS細胞はヒトES細胞に比べ倫理的な問題が少なく、医薬品開発のための安定した細胞供給源として期待される。これまでに、iPS細胞から肝細胞への分化誘導方法がいくつか報告されている（例えば特許文献１、非特許文献１～９を参照）。
特開２０１０－７５６３１号公報 特表２０１１－５２９３２９号公報
Song Z, et al: Cell Res. 19(11), 1233-1242, 2009 Snykers S, et al: Stem Cells 27(3), 577-605, 2009 Sullivan GJ, et al: Hepatology 51(1), 329-335, 2010 Touboul T, et al: Hepatology 51(5), 1754-1765, 2010 Huang HP, et al: J Biol Chem. 285(43), 33510-33519, 2010 Ghodsizadeh A, et al: Stem Cell Rev. 6(4), 622-632, 2010 Rashid ST, et al: J Clin Invest. 120(9), 3127-3136, 2010 Si-Tayeb K, et al: Hepatology 51(1), 297-305, 2010 Chen YF, et al: Hepatology. 55(4), 1193-1203, 2012
　iPS細胞を肝細胞へ分化誘導する主な方法では増殖因子等の液性因子が用いられているが（例えば非特許文献２、４、８、９を参照）、分化効率の面で不十分なうえに、非常に高価であることが課題となっている。そのため、安価で取り扱いの容易な低分子化合物を分化誘導因子として用いることが望まれる。本発明は、このような要望に応えるべく、iPS細胞を肝細胞へ効率的に分化誘導するための新規な方法及びその用途を提供することを目的とする。
　上記目的の下で研究を進める中で、本発明者らはロット間差が少なく安価なバルプロ酸に着目し、その分化誘導因子としての可能性を検討することにした。具体的には肝細胞への分化に与える影響を検討した。詳細な検討の結果、iPS細胞を肝細胞へ分化誘導する上で、バルプロ酸が分化の効率化及び機能獲得に極めて有効であることが判明した。また、使用時期（培地への添加期間）に関して重要且つ興味深い知見も得られた。バルプロ酸はてんかんに用いる代表的な薬物であり、その主作用としてのγ－アミノ酪酸（GABA）トランスアミナーゼ阻害作用は、抑制性シナプスにおいてGABA量を増加することにより抗痙攣作用を発揮する。しかし近年、バルプロ酸は他にも酸化ストレス産生作用やヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害作用を示すことが明らかとなり、癌治療への応用など、再び注目を浴びている薬物の一つでもある。これらバルプロ酸の特性を考慮すれば、本発明者らが得た上記知見は、iPS細胞を肝細胞へ分化誘導する際の条件として、HDACの阻害や酸化ストレスの負荷が有効であることを示唆する。
　ところで、バルプロ酸がiPS細胞の樹立効率を増加させるという報告がある（特許文献２）。しかし、バルプロ酸がiPS細胞の分化に与える影響については不明であった。本発明者らが明らかにした事実は、iPS細胞の応用及び実用化を促進し得るものであり、その意義は大きい。
　更に検討を進めた結果、肝細胞へ分化誘導する際、特定の培養時期には選択培地（肝細胞を選択的に生存させる培地）を使用することが、得られる肝細胞の純度を向上させる上で有効であることが判明した。また、培地組成や血清の添加濃度などについて、重要かつ有益な知見が得られた。
　以下に示す本願発明は、主として、本発明者らによる上記成果及び考察に基づく。
　［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、人工多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する方法：
　（１）人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
　（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を実施する工程。
　［２］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がヒストン脱アセチル化酵素１阻害剤である、［１］に記載の方法。
　［３］ヒストン脱アセチル化酵素１阻害剤がバルプロ酸である、［２］に記載の方法。
　［４］酸化ストレス負荷条件が、培地に過酸化水素、カタラーゼ阻害剤又はフリーラジカル生成剤が添加された条件である、［１］に記載の方法。
　［５］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養の期間は１日間～１３日間である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
　［６］工程（２）が、以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法：
　（２－１）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝芽細胞様細胞へと分化させる工程；
　（２－２）工程（２－１）で得られた肝芽細胞様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を実施する工程。
　［７］ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養を、工程（２－２）の開始後１６８時間までに開始し、２４時間～３１２時間、継続する、［６］に記載の方法。
　［８］工程（１）における分化誘導因子としてアクチビンAを用い、工程（２－１）における分化誘導因子としてDMSOを用い、工程（２－２）における分化誘導因子として肝細胞増殖因子、オンコスタチンM及びデキサメタゾンを用いる、［６］又は［７］に記載の方法。
　［９］工程（２）の初期と末期を除く培養期間を、糖源としてガラクトースを含有し、チロシン源としてフェニルアラニンを含有する選択培地を用いて培養する、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
　［１０］選択培地による培養期間の開始が、工程（１）の開始時から数えて８日目～１０日目の間であり、
　選択培地による培養期間の終了が、工程（１）の開始時から数えて１５日目～２０日目の間である、［９］に記載の方法。
　［１１］選択培地による培養期間が、工程（１）の開始時から数えて９日目～１６日目である、［９］に記載の方法。
　［１２］工程（１）の開始時から数えて１０日目以降は、糖源としてガラクトースを含有し、チロシン源としてフェニルアラニンを含有し、アルギニン源としてオルニチンを含有する選択培地を用いる、［９］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
　［１３］選択培地による培養期間は、FBSが添加された条件で培養する、［９］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
　［１４］FBSの添加濃度が1%（v/v）～10%（v/v）である、［１３］に記載の方法。
　［１５］選択培地中のガラクトース濃度が450mg/L～900mg/Lである、［９］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
　［１６］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
　［１７］［１］～［１６］のいずれか一項に記載の方法で得られた肝細胞様細胞。
　［１８］［１７］に記載の肝細胞様細胞を含む、細胞製剤。
　［１９］以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、被検物質の代謝を評価する方法：
　（ｉ）［１７］に記載の肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
　（ｉｉ）被検物質の代謝を測定する工程。
　［２０］以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、被検物質の毒性を評価する方法：
　（ｉ）［１７］に記載の肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
　（ｉｉ）工程（ｉ）後の肝細胞様細胞の状態を調べる工程。
肝細胞への分化に伴うヒトiPS細胞の形態学的変化と分化誘導プロトコルの概要。図中の略号は以下の通りである。DMSO，ジメチルスルホキシド；HGF，肝細胞増殖因子；OSM，オンコスタチンM；DEX，デキサメタゾン 肝細胞様細胞の各マーカー遺伝子発現。分化誘導前のヒトiPS細胞と分化誘導後のiPS細胞（25日間分化後）における各種マーカー遺伝子の発現を調べ、ヒト肝臓組織由来の総RNA（成人及び胎児）、及び凍結ヒト肝細胞から抽出した総RNA（解凍直後及び解凍後48時間に抽出）におけるマーカー遺伝子の発現と比較評価した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。N.D.，検出限界以下；ALB，アルブミン；AFP，α－フェトプロテイン；TAT，チロシン－アミノ基転移酵素；PXR，プレグナンX受容体；CYP3A4，シトクロムP450 3A4；CYP3A7，シトクロムP450 3A7 肝細胞様細胞の薬物代謝酵素活性。分化誘導後のiPS細胞（25日間分化後）の薬物代謝酵素活性を調べた。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。CYP1A，シトクロムP450 1A；CYP3A，シトクロムP450 3A；CYP2B，シトクロムP450 2B；CYP2D，シトクロムP450 2D；UGT，ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素；SULT，硫酸転移酵素；AAP，アセトアミノフェン；OHMZ，1’－ヒドロキシミダゾラム；OHBP，ヒドロキシブプロピオン；OHBF，1’－ヒドロキシブフラロール；7HC-Glu，7－ヒドロキシクマリングルクロニド；7HC-Sul，7－ヒドロキシクマリン硫酸塩 肝細胞分化に対するバルプロ酸の効果。バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合（コントロール）とバルプロ酸を使用して分化誘導させた場合（バルプロ酸）の間でマーカー遺伝子の発現量を比較評価した。比較のために、ヒト肝臓組織由来の総RNA（成人及び胎児）におけるマーカー遺伝子量も示した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。ALB，アルブミン；AFP，α－フェトプロテイン；TAT，チロシン－アミノ基転移酵素；PXR，プレグナンX受容体；CAR，構成的アンドロスタン受容体；FOXA2，フォークヘッド転写因子A2；UGT1A1，ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素1A1 肝細胞分化に対するバルプロ酸の効果。バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合（コントロール）とバルプロ酸を使用して分化誘導させた場合（バルプロ酸）の間でマーカー遺伝子の発現量を比較評価した。比較のために、ヒト肝臓組織由来の総RNA（成人及び胎児）におけるマーカー遺伝子量も示した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。CYP3A4，シトクロムP450 3A4；CYP3A5，シトクロムP450 3A5；CYP3A7，シトクロムP450 3A7；CYP2C19，シトクロムP450 2C19 バルプロ酸の添加時期の違いによる肝細胞の分化に対する効果。バルプロ酸の添加時期を変えた場合のマーカー遺伝子の発現量の変化を調べた。バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合をコントロールとした。比較のために、ヒト肝臓組織由来の総RNA（成人及び胎児）、及び凍結ヒト肝細胞から抽出した総RNA（解凍直後及び解凍後48時間に抽出）におけるマーカー遺伝子量も示した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。ALB，アルブミン；AFP，α－フェトプロテイン；TAT，チロシン－アミノ基転移酵素；PXR，プレグナンX受容体 バルプロ酸の添加時期の違いによる誘導剤に対する応答性。バルプロ酸の添加時期を変えた場合の、誘導剤に対する応答性の変化を調べた。バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合をコントロールとした。また、凍結ヒト肝細胞（解凍後48時間）の応答性も測定し、比較した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。図中の略号は以下の通りである。CYP3A4，シトクロムP450 3A4；CYP3A5，シトクロムP450 3A5；CYP3A7，シトクロムP450 3A7；RIF，リファンピシン処理（40μM） 検討に使用した培地（L-15特注培地E、変法L15培地、L15コントロール培地）の組成。L-15特注培地Eは、市販のL-15培地の組成から、L-アルギニン、L-チロシン、D-(+)-ガラクトース、ピルビン酸ナトリウムを除き、L-オルニチン、L-プロリン、グリセロール、インスリン、デキサメタゾンを加えたものである。変法L15培地は、L-15特注培地Eに、D-(+)-ガラクトース、FBS、アプロチニン、メルカプトエタノール、炭酸水素ナトリウムを加えたものである。L15コントロール培地は、L-15特注培地EにL-アルギニン、L-チロシン、D-(+)-グルコース、FBS、アプロチニン、メルカプトエタノール、炭酸水素ナトリウムを加えたものである。 変法L-15培地による培養時期の検討。全25日間のプロトコルで肝細胞へ分化(iPS51)させた。24ウェルプレートを使用し、12群の試験区を設けた（n=2）。肝細胞選択培地中の血清はFBS(10%)又はKSR(10%)とした。 変法L-15培地中のFBS濃度及びガラクトース濃度の検討。分化プロトコル（上）とFBS及びガラクトース／グルコースの添加条件（下）を示す。 肝細胞に特異的な代謝経路。 肝細胞特異的な酵素発現。肝細胞特異的な各酵素のmRNA発現量を経時的に測定した。 変法L-15培地による培養時期の検討。成熟肝細胞マーカーALBと、成人の主要な薬物代謝酵素CYP3A4についてmRNA発現量を比較した。 変法L-15培地中のFBS濃度及びガラクトース濃度の検討。成熟肝細胞マーカーALBと、成人の主要な薬物代謝酵素CYP3A4についてmRNA発現量を比較した。 アルブミン免疫染色の結果。 変法L-15培地が肝細胞及び線維芽細胞に与える影響。HFL細胞（ヒト胎児肝細胞）及びHFLung細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）を用いて6日間の培養を行い、顕微鏡下で観察した。上段はHFL細胞、下段はHFLung細胞。 実験方法の概要。 肝細胞様細胞の各マーカー遺伝子発現。分化誘導前のヒトiPS細胞と25日間分化誘導後のiPS細胞（バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合：対照群、バルプロ酸を使用して分化誘導させた場合：バルプロ酸）における各種マーカー遺伝子の発現を調べ、凍結ヒト肝細胞から抽出した総RNA（解凍後48時間に抽出）におけるマーカー遺伝子の発現と比較評価した。各データは平均±S.D.（n = 4）で表した。 肝細胞様細胞の各マーカー遺伝子（薬物代謝酵素の誘導に関与する受容体）発現。分化誘導前のヒトiPS細胞と25日間分化誘導後のiPS細胞（バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合：対照群、バルプロ酸を使用して分化誘導させた場合：バルプロ酸）における各種受容体遺伝子の発現を調べ、凍結ヒト肝細胞から抽出した総RNA（解凍後48時間に抽出）における受容体遺伝子の発現と比較評価した。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 肝細胞様細胞の各マーカー遺伝子（薬物代謝酵素）発現。分化誘導前のヒトiPS細胞と25日間分化誘導後のiPS細胞（バルプロ酸を使用せずに分化誘導させた場合：対照群、バルプロ酸を使用して分化誘導させた場合：バルプロ酸）における各種薬物代謝酵素遺伝子の発現を調べ、凍結ヒト肝細胞から抽出した総RNA（解凍後48時間に抽出）における薬物代謝酵素遺伝子の発現と比較評価した。各データは平均±S.D.（n = 4）で表した。 免疫染色、過ヨウ素酸シッフ染色、インドシアニングリーン染色の結果。上の３枚が未分化のヒトiPS細胞の結果（左：核染色、中：アルブミン染色、右；重ね合わせ像）、中央及び下の計６枚がバルプロ酸を用いて分化させたヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の結果（中左：核染色、中中：アルブミン染色、中右；重ね合わせ像、下左：過ヨウ素酸シッフ染色にてグリコーゲンの蓄積を染色したもの、下中：インドシアニングリーンを取りこませた直後、下右：インドシアニングリーンを除去後、排泄能を評価するために培養した後の像）。 バルプロ酸による薬物代謝酵素活性の変化。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 バルプロ酸による薬物代謝酵素活性の変化。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 バルプロ酸を用いて分化させた細胞の、薬物誘導剤に対する応答性。薬物代謝酵素のmRNA発現量を調べた。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 バルプロ酸を用いて分化させた細胞の、薬物誘導剤に対する応答性。薬物代謝酵素のmRNA発現量を調べた。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 バルプロ酸を用いて分化させた細胞の、薬物誘導剤に対する応答性。薬物代謝酵素の活性を調べた。各データは平均±S.D.（n = 4）で表した。 γアミノ酪酸アミノ基転移酵素阻害剤、ナトリウムチャネル阻害剤、カルシウムチャネル阻害剤、ナトリウムチャネル・カルシウムチャネル阻害剤の効果。バルプロ酸の作用の内、ヒストン脱アセチル化酵素阻害作用以外の作用を有する化合物を添加して培養した場合の肝細胞マーカーの発現を調べた。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 バルプロ酸による、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害。バルプロ酸を添加している期間中はヒストン脱アセチル化酵素が阻害されていることがわかる。各データは平均±S.D.（n = 4）で表した。 他のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がヒトiPS細胞の分化に与える影響。バルプロ酸に代えて各種ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加して培養した場合の肝細胞マーカーの発現を調べた。各データは平均±S.D.（n = 3）で表した。 他のiPS細胞株からの分化誘導。各種iPS細胞株を同様の方法で分化誘導させ、肝細胞マーカーの発現を調べた。各データは平均±S.D.（#51はn = 3、#11及び#16はn = 4）で表した。
　本発明は人工多能性幹細胞（iPS細胞）を肝細胞系譜へ分化誘導する方法（以下、「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、生体の肝臓組織を構成する肝細胞と類似の特性を示す細胞、即ち肝細胞様細胞が得られる。
　「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
　iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明ではiPS細胞を肝細胞へと分化誘導する。本発明の分化誘導方法は大別して２段階の誘導工程、即ち、iPS細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程（工程（１））と、得られた内胚葉様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程（工程（２））を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
＜工程（１）　内胚葉様細胞への分化＞
　この工程ではiPS細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下でiPS細胞を培養する。iPS細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/ml～200 ng/ml、好ましくは20 ng/ml～150 ng/mlとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)～10%(v/v)である。
　Wnt／β－カテニンシグナル経路の阻害剤（例えば、ヘキサクロロフェン、クエルセチン、WntリガンドであるWnt3a）を培地に添加し、内胚葉様細胞への分化の促進を図ってもよい。
　好ましい一態様では、後述の実施例に示すように、工程（１）として２段階の培養を行う。１段階目の培養は血清を添加した培地で行い、続く２段階目の培養では血清の代わりにKSRを用いる。このように２段階の培養を採用することは、１段階目の培養により未分化細胞の増殖を抑制し、続く２段階目により分化した細胞を増殖させ、KSRを用いることでロット間差の影響を軽減させる点で好ましい。
　工程（１）の期間（培養期間）は例えば３日間～１０日間、好ましくは４日間～７日間である。工程（１）として２段階の培養を採用する場合には１段階目の培養期間を例えば１日間～７日間、好ましくは２日間～５日間とし、２段階目の培養期間を例えば１日間～６日間、好ましくは２日間～４日間とする。
＜工程（２）　肝細胞様細胞への分化＞
　この工程ではヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を行い、工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる。典型的には、工程（１）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（２）に供する。一方で、工程（１）を経て得られた細胞集団の中から内胚葉様細胞を選別した上で工程（２）を実施することにしてもよい。内胚葉様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソター）で行えばよい。
　「ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤の存在下」とは、HDAC阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。従って、HDAC阻害剤の存在下での培養を行うためには、HDAC阻害剤が添加された培地を用いればよい。HDAC阻害剤の例としてバルプロ酸、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、Vorinostat、NCC-149、NCH-47、NCH-51、MS-275、FK228、Apicidin、MGCD-0103を挙げることができる（T.Suzuki et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 4809-4812）。好ましくは、HDACファミリーの一つであるHDAC1に対する阻害活性を示す化合物を使用する。当該化合物の具体例はバルプロ酸、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、NCH-47、NCH-51、MS-275である。HDAC阻害剤の添加濃度は予備実験等によって決定すればよい。添加濃度の例（バルプロ酸の場合）を示すと0.1mM～4mMである。
　「酸化ストレス負荷条件」とは、細胞に外的な酸化ストレスが加えられる条件をいう。培地に過酸化水素、カタラーゼ阻害剤又はフリーラジカル生成剤を添加することによって、酸化ストレス負荷状態を形成することができる。カタラーゼ阻害剤の例はアジ化ナトリウム（NaN3）、硫化水素（H2S）、シアン化水素（HCN）、ヒドロキシアミン（NH2OH）、3－アミノ－1,2,4－トリアゾールであり、フリーラジカル生成剤の例はドキソルビシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、プレオマイシン、ネオカルチノスタチンである。好ましい酸化ストレス負荷条件（例えば、過酸化水素やカタラーゼ阻害剤等の最適な添加濃度）は予備実験を通して決定すればよい。予備実験の際には、過度の酸化ストレスの負荷は細胞の生存率、増殖率、活性等の低下を引き起こすことを考慮するとよい。
　上記の記載から明らかなように、HDAC阻害剤の存在下と、酸化ストレス負荷条件下は互いに排他的な条件ではない。従って、両方の条件を満たす培養条件を採用してもよい。尚、例えばバルプロ酸のようにHDAC阻害作用と酸化ストレス産生作用を併せ持つ化合物を使用した場合、両方の条件が満たされることになる。
　本発明の分化誘導方法に特徴的な上記条件以外の培養条件については、肝細胞系譜への分化誘導に適したものを採用すればよい。一般に、肝細胞系譜への分化誘導にはDMSO、HGF、FGF、BMP4、オンコスタチンM、デキサメタゾン等が用いられる。
　工程（２）の期間（培養期間）は例えば７日間～４０日間、好ましくは１０日間～３０日間である。HDAC阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養は、工程（２）の少なくとも一部であり、その期間は例えば１日間～２０日間、好ましくは２日間～７日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、肝細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　肝細胞様細胞へ分化したことは、肝細胞マーカーの発現や薬物代謝活性等を指標にして判定ないし評価することができる。肝細胞マーカーの例を挙げると、アルブミン（ALB）、α－フェトプロテイン（AFP）、チロシン－アミノ基転移酵素（TAT）、プレグナンX受容体（PXR）である。
　目的の細胞（肝細胞様細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
　薬物代謝活性は、薬物代謝酵素の発現の検出又は薬物代謝アッセイによって評価することができる。薬物代謝酵素の例はシトクロムP450 3A4（CYP3A4）、シトクロムP450 3A7（CYP3A7）、シトクロムP450 1A（CYP1A）、シトクロムP450 3A（CYP3A）、シトクロムP450 2B（CYP2B）、シトクロムP450 2D（CYP2D）、ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素（UGT）、硫酸転移酵素（SULT）である。
　好ましい一態様では工程（２）として２段階の培養、即ち、工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝芽細胞様細胞へと分化させる工程（２－１）と、工程（２－１）で得られた肝芽細胞様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程（２－２）を行う。
　工程（２－１）には、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した培地が使用される。DMSOの添加量は例えば０．０１％～５％、好ましくは０．５％～３％である。
　工程（２－２）には、例えば、肝細胞増殖因子（HGF）、オンコスタチンM及びデキサメタゾン（DEX）を添加した培地が使用される。HGFの添加量は例えば1ng/mL～20ng/mL、好ましくは2ng/mL～15ng/mLであり、オンコスタチンMの添加量は例えば2ng/mL～40ng/mL、好ましくは4ng/mL～30ng/mLであり、DEXの添加量は例えば10-4M～１0-9M好ましくは10-5M～10-8Mである。
　工程（２）として工程（２－１）と工程（２－２）を行う場合、工程（２－１）の培養期間は例えば２日間～１４日間、好ましくは３日間～１０日間であり、工程（２－２）の培養期間は例えば３日間～２１日間、好ましくは５日間～１５日間である。また、HDAC阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養については、例えば、工程（２－２）の開始後１６８時間（７日）までに開始し、２４時間（１日間）～３１２時間（１３日間）、継続する。好ましくは、工程（２－２）の開始後１６８時間（７日）までに開始し、４８時間（２日間）～１６８時間（７日間）、継続する。
　工程（２－２）として２段階の培養を行うことにしてもよい。この場合には１段階目の培養を上記条件（例えば、HGF、オンコスタチンM及びDEXを添加した培地を使用する）で行い、２段階目の培養を例えば、HGF、オンコスタチンM及びDEXを含まない無血清培地で行う。このような２段階の培養を採用することは、１段階目の培養により細胞を成熟化させ、２段階目の培養にてサイトカイン類が薬物代謝酵素等の遺伝子発現に与える影響を回避できる点で好ましい。ここでの１段階目の培養の期間は例えば３日間～２１日間、好ましくは５日間～１４日間であり、２段階目の培養の期間は例えば１日間～７日間、好ましくは２日間～４日間である。
　本発明を構成する各工程（工程（１）、（２）、（２－１）、（２－２））において、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば1×104個／cm2～1×106個／cm2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。
　培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
　本発明を構成する各工程（工程（１）、（２）、（２－１）、（２－２））における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、Gibco社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Gibco社等）、グラスゴー基本培地（Gibco社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。工程（２）、（２－１）、（２－２）においては、肝細胞培養用の基本培地（タカラバイオ株式会社、Gibco社等）を用いることが好ましい。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、2-メルカプトエタノール、PVA、非必須アミノ酸（NEAA）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養するが、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
　後述の実施例に示す通り、本発明者らによる検討の結果、内胚葉様細胞から肝細胞へ分化誘導する際、即ち工程（２）において、その一部に選択培地を使用すると、最終的に得られる肝細胞様細胞の純度が向上することが判明した。そこで本発明の好ましい一態様では、工程（２）の初期と末期を除く培養期間を、糖源としてガラクトースを含有し（換言すれば、グルコースを含有しない）、チロシン源としてフェニルアラニンを含有する（換言すれば、チロシンを含有しない）選択培地（説明の便宜上、後述の選択培地２と区別するために「選択培地１」と呼ぶことがある）を用いて培養する。
　選択培地を用いた培養は、典型的には、工程（１）の開始時から数えて８日目（培養８日目）～１０日目（培養１０日目）に開始し、工程（１）の開始時から数えて１５日目（培養１５日目）～２０日目（培養２０日目）に終了する。例えば、培養９日目～培養１６日目を、選択培地を用いた培養期間とする。培養１０日目以降については、好ましくは、糖源としてガラクトースを含有し、チロシン源としてフェニルアラニンを含有し、アルギニン源としてオルニチンを含有する（換言すれば、アルギニンを含有しない）選択培地（選択培地２）を使用する。このように特定の時期に選択培地１から選択培地２に切り換えれば、最終的に得られる肝細胞様細胞の更なる純度向上を望める。
　選択培地１の具体例は、L-15特注培地Eにガラクトースとアルギニンを添加したもの（後述の実施例を参照）である。また、選択培地２の具体例は、変法L15培地（L15特注培地Eにガラクトースを添加したもの）である。
　後述の実施例に示した検討の結果を踏まえると、選択培地（選択培地１又は選択培地２）で培養する際には、ノックアウト血清代替物（KSR）ではなく、ウシ胎児血清（FBS）を添加した培地を使用することが好ましい。この場合のFBS濃度は例えば1%（v/v）～10%（v/v）であり、好ましくは、肝細胞系譜に分化した細胞が選択的に生存・増殖するように、1%（v/v）～2%（v/v）とする。
　選択培地中のガラクトース濃度は例えば450mg/L～900mg/Lである。FBS濃度を低く設定した場合（具体的には例えば1%（v/v））には、肝細胞系譜に分化した細胞の生存率／増殖率を維持ないし高めるために、ガラクトース濃度を比較的高く（例えば600mg/L～900mg/L）設定することが好ましい。
　選択培地を用いた培養におけるその他の培養条件は上述の通りである。即ち、DMSOの添加、HDAC1の添加、酸化ストレスの付加等が上記の説明に従って併用される。例えば工程（２）として２段階の培養（（２－１）及び（２－２））を行う場合には、工程（２－１）の一部をDMSO添加の培地（選択培地を使用しない）で実施し、それに続く残りの部分をDMSO添加の選択培地で実施することになる。また、工程（２－２）の一部をHGF、オンコスタチンM及びDEX添加の選択培地で実施し、それに続く残りの部分をHGF、オンコスタチンM及びDEX添加の培地（選択培地を使用しない）で実施することになる。好ましい一態様では、工程（１）の開始時から数えて９日目の培養をDMSO添加の選択培地１で実施し、工程（１）の開始時から数えて１０日目～１２日目の培養をDMSO添加の選択培地２で実施し、工程（１）の開始時から数えて１３日目～１６日目の培養をHGF、オンコスタチンM及びDEX添加の選択培地２で実施する。
　本発明の第２の局面は本発明の分化誘導方法で調製した肝細胞様細胞の用途に関する。第１の用途として、肝細胞様細胞を含有する細胞製剤が提供される。本発明の細胞製剤は各種肝疾患の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）肝臓組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の方法によって得られた肝細胞様細胞を生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば1×105個～1×1010個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
　細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
　本発明の分化誘導方法で調製した肝細胞様細胞の第２の用途として各種アッセイが提供される。例えば、肝細胞様細胞を用いて被検物質の代謝について試験することができる。即ち、本発明は、肝細胞様細胞の用途の一つとして、被検物質の代謝を評価する方法を提供する。当該方法では、（ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉ）被検物質の代謝を測定する工程を行う。工程（ｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被験化合物の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被験物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。被検物質がタンパク質やペプチド等の場合には、発現ベクターなどを利用して被検物質をコードするDNAを肝細胞様細胞に導入することにより、「接触」状態を形成することもできる。
　被検物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬や栄養食品等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
　工程（ｉ）の後、被検物質の代謝を測定する（工程（ｉｉ））。工程（ｉ）の直後、即ち、被検物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝を測定しても、或いは、一定の時間（例えば１０分～５時間）を経過した後に代謝を測定することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。
　典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。
　肝細胞様細胞における薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、UGT）の発現を指標として被検物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はmRNAレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のmRNAレベルに上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定を行うことにしてもよい。
　一方、本発明の分化誘導方法で調製した肝細胞様細胞を用いて被検物質の毒性を試験することもできる。即ち、本発明は、肝細胞様細胞の用途の一つとして、被検物質の毒性を評価する方法も提供する。当該方法では、（ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）後の肝細胞様細胞の状態を調べる工程を行う。工程（ｉ）については、上記のアッセイ（代謝を評価する方法）と同様であるため、その説明を省略する。
　工程（ｉｉ）では、被検物質を接触させた後の肝細胞様細胞の状態を調べ、被検物質の毒性を評価する。肝細胞様細胞の状態は、生存率の測定、細胞形態の観察、培養液中の肝障害マーカー（GOT、GPT等）の測定などによって把握することができる。例えば、被検物質の接触によって生存率の低下を認めたとき、「被検物質は肝毒性を有する」と判定することができる。また、被検物質の接触によって細胞形態の異常を認めたときや、培養液中の肝障害マーカーの量が上昇したときも同様に、「被検物質は肝毒性を有する」と判定することができる。生存率の低下の程度や肝障害マーカーの量に応じて定量的な判定を行ってもよい。定量的な判定では、例えば、被験物質の毒性レベルが、予め設定された評価レベル（例えば毒性レベル１～５）の中のいずれに該当するかが決定される。
＜ヒトiPS細胞から肝細胞への分化に与えるバルプロ酸の影響＞
　ヒトiPS細胞から肝細胞への分化に与えるバルプロ酸の影響を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。バルプロ酸はてんかんに用いる代表的な薬物であり、γ－アミノ酪酸（GABA）トランスアミナーゼ阻害作用を示す。バルプロ酸にはHDAC阻害作用や酸化ストレス産生作用もあることが知られている。
１．方法
（１）細胞
　ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4（OCT3/4）、sex determining region Y-box 2（SOX2）、kruppel-like factor 4（KLF4）、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog（avian）（c-MYC）を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎児線維芽細胞（MEF）を使用した。
（２）培地
　MEFの培養には10% ウシ胎児血清（FBS）、2 mmol/L L－グルタミン（L-Glu）、0.1 mmol/L 非必須アミノ酸（NEAA）、100 ユニット/mL ペニシリンG、100μg/mL ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05% トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20 % ノックアウト血清代替物（KSR）、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含むDMEM Ham's F-12を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mL コラゲナーゼIV、0.25% トリプシン、20% KSR、1 mmol/L 塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
（３）ヒトiPS細胞の培養
　マイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mm ディッシュ）上にヒトiPS細胞を播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3～5日培養後、1:2～1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞の解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日培地を交換した。
（４）ヒトiPS細胞の肝細胞への分化
　培養ディッシュに対し、ヒトiPS細胞の未分化コロニーの占める割合が約70%になった時点でヒトiPS細胞の肝細胞への分化を開始した。まず、0.5% FBS、100 ng/mL アクチビンAを含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）＋グルタマックス培地で3日間、2% KSR、100 ng/mL アクチビンAを含むRPMI＋グルタマックス培地で2日間培養することで内胚葉に分化させた。次に、Y-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、成長因子を除去したマトリゲル（予めヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈しておいたもの）にてコートした細胞培養用24ウェルプレートもしくは96ウェルプレートに播種した。その後、20% KSR、1% グルタマックス、1% NEAA、0.1 mmol/L 2-MeE、1% ジメチルスルホキシド（DMSO）、100 ユニット/mL ペニシリンG、100 μg/mL ストレプトマイシン、10μmol/L Y-27632を含むノックアウトDMEM（KO-DMEM）で1日間、20% KSR、1% グルタマックス、1% NEAA、0.1 mmol/L 2-MeE、1% DMSO、100 ユニット/mL ペニシリンG、100μg/mL ストレプトマイシンを含むKO-DMEMで6日間培養することで肝芽細胞に分化させた。最後に、10 ng/mL 肝細胞増殖因子（HGF）、20 ng/mL オンコスタチンM、10-7 mol/L デキサメタゾンを含む肝細胞培養用無血清培地で10日間、肝細胞培養用無血清培地で3日間培養することで肝細胞へ分化させた。薬物代謝酵素の誘導剤処理は40μmol/L リファンピシン（RIF）を含む肝細胞培養用無血清培地で回収前48時間培養することで行った。また、分化の際に2 mmol/L バルプロ酸を添加（分化19日目から72時間、分化13日目から168時間もしくは分化13日目から312時間処理）し、肝細胞への分化に及ぼす影響について検討した。
（５）総リボ核酸（RNA）抽出
　総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、RNeasy（登録商標） Mini Kit（Qiagen）の添付マニュアルに従い抽出した。
（６）逆転写反応
　相補的DNA（cDNA）の合成は、PrimeScript（登録商標） RT reagent Kit (Perfect Real Time)（タカラバイオ株式会社）を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
（７）リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time RT-PCR）
　SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）（タカラバイオ株式会社）を用い、cDNAを鋳型にしてReal-Time RT-PCRを行った。操作は添付マニュアルに従った。内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（GAPDH）を用い、測定結果を補正した。
（８）薬物代謝酵素活性測定
　分化誘導終了後、40μmol/L フェナセチン、50μmol/L ブプロピオン、5μmol/L ジクロフェナク、100μmol/L S－メフェニトイン、5μmol/L ブフラロール、5μmol/L ミダゾラムおよび10μmol/L 7－ヒドロキシクマリンを含む肝細胞培養用培地に交換し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて細胞（肝細胞様細胞）を6時間処理した。処理後、各ウェルから培地を採取し、等量の反応停止液（定量用内部標準物質を含むアセトニトリル）を加えた。代謝物の測定には超高速液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計（UPLC/MS/MS）システムを用いた。測定条件は以下の通りとした。即ち、逆相カラムAcquity UPLC BEH C18 column（2.1×50 mm）を用い、移動相は0.025% ギ酸を含む水及び0.025% ギ酸を含むメタノールを使用し、流速は0.8 mL/minとした。またMSの測定にはエレクトロスプレーイオン化法を採用し、キャピラリー電圧は0.5 kV、イオン源温度は150℃に設定した。
２．結果
（１）ヒトiPS細胞の肝細胞への分化
　25日間の分化誘導後の細胞（ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞）には、肝細胞に特徴的な多核の形態が認められた（図１）。また、mRNA解析を行ったところ、肝細胞マーカーであるアルブミン（ALB）やα－フェトプロテイン（AFP）、成熟肝マーカーであるチロシン－アミノ基転移酵素（TAT）、ヒト成人の主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450（CYP）やウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素（UGT）の発現が認められた（図２）。
（２）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の薬物代謝酵素活性
　各種CYPsのプローブ薬物を基質として添加し、生成する代謝物を測定したところ、第一相反応の酵素であるCYPにより生成される1’－ヒドロキシミダゾラム（CYP3A）やO－脱エチルフェナセチン（CYP1A）だけでなく、第二相反応の酵素であるUGTや硫酸転移酵素（SULT）により生成される7－ヒドロキシクマリン抱合代謝物（グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体）が検出された（図３）。
（２）ヒトiPS細胞の肝細胞への分化におけるバルプロ酸の効果
　上記の分化誘導条件をコントロールとして、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化に対するバルプロ酸の効果について検討を行った。25日間の分化後の細胞において、バルプロ酸の添加（バルプロ酸は分化19日目から72時間添加）によりALBで約4倍、TATで約12倍、CYP2C19で約3倍のmRNA発現の上昇が認められた（図４、５）。また、CYPの発現調節に関与する核内受容体であるプレグナンX受容体（PXR）や構成的アンドロスタン受容体（CAR）ではそれぞれ約30倍、約14倍のmRNA発現の増加が認められた（図４）。
（３）バルプロ酸の添加時期の違いによるヒトiPS細胞の肝細胞への分化
　バルプロ酸の添加によって、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の肝細胞マーカー発現が増加したことから、次に添加時期について検討を行った。バルプロ酸を分化19日目から72時間添加すると、ALBで約7倍、PXRで約75倍のmRNA発現の増加が認められた（図６）。また、バルプロ酸を分化誘導13日目から168時間添加すると、分化誘導後の細胞においてALBで約31倍、TATで約4倍、PXRで約21倍のmRNA発現の増加が認められた（図６）。一方で、バルプロ酸を分化誘導13日目から312時間添加すると、ALBのmRNA発現は約8倍に増加したものの、TATで約0.24倍、PXRで約0.49倍のmRNA発現の減少が認められた（図６）。CYP3A4については、バルプロ酸を72時間添加することにより約6倍、168時間添加することにより約8倍のmRNA発現の増加が認められた（図７）。さらに、CYP3Aの誘導剤であるRIF処理を行ったところ、バルプロ酸を72時間添加することで約6倍、168時間添加することで約12倍CYP3A4の発現が誘導された（図７）。しかし、バルプロ酸を312時間添加した群ではRIFに対するCYP3Aの誘導は認められなかった。
３．考察
　本検討においてヒトiPS細胞から分化させた細胞（肝細胞様細胞）では、肝細胞マーカーや薬物代謝酵素、CYP3A4の発現調節に関与する核内受容体のmRNA発現が認められた。さらに、薬物代謝において重要な第一相反応の酵素である各種CYPsおよび第二相反応の酵素であるUGTやSULTによる薬物代謝活性が検出されたことから、ヒトiPS細胞が機能を有する肝細胞様の細胞に分化していることが明らかとなった。また、バルプロ酸の添加により肝細胞マーカーのmRNA発現量が増加したため、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導において、バルプロ酸は分化の効率化あるいは機能獲得に有用であることが明らかとなった。バルプロ酸の添加時期の検討を行ったところ、分化19日目から72時間もしくは分化13日目から168時間添加すると肝細胞マーカーの発現が増加した。しかし一方で、バルプロ酸を分化13日目から312時間添加すると、肝細胞マーカーの発現が減少した。このことから、長期間暴露させるよりもむしろ、分化成熟の段階で一定期間処理した方がよく、即ち、添加期間が重要であると考えられた。
　バルプロ酸を72時間もしくは168時間添加するとCYP3AのmRNA発現は上昇し、しかも、RIFで処理することでCYP3AのmRNA発現が誘導されたことから、分化誘導処理後の細胞（ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞）ではRIFに対する応答性が肝細胞と類似していることが明らかとなった。
　前述したように、バルプロ酸はHDAC阻害作用や酸化ストレス産生作用などを有する。ヒト肝癌細胞株HepG2において細胞周期停止による細胞増殖抑制と分化誘導をHDAC1阻害剤が促進させることが報告されている（Yamashita Y, et al: Int J Cancer. 103(5), 572-576, 2003）。この報告に考慮しつつ実験結果を考察すると、バルプロ酸のHDAC阻害効果によって肝細胞への分化が促進された可能性が高い。また、酸化ストレスは細胞老化を引き起こすため、バルプロ酸の酸化ストレス産生作用が分化・成熟を促進させたとも考えられる。
　分化誘導処理後のヒトiPS細胞では各種肝細胞マーカーの発現や薬物代謝酵素活性が認められた。またRIFに対するCYP3Aの応答性が肝細胞と類似していた。このように、新規な分化誘導方法を適用することによって、薬物相互作用を含めた薬物動態研究へ応用可能な細胞の作成に成功した。低分子化合物を用いた簡便で安価な分化誘導方法の確立は、大きな成果であると考えられる。
４．まとめ
　以上の通り、ヒトiPS細胞が、機能を有する肝細胞様細胞へ分化したことが明らかとなった。即ち、ヒトiPS細胞を肝細胞へと分化誘導することに成功した。また、バルプロ酸がヒトiPS細胞から肝細胞への分化促進剤として有用であることが明らかとなった。バルプロ酸の作用を考慮すれば、HDACの阻害や酸化ストレスの負荷が分化の促進に有効であるといえる。
＜変法L-15培地を用いたヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の選択的培養法＞
　細胞は様々な代謝経路を有し、必要な栄養源を自ら合成する能力が存在する。この中で、糖代謝、アミノ酸代謝および尿素サイクルに関わる経路のうち、肝細胞特異的な経路が存在することが明らかとなっている。肝細胞は、グルコース、チロシン及びアルギニン合成能を有しているため、培地中にガラクトース、フェニルアラニン及びオルニチンが存在していれば、これらから必要な栄養素を合成し、利用することが可能である。そのため、これら肝細胞のみで利用できる栄養素を含む培地でiPS細胞由来肝細胞を培養することで、肝細胞以外に分化した他の細胞を死滅させることが可能であると考えられる。そこで、以下の検討では、分化の過程で変法L-15培地を用いてヒトiPS細胞から肝細胞に分化した細胞のみを選択的に培養し、最終的に得られるヒトiPS細胞由来肝細胞の純度を向上させることを目指した。
１．方法
（１）細胞
　ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4（OCT3/4）、sex determining region Y-box 2（SOX2）、kruppel-like factor 4（KLF4）、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog（avian）（c-MYC）を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎児線維芽細胞（MEF）を使用した。本検討で用いたヒト胎児肝細胞（HFL）は胎齢約13週の6胎児肝を混合した初代肝細胞であり、米国Applied Cell Biology Research Institute社がインフォームドコンセントに基づいて研究用に取得し、第5継代までの増殖が同社によって確認されているものを、大日本製薬株式会社を通して入手した。ヒト肺線維芽細胞（HFLung）は、日本人11週齢胎児肺由来正常線維芽細胞HFL-III:RCB0523であり、理研バイオリソースセンター細胞バンクより入手した。
（２）培地
　MEFの培養には10% ウシ胎児血清（FBS）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1%非必須アミノ酸（NEAA）、100 ユニット/mL ペニシリンG、100μg/mL ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20 % ノックアウト血清代替物（KSR）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含むDMEM Ham’s F-12を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mL コラゲナーゼIV、0.25% トリプシン、20% KSR、1 mmol/L 塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
（３）ヒトiPS細胞の培養
　ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mm ディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3～5日培養後、1:2～1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
（４）ヒトiPS細胞の肝細胞への分化
　ヒトiPS細胞の肝細胞への分化は、ヒトiPS細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約70%になった状態で開始した。0.5% FBS、100 ng/mL アクチビンAを含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）＋グルタマックス培地で3日間、2% KSR、100 ng/mL アクチビンAを含むRPMI＋グルタマックス培地で2日間培養することで内胚葉に分化させた。アクチビンA処理後、Y-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用24ウェルプレートもしくは96ウェルプレートに播種した。その後、20% KSR、1% グルタマックス、1% NEAA、0.1 mmol/L 2-MeE、1% ジメチルスルホキシド（DMSO）、100ユニット/mL ペニシリンG、100μg/mL ストレプトマイシン、10μmol/L Y-27632を含むノックアウトDMEM（KO-DMEM）で1日間、20% KSR、1% グルタマックス、1% NEAA、0.1 mmol/L 2-MeE、1% DMSO、100ユニット/mL ペニシリンG、100μg/mL ストレプトマイシンを含むKO-DMEMで6日間培養することで肝芽細胞に分化させた。最後に、10 ng/mL 肝細胞増殖因子、20 ng/mL オンコスタチンM、10-7 mol/L デキサメタゾンを含む肝細胞培養用無血清培地で10日間、肝細胞培養用無血清培地で3日間培養することで肝細胞へ分化させた。また、変法L-15培地の効果を検討するために分化後8、9もしくは10日目から7日間変法L-15培地（図８）で培養した。この際、変法L-15培地の変更時期及び栄養素の添加時期を全6群に分け、さらに培地中に添加する血清をFBS群とKSR群に分け、各々が分化に与える影響について検討した（図９）。次に、FBS濃度及びガラクトース濃度を全8群に分け、肝細胞への分化の至適条件を検討した（図１０）。分化終了後、RNAを抽出し、肝細胞で特異的に発現している遺伝子のmRNA発現量をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time RT-PCR）法にて解析した。また、免疫蛍光染色にて肝細胞マーカーであるアルブミン（ALB）陽性細胞の割合を観察することで、純度の評価も行った。
（５）総リボ核酸（RNA）抽出
　総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、RNeasy Mini Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
（６）逆転写反応
　相補的DNA（cDNA）の合成は、PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)を使用し、添付マニュアルに従い行った。
（７）Real-Time RT-PCR法
　Real-Time RT-PCRはSYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）を用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（GAPDH）を用いて補正した。
（８）ALB蛍光免疫染色
　免疫染色に用いる細胞はカバーガラス上で培養した。培養後、細胞は4% パラホルムアルデヒドを用いて室温にて10分間固定処理し、-20℃に使用前1時間以上予冷したメタノールを用いて-20℃にて5分間膜透過処理を行い、2% スキムミルクを用いて室温にて20分間ブロッキング処理を行った。その後、一次抗体はマウス抗ヒトALB抗体（abcam; 1:200）を用いて4℃にて一晩、二次抗体はAlexa Fluor 568ヤギ抗マウスIgG抗体（Invitrogen; 1:500）を用いて遮光下室温にて60分間反応させた。核染色は0.2μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を遮光下室温にて5分間処することで行った。
２．結果及び考察
（１）肝細胞特異的な酵素発現
　上述したように、肝細胞には栄養素を代謝・合成するための特異的な酵素が発現している（図１１）。まず、変法L-15培地による選択時期を設定するために、ヒトiPS細胞から分化させた肝細胞でこれらの酵素が発現しているか、発現量は経時的にどのように変化しているかを検討した。分化開始後5日目～12日目及び25日目に細胞を回収し、Real-Time RT-PCR法により各酵素の発現量を解析したところ、ガラクトースをガラクトース1リン酸に変換し、グルコースに代わる糖源として利用するために必要なガラクトキナーゼ1（GALK1）及びフェニルアラニンをチロシンに変換するために必要なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）の発現量は分化10日目にピークが認められた（図１２）。また、分化10日目に向かって酵素発現量が上昇しているため、培地にグルコースに代わる糖源としてガラクトースを添加し、チロシンを添加しない時期は分化10日目以前が適していることが考えられた。また、オルニチンからアルギニンを生成する尿素回路の酵素であるアルギニノコハク酸シンターゼ1（ASS1）及びアルギニノコハク酸リアーゼ（ASL）の発現量には大きな変化は認められなかったものの、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）の発現量は分化10日目にピークが認められた。尿素回路を回転させるためにはOTC、ASS1及びASLの3種類の酵素が揃っている必要があるため、アルギニンを培地に添加しない時期は分化10日目付近が適していることが考えられた。
（２）変法L-15培地による培養時期の検討
　ヒトiPS細胞から肝細胞への分化過程において、肝細胞特異的に存在する栄養素の合成経路に関わる酵素の発現量の経時的変化が明らかとなったため、次に変法L-15培地の培養及び栄養素の添加時期の検討を行った。変法L-15培地の培養時期及び栄養素の添加時期を6群に分け、さらに培地中に添加する血清をFBS群とKSR群に分け、肝細胞への分化を行った。分化後の細胞についてmRNA発現解析を行ったところ、成熟肝細胞マーカーであるALB、成人の主要な薬物代謝酵素であるCYP3A4の発現が認められ、ヒトiPS細胞が肝細胞様細胞へ分化したことが示唆された（図１３）。これらのmRNA発現レベルは、変法L-15培地を用いて分化を行った群で、変法L-15培地を使用しない方法（「標準法」と呼ぶ）と比較して増加が認められた。また、添加時期S2＋FBS群において最も発現量が高く、標準法と比較してALBで約23倍、CYP3A4で約14倍増加した。添加時期S2は分化9日目からガラクトースを添加し、チロシンを添加しない培地に、分化10日目からさらにアルギニンを添加しない培地に変更する条件であり、酵素発現の経時的変化の結果（図１２）と相関が認められた。これらのことから、変法L-15培地及び特定の栄養素を適切な時期に用いることで肝細胞への分化促進または純度の向上に効果的であることが示唆された。さらに、肝細胞への分化には、KSRよりもFBSの方が適していることが明らかとなった。
（３）変法L-15培地中FBS及びガラクトース濃度の検討
　肝細胞はグルコースを細胞外に放出する能力を有している。そのため、変法L-15培地を用いて培養することにより、ガラクトースから合成されたグルコースが培地中に放出され、肝細胞以外に分化した細胞が利用できる可能性がある。また、当研究室で用いているFBS中にはグルコースが約100 mg/100 mL含まれていた。そこで、ヒトiPS細胞由来肝細胞の純度をより高いものにするために、時期S2で変法L-15培地を用い、FBS及びガラクトース濃度の組み合わせについて検討を行った。その結果、先の実験で最も発現量の高かった群（添加時期検討のS2群、今回の実験ではA群）と比較して、F群（FBS 2%、ガラクトース 450 mg/L）もしくはG群（FBS 1%、ガラクトース 900 mg/L）においてALB発現量では差は認められなかったものの、CYP3A4で約3倍のmRNA発現レベルの上昇が認められた（図１４）。一方で、H群（FBS 1%、ガラクトース 450 mg/L）では、CYP3A4のmRNA発現レベルの減少が認められた。これらのことから、FBS及びガラクトース濃度が低すぎると肝細胞の生存にも過酷な環境であり、至適濃度が存在することが示唆された。また、F群もしくはG群において、ALBを免疫蛍光染色した細胞を顕微鏡下で観察したところ、ほぼすべての細胞で陽性像が認められ、ヒトiPS細胞が高純度な肝細胞に分化したことが示唆された（図１５）。また、これらの条件が肝細胞及び線維芽細胞にどのような影響を与えるかを明らかにするために、HFL及びHFLungを用いて6日間の培養を行った。L-15コントロール群と比較して、F群もしくはG群では、肝細胞であるHFLにおいて大きな変化は認められなかったものの、線維芽細胞であるHFLungにおいて顕微鏡下の観察で細胞数の減少が認められた（図１６）。この結果からも、FBS及びガラクトースを適切な濃度の組み合わせで変法L-15培地に添加し培養することにより、ヒトiPS細胞由来肝細胞を高純度で得られることが示唆された。
３．まとめ
　以上の結果より、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化において、変法L-15培地および添加因子を適切な時期に適切な濃度で使用することで、得られるヒトiPS細胞由来肝細胞の純度を向上させることが明らかとなった。今後、より高純度で、かつ成熟した肝細胞をヒトiPS細胞から分化誘導することができれば、医薬品の代謝や毒性試験における評価系として、利用可能になるものと考えられる。
＜バルプロ酸の効果の確認及び作用機序の検討＞
　バルプロ酸の効果の確認と、肝細胞への分化誘導に有効な作用の特定を目指し、以下の検討を行った。
（１）バルプロ酸の効果の検証
　上記＜ヒトiPS細胞から肝細胞への分化に与えるバルプロ酸の影響＞の欄に示した培養方法及び培養条件に従い、ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）を肝細胞に分化誘導した。2 mmol/L バルプロ酸を13日目～20日目（168時間）添加し、分化に与える影響を検討した（図１７）。
　25日間の分化誘導後の細胞についてmRNA解析を行った。その結果、肝細胞マーカーとして特に重要なアルブミンやヒト成人の主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450（CYP）、ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素（UGT）等の発現が確認された（図１８～２０）。また、免疫染色、過ヨウ素酸シッフ染色、インドシアニングリーン染色の結果（図２１）から、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞では分化インドシアニングリーンの取り込み及び排泄が確認でき、肝細胞として機能していることがわかる。
　一方、25日間の分化誘導後の培養液に各種CYPsのプローブ薬物を基質として添加し、生成する代謝物を測定した。その結果、主要な薬物代謝酵素が発現し、機能していることが示された（図２２、図２３）。また、薬物誘導剤に対する応答性を調べたところ、分化誘導後の細胞に良好な応答性を認めた（図２４～２６）。
（２）分化誘導に有効な作用の特定
　バルプロ酸はHDAC阻害作用以外にも様々な作用・活性（γアミノ酪酸アミノ基転移酵素阻害作用、ナトリウムチャネル阻害作用、カルシウムチャネル阻害作用など）を有する。HDAC阻害作用以外の作用が肝細胞への分化を促した可能性を考慮し、各種化合物（γアミノ酪酸アミノ基転移酵素阻害剤、ナトリウムチャネル阻害剤、カルシウムチャネル阻害剤、ナトリウムチャネル・カルシウムチャネル阻害剤）を使用したときの効果を検討した（図１７を参照）。図２７に示すように、バルプロ酸に代えて、γアミノ酪酸アミノ基転移酵素阻害剤、ナトリウムチャネル阻害剤、カルシウムチャネル阻害剤、又はナトリウムチャネル・カルシウムチャネル阻害剤を添加して培養した場合には、肝細胞マーカーであるアルブミンの発現増加は認められなかった。一方、バルプロ酸を使用した場合の培養液をサンプリングし、HDAC活性を調べたところ、バルプロ酸を添加している期間中はHDACが阻害されていた（図２８）。また、バルプロ酸に代えて、HDAC阻害活性を示す各種化合物を添加した場合においても、バルプロ酸と同様に、肝細胞マーカーであるアルブミンの発現増加を認めた（図２９）。以上の結果から、肝細胞への分化には、HDAC阻害作用が有効かつ重要であることがわかる。
＜各種ヒトiPS細胞株の分化誘導＞
　各種ヒトiPS細胞株を用い、本分化誘導法の有効性を検証した。培養方法及び培養条件は、iPS-51：Windy株（#51）を使用した場合と同一とした。尚、検討に使用したiPS細胞は以下の通りである。#11及び#16は国立成育医療研究センターより供与を受けた。
　#11（JCRB1327（細胞番号）、Dotcom（細胞名））
　#16（NIHS0604（細胞番号）、Fetch（細胞名））
　25日間の分化誘導後にmRNA解析を行った。その結果、#11株及び#16株でのアルブミンmRNA発現の増加が認められた。即ち、本分化誘導法の再現性及び汎用性が確認された。
　本願発明によれば、iPS細胞から機能的肝細胞様細胞を簡便且つ効率的に調製できる。肝細胞様肝細胞は、代謝アッセイや毒性アッセイなど、各種アッセイに有用である。また、各種肝疾患治療用の細胞製剤の有効成分として、或いは再生医療の材料としての利用も期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (20)

  1. 　以下の工程（１）及び（２）を含む、人工多能性幹細胞を肝細胞へ分化誘導する方法：
    　（１）人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
    　（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を実施する工程。
  2. 　ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がヒストン脱アセチル化酵素１阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ヒストン脱アセチル化酵素１阻害剤がバルプロ酸である、請求項２に記載の方法。
  4. 　酸化ストレス負荷条件が、培地に過酸化水素、カタラーゼ阻害剤又はフリーラジカル生成剤が添加された条件である、請求項１に記載の方法。
  5. 　ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養の期間は１日間～１３日間である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　工程（２）が、以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法：
    　（２－１）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を肝芽細胞様細胞へと分化させる工程；
    　（２－２）工程（２－１）で得られた肝芽細胞様細胞を肝細胞様細胞へと分化させる工程であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下で少なくとも一部の培養を実施する工程。
  7. 　ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下及び／又は酸化ストレス負荷条件下での培養を、工程（２－２）の開始後１６８時間までに開始し、２４時間～３１２時間、継続する、請求項６に記載の方法。
  8. 　工程（１）における分化誘導因子としてアクチビンAを用い、工程（２－１）における分化誘導因子としてDMSOを用い、工程（２－２）における分化誘導因子として肝細胞増殖因子、オンコスタチンM及びデキサメタゾンを用いる、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　工程（２）の初期と末期を除く培養期間を、糖源としてガラクトースを含有し、チロシン源としてフェニルアラニンを含有する選択培地を用いて培養する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　選択培地による培養期間の開始が、工程（１）の開始時から数えて８日目～１０日目の間であり、
    　選択培地による培養期間の終了が、工程（１）の開始時から数えて１５日目～２０日目の間である、請求項９に記載の方法。
  11. 　選択培地による培養期間が、工程（１）の開始時から数えて９日目～１６日目である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　工程（１）の開始時から数えて１０日目以降は、糖源としてガラクトースを含有し、チロシン源としてフェニルアラニンを含有し、アルギニン源としてオルニチンを含有する選択培地を用いる、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　選択培地による培養期間は、FBSが添加された条件で培養する、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　FBSの添加濃度が1%（v/v）～10%（v/v）である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　選択培地中のガラクトース濃度が450mg/L～900mg/Lである、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法で得られた肝細胞様細胞。
  18. 　請求項１７に記載の肝細胞様細胞を含む、細胞製剤。
  19. 　以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、被検物質の代謝を評価する方法：
    　（ｉ）請求項１７に記載の肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
    　（ｉｉ）被検物質の代謝を測定する工程。
  20. 　以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、被検物質の毒性を評価する方法：
    　（ｉ）請求項１７に記載の肝細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
    　（ｉｉ）工程（ｉ）後の肝細胞様細胞の状態を調べる工程。
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