CN114467915A - 一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了本发明要求保护一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液，所述冻存液为含有渗透性保护剂、非渗透性保护剂、重组人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、ROCK抑制剂、抗氧化剂的无血清基础培养基。本发明所述的原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液不含血清，成分明确，批间差异小。降低了DMSO的浓度，减轻对肿瘤细胞的毒性。渗透性保护剂和非渗透保护剂联合使用，另外添加重组人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、ROCK抑制剂、抗氧化剂，各组分协同增效，可有效克服在长期低温冻存过程中由水分子结晶引起的胞内冰晶损伤和细胞溶质损伤，维持细胞生物学特性和细胞活力。低温冻存后细胞胶滴包埋培养成功率高，能够满足原代肿瘤细胞/细胞球样体长期冷冻保存的需求。

Description

一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液。
背景技术
原代肿瘤细胞可以很好地保持原发肿瘤的生物学特性，具有宝贵的科学研究和临床应用价值，可广泛应用于肿瘤相关基础研究、药物研发、个体化治疗等领域，原代肿瘤细胞的保存是实现这些价值的基础。通过将细胞降低至超低温，其生物活性急剧减慢甚至完全停止，理想情况下，冻存之后复苏的细胞可恢复其冻存前的生物活性。然而，没有操纵干预的细胞低温保存在其三个阶段(降温、低温保存和复温)中的每一个阶段都会产生细胞损伤，除了细胞代谢失衡之外，细胞器膜脂质结构域也会发生改变。这些结构特性的改变可能导致：溶酶体和脂蛋白水解酶的激活和释放、钙依赖性磷脂酶的激活和游离脂肪酸的释放、凋亡级联反应的激活和细胞骨架基质的破坏。另外，随着自由基的产生，伴随低温的氧化应激物可能导致细胞凋亡或基因调控的细胞死亡。由此可见，在冻存过程中采用合适的冻存方法至关重要。
目前，应用于细胞冻存的方法主要有两种，低温冻存和玻璃化冻存。玻璃化冻存超快的降温速度可以避免细胞内冰晶的形成，通过降低凝固点和提高介质黏度来促进玻璃化的实现，极大地降低了冷冻过程中的细胞损伤。然而，高浓度冷冻保护剂的使用可能对细胞产生渗透性休克效应和化学毒性，导致细胞骨架变形、纺锤体解体和染色体扩散，超快的降温速率也意味着更高的设备要求及成本。低温冻存对设备要求较低，仍是实验或医学中最常用的细胞保存技术。但是，在低温冻存过程中，由水分子结晶引起的一系列变化容易造成细胞溶质损伤和胞内冰晶损伤。由于冷冻速度和融冻速度受目前工艺条件的限制，无法在短期内有较大改进，因此，冷冻保护剂的正确选择及应用就成为了决定低温冻存效果的最关键因素。
冷冻保护剂一般分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，可以抑制冰重结晶、降低冰点和控制冰的形状和生长，保护细胞免受冷冻损伤。渗透性冷冻保护剂多为小分子中性物质，其作用为弱化水结晶过程以及减少对细胞结构和功能的破坏，主要包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙酰胺等。非渗透性保护剂多为大分子物质，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤；结合水分子，降低胞外自由水含量，减少冰晶损伤。非渗透性冷保护剂主要包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、羟乙基淀粉、海藻糖、葡聚糖等。将渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联用，可有效降低渗透性冷冻保护剂浓度、减少其毒性、增强低温冻存效果。
在这些冷冻保护剂中，渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂血清(主要含白蛋白)是使用最为广泛的。胎牛血清可提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物、主要的低分子营养物，在低温长期保存时还有稳定细胞膜、调整渗透压和避免自由基形成的作用。然而，血清来源受限，价格昂贵，存在不同品牌、批次之间的差异，血清中的未知生长因子可能对干细胞产生不可预知的诱导分化。DMSO可降低保存液的冰点并减少胞内冰的形成，但是DMSO对细胞存在一定的毒性，严重影响冷冻保存细胞复苏后的存活率以及功能表达。理想的原代肿瘤细胞冻存液应满足以下几点：(1)可以抑制冰重结晶、降低冰点和控制冰的形状和生长，保护肿瘤细胞免受冷冻损伤；(2)降低或者不使用DMSO，减轻其对细胞的毒性；(3)成分明确，成本可控，能够避免动物血清带来的不利影响。然而，目前市场上针对各种细胞系的冻存液对于原代肿瘤细胞的冻存，通常存在细胞冻存损伤，进而导致复苏后细胞存活低、培养效率低等问题。
中国专利申请CN201610356737.6公开了一种肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法、中国专利申请CN201510261052.9公开了一种诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法、中国专利申请CN201910378204.1公开了一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法，但是专门针对原代肿瘤细胞和/或细胞球样体冻存液的报道较少。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供护一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液。
本发明的发明目的是提供一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明要求保护一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液，所述冻存液为含有渗透性保护剂、非渗透性保护剂、重组人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、ROCK抑制剂、抗氧化剂的无血清基础培养基。
其中，所述ROCK抑制剂为Y27632、thiazovivin、Fasudil(HA-1077)、GSK429286A、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole 1(TC-S 7001)、GSK269962、Netarsudil(AR-13324)、Y-39983、ZINC00881524、Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate、Hydroxyfasudil(HA-1100)中的一种或几种的混合物；
所述抗氧化剂为α-生育酚、谷胱甘肽、Glutamax、L-抗环血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶中的一种或几种的混合物；
所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或两种的混合物；
所述非渗透性保护剂为羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种或几种的混合物；
优选地，所述ROCK抑制剂为Y27632；
所述非渗透性保护剂为羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯醇(PVA)、牛血清白蛋白(BSA)、和海藻糖。
所述抗氧化剂为α-生育酚；
所述渗透性保护剂为DMSO。
更优选地，Y27632的用量为1～20μM。
进一步优选地，Y27632的用量为10μM。
更优选地，DMSO的用量为2％～15％(v/v)。
进一步优选地，DMSO的用量为5％(v/v)。
更优选地，羟乙基淀粉的用量为30～100mg/mL，聚乙烯醇的用量为1～10mg/mL、牛血清白蛋白的用量为2～50mg/mL、海藻糖的用量为1～10mg/mL。
进一步优选地，羟乙基淀粉的用量为50mg/mL，聚乙烯醇的用量为5mg/mL、牛血清白蛋白的用量为20mg/mL、海藻糖的用量为2mg/mL。
更优选地，α-生育酚的用量为1～20mM。
进一步优选地，α-生育酚的用量为5mM。
更优选地，重组人胰岛素的用量为1～30μg/mL。
进一步优选地，重组人胰岛素的用量为10μg/mL。
更优选地，转铁蛋白的用量为1～20μg/mL。
进一步优选地，转铁蛋白的用量为5μg/mL。
更优选地，亚硒酸钠的用量为10～10μg/mL。
进一步优选地，亚硒酸钠的用量为67μg/mL。
更优选地，所述无血清基础培养基为DMEM/F12、DMEM、RPMI 1640或F-12中的一种。
进一步优选地，所述无血清基础培养基为DMEM/F12。
更优选地，一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液，所述冻存液为含有1～20μM的Y27632、2％～15％(v/v)的DMSO、30～100mg/mL的羟乙基淀粉，1～10mg/mL的聚乙烯醇用量为、2～50mg/mL的牛血清白蛋白、1～10mg/mL的海藻糖、1～20mM的α-生育酚、1～30μg/mL的重组人胰岛素、和1～20μg/mL的转铁蛋白的无血清基础培养基。
最优选地，一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液，所述冻存液为含有10μM的Y27632、5％(v/v)的DMSO、50mg/mL的羟乙基淀粉，50mg/mL的聚乙烯醇用量为、20mg/mL的牛血清白蛋白、2mg/mL的海藻糖、5mM的α-生育酚、10μg/mL的重组人胰岛素、和5μg/mL的转铁蛋白无血清基础培养基。
优选地，所述肿瘤细胞/细胞球样体为胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌等实体瘤细胞/细胞球样体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液不含血清，成分明确，批间差异小。降低了DMSO的浓度，减轻对肿瘤细胞的毒性。渗透性保护剂和非渗透保护剂联合使用，另外添加重组人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、ROCK抑制剂、抗氧化剂，各组分协同增效，可有效克服在长期低温冻存过程中由水分子结晶引起的胞内冰晶损伤和细胞溶质损伤，维持细胞生物学特性和细胞活力。低温冻存后细胞胶滴包埋培养成功率高，能够满足原代肿瘤细胞/细胞球样体长期冷冻保存的需求。
(1)本发明所述的原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液中不含血清，排除了由于血清成分不明、批次差异，质量不稳定等带来的影响。
(2)发明利用渗透性和非渗透性冻存保护剂结合的方法进行肿瘤细胞冻存，同时对试剂的配制比例进行优化，使冻存液中DMSO的比例降低到5％，降低了细胞毒性，有助于维持细胞活力。
(3)本发明所述的原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液能够满足长期冻存的需要，冻存后肿瘤细胞的生物学特性和细胞活力仍得到很好地保持。
附图说明
图1为新鲜肿瘤细胞/细胞球样体(Control组)、以及在实施例1冻存液和常规冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞/细胞球样体，经中性红染色后的图片。
图2为采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存胃癌细胞/细胞球样体，分别于冻存前、冻存3个月、冻存6个月、和冻存12个月，采用MTT法进行细胞活力测定结果。
图3为采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存结直肠癌细胞/细胞球样体，分别于冻存前、冻存3个月、冻存6个月、和冻存12个月，采用MTT法进行细胞活力测定结果。
图4为采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存乳腺癌细胞/细胞球样体，分别于冻存前、冻存3个月、冻存6个月、和冻存12个月，采用MTT法进行细胞活力测定结果。
图5为采用实施例2～7的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，冻存12个月后，采用MTT法进行细胞活力测定结果。
图6为将新鲜肿瘤细胞/细胞球样体(Control组)以及在实施例1冻存液和常规冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞/细胞球样体进行胶滴包埋培养，培养结束后的胶原凝胶滴扫描图片。
图7为将新鲜肿瘤细胞/细胞球样体(Control组)以及在实施例1冻存液和常规冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞/细胞球样体进行胶滴包埋培养，培养结束后进行扫描分析得到的细胞增殖情况。
图8为在对照例1～5和实施例1冻存液中分别冻存12个月的胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体经中性红染色后的细胞图片。
图9为分别采用对照例1～5和实施例1冻存液冻存胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体，于冻存12个月采用MTT法进行细胞活力测定结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
实施例2一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，2％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
实施例3一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，15％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
实施例4一种原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，1mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
实施例5一种原代肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，10mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
实施例6一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，1μM；α-生育酚，5mM。
实施例7一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，20μM；α-生育酚，5mM。
实施例8一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，2％(v/v)；HES，30mg/mL；PVA，1mg/mL；BSA，2mg/mL；海藻糖，1mg/mL；重组人胰岛素，1μg/mL；转铁蛋白，1μg/mL；亚硒酸钠，10μg/mL；Y27632，1μM；α-生育酚，1mM。
实施例9一种原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，15％(v/v)；HES，100mg/mL；PVA，10mg/mL；BSA，50mg/mL；海藻糖，10mg/mL；重组人胰岛素，30μg/mL；转铁蛋白，20μg/mL；亚硒酸钠，100μg/mL；Y27632，20μM；α-生育酚，10mM。
实施例10原代肿瘤细胞/细胞球样体的冻存方法
一、实验方法
(1)将获取的新鲜原代肿瘤组织转移至细胞培养皿内，用含1％(v/v)Antibiotic-Antimycotic的无菌生理盐水清洗5次，剔除非肿瘤组织。
(2)将处理后的肿瘤组织转移至6cm培养皿内，滴加1mL DMEM/F-12，用无菌手术刀片、手术剪和手术镊将肿瘤组织分割为直径约1mm的小碎块。
(3)将切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管，1,200rpm离心3min。离心后弃上清，沉淀细胞中加入4.5mL DMEM/F12和0.5mL细胞分散酶溶液，置于37℃振荡器上低速振荡消化2h，所述细胞分散酶溶液为浓度200U/mL的Collagenase,Type I(GibcoTM17100017)。
(4)终止消化的肿瘤细胞簇通过孔径300μm尼龙滤膜过滤，1200rpm离心3min，弃上清。
(5)将细胞沉淀等分分别转移至装有1mL常规冻存液和实施例1到9冻存液的冻存管中，混合均匀。其中，常规冻存液为添加10％(v/v)DMSO和50％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基。
(6)将冻存管放入程序降温盒中，然后将程序降温盒放入-80℃冰箱中24小时，再转移至液氮罐中冻存。
(7)取出冻存一定时间的含肿瘤细胞的冻存管快速置于37℃水浴，直至细胞悬液完全融化，细胞悬液移至装有8mL DMEM/F12培养基的15mL离心管中，1200rpm，离心3min，去上清。向细胞沉淀中加入适量PCM-1培养基，混匀备用。
(8)取冻存12个月的细胞，中性红染色并拍照。由于中性红染色为活细胞染色，其着色度与细胞的活性呈正相关，着色越深，细胞活性越好。
(9)分别取冻存前、冻存3个月、冻存6个月、和冻存12个月的细胞，采用MTT法进行细胞活力测定。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、实验结果
结果如图1到图5所示。
图1为新鲜肿瘤细胞/细胞球样体(Control组)、以及在实施例1冻存液和常规冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞/细胞球样体，经中性红染色后的图片。由图中可以看出，与未冻存的细胞/细胞球样体相比，冻存12个月后，胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞的活性均有所下降。其中，于实施例1冻存液中冻存的胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞活性高于在常规冻存液中冻存的肿瘤细胞。
图2～4为采用实施例1的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液和常规冻存液分别冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，分别于冻存前、冻存3个月、冻存6个月、和冻存12个月，采用MTT法进行细胞活力测定结果。随着冻存时间的延长，在实施例1冻存液中冻存的肿瘤细胞活力下降速度比在常规冻存液中冻存的肿瘤细胞慢。采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存胃癌细胞，12个月后细胞活力分别为70％和52％；采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存结直肠癌细胞，12个月后细胞活力分别为74％和58％；采用实施例1冻存液和常规冻存液冻存乳腺癌细胞，12个月后细胞活力分别为68％和52％。与常规冻存液相比，实施例1冻存液更有利于胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞的长时间保存。
图5为采用实施例2～7的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，冻存12个月后，采用MTT法进行细胞活力测定结果。由图5可以看出，在添加不同浓度DMSO、海藻糖、Y27632条件下，其冻存效果均较好，且实施例1优于其它实施例冻存液。
采用实施例8和实施例9的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，细胞活力也优于常规冻存液。
综上，使用实施例1到9的冻存液冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，长期冻存后，细胞活力都显著优于常规冻存液。
实施例11冻存后胃癌、结直肠癌、和乳腺癌细胞/细胞球样体的增殖率测定
一、实验方法
(1)取出实施例10中冻存12个月含肿瘤细胞的冻存管快速置于37℃水浴，直至细胞悬液完全融化，细胞悬液移至装有8mL DMEM/F12培养基的15mL离心管中，1200rpm，离心3min，去上清。
(2)向细胞沉淀中加入5mL PCM-1培养基，混合均匀，将细胞悬液转移至包被有胶原凝胶溶液的培养瓶中，轻轻振荡使细胞/细胞球样体分布均匀。于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
(3)培养结束后，弃去培养基，向培养瓶中加入2mL DMEM/F12和100μL细胞分散酶溶液消化15～30min，所述细胞分散酶溶液为浓度200u/mL的Collagenase,Type I(GibcoTM17100017)。
(4)终止消化的肿瘤细胞簇通过孔径125μm尼龙滤膜过滤，1200rpm离心3min。
(5)将胶原凝胶溶液加入重悬后的细胞沉淀中，充分混匀，得到细胞-胶原混合液。
(6)将30μL细胞-胶原混合液滴到6孔培养板上制成胶原凝胶滴，放入37℃培养箱中孵育1h。
(7)加入3mL PCM-2，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(8)0-time组于培养第1天进行染色固定，实验组于培养第7天进行染色固定。中性红染色2h，4mL PBS清洗细胞2次，每次15min，中性福尔马林固定45min，于蒸馏水浸泡20min，通风干燥。
(9)采用广州达瑞生物技术股份有限公司的培养细胞分析系统DR6690或Primage图像分析系统对胶原凝胶滴进行扫描分析，计算细胞增殖率。细胞增殖率(GR)＝实验组平均OD值/0-time组平均OD值。GR≥0.8时，判定为肿瘤细胞存活。细胞培养成功率＝样本存活总数/样本总数×100％。
二、实验结果
图6、图7分别为将新鲜肿瘤细胞/细胞球样体(Control组)以及在实施例1冻存液和常规冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞/细胞球样体进行胶滴包埋培养，培养结束后的胶原凝胶滴扫描图片以及细胞增殖情况。结果表明，采用本发明提供的实施例1冻存液冻存胃癌细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞，冻存12个月后，仍可以实现胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞增殖，增殖效果优于在常规冻存液中冻存的肿瘤细胞。
表1到表3分别为将30例胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞样本在实施例1肿瘤细胞/细胞球样体的冻存液与常规冻存液中冻存6个月后进行胶滴包埋培养的情况。30例胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞样本在实施例1冻存液中冻存12个月后，胶滴包埋培养成功率达96％以上，均优于常规冻存液。
表1将30例胃癌细胞样本在实施例1的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液与常规冻存液中冻存12个月后进行胶滴包埋培养的情况：
实施例1冻存液 常规冻存液
样本总数 30 30
存活总数 30 27
成功率 100％ 90％
表2将30例结直肠癌细胞样本在实施例1的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液与常规冻存液中冻存12个月后进行胶滴包埋培养的情况：
实施例1冻存液 常规冻存液
样本总数 30 30
存活总数 30 29
成功率 100％ 96.67％
表3将30例乳腺癌细胞样本在实施例1的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液与常规冻存液中冻存12个月后进行胶滴包埋培养的情况：
实施例1冻存液 常规冻存液
样本总数 30 30
存活总数 29 27
成功率 96.67％ 90％
采用实施例2到实施例9的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液冻存胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体，胶滴包埋培养的成功率也优于常规冻存液。
实施例12 STR分型确定肿瘤的同源性
收集实施例10中冻存12个月后经传代培养至第三代(P3)的肿瘤细胞，利用试剂盒提取肿瘤细胞基因组DNA，进行STR(Short tandem repeat)基因分型检测，并与原发肿瘤STR分析结果进行对比。该方法是肿瘤细胞溯源性重要的评价指标。
实施例10中冻存于实施例1的冻存液12个月后经传代培养至第三代(P3)的肿瘤细胞检测结果显示如表4所示，冻存12个月后经传代培养至P3的胃癌细胞、结直肠癌细胞、乳腺癌细胞来源与患者原发肿瘤细胞来源分别均属于同一个体。结果显示，胃癌细胞、结直肠癌细胞、乳腺癌细胞在实施例1的冻存液中冻存12个月后经传代培养至第三代后细胞遗传性状稳定可溯源。
采用实施例2到实施例9的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液冻存胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体，STR基因分型检测结果也显示细胞遗传性状稳定可溯源。表4原代肿瘤细胞STR鉴定结果：
Figure BDA0003430417860000101
Figure BDA0003430417860000111
对照例1一种肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
对照例2一种肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
对照例3一种肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
对照例4一种肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM；α-生育酚，5mM。
对照例5一种肿瘤细胞/细胞球样体冻存液
组成：基础培养基DMEM/F12；DMSO，5％(v/v)；HES，50mg/mL；PVA，5mg/mL；BSA，20mg/mL；海藻糖，2mg/mL；重组人胰岛素，10μg/mL；转铁蛋白，5μg/mL；亚硒酸钠，67μg/mL；Y27632，10μM。
实施例13胃癌、结直肠癌、和乳腺癌细胞/细胞球样体的冻存
一、实验方法
使用对照例1～5的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液按照实施例10的方法分别冻存胃癌、肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体，并进行细胞活力检测。与使用实施例1冻存液冻存原代肿瘤细胞/细胞球样体效果作比较。
二、实验结果
结果如图8、图9所示。
图8为在对照例1～5和实施例1冻存液中分别冻存12个月的胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体经中性红染色后的细胞图片。由图中可以看出，在对照例1～5的肿瘤细胞/细胞球样体冻存液中冻存12个月的胃癌、肠癌、乳腺癌细胞着色程度比在实施例1冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞浅。因此可初步判断，胃癌、肠癌、乳腺癌细胞在对照例1～5冻存液中冻存12个月后，其细胞活性低于在实施例1冻存液中冻存12个月的肿瘤细胞。
图9为分别采用对照例1～5和实施例1冻存液冻存胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞/细胞球样体，于冻存12个月采用MTT法进行细胞活力测定结果。在对照例1～5的冻存液中冻存12个月，胃癌细胞活力维持在53％～69％，结直肠癌细胞活力维持在60％～69％，乳腺癌细胞活力维持在56％～64％。在实施例1冻存液中，胃癌、结直肠癌、乳腺癌细胞冻存12个月后的细胞活力均高于在对照例1～5的冻存液中冻存的肿瘤细胞的细胞活力。因此可进一步得出结论，HES、PVA、重组人胰岛素、α-生育酚组分的添加对于胃癌、肠癌、乳腺癌细胞活力的保持具有协同增效的作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液，其特征在于，所述冻存液为含有渗透性保护剂、非渗透性保护剂、重组人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、ROCK抑制剂、抗氧化剂的无血清基础培养基。
其中，所述ROCK抑制剂为Y27632、thiazovivin、Fasudil、GSK429286A、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole 1、GSK269962、Netarsudil、Y-39983、ZINC00881524、Ripasudilhydrochloride dihydrate、Hydroxyfasudil中的一种或几种的混合物；
所述抗氧化剂为α-生育酚、谷胱甘肽、Glutamax、L-抗环血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶中的一种或几种的混合物；
所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇中的一种或两种的混合物；
所述非渗透性保护剂为羟乙基淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种或几种的混合物；
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，
所述ROCK抑制剂为Y27632；
所述非渗透性保护剂为羟乙基淀粉、聚乙烯醇、牛血清白蛋白、和海藻糖；
所述抗氧化剂为α-生育酚；
所述渗透性保护剂为DMSO。
3.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，Y27632的用量为1～20μM。
4.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，DMSO的用量为2％～15％(v/v)。
5.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，羟乙基淀粉的用量为30～100mg/mL，聚乙烯醇的用量为1～10mg/mL、牛血清白蛋白的用量为2～50mg/mL、海藻糖的用量为1～10mg/mL。
6.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，α-生育酚的用量为1～20mM。
7.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于，重组人胰岛素的用量为1～30μg/mL。
8.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于，转铁蛋白的用量为1～20μg/mL。
9.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于，亚硒酸钠的用量为10～10μg/mL。
10.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述无血清基础培养基为DMEM/F12、DMEM、RPMI 1640或F-12中的一种。
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