JP7367992B2 - 多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの作製法 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程(1)~(5)を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法:
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程;
(4)工程(3)後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(5)工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程。
[2]基底膜成分をコートした培養面を用いて工程(3)の培養を行う、[1]に記載の作製方法。
[3]前記基底膜成分がラミニン511又はそのE8断片である、[2]に記載の作製方法。
[4]工程(3)において継代操作を行う、[1]~[3]のいずれか一項に記載の作製方法。
[5]前記継代操作の回数が1回又は2回である、[4]に記載の作製方法。
[6]線維芽細胞増殖因子がFGF2、FGF4又はFGF10であり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、GSK-3β阻害剤がCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin又は1-Azakenpaulloneであり、ROCK阻害剤がY-27632である、[1]~[5]のいずれか一項に記載の作製方法。
[7]工程(3)の培養期間が2日間~14日間である、[1]~[6]のいずれか一項に記載の作製方法。
[8]工程(4)の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、[1]~[7]のいずれか一項に記載の作製方法。
[9]水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程(5)の培養に用い、工程(4)で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、[1]~[8]のいずれか一項に記載の作製方法。
[10]前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、[9]に記載の作製方法。
[11]前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、[9]に記載の作製方法。
[12]BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、[1]~[11]のいずれか一項に記載の作製方法。
[13]工程(5)の培養期間が12日間~36日間である、[1]~[12]のいずれか一項に記載の作製方法。
[14]工程(5)の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、[1]~[13]のいずれか一項に記載の作製方法。
[15]工程(5)の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で行う、[1]~[13]のいずれか一項に記載の作製方法。
[16]前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、[1]~[15]のいずれか一項に記載の作製方法。
[17]前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、[1]~[15]のいずれか一項に記載の作製方法。
[18]前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、[17]に記載の作製方法。
[19][1]~[18]のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイド。
[20][19]に記載の腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[21]前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、[20]に記載の評価方法。
[22]以下の工程(I)及び(II)を含む、[19]に記載の方法:
(I)[19]に記載の腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
[23][1]~[17]のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイドに腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
[24][19]に記載の腸管オルガノイドを含む、移植材料。
[25]以下の工程(1)~(6)を含む、多能性幹細胞から腸管細胞層を作製する方法:
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程;
(4)工程(3)後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(5)工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程;
(6)工程(5)で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する工程。
[26]工程(6)の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質の存在下で行う、[25]に記載の作製方法。
[27]工程(6)の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、[25]に記載の作製方法。
[28]工程(6)の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とGSK-3β阻害剤の存在下で行う、[25]に記載の作製方法。
[29]工程(6)の平面培養の少なくとも一部を気液培養にする、[25]に記載の作製方法。
[30]前記気液培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMPシグナルを活性化する因子の存在下で行う、[29]に記載の作製方法。
[31]前記因子がcAMP誘導体、cAMP分解酵素阻害剤又はcAMP活性化物質である、[30]に記載の作製方法。
[32]前記因子がフォルスコリンである、[30]に記載の作製方法。
[33][25]~[32]のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管細胞層。
[34][33]に記載の腸管細胞層を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[35]前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、[34]に記載の方法。
[36]以下の工程(i)~(iii)を含む、[34]又は[35]に記載の方法:
(i)[33]に記載の腸管細胞層を用意する工程;
(ii)前記腸管細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記腸管細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を評価する工程。
[37]以下の工程(I)及び(II)を含む、[34]又は[35]に記載の方法:
(I)[33]に記載の腸管細胞層に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。
[38][25]~[32]のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管細胞層に腸疾患の病態を誘導することを特徴とする、腸疾患モデルの作製方法。
本発明は多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法(以下、「本発明の作製方法」とも呼ぶ。)に関する。本発明によれば、生体の腸管組織と類似の特性を示す(腸管組織を模倣した)3次元組織構造体である腸管オルガノイドが得られる。
この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/mL~200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL~150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物(Knockout serum replacement(KSR)など)を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)~10%(v/v)である。
この工程では、工程(1)で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。工程(1)に供する多能性幹細胞としてヒト細胞を用いた場合には、好ましくは、FGF4(線維芽細胞増殖因子4)とWntアゴニスト(例えばWnt3a、BML-284、2-Amino-4-(3,4-(methylenedioxy)benzylamino)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine等)の存在下で培養を行う。FGF4として好ましくはヒトFGF4(例えばヒト組換えFGF4)を用いる。一方、工程(1)に供する多能性幹細胞としてカニクイザル細胞やアカゲザル細胞、チンパンジー細胞等を用いた場合には、好ましくは、FGF2(線維芽細胞増殖因子2)とGSK-3阻害剤(例えばCHIR99021、CHIR98014、BIO、SB415286、SB216763、TWS119、A1070722等)の存在下で培養を行う。FGF2として例えばヒトFGF2(例えばヒト組換えFGF2)を用いる。
この工程では、工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する。理論に拘泥する訳ではないが、後述の実験結果を踏まえると、当該工程を、「幹細胞性を維持させつつ腸管へと分化方向を誘導する段階」として理解することができる。この工程を経ることは、最終的に得られる腸管オルガノイドの形態(絨毛-クリプト様構造を示す)及び機能(腸管マーカーや薬物トランスポーターが成人小腸に近い遺伝子発現を示す)に重要であり、本発明の最大の特徴の一つといえる。
この工程では、工程(3)を経た細胞を培養し、スフェロイドを形成させる。スフェロイドを形成させるためには浮遊培養が適する。浮遊培養では、通常、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面(例えば、ポリマー材料やハイドロゲル等の処理/結合により細胞低接着性/細胞非接着性が付与された培養面)を備える培養容器が使用され、培養面から離れた状態(即ち浮遊状態)で細胞を培養する。浮遊培養に用いる培養容器は特に限定されず、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、チューブ、トレイ、培養バック等を用いることができる。好ましくは、細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に均一な形状及び大きさの複数のウェルが形成された培養容器(一般にパターンプレートと呼ばれる。具体例として、AGCテクノグラス株式会社が提供するEZSPHERE(登録商標)、株式会社クラレが提供するElplasia等を挙げることができる)を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる。このようにすれば、効率よくスフェロイドを形成させることができ、ひいては腸管オルガノイドの作製効率が向上する。
この工程では、工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる。この工程において積極的な分化誘導は必須ではなく、一態様(第1態様)では工程(4)と同一又は類似の培地条件で培養を行う。具体的には、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下、即ち、これらの成分が添加された培地を用いて培養する。各化合物の具体例や添加濃度も工程(4)の場合と同様である。尚、工程(5)の期間(培養期間)は例えば12日間~36日間である。
この工程は、4種の低分子化合物(MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤)の組合せによる積極的な分化誘導を促す前の準備の段階として位置付けることができる。この工程を介在させることにより、スフェロイドの成長が促され、機能的な腸管オルガノイドの構築に有利となる。この工程の培養は、工程(4)と同条件(即ち、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での浮遊培養)で行うことができるが、好ましくは、水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料(粘性材料)を添加した液体培地を用い、工程(4)で形成させた複数のスフェロイドをまとめて浮遊培養することで、操作性及び効率性の向上を図る。
この工程では、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での浮遊培養を行い、積極的な分化誘導を促し、腸管オルガノイドを形成させる。培養条件は上記工程(5-1)の培養条件と同様であるため、その説明を省略する。
<培養工程A>
培養工程Aでは、(a-1)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養と、当該培養に続く、(a-2)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。即ち、cAMPが細胞へ供給される条件の有無で異なる2段階の培養を行う。このようにすれば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。(a-1)の培養の期間は例えば1日間~5日間である。同様に、(a-2)の培養の期間は例えば3日間~15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Bでは、(b-1)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、当該培養に続く、(b-2)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を行う。このように、cAMPが細胞へ供給される条件で培養した後、cAMP分解酵素阻害剤が存在する条件で培養すると、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。(b-1)の培養の期間は例えば3日間~15日間である。同様に、(b-2)の培養の期間は例えば3日間~15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Cでは、(c-1)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。(c-1)の培養の期間は例えば3日間~15日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
<培養工程A>
培養工程Aでは、(a-1)上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、(a-2)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及び上皮成長因子の存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(a-1)の培養の期間は例えば2日間~10日間、好ましくは4日間~8日間であり、(a-2)の培養の期間は例えば9日間~29日間、好ましくは7日間~27日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Bでは、(b-1)上皮成長因子の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、(b-2)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(b-1)の培養の期間は例えば2日間~10日間、好ましくは4日間~8日間であり、(b-2)の培養の期間は例えば9日間~19日間、好ましくは7日間~17日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Cでは、(c-1)上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、(c-2)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(c-1)の培養の期間は例えば2日間~10日間、好ましくは4日間~8日間であり、(c-2)の培養の期間は例えば9日間~19日間、好ましくは7日間~17日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Dでは、(d-1)MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、上皮成長因子及び細胞内cAMP合成促進剤の存在下での培養を行う。この培養工程は、培養操作が簡便であること、腸管上皮細胞への分化に対してより効果的であること、化合物であるため安定した効果が期待できること等の点で特に有利である。(d-1)の培養の期間は例えば15日間~25日間、好ましくは17日間~23日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
本発明は別の局面として、生体の腸管組織と類似の特性を示す腸管細胞層を作製する方法(以下、「本発明の腸管細胞層作製方法」とも呼ぶ)を提供する。本発明の腸管細胞層作製方法は、上記局面で得られる腸管オルガイドを利用するものであり、腸管オルガノイドを平面培養に供し(即ち、2次元培養系への移行・変換)、細胞層を形成させる。具体的には、本発明の腸管細胞層作製方法は以下の工程(1)~(6)によって特徴付けられる。
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程
(4)工程(3)後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程
(5)工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程
(6)工程(5)で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で平面培養する工程
本発明の第2の局面は本発明の作製方法で得られた腸管オルガノイドの用途に関する。第1の用途として各種アッセイが提供される。本発明の腸管オルガノイドは腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態(吸収、代謝など)の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管オルガノイドは、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
本発明の更なる局面は腸管細胞層の用途に関する。腸管細胞層は、腸管オルガノイドと同様、腸管(特に小腸)での薬物動態(吸収、代謝など)の評価や毒性の評価に有用である。腸管細胞層を利用したアッセイは二次元評価系となり、よりハイスループットな解析を可能にする。
機能的な腸管オルガノイドを作製する新規方法の創出を目指し、以下の検討を行った。尚、二次元培養系(平面培養)がハイスループット解析に有用であることに注目し、作製した腸管オルガノイドから細胞を回収し、病態モデル及び薬物スクリーニングに利用可能な二次元の評価モデルの作製が可能であるかについても検討した。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3~5日培養後、1:2~1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈したマトリゲル(成長因子除去)にてコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure(登録商標) hPSC 培地にて培養し、未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、500 ng/mL FGF4、3 μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40 μmナイロンメッシュのセルストレーナーにて細胞塊を砕き、PBS(-)にて0.16 μg/mLに希釈した iMatrix 511 silkをコーティングした100 mm dish 上に2.0×106細胞を播種した。細胞は、1% グルタマックス、10% KSR、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子(EGF)、30 ng/mL FGF2、0.5 μmol/L A-83-01、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で培養した。その後、2日毎に、最大2回、細胞をアキュターゼにて剥離し、PBS(-)にて0.16 μg/mLに希釈した iMatrix 511 silkをコーティングした100 mm dish上に2.0×106細胞を播種した。細胞は、1% グルタマックス、10% KSR、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子(EGF)、30 ng/mL FGF2、0.5 μmol/L A-83-01、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で培養した。2あるいは3日後、同様に剥離した後、3.0×106細胞を100 mm EZSPHERE(登録商標)上に播種した。その後、1% グルタマックス、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10 μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で2日間培養後、1% グルタマックス、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%を含むAdvanced-DMEM/F12で21日間超低接着100 mm dish上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。以下の実験では、分化誘導7日目にてEZSPHERE(登録商標)上に細胞を播種し、腸管オルガノイドを形成した群をコントロール群とした。尚、以上の培養方法(分化プロトコール)の概要を図9に示す。
低分子化合物(PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT)を非添加の条件、又は低分子化合物(PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT)を添加の条件で腸管オルガノイドへ、もしくは新規培養法に依り作製した高機能腸管オルガノイド(19~34日間培養したもの)に対してY27632を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて24時間処理した細胞を細胞剥離液(0.05%トリプシン-EDTA)にて剥離し、40 μmナイロンメッシュのセルストレーナーにて細胞塊を砕いた。iMatrix 511 silkをコーティングしたトランズウェル(登録商標)インサートもしくはマルチウェルプレート上に3.0×105cells/cm2の濃度で細胞を播種した。播種後24時間Y-27632(10 μM)で処理した。その後、培地7(図9参照)で6~14日間培養した。培養の際、様々な化合物を添加し、最適な条件を探索した。
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を用いて補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、HE染色では、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。アルシアンブルー染色では、pH2.5におけるアルシアンブルーを染色し、核染色としてヌクレアファストレッドを使用した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
α-SMA(alpha-smooth muscle actin。平滑筋マーカー)
ABCB1/P-gp(ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1、P糖タンパク質。排出トランスポーター)
ABCG2/BCRP(ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク。排出トランスポーター)
APOB(アポリポタンパク質B。小腸で主に合成され、小腸からの脂質吸収に必須な役割を担う)
APOC3(アポリポタンパク質C3。小腸で主に合成され、小腸からの脂質吸収に必須な役割を担う)
BRACHYURY(Tボックスとよばれる新規のDNA結合ドメインをもつ転写制御因子をコードし、後方中胚葉の形成に重要)
Caspase-3(Cas)(カスパーゼ3。アポトーシスの実行に関わるタンパク質)
CD34(細胞表面糖タンパク質。中胚葉系に由来する造血、血管内皮前駆細胞マーカー)
CDX2(Caudal-type ホメオボックス2。腸管上皮細胞の増殖・分化に関与している転写因子)
ChromograninA(CHGA)(分泌顆粒中に存在する特異的なタンパク質。腸管内分泌細胞マーカー)
Collagen type 1(colla-1)(細胞外マトリックスの主成分。線維性コラーゲン)
CYP3A4(腸管における主要な薬物代謝酵素)
E-cadherin(E-cad)(上皮カドヘリン。細胞表面に存在する糖タンパク質の一群で、細胞接着をつかさどる分子)
Fibronectin(フィブロネクチン。巨大な糖タンパク質で、細胞接着分子として機能)
FLK1(KDR 活性型キナーゼ。早期中胚葉マーカー)
HOXA13(動物の胚発生の初期において組織の前後軸および体節制を決定する遺伝子HOX。結腸特異的マーカー)
ISX(腸管特異的ホメオボックス。腸管上皮化生や細胞増殖に関与)
LGR5(ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体。腸管幹細胞のマーカー)
Lysozyme(Lyso)(真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素。腸管パネート細胞マーカー)
MUC2(ムチン2糖タンパク。杯細胞マーカー)
Occludin(オクルディン。タイトジャンクション(密着結合)の形成に関わる主要なタンパク質)
SATB2(結腸、直腸上皮細胞に特異的に発現するタンパク質)
SLC15A1/PEPT1(SLC(solute carrier)ファミリー メンバー15A1/ペプチドトランスポーター1。小腸の頂側膜側に発現している)
Villin(ビリン。微絨毛の主要な構成成分。吸収上皮細胞マーカー)
Vimentin(Vim)(ビメンチン。間葉系細胞に特有の中間径フィラメント)
ZO-1(密着結合の形成に関わる主要なタンパク質)
(1)新規腸管オルガノイド作製法による腸管オルガノイドの形態
分化誘導開始から34日後の腸管オルガノイドの形態を観察したところ、コントロール群では、sphericalな構造をしていた(図1A)。継代処理した腸管オルガノイドでは、絨毛-クリプト様構造を有するbuddingな構造をしていた(図1B、C)。継代培養時にGSK3阻害剤としてCHIR99021を使用しているが、他6種のGSK3阻害剤を用いて腸管オルガノイドを作製した。全てのGSK3阻害剤処理をした腸管オルガノイドにおいて、絨毛-クリプト様構造を有するbuddingな構造を確認した(図1D~I)。
分化誘導開始から34日後の腸管オルガノイドの遺伝子発現をコントロール群および成人小腸と比較したところ、吸収上皮細胞マーカーであるvillin、杯細胞マーカーであるMUC2や腸管特異的転写因子であるCDX2、ISXの発現は継代操作を行うことで、非常に高い発現を示した。一方、パネート細胞マーカーであるlysozymeや腸管内分泌細胞マーカーであるchromogranin Aの発現はコントロール群と同程度であった(図2)。
HE染色やアルシアンブルー染色の結果から、腸管オルガノイドは分泌細胞を含む細胞集団であることが分かった(図3A、B)。また、免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞(吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞)のマーカーの発現が認められた(図3C)。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。
腸管オルガノイドでは、小腸マーカーであるAPOB、APOC3の発現が非常に高く、結腸マーカーであるHOXA13、SATB2の発現が低かった(図4)。以上の結果から、腸管オルガノイドは小腸に近い特徴を有している可能性が示唆された。
トランスポーターであるPEPT1遺伝子発現は成人小腸に近い値を示したが、P-gpの発現はやや低かった(図5A)。免疫蛍光染色の結果から、タイトジャンクションタンパク質であるoccludinやZO-1、薬物トランスポーターであるPEPT1やBCRPの発現は腸管オルガノイドの管腔に沿って局在していることが確認された(図5B)。以上の結果から、小腸で発現する薬物トランスポーターが確認され、さらに、腸管オルガノイドの管腔側が刷子縁膜側に相当することが示唆された。また、形態学的な観察により、腸管オルガノイドは絨毛様構造を有していることが示唆された。
分化誘導時のEZSPHEREへ播種する直前のそれぞれの細胞の状態について、mRNA発現を解析した。その結果、腸管特異的転写因子であるCDX2の発現は、継代操作や培地5の影響によらず同程度であったが、中胚葉系マーカーであるBRACHYURY、CD34、FLK1の発現は培地5を用いて培養することで下がり、さらに継代操作を行うことでその発現はさらに減少した(図6)。以上の結果から、培地5と継代操作を合わせて行うことで、選択的に腸管へと分化方向が誘導される可能性が示唆された。
新規分化誘導法による腸管オルガノイドを用いて、炎症性腸疾患モデルが作製可能か検討するため、主要な要因とされている炎症性サイトカインであるTNF-αを分化誘導終了34日目から96時間添加した(図7A)。TNF-αを添加することでvillin、MUC2の遺伝子発現が減少し、TNF-αの発現は増加した。また、その発現変動は抗TNF-α抗体であるインフリキシマブにより抑制された(図7B)。次に、免疫蛍光染色にて、タイトジャンクションタンパク質およびアポトーシスマーカーの発現を確認した。TNF-αを添加することでタイトジャンクション構造が崩れている様子が観察された。また、Caspase-3陽性細胞数も増加していた。さらに、これらの変化はインフリキシマブ添加群では認められなかった(図7C)。炎症性腸疾患では、生体内で、炎症性サイトカイン等の影響により、腸管上皮細胞が障害を受けることで、タイトジャンクションが崩れ、粘液分泌細胞である杯細胞が減少することが報告されている。したがって、TNF-α添加により、in vitro評価系において、簡便に炎症性腸疾患の病態モデルを作製でき、薬物スクリーニングにも利用可能である可能性が示唆された。
炎症性腸疾患において慢性的に引き起こされる炎症によって進行する組織の線維化をin vitroで再現するため、主要な要因とされているTNF-αとTGF-βを分化誘導終了34日目から48時間添加した(図8A)。TNF-αとTGF-βを添加することで、線維化マーカーであるα-SMA、vimentin、fibronectin、collagen type 1のmRNA発現が増加した。一方、上皮細胞マーカーであるE-cadherinの発現は減少した。さらに、これら線維化マーカーの発現変動は、TGF-β阻害剤であるSB431542とRepsoxにより抑制された(図8B)。以上の結果から、TNF-αとTGF-βの添加により、線維化症モデルの作製が可能であることが示唆された。また、線維化マーカーが増加し、上皮細胞マーカーが減少したことから線維化に関わる上皮間葉転換を再現できる可能性が示唆された。
信頼性や正確性がより高い薬物スクリーニング系等への利用に向け、より生体の機能に近い、即ち高機能な腸管オルガノイドを作製するため、分化に効果的であると考えられる低分子化合物を添加して培養を行った。その結果、CYP3A4やMUC2などのmRNAの発現上昇が認められた(図10)。
病態モデルや薬物スクリーニングにより適した平面培養系を作製するため、腸管オルガノイドから回収した細胞をトランズウェル(登録商標)インサートに播種して細胞層を形成させ、その特性を検討した。腸管オルガノイド作製時に低分子化合物(PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01、DAPT)を添加しなかった群において、いくつかの培養パターンで膜抵抗値の上昇及び安定が認められた(図11B)。低分子化合物添加群においてはすべてのパターンにおいて膜抵抗値の上昇が確認されなかった。ある程度の膜抵抗値の上昇が認められた4つの群においてmRNAの発現量を測定した。フォルスコリンを単独で、又はDAPT若しくはCHIR99021と組み合わせて添加した群において腸管マーカーであるCDX2や腸管幹細胞マーカーであるLGR5が高発現し、CYP3A4やMUC2の発現も確認された(図11A)。以上より、作製した平面培養系は薬物スクリーニングに有用であるといえる。また、フォルスコリン、DAPT、CHIR99021の添加により、さらなる機能の向上も見込めることが示唆された。尚、膜抵抗値の顕著な上昇を認めた条件、即ち、フォルスコリンとDAPTの併用は高機能化に特に有効といえる。
作製した新規平面培養系において、腸管で主要な代謝酵素であるCYP3A4の誘導試験を行った。q PCRでmRNA発現量を比較し薬物応答性を評価した。リファンピシンを処理することで約900倍、活性型ビタミンD3を処理することで約1700倍CYP3A4のmRNA発現量が上昇した(図12)。この結果は、作製した新規平面培養系ではPXRおよびVDRを介して代謝酵素が誘導されることを示唆する。
平面培養開始から24時間以上経過後、インサートの下側(ウェル)のみに培地を加えて気液培養を行った。さらにcAMPシグナルを活性化し、分化誘導の促進を試みた。培地は培地7に低分子化合物を添加したものを使用し、cAMPシグナルを活性化する因子としてはフォルスコリン、8-bromo-cAMP(8-Br-cAMP)及び3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)を使用した。気液培養を行い、cAMPシグナルを活性化することで絨毛様構造を有する平面培養系の作製に成功した(図13B-F)。また、TGF-β阻害剤であるA 83-01を添加しないとき絨毛様構造の形成は見られなかった(図13A)。これらの結果から、平面培養系における組織様構造の構築にcAMPシグナルやTGF-βシグナルが強く関与していると示唆された。
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞から、より生体小腸に近い特徴を有するbuddingな腸管オルガノイドの作製に成功した。作製した腸管オルガノイドでは、腸管マーカーおよび薬物トランスポーターともに成人小腸に近い遺伝子発現を示した。作製した腸管オルガノイドは絨毛-クリプト様構造を有していることが示唆された。また、EZSPEHREと浮遊培養により、均一な腸管オルガノイドの大量培養に成功した。一方、炎症性腸疾患や線維化モデルをそれぞれ疾患の要因となっている主要なサイトカインを添加することで作製でき、これら病態に対する薬物スクリーニング系としても有用である可能性が示唆された。また、作製した腸管オルガノイドを平面培養に移すことで、よりハイスループット解析に有用なモデルを作製できると示唆された。更に、気液培養を行うことにより、絨毛構造を有する高機能な評価系の構築に成功した。この評価系は社会的利用に向けた利便性と評価系としての機能を両立しており、創薬研究、食品関連研究、腸内細菌叢との共培養研究、腸管細胞感染研究等において非常に有用であると考えられる。
分化促進及びより高い機能の獲得、並びに異種動物由来成分を使用しない培養系の構築を目指し、腸管オルガノイドを作製する際、マトリゲルの代替として多糖類ポリマーを使用した培地を用いて浮遊培養を行った。
(1)細胞
ヒトiPS細胞(iPS-51:Windy)は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4(OCT3/4)、sex determining region Y-box 2(SOX2)、kruppel-like factor 4(KLF4)、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog(avian)(c-MYC)を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を使用した。
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清(FBS)、2 mmol/L L-グルタミン(L-Glu)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール(2-MeE)、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)2を含むDMEM Ham’s F-12(DMEM/F12)を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF(6×105 cells/100 mmディッシュ)上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3~5日培養後、1:2~1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ヒトiPS細胞の腸管オルガノイドへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルをコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure(登録商標) hPSC 培地にて培養した。未分化コロニーの占める割合が約80%になった状態で開始した。100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地で1日間、0.2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、2 mmol/L L-Gluを含むRPMI培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、500 ng/mL FGF4、3μmol/L CHIR99021、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI+グルタマックス培地で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。FGF4、CHIR99021処理後、Y-27632(Rho結合キナーゼ阻害剤)を10μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞を0.05%トリプシン-EDTAにて剥離し、40μmナイロンメッシュのセルストレイナーにて細胞塊を砕き、3.0×106細胞を100 mm EZSPHERE(登録商標)上に播種した。その後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL上皮成長因子(EGF)、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、10μmol/L Y-27632を含むAdvanced-DMEM/F12で3日間培養後、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー(脱アシル化ジェランガム)を含むAdvanced-DMEM/F12で24日間超低接着6ウェルプレート上で浮遊培養することで腸管オルガノイドへ分化させた。また、分化開始19日目から34日目まで、以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059(20μmol/L)、5-アザ-2’-デオキシシチジン(5μmol/L)、A-83-01(0.5μmol/L)に加え、5μmol/L N-[(3,5-ジフルオロフェニル) アセチル]-L-アラニル-2-フェニル-1, 1-ジメチルエチルエステル-グリシン(DAPT)を添加した。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、100 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、200 ng/mL R-spondin-1、成長因子を除去したマトリゲル3%もしくは多糖類ポリマー(脱アシル化ジェランガム)を含むAdvanced-DMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を1μmol/Lとなるよう添加し、回収前72時間培養することで行った。多糖類ポリマーは日産化学工業株式会社よりご供与いただいたFP001もしくはFP003を培地中濃度0.015%(w/v)で使用し、腸管オルガノイドへの分化に及ぼす影響について検討した。
総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、Agencourt RNAdvence Tissueの添付マニュアルに従い抽出した。
相補的DNA(cDNA)の合成は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を用いて補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、マイヤーヘマトキシリン及びエオシンアルコールを使用して染色した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、OCTコンパウンドにて凍結包埋した。厚さ10μmの凍結切片を作製後、スライドガラスに貼り付け、抗原の賦活化を行った。5% FBS溶液にて30分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、スライドガラスを洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、核染色として4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いた。封入作業を行い、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをローダミン123を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。HBSSは、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4のものを用いた。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ローダミン123をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドをヘキスト33342を含むHBSSで37℃にてインキュベーションした。インキュベーション終了後、氷冷したPBSで細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。37℃に温めたPBSにて4時間インキュベーションすることにより、ヘキスト33342をオルガノイド外に放出させた。その後、Synergy HTX マイクロプレートリーダーを用いて上清の蛍光強度を測定した。輸送実験終了後、タンパク定量を行い、蛍光強度をタンパク量で補正した。
分化誘導終了後、腸管オルガノイドを5μmol/Lミダゾラムを含む培地(2 mmol/L L-Glu、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むAdvanced-DMEM/F12)で37℃にてインキュベーションし、24時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター(LC-MS/MS)を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。
(1)多糖類ポリマーを用いたヒト腸管オルガノイドへの分化誘導
ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化誘導の際に添加する多糖類ポリマーの影響について調べた。その結果、FP001およびFP003を添加した群で腸管関連遺伝子やCYP3A等をはじめとする様々な薬物動態関連遺伝子のmRNA発現量が増加した。特にFP001を加えた群で成長因子を除去したマトリゲル3%を加えたコントロール群に比べ、腸管での主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)3A4で3.7倍、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSLC15A1/PEPT1で4.1倍、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1で4.5倍、など多くの薬物動態関連遺伝子のmRNA発現が上昇した。また、腸管を構成している細胞マーカーであるVillin(吸収上皮細胞)、sucrase-isomaltase(上皮細胞の刷子縁)、MUC2(杯細胞)、LGR5(腸管幹細胞)はコントロール群に比べ、同程度もしくはそれ以上のmRNA発現を示した。(図14)。
マトリゲル及び多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒトiPS細胞由来腸管オルガノイドは球状の形をしていた(図15A-C)。HE染色の結果から、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドにおいても管腔が確認された(図15D-F)。
免疫蛍光染色により、腸管を構成している様々な細胞(吸収上皮細胞、腸管幹細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞、間葉系細胞)および排出トランスポーターやタイトジャンクションのマーカーの発現が認められた(図16)。したがって、腸管オルガノイドはこれらの細胞を含む腸管組織類似体であることが示唆された。
排出トランスポーターであるABCB1/MDR1の基質であるローダミン123および阻害剤であるベラパミルを用いて、ABCB1/MDR1の機能評価を行った。ローダミン123の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はベラパミルにより抑制された(図17)。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCB1/MDR1の機能を有していることが示唆された。
排出トランスポーターであるABCG2/BCRPの基質であるヘキスト33342および阻害剤であるKo143を用いて、ABCG2/BCRPの機能評価を行った。ヘキスト33342の腸管オルガノイド内への排出が認められ、その排出方向の輸送はKo143により抑制された(図18)。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドは、ABCG2/BCRPの機能を有していることが示唆された。
CYP3Aの誘導剤である1α,25-ジヒドロキシビタミンD3(VD3)を用いて、CYP3A4のmRNA発現誘導について検討を行った。コントロール群に比べ、VD3添加群で有意にCYP3A4のmRNA発現が誘導された(図19A)。また、VD3添加群において、有意にミダゾラムの代謝活性が上昇し(図19B)、CYP3A4のタンパク質レベルでの誘導が認められた。このことから、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドではCYP3A4の薬物応答性を有していることが示唆された。
CYP3A4の基質であるミダゾラムとその阻害剤であるケトコナゾールを用いて、CYP3A4の代謝活性を評価した。ヒト腸管オルガイドにおいて、ミダゾラムの代謝活性が認められ、その活性はケトコナゾールの添加により有意に阻害された(図20)。したがって、多糖類ポリマーを用いて分化誘導したヒト腸管オルガノイドでは、CYP3A4の代謝能を有していることが示唆された。
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞から腸管オルガノイドへの分化において有用な浮遊剤(粘性材料)を新たに見出すことができた。また、この方法によって作製した腸管オルガノイドは、排出トランスポーターの輸送機能に加え、薬物代謝酵素活性および誘導能を有するなど、腸管に特徴的な様々な薬物動態学的機能を有していることが明らかとなった。さらに、FP001およびFP003は多糖類のポリマーであり異種動物由来成分を含まないため、腸管オルガノイドを再生医療に用いる際に使用する培養材料として極めて有用であると考えられる。
Claims (34)
- 以下の工程(1)~(5)を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法:
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程;
(4)工程(3)後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(5)工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程。 - 基底膜成分をコートした培養面を用いて工程(3)の培養を行う、請求項1に記載の作製方法。
- 前記基底膜成分がラミニン511又はそのE8断片である、請求項2に記載の作製方法。
- 工程(3)において継代操作を行う、請求項1~3のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記継代操作の回数が1回又は2回である、請求項4に記載の作製方法。
- 線維芽細胞増殖因子がFGF2、FGF4又はFGF10であり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、GSK-3β阻害剤がCHIR99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin又は1-Azakenpaulloneであり、ROCK阻害剤がY-27632である、請求項1~5のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(3)の培養期間が2日間~14日間である、請求項1~6のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(4)の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、請求項1~7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程(5)の培養に用い、工程(4)で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、請求項1~8のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、請求項9に記載の作製方法。
- 前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項9に記載の作製方法。
- BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、請求項1~11のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(5)の培養期間が12日間~36日間である、請求項1~12のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(5)の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、請求項1~13のいずれか一項に記載の作製方法。
- 工程(5)の培養を、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加え、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の存在下で行う、請求項1~13のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項1~15のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項1~15のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項17に記載の作製方法。
- 以下の工程(A)及び(B)を含む、腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法:
(A)請求項1~18のいずれか一項に記載の作製方法で腸管オルガノイドを得る工程;
(B)工程(A)で得られた腸管オルガノイドを用いて被検物質の体内動態又は毒性を評価する工程。 - 前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項19に記載の評価方法。
- 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項20に記載の方法:
(I)請求項1~18のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。 - 以下の工程(A)及び(B)を含む、腸疾患モデルの作製方法:
(A)請求項1~17のいずれか一項に記載の作製方法で腸管オルガノイドを得る工程;
(B)工程(A)で得られた腸管オルガノイドに腸疾患の病態を誘導する工程。 - 以下の工程(1)~(6)を含む、多能性幹細胞から腸管細胞層を作製する方法:
(1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、TGFβ受容体阻害剤、GSK-3β阻害剤及びROCK阻害剤の存在下で培養する工程;
(4)工程(3)後の細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
(5)工程(4)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下での培養を含む工程;
(6)工程(5)で形成された腸管オルガノイドを構成する細胞を、上皮成長因子、TGFβ受容体阻害剤及びcAMP活性化物質の存在下で平面培養する工程。 - 工程(6)の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で行う、請求項23に記載の作製方法。
- 工程(6)の培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMP活性化物質とGSK-3β阻害剤の存在下で行う、請求項23に記載の作製方法。
- 工程(6)の平面培養の少なくとも一部を気液培養にする、請求項23に記載の作製方法。
- 前記気液培養を、上皮成長因子及びTGFβ受容体阻害剤に加え、cAMPシグナルを活性化する因子の存在下で行う、請求項26に記載の作製方法。
- 前記cAMPシグナルを活性化する因子がcAMP誘導体、cAMP分解酵素阻害剤又はcAMP活性化物質である、請求項27に記載の作製方法。
- 前記cAMPシグナルを活性化する因子がフォルスコリンである、請求項27に記載の作製方法。
- 以下の工程(A)及び(B)を含む、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法:
(A)請求項23~29のいずれか一項に記載の作製方法で腸管細胞層を得る工程;
(B)工程(A)で得られた腸管細胞層を用いて被検物質の体内動態又は毒性を評価する工程。 - 前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項30に記載の方法。
- 以下の工程(i)~(iii)を含む、請求項30又は31に記載の方法:
(i)請求項23~29のいずれか一項に記載の作製方法で腸管細胞層を得る工程;
(ii)前記腸管細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記腸管細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を評価する工程。 - 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項30又は31に記載の方法:
(I)請求項23~29のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管細胞層に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。 - 以下の工程(A)及び(B)を含む、腸疾患モデルの作製方法:
(A)請求項23~29のいずれか一項に記載の作製方法で腸管細胞層を得る工程;
(B)工程(A)で得られた腸管細胞層に腸疾患の病態を誘導する工程。
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