RU2602448C1

RU2602448C1 - Способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров

Info

Publication number: RU2602448C1
Application number: RU2015136086/13A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Ивановна Кузьмина; Диана Николаевна Татарская; Татьяна Ивановна Станиславович
Priority date: 2015-08-25
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2016-11-20

Abstract

Изобретение относится к области репродуктивной биотехнологии, а именно к способу экстракорпорального культивирования ооцитов коров. Способ включает оценку фазы роста ооцитов, выделенных стандартными методами из яичников коров после убоя, методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым, отделение не завершивших рост ооцитов и культивирование их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл. Культивирование проводят в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в среду, дополнительно содержащую хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл и культивируют еще 15 ч. Использование изобретения позволит повысить доли ооцитов, созревших в процессе экстракорпорального культивирования. 1 табл.

Description

Изобретение относится к области репродуктивных биотехнологий, конкретно к способам культивирования животных клеток, и может быть использовано для получения зрелых яйцеклеток коров in vitro, компетентных к дальнейшему развитию, получению эмбрионов - интактных, клонированных, трансгенных, а также для выделения линий эмбриональных стволовых клеток.

Одной из задач в области клеточных репродуктивных технологий в животноводстве является создание эффективных систем для культивирования незрелых ооцитов, извлеченных из яичников животных - доноров после убоя. Разработаны методы культивирования незрелых ооцитов в питательных средах для завершения процесса созревания. Например, после забоя коров извлекают яичники, выделяют из них ооциты, по морфологическим критериям выделяют незрелые, культивируют в питательной среде до стадии дозревания и проводят оплодотворение [1].

Немаловажным аспектом в описанных процедурах является повышение точности определения степени зрелости ооцитов. В частности, было предложено использовать для этой цели краситель ВСВ (brilliant cresyl blue), который реагирует на внутриклеточную активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH). Высокая активность фермента G6PDH в растущих ооцитах приводит к обесцвечиванию ВСВ, чего не наблюдается в ооцитах, завершивших фазу роста в организме животного [2]. Данный способ и был выбран в качестве прототипа.

Основным недостатком известных методик является небольшая относительная доля ооцитов, способных к дальнейшему развитию в эмбрионы.

Задачей предлагаемого изобретения была разработка способа экстракорпорального культивирования, обеспечивающего заметное увеличение количества ооцитов, созревших до состояния, пригодного для оплодотворения.

Решение поставленной задачи было найдено в виде способа, согласно которому фазу роста ооцитов, выделенных из коров после убоя, оценивают методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым (ВСВ), отделяют не завершившие рост ооциты, культивируют их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в другую среду, содержащую кроме выше упомянутых компонентов хорионический гонадотропин человека в концентрации 10 м.ед/мл, и культивируют еще 15 ч.

Были проведены следующие эксперименты. Из полученных на мясокомбинате яичников коров выделяли ооцит-кумулюсные комплексы путем аспирации содержимого фолликулов диаметром 3-6 мм. Затем морфологически оцененные ооциты в течение 90 минут подвергали воздействию раствора 26µМ ВСВ (В-5388, Sigma) в среде Дюльбекко и разделяли окрашенные ооциты (завершившие фазу роста) и без окраски (растущие).

Полученные описанным выше приемом ооциты, не завершившие фазу роста, разделили на две группы: контрольную и опытную. Ооциты контрольной группы культивировали согласно способу, описанному в прототипе [2], а именно, группами по 15-20 штук помещали в покрытые минеральным маслом капли объемом 200 мкл среды ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл. Опыт проводили в течение 24 ч при температуре 38.5°C в атмосфере с 5% углекислого газа при 90% влажности.

Ооциты опытной группы обрабатывали согласно заявляемому способу, а именно, сначала культивировали в указанной выше среде в течение 15 часов, затем переносили в среду, которая кроме указанных компонентов содержала хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл, и культивировали в течение 15 ч при тех же условиях.

Для проверки возможности эмбрионального развития все ооциты оплодотворяли спермой быков и помещали в капли объемом 25 мкл синтетической среды эмбрионов (mSOF) +20 г/л буфера BSA. Культивирование эмбрионов проводили под минеральным маслом в атмосфере 5% углекислого газа, 5% кислорода и 90% азота. Для мониторинга развития эмбрионов на 5-й и 8-й день после оплодотворения оценивали, соответственно, выход морул и бластоцист.

Результаты описанных сравнительных испытаний приведены в таблице. Хорошо видно, что объект изобретения показывает значительное преимущество перед прототипом. Количество эмбрионов, разделившихся до 8-16 клеток в опытном варианте, превышает аналогичный показатель в контроле примерно на четверть, а доля зародышей, достигших стадии бластоцисты - более чем вдвое.

Технический результат изобретения заключается в существенном повышении доли ооцитов, созревших в процессе экстракорпорального культивирования и компетентных к эмбриональному развитию, и их способности к развитию до стадии бластоцисты после оплодотворения in vitro.

Источники информации

1. Патент РФ №2410063 от 04.06.2009.

2. В. Heleil., Т. Kuzmina, N. Novikova, Н. Torner and Н. Alm // Effect of prolactin on Developmental Competence of Bovine Oocytes Selected by Brilliant Cresyl Blue Staining / Journal of Reproduction and Infertility. - 2010, №1, p. 1-7.

Claims

Способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров, согласно которому фазу роста ооцитов, выделенных стандартными методами из яичников коров после убоя, оценивают методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым (ВСВ), отделяют не завершившие рост ооциты и культивируют их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл, отличающийся тем, что упомянутое культивирование проводят в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в среду, содержащую кроме выше упомянутых компонентов хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл и культивируют еще 15 ч.