CN115299434B

CN115299434B - 细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用

Info

Publication number: CN115299434B
Application number: CN202210950482.1A
Authority: CN
Inventors: 林慧婷
Original assignee: Guangzhou Mingxun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Mingxun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-09
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-08-09
Also published as: CN115299434A

Abstract

本发明涉及用于提取核酸的细胞冻存液及其制备方法和应用。本发明的细胞冻存液包括胎牛血清、DMSO、ROCK1抑制剂、pMEK抑制剂和GSK‑3抑制剂。本发明的细胞冻存液用于提取核酸快速简单，减少了核酸损失以及减少样品交叉污染的可能性，成本低且适用于微量细胞样品的DNA制备。

Description

细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞冻存液、一种细胞冻存和复苏方法及其应用。

背景技术

胚胎干细胞是早期胚胎分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。胚胎干细胞的各种生物特性随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化，因此制备过程中需要进行有效的冻存。冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列的理化变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变以及蛋白质变性等，严重时甚至会导致细胞死亡。因此，冻存液的优劣对冻存后细胞的质量有着举足轻重的影响。

对基因编辑胚胎干细胞进行筛选有时仅能获得数十个细胞，采用常规的细胞冻存方式往往操作繁琐且细胞复苏活率较低，因此，亟需一种针对基因编辑胚胎干细胞的高效的细胞冻存液。

此外，针对基因编辑胚胎干细胞，过程中会产生大批量亟需鉴定的胚胎干细胞克隆，鉴定时间窗口短，若不能得知阳性克隆则需要对所有待鉴定克隆进行细胞传代操作，工作量极大且耗费巨大。若能在鉴定工作明确前将小鼠胚胎干细胞冻存，这将极大的拓宽鉴定所需的时间窗口。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明对96孔板直接冻存复苏胚胎干细胞的操作步骤进行优化，且对冻存液进行优化。为此，本发明提供了一种细胞冻存液和一种细胞冻存复苏方法。本发明提供的细胞冻存液可极大提高96孔板冻存复苏效率，极大拓宽可操作空间，对于基因编辑等待基因型鉴定结果，或者药物筛选等待筛选结果再传代等都具有重要的作用。此外，本发明的细胞冻存液可以进行批量冻存复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。

为了实现本发明的目的，采用如下技术方案。

在第一方面，本发明提供了一种细胞冻存液，其包括胎牛血清、DMSO、ROCK抑制剂、pMEK抑制剂和GSK-3抑制剂。

在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y-27632和H-1152中的至少一种，优选为Y-27632。

在一些实施方式中，所述pMEK抑制剂选自PD0325901、PD98059、U0126和ARRY-142886中的至少一种，优选为PD0325901。

在一些实施方式中，所述GSK-3抑制剂选自Chir99021、Chir-98014和SB216763中的至少一种，优选为Chir99021。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括：80-95v/v％胎牛血清；5-20v/v％DMSO；0.2-5μM ROCK抑制剂；0.2-5μM pMEK抑制剂；和0.2-5μM GSK-3抑制剂。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，胎牛血清的体积百分含量可以为80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、95％以及它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，DMSO的体积百分含量可以为5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％以及它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，ROCK抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，pMEK抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，GSK-3抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括：85-95v/v％胎牛血清；5-15v/v％DMSO；0.5-2μM ROCK抑制剂；0.5-2μM pMEK抑制剂；和0.5-2μM GSK-3抑制剂。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括90v/v％胎牛血清、10v/v％DMSO、1μMY27632、1μM pD0325901和1μM Chir99021。

在第二方面，本发明提供了一种细胞冻存和复苏的方法，包括将细胞与第一方面所述的细胞冻存液混合的步骤。

在一些实施方式中，所述方法包括将培养在96孔板中的细胞与所述细胞冻存液混合，并进行冷冻保存。

在一些实施方式中，所述方法还包括将在96孔板中冷冻保存的细胞解冻，进行复苏。

在一些实施方式中，所述冷冻保存的温度为-75℃至-85℃。在一些实施方案中，所述冷冻保存的温度为-80℃。

在一些实施方式中，所述解冻在35℃至40℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述解冻在37℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述解冻在水浴锅中进行。

在一些实施方式中，所述细胞为胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述细胞为经基因编辑的哺乳动物胚胎干细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为杂交瘤细胞。

在一些实施方式中，所述方法包括96孔板的冷冻和96孔板的复苏。在一些实施方式中，96孔板的冷冻包括以下步骤：(1)将96孔板中的细胞培养基上清弃掉；(2)将培养在96孔板中的细胞与所述细胞冻存液混合，密封，在-80℃下进行冷冻保存。在一些实施方式中，所述96孔板的复苏包括以下步骤：(3)将冷冻保存的96孔板在35-40℃水浴锅中摇晃解冻，直至冻存液完全化开；(4)弃去冻存液，加入培养基以使细胞适应培养环境；(5)弃去培养基，用PBS洗涤，用Accutase在35-40℃消化5-10min，随后加入培养基终止消化。

在第三方面，本发明提供了根据第一方面所述的细胞冻存液或根据第二方面所述的方法在杂交瘤细胞筛选或在经基因编辑的胚胎干细胞筛选中的应用。相比于现有技术，本发明提供的细胞冻存液特别适用于ESC细胞冻存，可以在ESC基因编辑细胞筛选过程中，在96孔板内，每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存，并且可以进行批量冻存复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。

下面提供实施例以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。

附图说明

图1示出了根据本申请实施例采用不同细胞冻存液获得的细胞复苏后细胞计数结果。

图2示出了根据本申请实施例采用不同细胞冻存液获得的细胞复苏三天后细胞计数结果。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

术语“胎牛血清(FBS)”是一种常用的血清添加剂，富含生长因子、蛋白和大分子。胎牛血清是一种外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10-30天的小牛。

术语“二甲基亚砜(DMSO)”是一种含硫有机化合物，分子式为C₂H₆OS，常温下为无色无臭的透明液体，在细胞冻存液中作为保护剂。

如本文所用的术语“ROCK抑制剂”是指能够抑制ROCK活性的任何分子，如通过抑制ROCK磷酸化水平确定的(通过蛋白质印迹分析检测)。术语“ROCK”是指Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶，其具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，并调节胞质分裂、平滑肌收缩、肌动蛋白应力纤维和粘着斑的形成以及c-fos血清反应元件的激活。如本文所用的术语“Y-27632”是一种ROCK Rho激酶的小分子抑制剂。如本文所用术语“Y27632”是ROCK的特异性抑制剂，包括ROCK1和ROCK2，同时也抑制PRK2，其抑制作用是通过与ATP竞争结合催化位点来实现的。Y-27632可以阻止胚胎干细胞的细胞凋亡。如本文所用术语“H-1152”是一种可透过膜的选择性ROCK抑制剂。

如本文所用的术语“MEK抑制剂”是指是指降低或减少MEK依赖性细胞信号传导/功能，并且降低或减少与MEK相关的干细胞增殖/生长的化合物或药物。本文所使用，术语“MEK”是指丝裂原/细胞外信号调节激酶(MEK)家族，是磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激酶。MEK也称为MAP2K和MAPKK。MEK的同工型包括但不限于MEK1和MEK2。“pMEK抑制剂”是非竞争性MEK抑制剂。本文所使用术语“PD0325901(Mirdametinib)”是指一种选择性的，非ATP竞争性MEK抑制剂。本文所使用术语“PD98059”是一种非ATP竞争性MEK抑制剂，IC50为2μM，能特异地抑制MEK-1-介导的MAPK活化，不会直接抑制ERK1和ERK2。本文所使用术语“U0126”是一种常用的MAPKK抑制剂，即MAPK kinase抑制剂或MEK1/2抑制剂。U0126可以通透细胞，选择性抑制MEK1/2，从而抑制MAP kinase(Erk1/2即p44/42MAPK)的磷酸化和激活。同时可以抑制AP-1依赖的基因转录激活。本文所使用术语“ARRY-142886”是一种高效选择性的，非ATP竞争性的MEK1/2抑制剂，抑制MEK1/2磷酸化水平。

如本文所用的术语“GSK-3抑制剂”是指能够抑制糖原合酶激酶3(GSK-3；全部或部分)的化合物或一组化合物。糖原合酶激酶3是介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。蛋白质通过GSK-3的磷酸化通常抑制其下游靶标的活性。已显示GSK-3整体上与细胞增殖和细胞凋亡的通路有关。例如，已显示GSK-3使β-连接素磷酸化，导致β-连接素被靶向降解。因此，GSK-3是经典的β-连接素/Wnt通路的一部分，其向细胞发送分裂和增殖的信号。GSK-3还通过使调节细胞凋亡的转录因子磷酸化而参与许多细胞凋亡信号传导通路。GSK-3可通过激活促凋亡因子(诸如例如p53)和通过磷酸化使存活促进因子失活二者来促进凋亡。本文所使用，术语“Chir99021”是一种有效且高度选择性的糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂，包括GSK-3β和GSK-3α。本文所使用术语“Chir-98014”是一种有效的、细胞通透的GSK-3抑制剂，可抑制GSK-3α和GSK-3β的活性。本文所使用术语“SB216763”是一种与ATP竞争并强效抑制α和βGSK-3的同工酶，是强效、选择性、细胞渗透性糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

实施例

1、配制冻存液

1号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO；

2号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901+1μMChir99021；

3号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901；

4号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM Chir99021；

5号冻存液：81％DMEM+9％胎牛血清+10％DMSO；

6号冻存液：90％IMDM+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901+1μM Chir99021；

7号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+0.2μM pD0325901+1μMChir99021；

8号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+2μM pD0325901+1μMChir99021；

9号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+5μM pD0325901+1μMChir99021；

10号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901+0.2μMChir99021；

11号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901+2μMChir99021；

12号冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO+1μM Y27632+1μM pD0325901+5μMChir99021。

2、96孔板的冻存

2.1提前复苏CF-1Feeder至96孔板中；

2.2每个孔接种200个小鼠胚胎干细胞(mES)，使用的培养基为ESC培养基配方：mES：KnockoutDMEM+15％FBS(Gibco)+Glutamax(Gibco，100x)+NEAA(Gibco，100x)+β-me+LIF(Millipore)+1μM pD0325901(Selleck，S1036)+3um Chir99021(selleck)；

2.3第三天后，取其中三个孔计数，计得平均每个孔为4×10⁴细胞；

2.4将剩余待冻存孔培养基上清吸掉，分别加入100μL上述12种冻存液，每6个孔加入同一种冻存液；

2.5将加完冻存液的96孔板用密封条封住，放入自封袋中，并上下各包上一块泡沫板，用橡皮筋固定后放入-80℃冰箱冷冻保存。

3、96孔板的复苏

3.1将冻存mES细胞的96孔板从-80℃冰箱中取出，放入37℃水浴锅中摇晃解冻，直至冻存液完全化开；

3.2在超净台中吸去冻存液，并加入100μL ES培养基，让细胞适应培养环境；

3.3第二天，将孔中培养基弃去，并用PBS洗涤一次，随后加入50μL Accutase 37℃消化5min，随后加入50μL ES培养基终止消化；

3.4每种冻存液取3个孔分别接种至24孔板中；

3.5另外3个孔加入等体积0.4％台盼蓝溶液，即100μL，混匀，显微镜下分别计总细胞数，结果如下表1和图1所示。

表1

3.6第三天后，将24孔板中的细胞计数，结果如下表2和图2所示。

表2

结果显示，采用本发明的细胞冻存液能够极大提高细胞的96孔板冻存复苏效率。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞冻存液在细胞冻存和复苏中的应用，所述细胞冻存液包括85-95v/v%胎牛血清、5-15v/v%DMSO、1-2μM ROCK抑制剂、1-5μM pMEK抑制剂和1-5μM GSK-3抑制剂，

所述ROCK抑制剂选自Y-27632，

所述pMEK抑制剂选自PD0325901，

所述GSK-3抑制剂选自Chir99021，

所述细胞为胚胎干细胞。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞冻存液包括90v/v%胎牛血清、10v/v%DMSO、1μM Y27632、1μM pD0325901和1μM Chir99021。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述细胞为经基因编辑的哺乳动物胚胎干细胞。

5. 一种细胞冻存和复苏的方法，包括将细胞与细胞冻存液混合的步骤，其中，所述细胞冻存液包括85-95v/v%胎牛血清、5-15v/v%DMSO、1-2μM ROCK抑制剂、1-5μM pMEK抑制剂和1-5μM GSK-3抑制剂，所述ROCK抑制剂选自Y-27632，所述pMEK抑制剂选自PD0325901，所述GSK-3抑制剂选自Chir99021，所述细胞为胚胎干细胞。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞冻存液包括90v/v%胎牛血清、10v/v%DMSO、1μM Y27632、1μM pD0325901和1μM Chir99021。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括将培养在96孔板中的细胞与所述细胞冻存液混合，并进行冷冻保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冷冻保存的温度为-75℃至-85℃。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将在96孔板中冷冻保存的细胞解冻，进行复苏。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述解冻在35℃至40℃的温度下进行。

11.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。

12.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为经基因编辑的哺乳动物胚胎干细胞。

13.根据权利要求5-12中任一项所述的方法在经基因编辑的胚胎干细胞筛选中的应用。