WO2021261540A1 - 腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用 - Google Patents

腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2021261540A1
WO2021261540A1 PCT/JP2021/023893 JP2021023893W WO2021261540A1 WO 2021261540 A1 WO2021261540 A1 WO 2021261540A1 JP 2021023893 W JP2021023893 W JP 2021023893W WO 2021261540 A1 WO2021261540 A1 WO 2021261540A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
intestinal
cell
intestinal epithelial
stem cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/023893
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
悠貴 今倉
伸治 美馬
泉 小椋
奈穂 山▲崎▼
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2022532526A priority Critical patent/JP7506746B2/ja
Priority to EP21828039.4A priority patent/EP4174170A4/en
Priority to CN202180044315.4A priority patent/CN115768874A/zh
Publication of WO2021261540A1 publication Critical patent/WO2021261540A1/ja
Priority to US18/146,198 priority patent/US20230126568A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing intestinal epithelial cells, which comprises inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the present invention further relates to intestinal epithelial cells, cell sheets, methods for evaluating test substances, screening kits for test substances, and cell preparations.
  • Human induced pluripotent stem (iPS) cells were established by Yamanaka et al. In 2007. These human iPS cells are pluripotent and almost infinite proliferative cells similar to the human embryonic stem (ES) cells established by Thomson et al. In 1998. Human iPS cells have less ethical problems than human ES cells and are expected to be a stable cell source for drug development.
  • iPS Human induced pluripotent stem
  • Patent Document 1 describes artificial pluripotent stem cell-derived intestinal stem cell-like cells as GSK as a culturing method that enables the maintenance and culturing of induced pluripotent stem cell-derived intestinal stem cells while maintaining the properties of the intestinal stem cells. It has been described to culture in the presence of -3 ⁇ inhibitors, histone deacetylation inhibitors, and serum substitutes, or in the presence of GSK-3 ⁇ inhibitors and serum substitutes.
  • Patent Document 2 describes (1) a step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cell-like cells; and (2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cAMP activator.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into intestinal epithelial cells is described, which comprises a step of differentiating the intestinal stem cell-like cells obtained in step (1) into intestinal epithelial cell-like cells.
  • the intestinal epithelial cells induced to differentiate by the method described in Patent Document 2 have the same level of drug-metabolizing active enzyme (CYP3A4) activity as human primary small intestinal cells (living body-derived intestinal epithelial cells).
  • CYP3A4 drug-metabolizing active enzyme
  • the present invention should be solved to provide a method for producing intestinal epithelial cells having a large number of cells per area and having high accuracy of predicting kinetics for a CYP3A4 substrate drug such as midazolam by inducing differentiation of pluripotent stem cells. Make it an issue.
  • Another object of the present invention is to provide an intestinal epithelial cell having a large number of cells per area and a high accuracy of predicting kinetics for a CYP3A4 substrate drug such as midazolam, and a cell sheet containing the intestinal epithelial cell.
  • the present invention is an object to be solved to provide a method for evaluating a test substance, a screening kit for the test substance, and a cell preparation using the above-mentioned intestinal epithelial cells or cell sheets.
  • the present inventors have conducted diligent studies to solve the above problems.
  • the first differentiation step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells the proliferation step of proliferating intestinal stem cells obtained in the differentiation step, and the second differentiation of intestinal stem cells obtained in the proliferation step into intestinal epithelial cells.
  • the proliferation step in the method for producing intestinal epithelial cells including the differentiation step of, by differentiating the intestinal stem cells into intestinal epithelial cells after making them into a specific state, the morphology and cell number of the intestinal epithelial cells after differentiation are improved, and midazolam is used. It was found that the dynamic prediction accuracy for the disease can be improved.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • First differentiation step for differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells Proliferation step to proliferate intestinal stem cells obtained in the differentiation step; and second differentiation step to differentiate intestinal stem cells obtained in the proliferation step into intestinal epithelial cells;
  • a method for producing intestinal epithelial cells, including The breeding process is A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step becomes 30 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more; A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step becomes 2.0 times or more the density immediately after the first differentiation step;
  • the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 90% or more; or the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is the ratio immediately after the first differentiation step.
  • a method for producing intestinal epithelial cells which is one of the above.
  • the proliferation step comprises culturing intestinal stem cells in the presence of a Wnt agonist or a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the proliferation step comprises culturing intestinal stem cells in the presence of a GSK-3 ⁇ inhibitor and a serum substitute.
  • the cell density at the end of the first differentiation step is 5.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 20 ⁇ 10 4 cells / cm 2.
  • the intestinal stem cells obtained in the first differentiation step are seeded in a container so as to have a cell density of 1.1 to 3.3 times, and then the intestinal stem cells are cultured and proliferated.
  • ⁇ 6> The method for producing intestinal epithelial cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the proliferation step is carried out for 1 to 10 days.
  • the proliferation step and the second differentiation step are performed on a culture vessel coated with an extracellular matrix of 3% by volume to 100% by volume.
  • the second differentiation step comprises the step of differentiating intestinal stem cells into intestinal epithelial cells in the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cAMP activator.
  • ⁇ 12> A cell sheet containing the intestinal epithelial cells according to ⁇ 11>.
  • ⁇ 13> A cell sheet containing pluripotent stem cell-derived intestinal epithelial cells in which the proportion of columnar intestinal epithelial cells in the intestinal epithelial cells is 10% or more.
  • the amount of midazolam metabolite after incubation in a medium containing 5 ⁇ mol / L midazolam at 37 ° C. for 2 hours is 300 pmol / cm 2 or more per cell sheet area, according to ⁇ 13> or ⁇ 14>.
  • Cell sheet. ⁇ 16> The cell sheet according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 15>, wherein the CYP3A4 activity per protein mass is 400 to 2500 pmol / 2hr / mg protein.
  • ⁇ 17> The cell sheet according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 16>, wherein the apparent permeability coefficient of midazolam is 40 ⁇ 10 -6 cm / s or less.
  • ⁇ 18> A method for evaluating a test substance, which comprises contacting the test substance with the intestinal epithelial cell according to ⁇ 11> or the cell sheet according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 19> The method for evaluating a test substance according to ⁇ 18>, which comprises correcting an apparent permeability coefficient using a scaling factor.
  • ⁇ 20> The method for evaluating a test substance according to ⁇ 18>, which comprises correcting Fg using a scaling factor.
  • ⁇ 21> The method for evaluating a test substance according to ⁇ 19> or ⁇ 20>, wherein the scaling factor is 0.1 to 500.
  • ⁇ 22> A screening kit for a test substance containing the intestinal epithelial cells according to ⁇ 11> or the cell sheet according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 23> A cell preparation comprising the intestinal epithelial cell according to ⁇ 11> or the cell sheet according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 17>.
  • the present invention it is possible to provide intestinal epithelial cells having a large number of cells per area and having high kinetic prediction accuracy for CYP3A4 substrate agents such as midazolam. According to the intestinal epithelial cell, the cell sheet, the evaluation method of the test substance, and the screening kit of the test substance of the present invention, the dynamics of the test substance can be predicted with high accuracy.
  • FIG. 1 shows an outline of the differentiation culture method of Comparative Example 1 and Examples 1 to 5.
  • FIG. 2 shows a section image of the intestinal epithelial cell of Comparative Example 1.
  • FIG. 3 shows a section image of the intestinal epithelial cell of Example 1.
  • FIG. 4 shows a section image of the intestinal epithelial cells of Example 3.
  • FIG. 5 shows a section image of the intestinal epithelial cells of Example 4.
  • FIG. 6 shows a section image of the intestinal epithelial cells of Example 5.
  • the method for producing intestinal epithelial cells of the present invention is: First differentiation step to differentiate pluripotent stem cells into intestinal stem cells; Proliferation step to proliferate intestinal stem cells obtained in the differentiation step; and second differentiation step to differentiate intestinal stem cells obtained in the proliferation step into intestinal epithelial cells;
  • a method for producing intestinal epithelial cells, including The breeding process is A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step becomes 30 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more; A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step becomes 2.0 times or more the density immediately after the first differentiation step;
  • the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 90% or more; or the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is the ratio immediately after the first differentiation step.
  • the method of the present invention is characterized in that the intestinal stem cells have a high density above a certain level. Increasing cell density by adding Wnt agonists or GSK-3 ⁇ inhibitors to intestinal stem cells is seen to improve the morphology and function of intestinal epithelial cells. On the other hand, when the cell density is insufficient, the cell morphology and the dynamics of the substrate of the metabolic enzyme are not improved. There has been no finding that the morphology of pluripotent stem cells derived from pluripotent stem cells differentiated in a plane can be made into a columnar shape close to that of a living body by making the intestinal stem cells denser than a certain level, and the present invention is advantageous. It has a great effect.
  • pluripotent stem cells are induced to differentiate into the intestinal epithelial cell lineage.
  • cells exhibiting characteristics similar to those of intestinal epithelial cells constituting the intestinal tissue of a living body, that is, intestinal epithelial cells can be obtained.
  • Pluripotent stem cells are the ability to differentiate into all cells that make up a living body (pluripotency) and the ability to produce daughter cells that have the same differentiation ability as self through cell division (self-renewal ability). ) And a cell. Differentiation pluripotency can be evaluated by transplanting the cells to be evaluated into nude mice and testing for the presence or absence of terratomae formation containing each of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm). can.
  • pluripotent stem cells examples include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc., which have both pluripotent differentiation and self-renewal ability. As long as it is a cell, it is not limited to this.
  • ES cells or iPS cells are used. More preferably, iPS cells are used.
  • Pluripotent stem cells are preferably mammalian cells (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), particularly preferably human cells. Therefore, in the most preferred embodiment of the present invention, human iPS cells are used as pluripotent stem cells.
  • ES cells can be established, for example, by culturing an early embryo before implantation, an inner cell mass constituting the early embryo, a single blastomere, etc. (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J.A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)).
  • an early embryo prepared by nuclear transplantation of the nucleus of a somatic cell may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256). (1998)), Akira Iriya et al.
  • fusion ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also included in the embryonic stem cells used in the method of the present invention.
  • ES cells are available from storage institutions or are commercially available.
  • human ES cells can be obtained from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (for example, KhES-1, KhES-2 and KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO and the like.
  • EG cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, SCF, etc. (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9523), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21 (5), 598-609, 2003)).
  • iPS cells are pluripotent (pluripotent) and proliferative cells produced by reprogramming somatic cells by introducing a reprogramming factor or the like. Induced pluripotent stem cells exhibit properties similar to ES cells.
  • the somatic cells used for producing iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. Further, the origin thereof is not particularly limited, but it is preferable to use somatic cells of mammals (for example, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), and particularly preferably human somatic cells.
  • somatic cells derived from adults may be used.
  • somatic cells include (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, and (3) fibroblasts (skin cells, etc.).
  • Epithelial cells Epithelial cells, hepatocytes, lymphocytes (T cells, B cells), endothelial cells, muscle cells, hair cells, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lungs Examples thereof include differentiated cells such as cells, kidney cells, and skin cells.
  • iPS cells can be produced by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that the iPS cell production method to be developed in the future will be applied.
  • the most basic method for producing iPS cells is a method of introducing four transcription factors, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka S). : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007).
  • There is a report of establishment of human iPS cells by introducing four factors, Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007).
  • 3 factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • lentiviruses YuJ, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007
  • adenoviruses Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903).
  • iPS cells that have undergone transformation into iPS cells, that is, reprogramming, express pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Cript. Etc. can be selected as an index.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Cript. Etc. can be selected as an index.
  • the selected cells are collected as iPS cells.
  • the iPS cells can also be provided by, for example, the National University Corporation Kyoto University or the RIKEN BioResource Center.
  • inducing differentiation means working to differentiate along a specific cell lineage.
  • iPS cells are induced to differentiate into intestinal epithelial cells.
  • the method for producing intestinal epithelial cells of the present invention is roughly divided into three steps (first differentiation step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells; proliferation step of proliferating intestinal stem cells obtained in the differentiation step; and proliferation.
  • a second differentiation step for differentiating the intestinal stem cells obtained in the step into intestinal epithelial cells) is included.
  • Step (1-1) Differentiation into intestinal stem cells
  • step (1-2) Differentiation into intestinal stem cells
  • Step (1-1) Differentiation into endoderm-like cells
  • pluripotent stem cells are cultured and differentiated into endoderm-like cells.
  • pluripotent stem cells are cultured under conditions that induce differentiation into endoderm.
  • the culture conditions are not particularly limited. For example, incubate in a medium supplemented with activin A according to a conventional method.
  • the concentration of activin A in the medium is, for example, 10 ng / mL to 200 ng / mL, preferably 20 ng / mL to 150 ng / mL.
  • serum or a serum substitute KnockOut TM Serum Resolution (KSR) or the like
  • the serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum and the like can also be used.
  • the amount of serum or serum substitute added is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • Inhibitors of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway may be added to the medium to promote differentiation into endoderm-like cells.
  • One or more of BMP4, VEGF, and FGF2 may be added to the medium to promote differentiation into endoderm-like cells.
  • This step can also be performed by the method described in International Publication No. 2014/165663 or a method similar thereto.
  • two-step culture is performed as step (1-1).
  • the first stage culture is performed on a medium supplemented with a relatively low concentration of serum (for example, 0.1% (v / v) to 1% (v / v)), and the subsequent second stage culture is performed in the first stage. It is carried out in a medium having a higher serum concentration than that of the culture of (for example, the serum concentration is 1% (v / v) to 10% (v / v)).
  • Adopting such a two-step culture is preferable in that the growth of undifferentiated cells is suppressed by the first-step culture and the differentiated cells are proliferated by the subsequent second-step culture.
  • the period (culture period) of the step (1-1) is, for example, 1 to 10 days, preferably 2 to 7 days.
  • the first-stage culture period is, for example, 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days
  • the second-stage culture period is, for example, 1 day. Up to 6 days, preferably 1 to 4 days.
  • the endoderm-like cells obtained in step (1-1) are cultured and differentiated into intestinal stem cells.
  • endoderm-like cells are cultured under conditions that induce differentiation into intestinal stem cells.
  • the culture conditions are not particularly limited.
  • the culture is carried out in the presence of FGF2 (fibroblast growth factor 2) or in the presence of a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • human FGF2 for example, human recombinant FGF2 is preferably used.
  • the cell population obtained through the step (1-1) or a part thereof is subjected to the step (1-2) without sorting.
  • the step (1-2) may be carried out after selecting endoderm-like cells from the cell population obtained through the step (1-1).
  • the selection of endoderm-like cells may be performed by, for example, a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • FGF2 In the presence of FGF2 is synonymous with the condition that FGF2 is added to the medium. Therefore, in order to carry out the culture in the presence of FGF2, a medium to which FGF2 has been added may be used.
  • An example of the addition concentration of FGF2 is 100 ng / mL to 500 ng / mL.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor in the presence of a GSK-3 ⁇ inhibitor, is synonymous with the condition that the GSK-3 ⁇ inhibitor is added to the medium. Therefore, in order to carry out the culture in the presence of the GSK-3 ⁇ inhibitor, a medium supplemented with FGF2 may be used.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021, SB216763, CHIR98014, TWS119, Tideglusib, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY209314, IM-12, Indirubin. be able to.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor added may be 0.1 nmol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 1 nmol / L to 10 ⁇ mol / L, and more preferably 10 nmol / L to 10 ⁇ mol / L. More preferably, it is 50 nmol / L to 5 ⁇ mol / L.
  • the period (culture period) of the step (1-2) is, for example, 2 to 10 days, preferably 3 to 7 days. If the culture period is too short, the expected effects (increased differentiation efficiency, promotion of acquisition of function as intestinal stem cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is lowered.
  • Differentiation into intestinal stem cells can be determined or evaluated, for example, by using the expression of an intestinal stem cell marker as an index.
  • intestinal stem cell markers are G protein-coupled receptor 5 (LGR5) containing leucine-rich repeat and ephrin B2 receptor (EphB2).
  • the cell density at the end of the first differentiation step may be 5.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 20 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 6.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 16. It is preferably ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and more preferably 7.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 14 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the intestinal stem cells obtained in step (1-2) can also be cryopreserved.
  • the cryopreserved intestinal stem cells may be thawed and the subsequent steps (proliferation step, etc.) may be carried out.
  • a solution generally used for cryopreservation of cultured cells can be used, and a medium, DMSO, serum, general cryopreservation reagents and the like may be contained.
  • general cryopreservation reagents include CryoStor® Freeze Media, CellBanker®, FreSR®-S, NutriFreez® D10 Cryopreservation Medium, Cellvation, Cryoscarless® and Bambanker®. Registered trademark).
  • the breeding process is A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step becomes 30 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more (hereinafter referred to as step a); A step in which the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 2.0 times or more the density immediately after the first differentiation step (hereinafter referred to as step b); A step in which the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 90% or more (hereinafter referred to as step c); or the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is first.
  • a step (hereinafter referred to as step d) that is more than three times as high as the ratio immediately after the differentiation step of. It is one of.
  • the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 30 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, preferably 32 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, and more preferably 40 ⁇ 10 It will be 4 cells / cm 2 or more, and particularly preferably 45 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more.
  • the density of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 2.0 times or more, preferably 2.5 times or more, more than the density immediately after the first differentiation step. It is preferably 3.0 times or more, more preferably 3.5 times or more, and particularly preferably 4.0 times or more.
  • the EdU-positive ratio of the intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 100%. Become.
  • the EdU-positive ratio of intestinal stem cells obtained in the first differentiation step is 3 times or more, preferably 3.2 times or more, more than the ratio immediately after the first differentiation step. It is preferably 3.5 times or more.
  • the intestinal stem cells obtained in the first differentiation step are preferably 1.1 to 3.3 times, more preferably 1.
  • intestinal stem cells are cultured and proliferated. Can be made to.
  • the intestinal stem cells can be cultured in the presence of a Wnt agonist or GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • Wnt agonist include the Wnt family such as Wnt3a and the R-spondin family such as R-spondin1.
  • the concentration of the Wnt agonist added is 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 100 ng / mL to 1 ⁇ g / mL, and more preferably 100 ng / mL to 500 ng / mL.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors examples include CHIR99021, SB216763, CHIR98014, TWS119, Tideglusib, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY209314, IM-12, Indirubin can.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor added is 0.1 nmol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 1 nmol / L to 10 ⁇ mol / L, more preferably 10 nmol / L to 10 ⁇ mol / L, and even more preferably.
  • concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor added may be 1.0 ⁇ mol / L to 3.0 ⁇ mol / L, and within the above concentration range, the cell performance (barrier function, etc.) tends to be reproducibly stable.
  • intestinal stem cells are preferably cultured in the presence of GSK-3 ⁇ inhibitors, histone deacetylation inhibitors, and serum substitutes, or in the presence of GSK-3 ⁇ inhibitors and serum substitutes. can.
  • Valproic acid, vorinostat, tricostatin A, tubastatin A, gibinostat, and placenostat can be exemplified as histone deacetylase inhibitors.
  • the serum substitute is a composition used as a substitute for serum containing a differentiation-inducing factor in order to culture iPS cells, ES cells and the like while maintaining their undifferentiated state.
  • a knockout serum replenishment KSR
  • concentration of the histone deacetylase added in the case of valproic acid
  • concentration of the histone deacetylase added is 0.1 mmol / L to 10 mmol / L, preferably 0.5 mmol / L to 3 mmol / L, and the concentration of the serum substitute is added.
  • KSR it is 5% (v / v) to 20% (v / v), preferably 5% (v / v) to 10% (v / v).
  • the proliferation steps are preferably epidermal growth factor (EGF), TGF ⁇ receptor inhibitor (A8301 etc.), ROCK inhibitor (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase) (Y-27632 etc.), and This can be done under conditions in which one or more compounds selected from the group consisting of fibroblast growth factor (such as FGF2) are further present.
  • the concentration of EGF in the medium in the growth step is, for example, 1.0 ng / mL to 1 mg / mL, preferably 10 ng / mL to 300 ng / mL, and more preferably 30 ng / mL to 300 ng / mL.
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor is, for example, 10 ng / mL to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.1 ⁇ mol / L to 1.0 ⁇ mol / L.
  • the concentration of the ROCK inhibitor is, for example, 0.1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • the concentration of FGF2 is, for example, 1.0 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 100 ng / mL.
  • the culture period of the growth step is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 days, more preferably 1 to 5 days, still more preferably 2 to 4 days, and for example, 3 days. ..
  • the second differentiation step is a step of differentiating intestinal stem cells into intestinal epithelial cells.
  • the second differentiation step preferably comprises the step of differentiating intestinal stem cells into intestinal epithelial cells in the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cAMP activator.
  • the intracellular cAMP level can be positively increased.
  • “In the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cAMP activator” means one or more cultures constituting the second differentiation step. It means that all compounds are required, that is, it is required that all these compounds are used at the same time, that is, that culture using a medium to which all these compounds are added is performed as an essential condition. is not it.
  • the cell population obtained in the first differentiation step or a part thereof is subjected to the second differentiation step without sorting.
  • intestinal stem cells may be selected from the cell population obtained in the first differentiation step, and then the second differentiation step may be carried out. Selection of intestinal stem cells may be performed, for example, with a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • the second differentiation step is composed of one or more cultures (details will be described later).
  • a medium to which EGF and cAMP activator are added as essential components for example, a medium to which EGF and cAMP activator are added as essential components, MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF are essential.
  • MEK1 inhibitor for example, MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF are essential.
  • MEK1 inhibitor DNA methylation inhibitor
  • TGF ⁇ receptor inhibitor a medium to which EGF and cAMP activator are added as essential components
  • MEK1 inhibitor DNA methylation inhibitor
  • TGF ⁇ receptor inhibitor for example, a medium to which EGF and cAMP activator are added as essential components, MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF are essential.
  • MEK1 inhibitor for example, a medium to which EGF and cAMP activator are added as essential components, MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF
  • Examples of the MEK1 inhibitor include PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEKinhibitorI, MEKinhibitorII, MEK1 / 2inhibitorII, and SL327.
  • DNA methylation inhibitors can include 5-aza-2'-deoxycytidine, 5-azacitidine, RG108, and zebularine.
  • TGF ⁇ receptor inhibitor considering that A8301 used in the examples described later exhibits inhibitory activity on TGF- ⁇ receptors ALK4, ALK5 and ALK7, TGF- ⁇ receptors ALK4, ALK5, are preferable. Those exhibiting inhibitory activity against one or more of ALK7 may be used.
  • A8301, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5 inhibitor, LY2157299, LY364497, GW788388, and RepSox satisfy the above conditions.
  • As the cAMP activating substance forskolin, indomethacin, NKH477 (cholhorsin daropert), cell-derived toxin protein (pertussis toxin, cholera toxin), PACAP-27, PACAP-38, SKF83822 and the like can be used.
  • Forskolin exhibits adenylate cyclase activating activity and promotes the synthesis of intracellular cAMP.
  • concentration of the MEK1 inhibitor added is 4 ⁇ mol / L to 100 ⁇ mol / L, preferably 10 to 40 ⁇ mol / L.
  • concentration of the DNA methylation inhibitor in the case of 5-aza-2'-deoxycytidine
  • concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor added in the case of A8301 is 0.1 ⁇ mol / L to 2.5 ⁇ mol / L, preferably 0.2 ⁇ mol / L to 1 ⁇ mol / L.
  • An example of the concentration of EGF added is 5 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 50 ng / mL.
  • An example of the concentration of the cAMP activating substance added is 1 ⁇ mol / L to 200 ⁇ mol / L, preferably 5 ⁇ mol / L to 100 ⁇ mol / L.
  • the added concentration when a compound different from the exemplified compounds, that is, PD98059, 5-aza-2'-deoxycytidine, A8301 and forskolin is used, the characteristics of the compound used and the exemplified compound (PD98059) are used.
  • step (2) is a condition in which cAMP is supplied to cells (referred to as "additional condition 1"), a condition in which a cAMP degrading enzyme inhibitor is present (referred to as “additional condition 2”), or these. It may be performed under any of the conditions of.
  • the additional condition 1 condition in which cAMP is supplied to cells
  • the additional condition 1 is synonymous with the condition in which a compound that can be taken up into cells and acts as cAMP when taken up into cells exists. Therefore, in order to satisfy the additional condition 1, for example, a medium to which a cAMP derivative that can be taken up into cells may be added may be used.
  • the additional condition 1 When the additional condition 1 is adopted, it can be expected that the decrease in the intracellular cAMP concentration is suppressed, and the induction of differentiation into the intestinal epithelium, particularly the acquisition of the function as an intestinal epithelial cell, is promoted. That is, the above conditions may allow the preparation of more functional intestinal epithelial cells.
  • a PKA activator for example, 8-Br-cAMP (8-Bromoadenosine-3', 5'-cyclic monophosphate solidium salt, CASNumer: 76939-46-3), 6-Bnz-cAMP (N6-Ben) 3', 5'-cyclic monophosphate solid salt, CASNumber: 1135306-29-4
  • cAMPS-Rp ((R) -Adenosine, cyclic 3', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 5', 09-1
  • cAMPS-Sp ((S) -Adenosine, cyclic3', 5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylaminosalt, CASNumber: 93602-66-5)
  • CyclicAdenosine6- ', 5'-cyclic adenosine sodium salt salt for example, 8-B
  • Epac activator Rp-8-Br-cAMPS (8-Bromoadenosine 3', 5'-cyclic Monophosphothioate, Rp-Isomer.sodium salt, CASNumber: 129735-00-8), 8-C -(4-Cyclic adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, CASNumber: 93882-12-3), 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (8- (4-Cyclic adenosine) -2'- O-methyladenosine 3', 5'-cyclic monophosphate monosodium, CASNumber: 634207-53-7), etc.) can be adopted.
  • An example of the addition concentration of the cAMP derivative (in the case of 8-Br-cAMP) is shown.
  • the addition concentration when using the exemplified compound that is, a compound different from 8-Br-cAMP
  • those skilled in the art can set the concentration according to the above concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later.
  • Additional condition 2 (condition in which the cAMP degrading enzyme inhibitor is present) is synonymous with the condition in which the cAMP degrading enzyme inhibitor is added to the medium.
  • the additional condition 2 it can be expected that the decrease in the intracellular cAMP concentration is suppressed by the inhibition of the degradation of cAMP, and the induction of differentiation into the intestinal epithelium, particularly the acquisition of the function as the intestinal epithelial cell is promoted. That is, the above conditions may allow the preparation of more functional intestinal epithelial cells.
  • the additional condition 1 and the additional condition 2 are used in combination, it is possible to suppress a decrease in the intracellular cAMP concentration while supplying cAMP to the cells. Therefore, it can be expected that it will be an effective condition for maintaining the intracellular cAMP at a high level, and that efficient induction of differentiation into intestinal epithelial cells will be promoted.
  • IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) (MIX), Theophylline, Papaverine, Pentoxifylline (Tental), KS-505, 8-Metoxymethyle, IX, 8-Metoxymethyl-IX.
  • Sulmazol (AR-L115BS) can be exemplified.
  • An example (in the case of IBMX) of the addition concentration of the cAMP degrading enzyme inhibitor is shown, 0.05 mmol / L to 5 mmol / L, preferably 0.1 mmol / L to 3 mmol / L, and more preferably 0.2 mmol / L to. It is 1 mmol / L.
  • the addition concentration when a compound different from the exemplified compound that is, a compound different from IBMX is used
  • the difference between the characteristics of the compound used and the characteristic of the exemplified compound (IBMX) (particularly the difference in activity) can be taken into consideration.
  • Those skilled in the art can set according to the above concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later.
  • the period (culture period) of the second differentiation step is, for example, 7 to 40 days, preferably 10 to 30 days. If the culture period is too short, the expected effects (increased differentiation efficiency, promotion of acquisition of function as intestinal epithelial cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, it causes a decrease in differentiation efficiency.
  • Differentiation into intestinal epithelial cells can be determined or evaluated by, for example, expression of intestinal epithelial cell markers, uptake of peptides, or induction of expression of drug-metabolizing enzymes via vitamin D receptors.
  • intestinal epithelial cell markers include ATP-binding cassette transporter B1 / multidrug-resistant protein 1 (ABCB1 / MDR1), ATP-binding cassette transporter G2 / breast cancer-resistant protein (ABCG2 / BCRP), and cytochrome P450 3A4 (CYP3A4).
  • Fatty-binding protein 2 Fatty-binding protein 2 (FABP), Pregnane X receptor (PXR), SLC (solute carrier) family member 5A1 / sodium-conjugated glucose transporter 1 (SLC5A1 / SGLT1), SLC (solute carrier) family member 15A1 / peptide trans Porter 1 (SLC15A1 / PEPT1), SLC (solutecarrier) organic anion transporter 2B1 (SLCO2B1 / OATP2B1), scrase-isomartase, uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1), uridine diphosphate-glucuronic acid Transferases 1A4 (UGT1A4), Billin 1 (Villin 1), and carboxyl esterase 2A1 (CES2A1).
  • Fatty-binding protein 2 Fatty-binding protein 2
  • PXR Pregnane X receptor
  • SLC solute carrier family member 5
  • sucrase-isomaltase which is highly specific for the intestinal epithelium, and billin 1, CYP3A4, which is a major drug-metabolizing enzyme in the small intestine
  • SLC15A1 / PEPT1 which is involved in the absorption of peptides in the small intestine, and the apical membrane side of the small intestine.
  • SLC5A1 / SGLT1 which is a glucose transporter expressed in the small intestine
  • SLCO2B1 / OATP2B1 which is involved in the absorption of organic anions in the small intestine
  • CES2A1 which is a hydrolyzed enzyme highly expressed in the small intestine are particularly effective markers.
  • the cell population after culturing may be selected and sorted.
  • any of the following culture steps A to D is performed.
  • ⁇ Culture step A> In the culture step A, (a-1) culture in the presence of EGF and intracellular cAMP synthesis promoter, and (a-2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, and TGF ⁇ acceptance performed after the above culture. Incubate in the presence of body inhibitors and EGF.
  • the culture period of (a-1) is, for example, 2 to 10 days, preferably 4 to 8 days
  • the culture period of (a-2) is, for example, 7 to 29 days, preferably 9 to 27 days. It's a day.
  • the culture of (a-1) is a condition in which cAMP is supplied to cells (referred to as "additional condition 1") and a condition in which a cAMP degrading enzyme inhibitor is present (referred to as “additional condition 2”), or any of these. It may be done under the condition of. The same applies to the culture of (a-2).
  • additional condition 1 a condition in which cAMP is supplied to cells
  • additional condition 2 a condition in which a cAMP degrading enzyme inhibitor is present
  • ⁇ Culture step B> In the culture step B, (b-1) culture in the presence of EGF and (b-2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cells performed after the above culture. Culturing is performed in the presence of an internal cAMP synthesis promoter. By performing the two-step culture in this way, the effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturation, and acquisition of functions can be expected.
  • the culture period of (b-1) is, for example, 2 to 10 days, preferably 4 to 8 days
  • the culture period of (b-2) is, for example, 7 to 19 days, preferably 9 to 17 days. It's a day.
  • culturing (b-2) After culturing (b-2), culturing in the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culture of (b-3)) may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 to 10 days.
  • This culture can be expected to have the effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturing, and acquiring functions.
  • ⁇ Culture step C> In the culture step C, (c-1) culture in the presence of EGF and intracellular cAMP synthesis promoter, and (c-2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, and TGF ⁇ acceptance performed after the above culture. Incubate in the presence of body inhibitors, EGF and intracellular cAMP synthesis promoters. By performing the two-step culture in this way, the effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturation, and acquisition of functions can be expected.
  • the culture period of (c-1) is, for example, 2 to 10 days, preferably 4 to 8 days
  • the culture period of (c-2) is, for example, 7 to 19 days, preferably 9 to 17 days. It's a day.
  • culturing (c-2) After culturing (c-2), culturing in the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culture of (c-3)) may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 to 10 days.
  • This culture can be expected to have the effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturing, and acquiring functions.
  • ⁇ Culture step D> culture is performed in the presence of (d-1) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and intracellular cAMP synthesis promoter.
  • This culturing step is particularly advantageous in that the culturing operation is simple, it is more effective for differentiation into intestinal epithelial cells, and since it is a compound, stable effects can be expected.
  • the culture period of (d-1) is, for example, 15 to 25 days, preferably 17 to 23 days.
  • culturing (d-1) After culturing (d-1), culturing in the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culture of (d-2)) may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 to 10 days.
  • This culture can be expected to have the effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturing, and acquiring functions.
  • subculture may be carried out in the middle.
  • the cells become confluent or subconfluent, a part of the cells is collected and transferred to another culture vessel, and the culture is continued. It is preferable to set the cell density low in order to promote differentiation.
  • cells may be seeded at a cell density of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2.
  • ROCK inhibitor Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase
  • Other culture conditions (culture temperature, etc.) in each step constituting the present invention may be conditions generally adopted in the culture of animal cells. That is, for example, the cells may be cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2.
  • the basic medium Iskov modified Dulbecco medium (IMDM) (GIBCO, etc.), Ham F12 medium (HamF12) (SIGMA, Gibco, etc.), Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM) (Nakalitesk Co., Ltd., etc.) Sigma, Gibco, etc.), Grasgo basic medium (Gibco, etc.), RPMI1640 medium, etc. can be used. Two or more kinds of basal media may be used in combination.
  • a basal medium suitable for culturing epithelial cells for example, D-MEM and ham F12. It is preferable to use a mixed medium (D-MEM).
  • D-MEM mixed medium
  • components that can be added to the medium include bovine serum albumin (BSA), antibiotics, 2-mercaptoethanol, PVA, non-essential amino acids (NEAA), insulin, transferrin, and selenium.
  • BSA bovine serum albumin
  • NEAA non-essential amino acids
  • insulin transferrin
  • selenium selenium
  • cells are two-dimensionally cultured using a culture dish or the like.
  • intestinal epithelial cell-like cells can be obtained from pluripotent stem cells by two-dimensional culture.
  • three-dimensional culture may be carried out using a gel-like culture substrate, a three-dimensional culture plate, or the like.
  • the proliferation step and the second differentiation step can be performed on a culture vessel coated with 3% -100% extracellular matrix.
  • the proliferation step and the second differentiation step can be performed in a medium supplemented with 1% by volume to 10% by volume extracellular matrix.
  • the proliferation step and the second differentiation step may be performed in a medium in which 1% by volume to 10% by volume of extracellular matrix is added only to the bassolateral side of the cells.
  • extracellular matrix examples include matrigel®, fibronectin, laminin, vitronectin, tenascin, entactin, thrombospontin, elastin, gelatin, collagen, fibrin, merosin, ancholine, chondronectin, link protein, bone sialoprotein, osteocalcin.
  • Osteopontin, Epinectin, Hyalronectin, Anjurin, Epirigulin and Carinine can be used, preferably Matrigel®.
  • Matrigel® is a trade name for a gelatinous protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells produced by Corning Life Sciences.
  • an intestinal epithelial cell produced by the method of the present invention described above, and a cell sheet containing the intestinal epithelial cell are provided.
  • the proportion of columnar intestinal epithelial cells in the intestinal epithelial cells is 10% or more, preferably 15% or more, more preferably 20% or more. Is.
  • the proportion of columnar intestinal epithelial cells in the intestinal epithelial cells may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100%.
  • the columnar intestinal epithelial cell means an intestinal epithelial cell in which the longest diameter of the cell is three times or more the longest diameter of the nucleus.
  • the cell density is preferably 50 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, preferably 60 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, and more preferably 65 ⁇ 10 4 cells / cm 2.
  • the above is more preferably 70 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more.
  • the cell density may be 75 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more, or 80 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more.
  • the cell sheet, midazolam metabolite per area preferably 300 pmol / cm 2 or more, more preferably 360 pmoles / cm 2 or more, further preferably 420pmol / cm 2 or more.
  • the amount of midazolam metabolite per area of the cell sheet may be 450 pmol or more, 540 pmol or more, 600 pmol or more, or 630 pmol or more.
  • the amount of midazolam metabolite per cell sheet area is the amount of midazolam metabolite after incubation in a medium containing 5 ⁇ mol / L midazolam at 37 ° C. for 2 hours.
  • the CYP3A4 activity per protein mass of the cell sheet is preferably 400-2500 pmol / 2 hr / mg protein, more preferably 500-2000 pmol / 2 hr / mg proteinin.
  • the CYP3A4 activity per protein mass may be 700-2000 pmol / 2hr / mg proteinin, 1000-2000 pmol / 2hr / mg proteinin, or 1000-1500 pmol / 2hr / mg proteinin.
  • the CYP3A4 activity per protein mass is obtained by adding a medium containing a substrate (midazolam), quantifying the amount of metabolite (1'-hydroxymidazolam) in the supernatant recovered after a certain period of time, and dividing by the protein mass. You can ask. The amount of metabolites in the supernatant can be measured using liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS) or the like.
  • the apparent permeability coefficient can be used as an index for predicting pharmacokinetics.
  • the apparent permeability coefficient of midazolam on the cell sheet is preferably 40 ⁇ 10-6 cm / s or less, more preferably 38 ⁇ 10-6 cm / s or less, and even more preferably 35 ⁇ 10-6 cm / s. It is s or less, and particularly preferably 33 ⁇ 10 -6 cm / s or less.
  • the apparent permeability coefficient of midazolam can be determined by adding midazolam to the apical side of the cell and quantifying the amount of midazolam that has permeated to the bassolateral side after a certain period of time.
  • the amount of midazolam that has permeated can be measured using a liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS) or the like.
  • the apparent permeability coefficient of midazolam determined in vitro using living small intestinal tissue is 5 ⁇ 10 -6 cm / s (AL. Ungel et al., Eur. J. Phrm. Sci. 48, 166 (2013)). ).
  • the present invention relates to the use of intestinal epithelial cells or cell sheets produced by the method of the present invention.
  • the first use includes a method for evaluating a test substance (screening method), which comprises contacting the test substance with the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention, and the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention.
  • a screening kit for the test substance is provided.
  • the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention can be used for a model system of the intestinal tract, especially the small intestine, and is useful for evaluation of pharmacokinetics (absorption, metabolism, etc.), toxicity, and response of the small intestine. Is.
  • the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention can be used for evaluation of pharmacokinetics of a test substance, evaluation of toxicity, and evaluation of response to a test substance.
  • the intestinal epithelial cells or cell sheets of the present invention are used to test the absorbability or membrane permeability of the test substance, drug interaction, induction of drug-metabolizing enzymes, induction of drug transporters, toxicity, immune response, and the like. can do. That is, the present invention is one of the uses of intestinal epithelial cells or cell sheets, such as absorbability or membrane permeability of a test substance, drug interaction, induction of drug-metabolizing enzyme, induction of drug transporter, toxicity, immune response, etc. (1st aspect) is provided.
  • a step of preparing a cell layer composed of intestinal epithelial cell-like cells obtained by the method for inducing differentiation of the present invention and (ii) a step of contacting the test substance with the cell layer, (ii).
  • the absorbability of the test substance can also be evaluated by the method described later (second aspect).
  • intestinal epithelial cell-like cells are typically cultured on a semi-permeable membrane (porous membrane) to form a cell layer.
  • a semi-permeable membrane porous membrane
  • the intestinal tract is formed.
  • the "contact” in step (ii) is typically performed by adding the test substance to the medium.
  • the timing of addition of the test substance is not particularly limited. Therefore, after starting the culture in a medium containing no test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or the culture may be started in a medium containing the test substance in advance.
  • Organic compounds or inorganic compounds of various molecular sizes can be used as the test substance, and bacteria (intestinal bacteria, lactic acid bacteria, etc.), viruses, and cells (immune cells, fibroblasts) can also be used.
  • examples of organic compounds are nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosyl glycerides, celebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1,). B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) can be exemplified.
  • the candidate component is also one of the preferable test substances.
  • a plant extract, a cell extract, a culture supernatant and the like may be used as the test substance.
  • the test substances are interspersed with each other. Interactions, synergies, etc. may be investigated.
  • the test substance may be derived from a natural product or synthetically. In the latter case, for example, a method of combinatorial synthesis may be used for efficiency. It is possible to construct a steroidal assay system.
  • the period of contact with the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the contact may be divided into a plurality of times.
  • the test substance that has permeated the cell layer is quantified.
  • a culture vessel equipped with a cell culture insert such as Transwell® was used, the test substance permeated the cell culture insert, ie, moved into the upper or lower vessel through the cell layer.
  • the test substance is quantified by a measurement method such as mass analysis, liquid chromatography, immunological method (for example, fluorescent immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) depending on the test substance.
  • FIA method fluorescent immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • Absorption or membrane permeability of the test substance, drug interaction, drug metabolizing enzyme based on the quantitative result (amount of the test substance that has permeated the cell layer) and the amount of the test substance used (typically the amount added to the medium).
  • Induction, drug transporter induction, toxicity, or immune response is determined and evaluated.
  • the present invention also provides, as another aspect (second aspect), a method for evaluating metabolism or absorption of a test substance.
  • a method for evaluating metabolism or absorption of a test substance In the above method, (I) the step of contacting the test substance with the intestinal epithelial cell-like cell obtained by the differentiation induction method of the present invention, and (II) metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug-metabolizing enzyme. , To measure and evaluate the induction, toxicity, or immune response of drug transporters.
  • Step (I) that is, contact between the intestinal epithelial cell-like cells and the test substance can be carried out in the same manner as in the above step (ii). However, it is not essential to form a cell layer in advance.
  • step (I) the metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug-metabolizing enzyme, induction of drug transporter, toxicity, or immune response is measured and evaluated (step (II)).
  • step (I) that is, after contact with the test substance, metabolism or the like can be measured and evaluated without a substantial time interval, or a certain time (for example, 10 minutes to 5 hours) has elapsed. After that, metabolism and the like may be measured and evaluated. Measurement of metabolism can be performed, for example, by detection of metabolites. In this case, the expected metabolites are usually measured qualitatively or quantitatively using the culture solution after step (I) as a sample.
  • An appropriate measurement method may be selected according to the metabolite, and for example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological method (for example, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) ) Etc. can be adopted.
  • FIA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • a metabolite of the test substance when a metabolite of the test substance is detected, it is determined or evaluated that the test substance has been metabolized.
  • the amount of metabolism of the test substance can be evaluated according to the amount of metabolite.
  • the metabolic efficiency of the test substance may be calculated based on the detection result of the metabolite and the amount of the test substance used (typically, the amount added to the medium).
  • the test substance is based on the expression of drug-metabolizing enzymes (cytochrome P450 (particularly CYP3A4), uridine diphosphate-glucuronosyltransferase (particularly UGT1A8, UGT1A10), and sulfate transfer enzymes (particularly SULT1A3)) in intestinal epithelial cell-like cells. It is also possible to measure metabolism. Expression of drug-metabolizing enzymes can be assessed at the mRNA or protein level. For example, when an increase in the mRNA level of a drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that the test substance has been metabolized. Similarly, when an increase in the activity of a drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that the test substance has been metabolized. Similar to the case of determination using a metabolite as an index, quantitative determination / evaluation may be performed based on the expression level of the drug-metabolizing enzyme.
  • drug-metabolizing enzymes cytochrome P450 (particularly CYP3A4), ur
  • the residual amount of the test substance in the culture solution is measured.
  • the test substance is quantified using the culture solution after step (I) as a sample.
  • An appropriate measurement method may be selected according to the test substance. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological methods (for example, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) and the like can be adopted.
  • FFA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • the absorption amount or absorption efficiency of the test substance can be determined and evaluated according to the degree of decrease. Absorption can also be evaluated by measuring the amount of the test substance taken up into the cells.
  • the measurement / evaluation of metabolism and the measurement / evaluation of absorption may be performed simultaneously or in parallel.
  • metabolic enzymes include cytochrome P450 (CYP).
  • cytochrome P450 examples include CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4.
  • examples of the metabolic enzyme include carboxylesterase (CES), UDP-glucuronosyltransferase (UGT), sulfate transferase (SULT), and Sucase-Isomaltase.
  • carboxylesterase (CES) include CES1 and CES2.
  • UDP-glucuronosyltransferase examples include UGT1A1, UGT1A6, UGT1A7, UGT2B7, and UGT2B11.
  • SULT sulfotransferase
  • the scaling factor is a constant obtained by focusing on the morphology (cell morphology / tissue structure) and function (metabolic enzyme activity / transporter activity) of the living small intestine.
  • the scaling factor can be multiplied by various parameters obtained by permeating and metabolizing the test substance into the cell or cell sheet of the present invention.
  • the following five types of parameters can be mentioned. 1) The amount of the test substance and its metabolites in the test solution (apical side / basolateral side), in cells, and on the insert membrane. 2) Time change in 1). 3) All parameters obtained by calculation from 1) and 2). For example, apparent permeability coefficient, permeation clearance, metabolic clearance, Efflux ratio. 4) Amount of change in 1) 2) 3) when a drug that inhibits or induces metabolism or absorption is added. 5) Parameters obtained by calculating from 1) 2) 3) 4) obtained by conducting independent tests on two or more drugs. As an example of the present invention, the apparent transmission coefficient can be corrected by using a scaling factor.
  • the apparent transmission coefficient can be corrected by the following equation.
  • Permeation amount per unit time (Basic B60-xx certain parameter) / Permeation time
  • the parameters shown in 1) 2) 3) 4) 5) above can be used, for example, the amount of metabolites. Parameters such as the difference in "base B60" depending on the presence or absence of the addition of a metabolism inhibitor can be mentioned.
  • the parameter shown in 2) above the parameter obtained by multiplying the time change in 1) by time can be used. From the above, by correcting the apparent permeability coefficient, it is possible to improve the prediction accuracy of Fa ⁇ Fg or Fg in the living small intestine.
  • Fa is the absorption rate in the intestinal tract, and for example, Fa in the living small intestine of midazolam is considered to be 1.0.
  • Fg is the metabolic avoidance rate in the intestinal tract. For example, Fg in the living small intestine of midazolam is 0.369 to 0. It is believed to be 5 (Pharm Res. 2012 Mar; 29 (3): 651).
  • Fg (group B60 + group cell60) / (group B60 + group cell60 + total 60) ... (Equation 1)
  • Group B60 60 minutes after the substrate test substance was added to the A side
  • the group mass group permeated to the B side cell60 60 minutes after the substrate test substance was added to the A side, the cells were intracellular.
  • Total accumulated base mass cost 60 As an example of the total parameter of the amount of metabolites accumulated in the A side, B side, and cells 60 minutes after the addition of the test substance as the substrate to the A side, in the formula of Fg. "Total 60" can be mentioned.
  • Fg 431 / (431 + 91 ⁇ x) x: Scaling factor Can be.
  • x can be 0.1 to 500, preferably 1.2 to 30.
  • the scaling factor can be used to correct Fg.
  • a second use of the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention provides a cell preparation containing the intestinal epithelial cell or cell sheet.
  • the cell preparation of the present invention can be applied to the treatment of various intestinal diseases. In particular, it is expected to be used as a material for regeneration / reconstruction of impaired (including dysfunctional) intestinal epithelial tissue. That is, it can be expected to contribute to regenerative medicine.
  • the cell preparation of the present invention is, for example, suspending the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention in a physiological saline solution, a buffer solution (for example, a phosphate-based buffer solution), or a three-dimensional tissue using the above cells. It can be prepared by making (organoids and spheroids).
  • 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 10 cells may be contained as a single dose so that a therapeutically effective amount of cells can be administered.
  • the cell content can be appropriately adjusted in consideration of the purpose of use, the target disease, the sex of the target (recipient), age, body weight, the condition of the affected area, the condition of the cells, and the like.
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • serum albumin for the purpose of protecting cells, antibiotics, etc. for the purpose of preventing bacterial contamination
  • various components for the purpose of activating, proliferating, or inducing differentiation of cells.
  • Cytokines, growth factors, steroids, etc. may be contained in the cell preparation of the present invention.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, saline, etc. It may be contained in the cell preparation of the present invention.
  • a third use of the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention includes culturing microorganisms (bacteria, fungi, viruses, etc.) or parasites using the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention.
  • microorganisms bacteria, fungi, viruses, etc.
  • parasites using the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention.
  • the infectivity of the microorganism or the parasite to the intestinal epithelial cell can be analyzed.
  • the maintenance or proliferation ability of microorganisms or parasites can be confirmed.
  • microorganisms or parasites that proliferate repeatedly can be obtained.
  • the infected state of pathogenic microorganisms can be reproduced and used for screening of therapeutic agents, and the effects of substances produced by microorganisms or parasites on intestinal cells can be reproduced to screen for substances useful or harmful to the living small intestine. It can be performed.
  • microorganisms or parasites include Escherichia coli, lactic acid bacteria, bifidus bacteria, enteritis vibrio bacteria, salmonella bacteria, various enterobacteria, influenza virus, rotavirus, adenovirus, astrovirus, Sapporo virus, norovirus, HIV, coronavirus, etc. However, it is not limited to these.
  • a fourth use of the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention includes a co-culture model using the intestinal epithelial cell or cell sheet of the present invention.
  • the structure of living tissue can be reproduced and the interaction with other cells can be analyzed.
  • the pathological condition of the disease can be reproduced and the therapeutic agent can be screened.
  • the cells to be co-cultured are cell types existing in the living body of primates or rodents, and cells existing around the small intestine are particularly preferable. Examples include, but are not limited to, hepatocytes, pancreas, vascular endothelial cells, immune cells, nerves, fibroblasts, muscle cells, stromal cells, and the like.
  • the cells to be co-cultured may be primate or rodent-derived cell lines. Examples thereof include, but are not limited to, immortalized cell lines such as Hela cells and THP-1 cells, pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, and cells differentiated from these.
  • test substance that can be tested in the co-culture model
  • organic compounds or inorganic compounds of various molecular sizes can be used.
  • Existing or candidate ingredients such as pharmaceuticals and nutritional foods are also preferred test substances.
  • a plant extract, a cell extract, a culture supernatant, or the like may be used as a test substance. Moreover, you may use these two or more types in combination.
  • IPS cells FF-1 strain donated by Fujifilm Cellular Dynamics
  • Human iPS cells prepared from human fibroblasts by the method described in Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007 were used in Matrigel (strain). It was seeded on a coated 6-well plate or 100 mm dish and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator under 5% O 2 conditions.
  • Subculture of human iPS cells (FF-1 strain) was carried out at a split ratio of 1: 3 to 1:10 after culturing for 3 to 5 days. The medium was not changed for 48 hours after the passage, and every day thereafter.
  • FIG. 1 shows an outline of the differentiation culture methods of Comparative Example 1 and Examples 1 to 5.
  • Comparative Example 1 A total of human iPS cells (FF-1 strain) cultured in the presence of Activin A and cultured in the presence of BMP4, VEGF, FGF2 and EGF according to the method described in International Publication No. 2014/165663. Incubate for 7 days (7th to 7th days), and further incubate for 4 days (7th to 11th days) in DMEM / F12 containing 2% FBS, 1% Glutamax, 250ng / mL FGF2. , Induced differentiation into intestinal stem cells. Then, Y-27632 (Rho-binding kinase inhibitor) was added so as to be 10 ⁇ mol / L, and the cells treated at 37 ° C.
  • Y-27632 Rho-binding kinase inhibitor
  • the semipermeable membrane on the coated cell culture insert (Falcon, # 353495) was seeded at a cell density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2.
  • Example 1 Human iPS cells (FF-1 strain) were cultured for 11 days under the same conditions as in Comparative Example 1 to induce differentiation into intestinal stem cells. Then, the cells were detached under the same conditions as in Comparative Example 1, the cell culture inserts (Falcon, # 353495) in a semi-permeable membrane on, were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . In addition, 10% KSR, 1% Glutamax, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 30 ng / mL FGF2, 2 ⁇ mol / L Y-27632, 0.5 ⁇ mol / L. The cells were cultured in Advanced DMEM / F12 containing A8303 and 3 ⁇ mol / L CHIR99021 for 3 days (11th to 14th days).
  • Example 2 Human iPS cells (FF-1 strain) were cultured for 11 days under the same conditions as in Comparative Example 1 to induce differentiation into intestinal stem cells. Then, the cells were detached under the same conditions as in Comparative Example 1, the cell culture inserts (Falcon, # 353495) in a semi-permeable membrane on, were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . In addition, 10% KSR, 1% Glutamax, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 30 ng / mL FGF2, 2 ⁇ mol / L Y-27632, 0.5 ⁇ mol / L. The cells were cultured in Advanced DMEM / F12 containing A8301, 500 ng / mL Wnt3a for 3 days (11th to 14th days).
  • Example 3 Human iPS cells (FF-1 strain) were cultured for 11 days under the same conditions as in Comparative Example 1 to induce differentiation into intestinal stem cells. Then, the cells were detached under the same conditions as in Comparative Example 1, the cell culture inserts (Falcon, # 353495) in a semi-permeable membrane on, were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . In addition, 10% KSR, 1% Glutamax, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 30 ng / mL FGF2, 2 ⁇ mol / L Y-27632, 0.5 ⁇ mol / L. The cells were cultured in Advanced DMEM / F12 containing A8301, 5 ⁇ mol / L TWS119 for 3 days (11th to 14th days).
  • Example 4 Human iPS cells (FF-1 strain) were cultured for 11 days under the same conditions as in Comparative Example 1 to induce differentiation into intestinal stem cells. Then, the cells were detached under the same conditions as in Comparative Example 1, the cell culture inserts (Falcon, # 353495) in a semi-permeable membrane on, were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . In addition, 10% KSR, 1% Glutamax, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 30 ng / mL FGF2, 2 ⁇ mol / L Y-27632, 0.5 ⁇ mol / L. A8301 was cultured in Advanced DMEM / F12 containing 5 ⁇ mol / L BIO for 3 days (11th to 14th days).
  • Example 5 Human iPS cells (FF-1 strain) were cultured for 11 days under the same conditions as in Comparative Example 1 to induce differentiation into intestinal stem cells. Then, the cells were detached under the same conditions as in Comparative Example 1, the cell culture inserts (Falcon, # 353495) in a semi-permeable membrane on, were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 . In addition, 10% KSR, 1% Glutamax, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ng / mL epidermal growth factor (EGF), 30 ng / mL FGF2, 2 ⁇ mol / L Y-27632, 0.5 ⁇ mol / L. The cells were cultured in Advanced DMEM / F12 containing A8301, 2.5 ⁇ mol / L BIO for 3 days (11th to 14th days).
  • ⁇ Test Example 1> The cell densities of the intestinal stem cells obtained in the middle of Comparative Example 1 and Examples 1 to 3 were evaluated.
  • the intestinal stem cells obtained in Comparative Example 1 (day 12) and Examples 1 to 3 (day 14) were washed with D-PBS, immersed in ice-cold methanol, and fixed and membrane-permeated. After that, DAPI was added, the cells were stained at room temperature for 5 minutes, replaced with D-PBS, and then observed with a fluorescence microscope. Cell density was calculated by counting the number of nuclei stained with DAPI. The results are shown in Table 1. Examples 1 and 3 showed higher intestinal stem cell densities as opposed to Comparative Example 1.
  • Test Example 2 The EdU positive rate of intestinal stem cells obtained in the middle of Comparative Example 1 and Examples 1 to 3 was evaluated.
  • the intestinal stem cells obtained in Comparative Example 1 (day 12) and Examples 1 to 3 (day 14) were added with EdU, cultured for 24 hours, washed with D-PBS, and immersed in ice-cold methanol. , Immobilization and membrane permeation treatment. After that, the cells were stained according to the attached manual of Click-iT EdU Imaging Kits (Invitrogen), and observed with a fluorescence microscope.
  • the EdU positive rate was calculated by dividing the number of nuclei stained with Click-iT EdU Imaging Kits by the number of nuclei stained with Hoechst 33342. The results are shown in Table 2.
  • Example 1 showed a high EdU positive rate with respect to Comparative Example 1.
  • Test Example 3 The cell densities of the intestinal epithelial cells obtained in Comparative Example 1 and Examples 1 to 3 were evaluated. After the differentiation induction was completed, the cells were washed with D-PBS, immersed in ice-cold methanol, and fixed and membrane-permeated. After that, DAPI was added, the cells were stained at room temperature for 5 minutes, replaced with D-PBS, and then observed with a fluorescence microscope. Cell density was calculated by counting the number of nuclei stained with DAPI. The results are shown in Table 3. In contrast to Comparative Example 1, Examples 1 to 3 showed a high density of intestinal epithelial cells.
  • Test Example 4 The cell morphology of the intestinal epithelial cells obtained in Comparative Examples 1 and 1 to 5 was evaluated. After the differentiation induction was completed, the cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde phosphate buffer. The membrane to which the cells adhered was cut out from the cell culture insert and embedded in paraffin. Section thickness was sliced 2-3 ⁇ m and stained with hematoxylin 3G and eosin. Observations were performed after the use of encapsulants (Paramount, Pharma). Cells having the longest diameter of cells at least 3 times the longest diameter of the nucleus were designated as columnar cells, and the ratio of columnar cells to the entire section was evaluated. The results are shown in Table 4. Comparative Example 1 showed a ratio of columnar cells of 0%, whereas Examples 1 to 5 showed a ratio of columnar cells of 20 to 100%.
  • FIGS. 2 Comparative Example 1
  • FIG. 3 Example 1
  • FIG. 4 Example 3
  • FIG. 5 Example 4
  • FIG. 6 Example 4
  • Example 5 Example 5
  • Examples 1, 3, 4 and 5 showed a columnar cell morphology as compared with Comparative Example 1, and it was found that the morphology was closer to that of the living small intestine.
  • Test Example 5 The CYP3A4 activity per area of the intestinal epithelial cell sheet obtained in Comparative Examples 1 and 1 to 5 was measured from the amount of the metabolite of midazolam. After completion of differentiation induction, incubation was carried out at 37 ° C. in a medium containing 5 ⁇ mol / L midazolam, and after 2 hours, the medium was sampled. Metabolic activity was calculated from the amount of 1'-hydroxymidazolam in the medium measured using a liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS). The results are shown in Table 5. In contrast to Comparative Example 1, Examples 1-5 showed a high amount of midazolam metabolites per area of cell sheet.
  • Test Example 6 The midazolam permeability of the intestinal epithelial cells obtained in Comparative Examples 1 and 1 to 5 was evaluated. After the differentiation induction was completed, HBSS (pH 6.5) was added to the apical side and HBSS (pH 7.4) was added to the basolate (basolatera1) side, and the cells were pre-incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Then, HBSS (pH 6.5) containing 10 ⁇ mol / L midazolam was added to the apical side, HBSS (pH 7.4) was added to the basilara1 side, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Samples were collected from the basolatera1 side every 15 minutes.
  • Test Example 7 The apparent permeability coefficient was corrected by using the scaling factor x for the apparent permeability coefficient of Example 4 obtained in Test Example 6. At this time, the following formula was used.
  • Permeation amount per unit time (group B60-x x difference in group B60 depending on the addition or absence of a metabolism inhibitor) / permeation time
  • the apparent permeability coefficient obtained when the small intestinal cell sheet of the present invention was used became a value closer to the apparent permeability coefficient obtained by using the living small intestinal tissue. This improved the dynamic prediction accuracy.
  • Test Example 8 In Example 4, it was found that the Fg simply calculated by substituting the experimental values obtained when Test Example 6 was performed in Equation 1 was 0.83.
  • the correction results were obtained as shown in the table below.
  • Fg 431 / (431 + 91 ⁇ x) ... (Equation 2)
  • the apparent Fg of midazolam was 0.28 to 0.54
  • the Fg equivalent to the Fg of the living small intestine of 0.369 to 0.5 was calculated, and the prediction accuracy was correct. Has improved.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

本発明の課題は、面積当たりの細胞数が多く、ミダゾラム等のCYP3A4基質薬剤に対する動態予測精度が高い腸管上皮細胞を多能性幹細胞を分化誘導することによって製造する方法を提供すること、並びに上記腸管上皮細胞、細胞シート、被験物質の評価方法、被験物質のスクリーニングキット、及び細胞製剤を提供することである。本発明によれば、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程；分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程；及び増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、増殖工程が、腸管幹細胞を特定の状態にする工程である、腸管上皮細胞の製造方法が提供される。

Description

腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用
　本発明は、多能性幹細胞を分化誘導することを含む腸管上皮細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、腸管上皮細胞、細胞シート、被験物質の評価方法、被験物質のスクリーニングキット、及び細胞製剤に関する。
　小腸には多くの薬物代謝酵素や薬物トランスポーターが存在することから、肝臓と同様、薬物の初回通過効果に関わる臓器として非常に重要である。そのため、医薬品開発早期の段階から小腸における医薬品の膜透過性や代謝を評価することが、薬物動態特性に優れた医薬品の開発に必要である。現在、小腸のモデル系としてはヒト結腸癌由来のＣａｃｏ－２細胞が多用されている。しかし、Ｃａｃｏ－２細胞における薬物トランスポーターの発現パターンはヒト小腸とは異なる。また、Ｃａｃｏ－２細胞には薬物代謝酵素の発現及び酵素誘導はほとんど認められないことから、正確に小腸での薬物動態を評価することは難しい。したがって、小腸における薬物代謝及び膜透過性を総合的に評価するためには初代小腸上皮細胞の利用が望ましいが、機能の面や供給に関して問題があることから、初代肝細胞のように薬物動態試験系として広く利用することは困難である。
　ヒト人工多能性幹（induced pluripotent stem：ｉＰＳ）細胞は２００７年に山中らによって樹立された。このヒトｉＰＳ細胞は、１９９８年にThomsonらによって樹立されたヒト胚性幹（embryonic stem：ＥＳ）細胞と同様な、多分化能とほぼ無限の増殖能をもつ細胞である。ヒトｉＰＳ細胞はヒトＥＳ細胞に比べ倫理的な問題が少なく、医薬品開発のための安定した細胞供給源として期待される。
　特許文献１には、腸管幹細胞の性質を維持させたまま、人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞を維持・培養することを可能にする培養方法として、人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞様細胞をＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下、或いはＧＳＫ－３β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養することが記載されている。
　特許文献２には、（１）多能性幹細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；及び（２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質を併用し、工程（１）で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程を含む、多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法が記載されている。
ＷＯ２０１８／１５１３０７号公報 ＷＯ２０１９／１５６２００号公報
　特許文献２に記載の方法により分化誘導した腸管上皮細胞は、ヒト初代小腸細胞（生体由来の腸管上皮細胞）と同程度の薬物代謝活性酵素（ＣＹＰ３Ａ４）活性を有している。その一方、面積当たりの細胞数をさらに増大させ、ミダゾラム等のＣＹＰ３Ａ４基質薬剤に対する動態予測精度をさらに改善できるような、腸管上皮細胞の製造方法の開発が求められている。
　本発明は、面積当たりの細胞数が多く、ミダゾラム等のＣＹＰ３Ａ４基質薬剤に対する動態予測精度が高い腸管上皮細胞を、多能性幹細胞を分化誘導することによって製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、面積当たりの細胞数が多く、ミダゾラム等のＣＹＰ３Ａ４基質薬剤に対する動態予測精度が高い腸管上皮細胞、及び上記腸管上皮細胞を含む細胞シートを提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いた、被験物質の評価方法、被験物質のスクリーニングキット、及び細胞製剤を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程、分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程、及び増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程を含む腸管上皮細胞の製造方法における増殖工程において、腸管幹細胞を特定の状態にした後に腸管上皮細胞に分化させることによって、分化後の腸管上皮細胞の形態及び細胞数が改善し、ミダゾラムに対する動態予測精度を改善できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程；
　分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程；及び
　増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程；
を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、
　増殖工程が、
第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になる工程；
第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が、第一の分化工程直後の密度と比べて２.０倍以上になる工程；
第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が９０％以上になる工程；又は
第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が、第一の分化工程直後の割合と比べて２．０倍以上になる工程；
のうちの何れかである、腸管上皮細胞の製造方法。
＜２＞　増殖工程が、腸管幹細胞をＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ－３β阻害剤の存在下で培養する工程を含む、＜１＞に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜３＞　増殖工程が、腸管幹細胞をＧＳＫ－３β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養する工程を含む、＜１＞に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜４＞　第一の分化工程の終了時の細胞密度が５．０×１０４細胞／ｃｍ２～２０×１０４細胞／ｃｍ２である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜５＞　増殖工程において、第一の分化工程で得た腸管幹細胞を、１．１～３．３倍の細胞密度になるように容器に播種した後に、腸管幹細胞を培養して増殖させる、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜６＞　増殖工程を、１～１０日間行う、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜７＞　増殖工程及び第二の分化工程を、３容量％～１００容量％の細胞外マトリクスでコーティングした培養容器上で行う、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜８＞　増殖工程及び第二の分化工程を、１％～１０％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行う、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜９＞　増殖工程及び第二の分化工程を、セルカルチャーインサートの側底（basolatera1）側のみに１％～１０％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行う、＜８＞に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜１０＞　第二の分化工程が、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質の存在下において腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる工程を含む、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
＜１１＞　＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法により製造される腸管上皮細胞。
＜１２＞　＜１１＞に記載の腸管上皮細胞を含む細胞シート。
＜１３＞　腸管上皮細胞における円柱腸管上皮細胞の割合が１０％以上である、多能性幹細胞由来の腸管上皮細胞を含む細胞シート。
＜１４＞　細胞密度が、５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上である、＜１３＞に記載の細胞シート。
＜１５＞　５μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含む培地で３７℃にて２時間インキュベーションした後のミダゾラム代謝産物量が、細胞シートの面積あたり３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上である、＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞シート。
＜１６＞　蛋白質量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性が４００～２５００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎである、＜１３＞から＜１５＞の何れか一に記載の細胞シート。
＜１７＞　ミダゾラムの見かけの透過係数が、４０×１０－６ｃｍ／ｓ以下である、＜１３＞から＜１６＞の何れか一に記載の細胞シート。
＜１８＞　＜１１＞に記載の腸管上皮細胞又は＜１２＞から＜１７＞の何れか一に記載の細胞シートに被験物質を接触させることを含む、被験物質の評価方法。
＜１９＞　スケーリングファクターを用いて見かけの透過係数を補正することを含む、＜１８＞に記載の被験物質の評価方法。
＜２０＞　スケーリングファクターを用いてＦｇを補正することを含む、＜１８＞に記載の被験物質の評価方法。
＜２１＞　スケーリングファクターが０．１～５００である、＜１９＞又は＜２０＞に記載の被験物質の評価方法。
＜２２＞　＜１１＞に記載の腸管上皮細胞又は＜１２＞から＜１７＞の何れか一に記載の細胞シートを含む、被験物質のスクリーニングキット。
＜２３＞　＜１１＞に記載の腸管上皮細胞又は＜１２＞から＜１７＞の何れか一に記載の細胞シートを含む、細胞製剤。
　本発明によれば、面積当たりの細胞数が多く、ミダゾラム等のCYP3A4基質薬剤に対する動態予測精度が高い腸管上皮細胞を提供することができる。本発明の腸管上皮細胞、細胞シート、被験物質の評価方法、及び被験物質のスクリーニングキットによれば、被験物質の動態を高い精度で予測することができる。
図１は、比較例１、実施例１～５の分化培養方法の概要を示す。 図２は、比較例１の腸管上皮細胞の切片画像を示す。 図３は、実施例１の腸管上皮細胞の切片画像を示す。 図４は、実施例３の腸管上皮細胞の切片画像を示す。 図５は、実施例４の腸管上皮細胞の切片画像を示す。 図６は、実施例５の腸管上皮細胞の切片画像を示す。
　本発明の実施の形態を以下に説明する。
　本明細書における用語は以下の意味を有する。
５－ａｚａ－２’ｄｃ： 5-Aza-2'-deoxycytidine：5-アザ-2'-デオキシシチジン
ｂＦＧＦ： Basic Fibroblast Growth Factor：塩基性線維芽細胞増殖因子
ＢＭＰ４:Bone morphogenetic protein 4：骨形成蛋白質４
ｃＡＭＰ：Cyclic adenosine monophosphate：環状アデノシン一リン酸
Ｃｒｉｐｔ：Cysteine-rich PDZ-binding protein：システインリッチPDZ結合タンパク質
ＤＡＰＩ：4',6-diamidino-2-phenylindole：4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール
ＤＭＥＭ： Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ダルベッコ改変イーグル培地
Ｄ－ＰＢＳ：Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline：ダルベッコリン酸緩衝食塩水
ＥｄＵ：5-Ethynyl-2’-deoxyuridine ：5-エチニル-2’-デオキシウリジン
ＥＧＦ: Epidermal Growth Factor：上皮成長因子
ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清
Ｆｂｘｏ１５：F-Box Protein 15：Ｆ－ボックスプロテイン１５
ＦＧＦ２：Fibroblast Growth Factor-2：繊維芽細胞成長因子２
ＧＳＫ－３β：Glycogen synthase kinase 3β：グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β
ＨＢＳＳ：Hank's Balanced Salt Solution：Hank's平衡塩溶液
ＬＩＦ：Leukemia inhibitory factor：白血病阻止因子
ＭＥＫ１：MAPK-ERK　kinase 1：MAPK-ERKキナーゼ1
ＮＥＡＡ：Non-Essential Amino Acids:非必須アミノ酸
ＰＫＡ：protein kinase A:プロテインキナーゼA
ＳＣＦ：Stem cell factor：幹細胞因子
ＴＧＦβ：Transforming Growth Factor-β：トランスフォーミング増殖因子β
ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor：血管内皮細胞増殖因子
Ｗｎｔ：Wingless-type MMTV integration site family:ウイングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー
＜腸管上皮細胞の製造方法＞
　本発明の腸管上皮細胞の製造方法は、
　多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程；
　分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程；及び
　増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程；
を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、
　増殖工程が、
第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になる工程；
第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が、第一の分化工程直後の密度と比べて２．０倍以上になる工程；
第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が９０％以上になる工程；又は
第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が、第一の分化工程直後の割合と比べて３倍以上になる工程；
のうちの何れかである方法である。
　本発明の方法は、腸管幹細胞を一定以上の高い密度にすることを特徴とする。腸管幹細胞にＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ－３β阻害剤を添加することにより細胞密度を増加させると、腸管上皮細胞の形態及び機能の改善が見られる。一方、細胞密度が足りない場合にが、細胞形態と代謝酵素の基質の動態は改善されない。腸管幹細胞を一定以上の高い密度にすることにより、平面で分化した多能性幹細胞由来の腸管上皮細胞の形態を、生体に近い円柱状にできるという知見はこれまで存在せず、本発明は有利な効果を奏するものである。
　本発明においては、多能性幹細胞を腸管上皮細胞系譜へ分化誘導する。本発明によれば、生体の腸管組織を構成する腸管上皮細胞と類似の特性を示す細胞、即ち腸管上皮細胞が得られる。
　「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
　多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いる。更に好ましくはｉＰＳ細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞が用いられる。
　ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、上記初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
　ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ ＢＩＯなどから入手可能である。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.，Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，9523）,13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.，Stem Cells，21（5），598-609，2003））。
　「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成人由来の体細胞（即ち、成熟した体細胞）を用いてもよい。体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　ｉＰＳ細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８及びＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Ｏｃｔ３／４及びＫｌｆ４の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１及びＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
　ｉＰＳ細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明ではｉＰＳ細胞を腸管上皮細胞へと分化誘導する。
　本発明の腸管上皮細胞の製造方法は、大別して３段階の工程（多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程；分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程；及び増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程）を含む。
＜第一の分化工程：腸管幹細胞への分化＞
　第一の分化工程では、多能性幹細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が腸管幹細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、多能性幹細胞が内胚葉様細胞を介して腸管幹細胞へと分化するように、以下で説明する２段階の分化誘導、即ち、多能性幹細胞の内胚葉様細胞への分化（工程（１－１））と、内胚葉様細胞の腸管幹細胞への分化（工程（１－２））を行う。
工程（１－１）内胚葉様細胞への分化
　この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンＡを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンＡの濃度を例えば１０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）である。
　Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル経路の阻害剤（例えば、ヘキサクロロフェン、クエルセチン、ＷｎｔリガンドであるＷｎｔ３ａ）を培地に添加し、内胚葉様細胞への分化の促進を図ってもよい。
　ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２の一以上を培地に添加し、内胚葉様細胞への分化の促進を図ってもよい。
　この工程は、国際公開第２０１４／１６５６６３号パンフレットに記載の方法又はそれに準じた方法で行うこともできる。
　好ましい一態様では、工程（１－１）として２段階の培養を行う。１段階目の培養では比較的低濃度の血清（例えば、０．１％（ｖ／ｖ）～１％（ｖ／ｖ））を添加した培地で行い、続く２段階目の培養では１段階目の培養よりも血清濃度を高めた培地（血清濃度を例えば１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ））で行う。このように２段階の培養を採用することは、１段階目の培養により未分化細胞の増殖を抑制し、続く２段階目により分化した細胞を増殖させる点で好ましい。
　工程（１－１）の期間（培養期間）は例えば１日間～１０日間、好ましくは２日間～７日間である。工程（１－１）として２段階の培養を採用する場合には１段階目の培養期間を例えば１日間～７日間、好ましくは２日間～５日間とし、２段階目の培養期間を例えば１日間～６日間、好ましくは１日間～４日間とする。
工程（１－２）　腸管幹細胞への分化
　この工程では、工程（１－１）で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉様細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞へと分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）の存在下、又はＧＳＫ－３β阻害剤の存在下で培養を行う。ＦＧＦ２としては好ましくはヒトＦＧＦ２（例えばヒト組換えＦＧＦ２）を用いる。
　典型的には、工程（１－１）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（１－２）に供する。一方で、工程（１－１）を経て得られた細胞集団の中から内胚葉様細胞を選別した上で工程（１－２）を実施することにしてもよい。内胚葉様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　「ＦＧＦ２の存在下」とは、ＦＧＦ２が培地中に添加された条件と同義である。従って、ＦＧＦ２の存在下での培養を行うためには、ＦＧＦ２が添加された培地を用いればよい。ＦＧＦ２の添加濃度の例を示すと１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬである。
　同様に、「ＧＳＫ－３β阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ－３β阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。従って、ＧＳＫ－３β阻害剤の存在下での培養を行うためには、ＦＧＦ２が添加された培地を用いればよい。ＧＳＫ－３β阻害剤としてＣＨＩＲ ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを例示することができる。ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度は０．１ｎｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌであってもよく、好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、１０ｎｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは、５０ｎｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌである。
　工程（１－２）の期間（培養期間）は例えば２日間～１０日間、好ましくは３日間～７日間である。上記培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管幹細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、上記培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管幹細胞へ分化したことは、例えば、腸管幹細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。腸管幹細胞マーカーの例を挙げると、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、エフリンＢ２受容体（ＥｐｈＢ２）である。
　第一の分化工程の終了時の細胞密度は、５.０×１０４細胞／ｃｍ２～２０×１０４細胞／ｃｍ２であってもよく、６.０×１０４細胞／ｃｍ２～１６×１０４細胞／ｃｍ２であることが好ましく、７.０×１０４細胞／ｃｍ２～１４×１０４細胞／ｃｍ２であることがより好ましい。
　工程（１－２）により得られた腸管幹細胞は、凍結保存することも可能である。凍結保存した腸管幹細胞を解凍し、以降の工程（増殖工程等）を実施してもよい。細胞の凍結保存には、一般的に培養細胞の凍結保存に用いられる溶液を使用することができ、培地、DMSO、血清、及び一般の凍結保存用試薬等を含んでもよい。一般の凍結保存用試薬の例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ　Ｍｅｄｉａ、ＣｅｌｌＢａｎｋｅｒ（登録商標）、ＦｒｅＳＲ（商標）－Ｓ 、NutriFreez（商標） D10 Cryopreservation Medium、Cellvation、Cryoscarless（登録商標）およびBambanker（登録商標）が挙げられる。
＜増殖工程＞
　増殖工程は、
　第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になる工程（以下、工程ａという）；
　第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が、第一の分化工程直後の密度と比べて２.０倍以上になる工程（以下、工程ｂという）；
　第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が９０％以上になる工程（以下、工程ｃという）；又は
　第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が、第一の分化工程直後の割合と比べて３倍以上になる工程（以下、工程ｄという）；
のうちの何れかである。
　工程ａにおいては、第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度は３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になり、好ましくは３２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になり、より好ましくは４０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になり、特に好ましくは４５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になる。
　工程ｂにおいては、第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が、第一の分化工程直後の密度と比べて２.０倍以上になり、好ましくは、２．５倍以上になり、より好ましくは、３.０倍以上になり、さらに好ましくは３.５倍以上になり、特にこのましくは、４.０倍以上になる。
　工程ｃにおいては、第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合は９０％以上になり、好ましくは９５％以上になり、より好ましくは９７％以上になり、特に好ましくは１００％になる。
　工程ｄにおいては、第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合は、第一の分化工程直後の割合と比べて３倍以上になり、好ましくは３．２倍以上になり、より好ましくは３．５倍以上になる。
　増殖工程においては、第一の分化工程で得た腸管幹細胞を、第一の分化工程で得た腸管幹細胞の細胞密度に対して、好ましくは１．１～３．３倍、より好ましくは１．５～３．０倍、さらに好ましくは１．５～２．５倍、とくに好ましくは１．５～２．０倍の播種密度になるように容器に播種した後に、腸管幹細胞を培養して増殖させることができる。
　増殖工程の培養条件は、上記の工程ａ～工程ｄの何れかの条件を満たす限り特に限定されない。好ましくは、腸管幹細胞をＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ－３β阻害剤の存在下で培養することができる。
　Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔ３ａ等のＷｎｔファミリーや、Ｒ－スポンジン１等のＲ-スポンジンファミリーを例示することができる。Ｗｎｔアゴニストの添加濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬである。
　ＧＳＫ－３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを例示することができる。ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度は、０．１ｎｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、１０ｎｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは、５０ｎｍｏｌ／Ｌ～５.０μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは１.０μｍｏｌ／Ｌ～５.０μｍｏｌ／Ｌである。ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度は、１.０μｍｏｌ／Ｌ～３.０μｍｏｌ／Ｌでもよく、上記濃度範囲であれば、細胞の性能（バリア機能等）について、再現良く安定する傾向がある。
　増殖工程においては、好ましくは、腸管幹細胞をＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下、又はＧＳＫ－３β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養することができる。
　ヒストン脱アセチル化阻害剤としてバルプロ酸、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、ツバスタチンＡ、ギビノスタット、プラシノスタットを例示することができる。
　血清代替物とは、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等をその未分化な状態を維持させたままで培養するために、分化誘導因子を含む血清の代わりとして使用される組成物である。好ましくは、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ））を用いる。
　ヒストン脱アセチル化阻害剤の添加濃度の例（バルプロ酸の場合）を示すと０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～３ｍｍｏｌ／Ｌであり、血清代替物の添加濃度の例（ＫＳＲの場合）を示すと５％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）である。
　増殖工程は、好ましくは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦβ受容体阻害剤（Ａ８３０１など）、ＲＯＣＫ阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）（Ｙ－２７６３２等）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２など）からなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で行うことができる。増殖工程における、培地中のＥＧＦの濃度は例えば１．０ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬである。ＴＧＦβ受容体阻害剤の濃度は例えば、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～１．０μｍｏｌ／Ｌである。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は例えば０.１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、０.５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌである。ＦＧＦ２の濃度は例えば１．０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである。
　増殖工程の培養期間は特に限定されないが、好ましくは１～１０日間であり、より好ましくは１～５日間であり、さらに好ましくは２～４日間であり、一例としては３日間とすることができる。
＜第二の分化工程：腸管上皮細胞への分化＞
　第二の分化工程は、腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる工程である。第二の分化工程は、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質の存在下において腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる工程を含むことが好ましい。
　ｃＡＭＰ活性化物質を使用することで、細胞内のｃＡＭＰレベルを積極的に上昇させることができる。「ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質の存在下において」とは、第二の分化工程を構成する１又は２以上の培養を行うため、これら全ての化合物が必要とされることをいい、これら全ての化合物が同時に使用されること、即ち、これら全ての化合物が添加された培地を用いた培養が行われることを必須の条件として要求するものではない。
　典型的には、第一の分化工程で得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく第二の分化工程に供する。一方で、第一の分化工程で得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で、第二の分化工程を実施してもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　第二の分化工程は、１又は２以上の培養によって構成される（詳細は後述する）。第二の分化工程を構成する各培養では、例えば、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質が必須の成分として添加された培地、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦが必須の成分として添加された培地、ＥＧＦが必須の成分として添加された培地、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質が必須の成分として添加された培地等が用いられる。
　ＭＥＫ１阻害剤として、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＭＥＫ１／２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＳＬ３２７を挙げることができる。同様に、ＤＮＡメチル化阻害剤として５－アザ－２’－デオキシシチジン、５－アザシチジン、ＲＧ１０８、ゼブラリンを挙げることができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤については、後述の実施例に使用したＡ８３０１がＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７に阻害活性を示すことを考慮すれば、好ましくは、ＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘが上記条件を満たす。ｃＡＭＰ活性化物質としては、フォルスコリン、インドメタシン、ＮＫＨ４７７（コルホルシンダロパート）、細胞由来毒素タンパク質（百日咳毒素、コレラ毒素）、ＰＡＣＡＰ－２７、ＰＡＣＡＰ－３８、ＳＫＦ８３８２２等を用いることができる。フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼ活性化作用を示し、細胞内ｃＡＭＰの合成を促進する。
　ＭＥＫ１阻害剤の添加濃度の例（ＰＤ９８０５９の場合）を示すと４μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０～４０μｍｏｌ／Ｌである。同様にＤＮＡメチル化阻害剤の添加濃度の例（５－アザ－２’－デオキシシチジンの場合）を示すと、１μｍｏｌ／Ｌ～２５μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、ＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度の例（Ａ８３０１の場合）を示すと０．１μｍｏｌ／Ｌ～２．５μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌである。ＥＧＦの添加濃度の例は、５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである。また、ｃＡＭＰ活性化物質の添加濃度の例（フォルスコリンの場合）を示すと、１μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌである。尚、例示した化合物、即ち、ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン、Ａ８３０１及びフォルスコリンとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン、Ａ８３０１、フォルスコリン）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　工程（２）を上記の条件に加え、ｃＡＭＰが細胞へ供給される条件（「追加条件１」と呼ぶ）及びｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件（「追加条件２」と呼ぶ）、或いはこれらのいずれかの条件の下で行うことにしてもよい。追加条件１（ｃＡＭＰが細胞へ供給される条件）とは、細胞内へ取り込み可能な化合物であって、細胞内に取り込まれるとｃＡＭＰとして作用する化合物が存在する条件と同義である。従って、追加条件１を満たすためには、例えば、細胞内へと取り込み可能なｃＡＭＰ誘導体が添加された培地を用いればよい。追加条件１を採用すると、細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、上記条件は、より機能的な腸管上皮細胞の調製を可能にし得る。ｃＡＭＰ誘導体としてＰＫＡ活性剤（例えば、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ（８－Ｂｒｏｍｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：７６９３９－４６－３）、６－Ｂｎｚ－ｃＡＭＰ（Ｎ６－Ｂｅｎｚｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１１３５３０６－２９－４）、ｃＡＭＰＳ－Ｒｐ（（Ｒ）－Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，ｃｙｃｌｉｃ ３’，５’－（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１５１８３７－０９－１）、ｃＡＭＰＳ－Ｓｐ（（Ｓ）－Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｃｙｃｌｉｃ ３’，５’－（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ） ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３６０２－６６－５）、Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ（Ｎ６，Ｏ２’－Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１６９８０－８９－５）、８－Ｃｌ－ｃＡＭＰ（８－Ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ－ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２４７０５－０３－９））、Ｅｐａｃ活性剤（Ｒｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰＳ（８－Ｂｒｏｍｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ，Ｒｐ－Ｉｓｏｍｅｒ．ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２９７３５－００－８）、８－ＣＰＴ－ｃＡＭＰ（８－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３８８２－１２－３）、８－ｐＣＰＴ－２’－Ｏ－Ｍｅ－ｃＡＭＰ（８－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ，ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：６３４２０７－５３－７）等）を採用することができる。ｃＡＭＰ誘導体の添加濃度の例（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰの場合）を示すと、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～２ｍｍｏｌ／Ｌである。尚、例示した化合物、即ち、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　追加条件２（ｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件）は、ｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。追加条件２を採用すると、ｃＡＭＰの分解阻害によって細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、上記条件は、より機能的な腸管上皮細胞の調製を可能にし得る。尚、追加条件１と追加条件２を併用すれば、ｃＡＭＰを細胞へ供給しつつ、細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下を抑えることができる。従って、細胞内ｃＡＭＰを高レベルに維持するために有効な条件となり、腸管上皮細胞への効率的な分化誘導が促されることを期待できる。
　ｃＡＭＰ分解酵素阻害剤として、ＩＢＭＸ （３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）（ＭＩＸ）、Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ、Ｐａｐａｖｅｒｉｎｅ、Ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ（Ｔｒｅｎｔａｌ）、ＫＳ－５０５、８－Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ－ＩＢＭＸ、Ｖｉｎｐｏｃｅｔｉｎｅ（ＴＣＶ－３Ｂ）、ＥＨＮＡ、Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ（ＨＬ－７２５）、Ｌｉｘａｚｉｎｏｎｅ（ＲＳ－８２８５６）、（ＬＹ－１８６１２６）、Ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ（ＯＰＣ３６８９）、Ｂｅｍｏｒａｄａｎ（ＲＷＪ－２２８６７）、Ａｎｅｒｇｒｅｌｉｄｅ（ＢＬ４１６２Ａ）、Ｉｎｄｏｌｉｄａｎ（ＬＹ１９５１１５）、Ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ（ＯＰＣ－１３０１３）、Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ（ＷＩＮ４７２０３）、Ｓｉｇｕａｚｏｄａｎ（ＳＫＦ－９４８３６）、５－Ｍｅｔｈｙｌ－ｉｍａｚｏｄａｎ（ＣＩ ９３０）、ＳＫＦ－９５６５４、Ｐｉｒｉｌｏｂｅｎｄａｎ（ＵＤ－ＣＧ １１５ ＢＳ）、Ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ（ＭＤＬ １７０４３）、Ｉｍａｚｏｄａｎ（ＣＬ ９１４）、ＳＫＦ－９４１２０、Ｖｅｓｎａｒｉｎｏｎｅ（ＯＰＣ ８２１２）、Ｒｏｌｉｐｒａｍ（Ｒｏ－２０－１７２４）、（ＺＫ－６２７１１）、Ｄｅｎｂｕｆｙｌｌ’ｉｎｅ、Ｚａｐｒｉｎａｓｔ（Ｍ＆Ｂ－２２，９４８）、Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ、Ｚａｐｒｉｎａｓｔ（Ｍ＆Ｂ－２２，９４８）、Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ、Ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ、ＡＨ－２１－１３２、Ｓｕｌｍａｚｏｌ（ＡＲ－Ｌ １１５ ＢＳ）を例示することができる。ｃＡＭＰ分解酵素阻害剤の添加濃度の例（ＩＢＭＸの場合）を示すと、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～３ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ～１ｍｍｏｌ／Ｌである。尚、例示した化合物、即ち、ＩＢＭＸとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（ＩＢＭＸ）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　第二の分化工程の期間（培養期間）は例えば７日間～４０日間、好ましくは１０日間～３０日間である。培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管上皮細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管上皮細胞へ分化したことは、例えば、腸管上皮細胞マーカーの発現やペプチドの取り込み、或いはビタミンD受容体を介した薬物代謝酵素の発現誘導を指標にして判定ないし評価することができる。腸管上皮細胞マーカーの例を挙げると、ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク１（ＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＧ２／乳ガン耐性タンパク（ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ）、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、脂肪酸結合タンパク２（ＦＡＢＰ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー５Ａ１／ナトリウム共役型グルコーストランスポーター１（ＳＬＣ５Ａ１／ＳＧＬＴ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー１５Ａ１／ペプチドトランスポーター１（ＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）有機アニオントランスポーター２Ｂ１（ＳＬＣＯ２Ｂ１／ＯＡＴＰ２Ｂ１）、スクラーゼ－イソマルターゼ、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ４（ＵＧＴ１Ａ４）、ビリン １（Ｖｉｌｌｉｎ １）、カルボキシルエステラーゼ２Ａ１（ＣＥＳ２Ａ１）である。この中でも、腸管上皮に特異性の高いスクラーゼ－イソマルターゼ、及びビリン１、小腸での主要な薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４、小腸でのペプチドの吸収に関与するＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１、小腸の頂側膜側に発現しているグルコーストランスポーターであるＳＬＣ５Ａ１／ＳＧＬＴ１、小腸での有機アニオンの吸収に関与するＳＬＣＯ２Ｂ１／ＯＡＴＰ２Ｂ１、小腸での発現が高い加水分解酵素であるＣＥＳ２Ａ１は特に有効なマーカーである。
　目的の細胞（腸管上皮細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
　好ましくは、工程（２）として、以下のＡ～Ｄのいずれかの培養工程を行う。
＜培養工程Ａ＞
　培養工程Ａでは、（ａ－１）ＥＧＦ及び細胞内ｃＡＭＰ合成促進剤の存在下での培養と、上記培養の後に行われる、（ａ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ａ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ａ－２）の培養の期間は例えば７日間～２９日間、好ましくは９日間～２７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ａ－１）の培養をｃＡＭＰが細胞へ供給される条件（「追加条件１」と呼ぶ）及びｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件（「追加条件２」と呼ぶ）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ａ－２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
＜培養工程Ｂ＞
　培養工程Ｂでは、（ｂ－１）ＥＧＦの存在下での培養と、上記培養の後に行われる、（ｂ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及び細胞内ｃＡＭＰ合成促進剤の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｂ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ｂ－２）の培養の期間は例えば７日間～１９日間、好ましくは９日間～１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｂ－１）の培養をｃＡＭＰが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ｂ－２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
　（ｂ－２）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下での培養（（ｂ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
＜培養工程Ｃ＞
　培養工程Ｃでは、（ｃ－１）ＥＧＦ及び細胞内ｃＡＭＰ合成促進剤の存在下での培養と、上記培養の後に行われる、（ｃ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及び細胞内ｃＡＭＰ合成促進剤の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｃ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ｃ－２）の培養の期間は例えば７日間～１９日間、好ましくは９日間～１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｃ－１）の培養をｃＡＭＰが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。（ｃ－２）の培養も同様である。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
　（ｃ－２）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下での培養（（ｃ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
＜培養工程Ｄ＞
　培養工程Ｄでは、（ｄ－１）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及び細胞内ｃＡＭＰ合成促進剤の存在下での培養を行う。この培養工程は、培養操作が簡便であること、腸管上皮細胞への分化に対してより効果的であること、化合物であるため安定した効果が期待できること等の点で特に有利である。（ｄ－１）の培養の期間は例えば１５日間～２５日間、好ましくは１７日間～２３日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｄ－１）の培養をｃＡＭＰが細胞へ供給される条件（追加条件１）及びｃＡＭＰ分解酵素阻害剤が存在する条件（追加条件２）、或いはこれらのいずれかの条件で行うことにしてもよい。追加条件１及び追加条件２の詳細は上記の通りである。
　（ｄ－１）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下での培養（（ｄ－２）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
　本発明における各工程（第一の分化工程及びそれを構成する工程、増殖工程、第二の分化工程及びそれを構成する工程）においては、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。
　培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
　本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、グラスゴー基本培地（Ｇｉｂｃｏ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。工程（１－２）、第二の分化工程（及びそれを構成する工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ及び工程Ｄ）においては、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばＤ－ＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地、Ｄ－ＭＥＭ）を用いることが好ましい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２－メルカプトエタノール、ＰＶＡ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。本発明の方法によれば、二次元培養によって多能性幹細胞から腸管上皮細胞様細胞を得ることが可能となる。但し、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
　一例においては、増殖工程及び第二の分化工程は、３％～１００％の細胞外マトリクスでコーティングした培養容器上で行うことができる。
　別の例においては、増殖工程及び第二の分化工程を、１容量％～１０容量％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行うことができる。この場合、増殖工程及び第二の分化工程を、細胞のbasolateral側のみに１容量％～１０容量％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行ってもよい。細胞外マトリクスの例として、マトリゲル（登録商標）、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンチン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクたんぱく質、骨シアロたんぱく質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンジュリン、エピリグリン及びカリニンを用いることができ、マトリゲル（登録商標）を用いることが好ましい。マトリゲル（登録商標）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓが生産するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞が分泌するゼラチン状タンパク質混合物の商品名である。
＜腸管上皮細胞、及び細胞シート＞
　本発明によれば、上記した本発明の方法により製造される腸管上皮細胞、並びに上記腸管上皮細胞を含む細胞シートが提供される。
　本発明による多能性幹細胞由来の腸管上皮細胞を含む細胞シートにおいては、腸管上皮細胞における円柱腸管上皮細胞の割合が１０％以上であり、好ましくは１５％以上であり、より好ましくは２０％以上である。腸管上皮細胞における円柱腸管上皮細胞の割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上でもよく、１００％でもよい。円柱腸管上皮細胞とは、細胞の最長径が、核の最長径の３倍以上である腸管上皮細胞のことを意味する。また、円柱腸管上皮細胞は、細胞側底部の接着面と水平方面の細胞の長さをｈ、接着面と垂直方向の細胞の長さをｖとしたとき、ｖ／ｈ≧１であることが好ましい。
　本発明の細胞シートにおいて、細胞密度は、好ましくは５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上であり、好ましくは６０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは６５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは７０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上である。細胞密度は、７５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、又は８０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上でもよい。
　細胞シートの、面積あたりのミダゾラム代謝産物量は、好ましくは３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは３６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは４２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上である。細胞シートの面積当たりのミダゾラム代謝産物量は、４５０ｐｍｏｌ以上、５４０ｐｍｏｌ以上、６００ｐｍｏｌ以上、又は６３０ｐｍｏｌ以上でもよい。
　細胞シートの面積あたりのミダゾラム代謝産物量は、５μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含む培地で３７℃にて２時間インキュベーションした後のミダゾラム代謝産物量である。
　細胞シートの、蛋白質量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性は、好ましくは４００～２５００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであり、より好ましくは５００～２０００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎである。蛋白質量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性は、７００～２０００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、１０００～２０００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、又は１０００～１５００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎでもよい。
　蛋白質量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性は、基質（ミダゾラム）入りの培地を添加し、一定時間後に回収した上清中の代謝産物（1’-ヒドロキシミダゾラム）の量を定量し、蛋白質量で除することにより求めることができる。上清中の代謝産物の量は、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメーター（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などを用いて測定することができる。
　一般的に、見かけの透過係数は、薬物動態予測の指標とすることができる。細胞シートのミダゾラムの見かけの透過係数は、好ましくは４０×１０－６ｃｍ／ｓ以下であり、より好ましくは３８×１０－６ｃｍ／ｓ以下であり、さらに好ましくは３５×１０－６ｃｍ／ｓ以下であり、特に好ましくは３３×１０－６ｃｍ／ｓ以下である。ミダゾラムの見かけの透過係数は、ミダゾラムを細胞のapical側に添加し、一定時間後にbasolateral側に透過してきたミダゾラムの量を定量することにより求めることができる。透過してきたミダゾラムの量は液体クロマトグラフィー－マススペクトロメーター（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などを用いて測定することができる。生体小腸組織を用いてin vitroで求めたミダゾラムの見かけの透過係数は５×１０-６cm/sである（A-L. Ungel et al., Eur. J. Phrm. Sci. 48, 166 (2013)）。
＜腸管上皮細胞及び細胞シートの用途＞
　本発明は、本発明の方法で製造した腸管上皮細胞又は細胞シートの用途に関する。
　第１の用途としては、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートに被験物質を接触させることを含む、被験物質の評価方法（スクリーニング方法）、並びに、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを含む、被験物質のスクリーニングキットが提供される。本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートは腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価、小腸の応答評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートは、被験物質の体内動態の評価や毒性の評価、被験物質に対する応答評価にその利用が図られる。
　具体的には、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いて被験物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、免疫応答等を試験することができる。即ち、本発明は、腸管上皮細胞又は細胞シートの用途の一つとして、被験物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、免疫応答等を評価する方法（第１の態様）を提供する。上記方法では、（ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程と、（ｉｉ）上記細胞層に被験物質を接触させる工程と、（ｉｉｉ）上記細胞層を透過した被験物質を定量し、被験物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、又は免疫応答を評価する工程を行う。尚、被験物質の吸収性については、後述の方法（第２の態様）でも評価することができる。
　工程（ｉ）では、典型的には、半透過性膜（多孔性膜）の上で腸管上皮細胞様細胞を培養し、細胞層を形成させる。具体的には、例えば、セルカルチャーインサートを備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランスウェル（登録商標））を使用し、セルカルチャーインサート内に細胞を播種して培養することにより、腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を得る。
　工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被験物質を添加することによって行われる。被験物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被験物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被験物質を添加することにしても、予め被験物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
　被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができ、細菌(腸内細菌、乳酸菌等)、ウイルス、細胞(免疫細胞、線維芽細胞)を用いることもできる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）を例示できる。医薬品、栄養食品、サプリメント、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被験物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
　工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被験物質を定量する。例えば、トランスウェル（登録商標）のようなセルカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、セルカルチャーインサートを透過した被験物質、即ち、細胞層を介して上部もしくは下部容器内に移動した被験物質を、被験物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被験物質の量）と被験物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被験物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、又は免疫応答を判定・評価する。
　本発明は別の態様（第２の態様）として、被験物質の代謝又は吸収を評価する方法も提供する。上記方法では、（Ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞に被験物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被験物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、又は免疫応答を測定・評価する工程を行う。
　工程（Ｉ）、即ち腸管上皮細胞様細胞と被験物質の接触は、上記工程（ｉｉ）と同様に実施することができる。但し、予め細胞層を形成させることは必須ではない。
　工程（Ｉ）の後、被験物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性、又は免疫応答を測定・評価する（工程（ＩＩ））。工程（Ｉ）の直後、即ち、被験物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝等を測定・評価しても、或いは、一定の時間（例えば１０分～５時間）を経過した後に代謝等を測定・評価することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。
　典型的には、被験物質の代謝産物が検出されたとき、「被験物質が代謝された」と判定ないし評価する。また、代謝産物の量に応じて被験物質の代謝量を評価することができる。代謝産物の検出結果と、被験物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被験物質の代謝効率を算出することにしてもよい。
　腸管上皮細胞様細胞における薬物代謝酵素（シトクロムＰ４５０（特にＣＹＰ３Ａ４）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素（特にＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ１０）、硫酸転移酵素（特にＳＵＬＴ１Ａ３など））の発現を指標として被験物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のｍＲＮＡレベルに上昇を認めたとき、「被験物質が代謝された」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被験物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定・評価を行うことにしてもよい。
　被験物質の吸収を評価するためには、例えば、培養液中の被験物質の残存量を測定する。通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして被験物質を定量する。測定方法は被験物質に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。典型的には、培養液中の被験物質の含有量の低下を認めたとき、「被験物質が吸収された」と判定・評価する。また、低下の程度に応じて被験物質の吸収量ないし吸収効率を判定・評価することができる。尚、細胞内に取り込まれた被験物質の量を測定することによっても、吸収の評価は可能である。
　尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時に又は並行して行うことにしてもよい。
　代謝酵素の基質となる被験物質は、スケーリングファクターを用いることで、代謝又は吸収の評価結果を補正し、予測精度を向上することができる。
　代謝酵素の例としては、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）が挙げられる。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）としては、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４などが挙げられる。また、代謝酵素の例として、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥＳ）、ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）、硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）、Ｓｕｃｌａｓｅ－Ｉｓｏｍａｌｔａｓｅなどを挙げることもできる。カルボキシルエステラーゼ（ＣＥＳ）としては、ＣＥＳ１、ＣＥＳ２などが挙げられる。ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素　（ＵＧＴ）としては、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１１などが挙げられる。硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）としては、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＵＬＴ１Ｂ１、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＵＬＴ２Ａ１などが挙げられる。
　ＣＹＰ３Ａ４の基質となる被験物質としては、例えば、ミダゾラム、ベラパミル、タクロリムスなどがある。
　スケーリングファクターとは、生体小腸の形態（細胞形態・組織構造）や機能（代謝酵素活性・トランスポーター活性）に着目して得られる定数である。スケーリングファクターは、本発明の細胞または細胞シートに、被験物質を透過・代謝させて得られた各種パラメーターに乗じることができる。
　各種パラメーターとしては以下５種類が挙げられる。
１）　試験溶液中（ａｐｉｃａｌ側・ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側）や細胞内、インサート膜上の被験物質及びその代謝物の量。
２）　１）の時間変化。
３）　１）２）より計算して得られる全てのパラメーター。例えば、見かけの透過係数、透過クリアランス、代謝クリアランス、Ｅｆｆｌｕｘ　ｒａｔｉｏ。
４）　代謝又は吸収を阻害もしくは誘導する薬剤を添加した際の１）２）３）の変化量。
５）　２種以上の薬剤について独立した試験を実施して得られた１）２）３）４）より、計算して得られるパラメーター。
　本発明の一例としては、スケーリングファクターを用いて見かけの透過係数を補正することができる。
　見かけの透過係数Ｐａｐｐは、以下の式で求められる。
Ｐａｐｐ＝単位時間当たりの透過量／（基　Ａ０濃度　×　透過面積）
単位時間当たりの透過量＝基　Ｂ６０／透過時間
基　Ａ０濃度：Ａ側に基質となる被験物質を添加した際の濃度
透過面積：被験物質が透過する面積
基　Ｂ６０：Ａ側に基質となる被験物質を添加してから６０分後に、Ｂ側に透過した基質量
透過時間：Ａ側に基質となる被験物質を添加してからサンプリングを完了するまでの時間
　スケーリングファクターｘを用いる場合、例えば、以下の式により見かけの透過係数を補正することが出来る。
単位時間当たりの透過量＝（基　Ｂ６０－　ｘ×あるパラメーター）／透過時間　あるパラメーターとしては、上記１）２）３）４）５）で示すパラメーターを使用することができ、例えば代謝物の量や、代謝阻害剤の添加有無による「基　Ｂ６０」の差などのパラメーターが挙げられる。上記２）で示すパラメーターを使用する場合、１）の時間変化に時間を乗じたものをパラメーターとして使用することができる。
　以上より、見かけの透過係数を補正することで、生体小腸でのＦａ×Ｆｇまたは、Ｆｇの予測精度を向上することができる。なお、Ｆａは腸管での吸収率であり、例えば、ミダゾラムの生体小腸でのＦａは、１．０であると考えられている。（文献情報Takenaka T. et al.Drug Metab Dispos. 42, 1947-54 (2014)）Ｆｇは腸管での代謝回避率であり、例えば、ミダゾラムの生体小腸でのＦｇは、０．３６９～０．５であると考えられている（Pharm Res. 2012 Mar;29(3):651）。
　別の方法として、簡易的にＦｇを求める式を立てることができる（Takayama K. et al. Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., 8, 513-526 (2019)）。
Ｆｇ＝（基　Ｂ６０＋基　ｃｅｌｌ６０）／（基　Ｂ６０＋基　ｃｅｌｌ６０＋代　合計６０）・・（式１）
基　Ｂ６０：Ａ側に基質となる被験物質を添加してから６０分後に、Ｂ側に透過した基質量
基　ｃｅｌｌ６０：Ａ側に基質となる被験物質を添加してから６０分後に、細胞内に蓄積した基質量
代　合計６０：Ａ側に基質となる被験物質を添加してから６０分後に、Ａ側・Ｂ側・細胞内に蓄積した代謝物量の合計
　パラメーターの一例として、Ｆｇの式中の「代　合計６０」が挙げられる。
　例えば、Ｆｇ＝４３１／（４３１＋９１×ｘ）　ｘ：スケーリングファクター　
とすることができる。ｘは、０．１～５００とすることができ、好ましくは、１．２～３０である。
　本発明の一例においては、スケーリングファクターを用いてＦｇを補正することができる。
　本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートの第２の用途としては、腸管上皮細胞又は細胞シートを含有する細胞製剤が提供される。本発明の細胞製剤は、各種腸疾患の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）腸管上皮組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁すること、或いは上記細胞を用いて三次元組織体（オルガノイドやスフェロイド）を作製することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば１×１０５個～１×１０１０個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
　細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
　本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートの第３の用途としては、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いて、微生物（細菌、真菌、ウイルス等）又は寄生虫を培養することが挙げられる。本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いて微生物又は寄生虫を培養することにより、腸管上皮細胞への微生物又は寄生虫の感染性を解析することができる。また、感染性がある場合には、微生物又は寄生虫の維持又は増殖能を確認することができる。また、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いて微生物又は寄生虫を培養することにより、繰り返し増殖する微生物又は寄生虫を得ることができる。さらに、病原性微生物の感染状態を再現し、治療薬のスクリーニングに利用したり、微生物又は寄生虫が産生する物質の腸管細胞へ与える影響を再現し、生体小腸に有用もしくは有害な物質のスクリーニング等を行うことができる。
　微生物又は寄生虫の具体例としては、大腸菌、乳酸菌、ビフィズス菌、腸炎ビブリオ菌、サルモネラ菌、各種腸内細菌、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、サッポロウイルス、ノロウイルス、ＨＩＶ、コロナウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートの第４の用途としては、本発明の腸管上皮細胞又は細胞シートを用いた共培養モデルが挙げられる。上記した共培養モデルによれば、生体組織の構造を再現し、他の細胞との相互作用を解析することができる。また、上記した共培養モデルによれば、疾患の病態を再現し、治療薬のスクリーニングを行うことができる。
　共培養する細胞としては、霊長類又はげっ歯類の生体内に存在する細胞種で、特に小腸周辺に存在する細胞が好ましい。例えば、肝細胞、すい臓、血管内皮細胞、免疫細胞、神経、線維芽細胞、筋細胞、間質系細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。共培養する細胞は、霊長類又はげっ歯類由来の株化細胞でもよい。例えば、Ｈｅｌａ細胞やＴＨＰ－１細胞などの不死化細胞株、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞及びこれらから分化した細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　共培養モデルにおいて試験することができる被験物質としては、様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。医薬や栄養食品等の既存成分あるいは候補成分も好ましい被験物質である。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。またこれらの２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
＜ヒトｉＰＳ細胞の培養＞
　ヒト繊維芽細胞からYu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007に記載の方法で作製したｉＰＳ細胞（富士フイルム・セルラー・ダイナミクスより供与されたＦＦ－１株）をマトリゲル（登録商標）コートした６ウェルプレートもしくは１００ｍｍディッシュ上に播種し、５％Ｏ２条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）の継代は３～５日培養後、１：３～１：１０のスプリット比で行った。継代後４８時間は培地を交換せず、それ以降は毎日交換した。
＜ヒトｉＰＳ細胞の腸管上皮細胞への分化誘導＞
　比較例１、実施例１～５の分化培養方法の概要を図１に示す。
比較例１
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、国際公開第２０１４／１６５６６３号パンフレットに記載の方法に準じて、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ存在下での培養、並びにＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＥＧＦ存在下での培養の合計で７日間（０日目～７日目）培養し、さらに、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で４日間（７日目～１１日目）の培養を行い、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめマトリゲル（登録商標）にてコートしたセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，　＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、１０μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間（１１日目～１２日目）培養した。さらに、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを含む培地で１８日間培養することで腸管上皮細胞へ分化誘導した。その後さらに、５μｍｏｌ／Ｌ　５－ａｚａ－２’ｄｃ、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＤ９８０５９、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１を上記培地に添加して１３日間（１８日目～３１日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
実施例１
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、比較例１と同様の条件で細胞を剥離し、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、１０％ＫＳＲ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１、３μｍｏｌ／Ｌ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間（１１日目～１４日目）培養した。
　その後、比較例１と同様の条件で６日間（１４日目～２０日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１７日間（２０日目～３７日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
実施例２
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、比較例１と同様の条件で細胞を剥離し、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、１０％ＫＳＲ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１、５００ｎｇ／ｍＬ　Ｗｎｔ３ａを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間（１１日目～１４日目）培養した。
　その後、比較例１と同様の条件で６日間（１４日目～２０日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１７日間（２０日目～３７日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
実施例３
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、比較例１と同様の条件で細胞を剥離し、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、１０％ＫＳＲ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１、５μｍｏｌ／Ｌ　ＴＷＳ１１９を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間（１１日目～１４日目）培養した。
　その後、比較例１と同様の条件で６日間（１４日目～２０日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１７日間（２０日目～３７日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
実施例４
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、比較例１と同様の条件で細胞を剥離し、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、１０％ＫＳＲ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１、５μｍｏｌ／Ｌ　ＢＩＯを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間（１１日目～１４日目）培養した。
　その後、比較例１と同様の条件で６日間（１４日目～２０日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１７日間（２０日目～３７日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
実施例５
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、比較例１と同様の条件で細胞を剥離し、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５３４９５）上の半透膜に、２.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種した。さらに、１０％ＫＳＲ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２μｍｏｌ／Ｌ　Ｙ－２７６３２、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１、２．５μｍｏｌ／Ｌ　ＢＩＯを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間（１１日目～１４日目）培養した。
　その後、比較例１と同様の条件で６日間（１４日目～２０日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１７日間（２０日目～３７日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
　比較例１及び実施例１～５は、ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１株）を１１日間培養した時点で細胞密度は１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であった。
＜試験例１＞
　比較例１、実施例１～３の途中で得られた腸管幹細胞の細胞密度を評価した。比較例１（１２日目）、実施例１～３（１４日目）で得られた腸管幹細胞について、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで浸漬し、固定及び膜透過処理を行った。その後ＤＡＰＩを添加して室温５分で染色し、Ｄ－ＰＢＳで置換してから蛍光顕微鏡にて観察を行った。ＤＡＰＩで染色された核数をカウントすることで、細胞密度を算出した。結果を表１に示す。比較例１に対し、実施例１及び３は高い腸管幹細胞密度を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例２
　比較例１、実施例１～３の途中で得られた腸管幹細胞のＥｄＵ陽性率を評価した。比較例１（１２日目）、実施例１～３（１４日目）で得られた腸管幹細胞について、ＥｄＵを添加して２４時間培養後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで浸漬し、固定及び膜透過処理を行った。その後Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ　ＥｄＵ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添付マニュアルに従って染色し、蛍光顕微鏡にて観察を行った。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ　ＥｄＵ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｋｉｔｓで染色された核数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で染色された核数で除することで、ＥｄＵ陽性率を算出した。結果を表２に示す。比較例１に対し、実施例１は高いＥｄＵ陽性率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例３
　比較例１、実施例１～３で得た腸管上皮細胞の細胞密度を評価した。分化誘導終了後、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで浸漬し、固定及び膜透過処理を行った。その後ＤＡＰＩを添加して室温５分で染色し、Ｄ－ＰＢＳで置換してから蛍光顕微鏡にて観察を行った。ＤＡＰＩで染色された核数をカウントすることで、細胞密度を算出した。結果を表３に示す。比較例１に対し、実施例１～３は高い腸管上皮細胞密度を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
試験例４
　比較例１、実施例１～５で得た腸管上皮細胞の細胞形態を評価した。分化誘導終了後、２．５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液により固定した。セルカルチャーインサートから細胞が接着したメンブレンを切り出し、パラフィンで包埋した。切片厚を２～３μｍで薄切し、ヘマトキシリン３Ｇ及びエオジンにより染色した。封入剤（パラマウント、ファルマ）を使用した後に観察を実施した。細胞の最長径が、核の最長径の３倍以上である細胞を円柱状細胞とし、切片全体に占める円柱状細胞の割合を評価した。結果を表４に示す。比較例１は円柱状細胞が０％であったのに対し、実施例１～５は円柱状細胞が２０～１００％の割合を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、薄切した切片についてスライドスキャナーで取得した画像を図２（比較例１）、図３（実施例１）、図４（実施例３）、図５（実施例４）、及び図６（実施例５）に示す。実施例１、３、４及び５は比較例１に対し、円柱状の細胞形態を示し、生体小腸により近い形態であることがわかった。
試験例５
　比較例１、実施例１～５で得た腸管上皮細胞シートの面積当たりのＣＹＰ３Ａ４活性をミダゾラムの代謝産物の量から測定した。分化誘導終了後、５μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含む培地で３７℃にてインキュベーションし、２時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメーター（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定した培地中の１’－ヒドロキシミダゾラムの量より算出した。結果を表５に示す。比較例１に対し、実施例１～５は高い細胞シートの面積当たりのミダゾラム代謝産物量を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例６
　比較例１、実施例１～５で得た腸管上皮細胞のミダゾラム透過性を評価した。分化誘導終了後、ａｐｉｃａｌ側にＨＢＳＳ（ｐＨ６．５）を、側底（basolatera1）側にＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）を添加し、３７℃にて６０分間プレインキュベートした。その後、１０μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含むＨＢＳＳ（ｐＨ６．５）をａｐｉｃａｌ側に添加し、側底（basolatera1）側にはＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。１５分毎にサンプルを側底（basolatera1）側から回収した。各化合物（未変化体）の量を、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメーター（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて定量した。定量結果から、見かけの透過係数（Ｐａｐｐ）を算出した。結果を表６に示す。実施例１～５は、比較例１に対し、見かけの透過係数（Ｐａｐｐ）の低下を示したことから、動態予測精度が改善したといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
試験例７
　試験例６で得られた実施例４の見かけの透過係数にスケーリングファクターｘを用いることにより見かけの透過係数が補正された。この際、以下の式を用いた。
単位時間当たりの透過量＝（基　Ｂ６０－　ｘ×代謝阻害剤の添加有無による基　Ｂ６０の差）／透過時間
　スケーリングファクターを用いることにより、本発明の小腸細胞シートを用いた場合に得られる見かけの透過係数が、生体小腸組織を用いて求めた見かけの透過係数により近い値となった。これにより動態予測精度が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
試験例８
　実施例４において、式１に試験例６を行った際に得られる実験数値を代入することで簡易的に算出したＦｇが０．８３であることがわかった。
Ｆｇ＝４３１／（４３１＋９１）＝０．８３
　式２においてスケーリングファクターｘを用いてＦｇを補正したところ、以下の表のとおり、補正結果が得られた。
Ｆｇ＝４３１／（４３１＋９１×ｘ）・・（式２）
　ｘ＝４～１２でＦｇを補正したところ、ミダゾラムの見かけのＦｇは０．２８～０．５４となり、生体小腸のＦｇである０．３６９～０．５と同等のＦｇが算出され、予測精度が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  

Claims (23)

  1. 　多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる第一の分化工程；
    　分化工程で得た腸管幹細胞を増殖させる増殖工程；及び
    　増殖工程で得た腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる第二の分化工程；
    を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、
    　増殖工程が、
    第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が３０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上になる工程；
    第一の分化工程で得た腸管幹細胞の密度が、第一の分化工程直後の密度と比べて２.０倍以上になる工程；
    第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が９０％以上になる工程；又は
    第一の分化工程で得た腸管幹細胞のＥｄＵ陽性の割合が、第一の分化工程直後の割合と比べて３倍以上になる工程；
    のうちの何れかである、腸管上皮細胞の製造方法。
  2. 増殖工程が、腸管幹細胞をＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ－３β阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項１に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  3. 増殖工程が、腸管幹細胞をＧＳＫ－３β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養する工程を含む、請求項１に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  4. 第一の分化工程の終了時の細胞密度が５.０×１０４細胞／ｃｍ２～２０×１０４細胞／ｃｍ２である、請求項１から３の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  5. 増殖工程において、第一の分化工程で得た腸管幹細胞を、１．１～３．３倍の細胞密度になるように容器に播種した後に、腸管幹細胞を培養して増殖させる、請求項１から４の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  6. 増殖工程を、１～１０日間行う、請求項１から５の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  7. 増殖工程及び第二の分化工程を、３容量％～１００容量％の細胞外マトリクスでコーティングした培養容器上で行う、請求項１から６の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  8. 増殖工程及び第二の分化工程を、１％～１０％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行う、請求項１から６の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  9. 増殖工程及び第二の分化工程を、細胞のbasolatera1側のみに１％～１０％の細胞外マトリクスが添加された培地中において行う、請求項８に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  10. 第二の分化工程が、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦ及びｃＡＭＰ活性化物質の存在下において腸管幹細胞を腸管上皮細胞へ分化させる工程を含む、請求項１から９の何れか一項に記載の腸管上皮細胞の製造方法。
  11. 請求項１から１０の何れか一項に記載の方法により製造される腸管上皮細胞。
  12. 請求項１１に記載の腸管上皮細胞を含む細胞シート。
  13. 腸管上皮細胞における円柱腸管上皮細胞の割合が１０％以上である、多能性幹細胞由来の腸管上皮細胞を含む細胞シート。
  14. 細胞密度が、５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上である、請求項１３に記載の細胞シート。
  15. ５μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含む培地で３７℃にて２時間インキュベーションした後の面積当たりのミダゾラム代謝産物量が、細胞シートの面積あたり３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上である、請求項１３又は１４に記載の細胞シート。
  16. 蛋白質量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性が４００～２５００ｐｍｏｌ／２ｈｒ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎである、請求項１３から１５の何れか一項に記載の細胞シート。
  17. ミダゾラムの見かけの透過係数が、４０×１０－６ｃｍ／ｓ以下である、請求項１３から１６の何れか一項に記載の細胞シート。
  18. 請求項１１に記載の腸管上皮細胞又は請求項１２から１７の何れか一項に記載の細胞シートに被験物質を接触させることを含む、被験物質の評価方法。
  19. スケーリングファクターを用いて見かけの透過係数を補正することを含む、請求項１８に記載の被験物質の評価方法。
  20. スケーリングファクターを用いてＦｇを補正することを含む、請求項１８に記載の被験物質の評価方法。
  21. スケーリングファクターが０．１～５００である、請求項１９又は２０に記載の被験物質の評価方法。
  22. 請求項１１に記載の腸管上皮細胞又は請求項１２から１７の何れか一項に記載の細胞シートを含む、被験物質のスクリーニングキット。
  23. 請求項１１に記載の腸管上皮細胞又は請求項１２から１７の何れか一項に記載の細胞シートを含む、細胞製剤。
     
PCT/JP2021/023893 2020-06-25 2021-06-24 腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用 WO2021261540A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022532526A JP7506746B2 (ja) 2020-06-25 2021-06-24 腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用
EP21828039.4A EP4174170A4 (en) 2020-06-25 2021-06-24 METHOD FOR PRODUCING INTESTINAL EPITHELIAL CELLS AND USE THEREOF
CN202180044315.4A CN115768874A (zh) 2020-06-25 2021-06-24 肠上皮细胞的制造方法及其利用
US18/146,198 US20230126568A1 (en) 2020-06-25 2022-12-23 Production method for intestinal epithelial cells and utilization thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-109311 2020-06-25
JP2020109311 2020-06-25
JP2020203679 2020-12-08
JP2020-203679 2020-12-08

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/146,198 Continuation US20230126568A1 (en) 2020-06-25 2022-12-23 Production method for intestinal epithelial cells and utilization thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021261540A1 true WO2021261540A1 (ja) 2021-12-30

Family

ID=79281337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/023893 WO2021261540A1 (ja) 2020-06-25 2021-06-24 腸管上皮細胞の製造方法、及びその利用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230126568A1 (ja)
EP (1) EP4174170A4 (ja)
JP (1) JP7506746B2 (ja)
CN (1) CN115768874A (ja)
WO (1) WO2021261540A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024112170A1 (ko) * 2022-11-24 2024-05-30 한국생명공학연구원 박막 코팅된 표면 위에서 장 줄기세포를 무이종 배양하는 법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014132933A1 (ja) * 2013-02-26 2014-09-04 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法
WO2014165663A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
WO2018151307A1 (ja) 2017-02-20 2018-08-23 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞の維持培養
WO2019156200A1 (ja) 2018-02-09 2019-08-15 公立大学法人名古屋市立大学 多能性幹細胞から腸管上皮細胞への分化誘導方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014132933A1 (ja) * 2013-02-26 2014-09-04 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法
WO2014165663A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
WO2018151307A1 (ja) 2017-02-20 2018-08-23 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞の維持培養
WO2019156200A1 (ja) 2018-02-09 2019-08-15 公立大学法人名古屋市立大学 多能性幹細胞から腸管上皮細胞への分化誘導方法

Non-Patent Citations (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual", 1994, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
A-L. UNGEL ET AL., EUR. J. PHRM. SCI., vol. 48, 2013, pages 166
BAGUISI ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 17, 1999, pages 456
CAS , no. 1135306-29-4
CHUNG Y. ET AL., CELL STEM CELL, vol. 2, 2008, pages 113 - 117
CIBELLI ET AL., SCIENCE, vol. 280, 1998, pages 1256 - 1147
IRIYA ET AL., PROTEIN NUCLEIC ACID ENZYME, vol. 44, 1999, pages 892
KIM DKIM C HMOON J I ET AL., CELL STEM CELL, vol. 4, 2009, pages 472 - 476
KIM ET AL., CELL STEM CELL, vol. 1, 2007, pages 346 - 352
KIM J B ET AL., CELL, vol. 136, no. 3, 2009, pages 411 - 419
KIM J B ET AL., NATURE, vol. 454, no. 7204, 2008, pages 646 - 650
KLIMANSKAYAI. ET AL., NATURE, vol. 444, 2006, pages 481 - 485
MATSUI ET AL., CELL, vol. 70, 1992, pages 841 - 847
NAKAGAWA M ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, no. 11, 2008, pages 1269 - 1275
NAKAJIMA ET AL., STEM CELLS, vol. 25, 2007, pages 983 - 985
NATURE GENETICS, vol. 22, 1999, pages 127
PHARM RES, vol. 29, no. 3, March 2012 (2012-03-01), pages 651
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 96, 1999, pages 14984
REVAZOVA ET AL., CLONING STEM CELLS, vol. 10, 2008, pages 11 - 24
REVAZOVA ET AL., CLONING STEM CELLS, vol. 9, 2007, pages 432 - 449
RIDEOUT III ET AL., NATURE GENETICS, vol. 24, 2000, pages 109
See also references of EP4174170A4
SHAMBLOTT ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 9523, 1998, pages 13726 - 13731
SILVA J ET AL., PLOS. BIOL., vol. 6, no. 10, 2008, pages e253
STADTFELD M ET AL., SCIENCE, vol. 322, no. 5903, 2008, pages 949 - 953
STRELCHENKO N. ET AL., REPROD BIOMED ONLINE, vol. 9, 2004, pages 623 - 629
TACHIBANA ET AL.: "Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer", CELL, 2013
TAKAHASHI KYAMANAKA S, CELL, vol. 126, no. 4, 2006, pages 663 - 676
TAKAHASHI, K ET AL., CELL, vol. 131, no. 5, 2007, pages 861 - 72
TAKAYAMA K. ET AL., CELL. MOL. GASTROENTEROL. HEPATOL., vol. 8, 2019, pages 513 - 526
TAKENAKA T. ET AL., DRUG METAB DISPOS, vol. 42, no. 1947, 2014, pages 54
TURNPENNY ET AL., STEM CELLS, vol. 21, no. 5, 2003, pages 598 - 609
WAKAYAMA ET AL., NATURE, vol. 394, 1998, pages 369
WASSARMAN, P. M. ET AL., METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 365, 2003
WILMUT ET AL., NATURE, vol. 385, 1997, pages 810
WOLTJEN KMICHAEL I PMOHSENI P ET AL., NATURE, vol. 458, 2009, pages 771 - 775
YU J ET AL., SCIENCE, vol. 318, no. 5858, 2007, pages 1917 - 1920
YU JHU KSMUGA-OTTO KTIAN S ET AL., SCIENCE, vol. 324, 2009, pages 797 - 801
YUSA KRAD RTAKEDA J ET AL., NAT METHODS, vol. 6, 2009, pages 363 - 369
ZHANG X. ET AL., STEM CELLS, vol. 24, 2006, pages 2669 - 2676

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024112170A1 (ko) * 2022-11-24 2024-05-30 한국생명공학연구원 박막 코팅된 표면 위에서 장 줄기세포를 무이종 배양하는 법

Also Published As

Publication number Publication date
US20230126568A1 (en) 2023-04-27
JPWO2021261540A1 (ja) 2021-12-30
JP7506746B2 (ja) 2024-06-26
CN115768874A (zh) 2023-03-07
EP4174170A1 (en) 2023-05-03
EP4174170A4 (en) 2023-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6949336B2 (ja) 人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞の維持培養
JP7367992B2 (ja) 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法
JP7317323B2 (ja) 多能性幹細胞から腸管上皮細胞への分化誘導方法
WO2012056997A1 (ja) 多能性幹細胞の分化誘導効率を改善するための方法及び培地
KR20200004815A (ko) 다능성줄기세포 유래 장관 오가노이드의 제작법
JP6937036B2 (ja) 人工多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導
US20230126568A1 (en) Production method for intestinal epithelial cells and utilization thereof
WO2022168908A1 (ja) 多能性幹細胞由来の陰窩－絨毛様構造を有する腸管細胞の製造方法及びその用途
JP7058330B2 (ja) 腸管上皮細胞の製造方法および腸管上皮細胞
JP2022019411A (ja) 人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法及びその利用
WO2023074648A1 (ja) 腸内分泌細胞を製造する方法、多能性幹細胞由来の腸内分泌細胞、培地又は培地キット、およびそれらの利用
WO2020095879A1 (ja) 多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21828039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022532526

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021828039

Country of ref document: EP

Effective date: 20230125