CN112450206A - 一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞治疗领域，特别涉及一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液，所述的直接静脉使用的非程序细胞冻存液包含以下体积百分比成分：人体血清白蛋白5‑15％、二甲基亚砜5‑15％、羟乙基淀粉70‑90％，该细胞冻存液不含动物血清，降低了动物病原污染的可能性，冻存复苏后在用于继续培养或临床直接回输，安全有效，制备方法简单，成本低廉，具有良好的临床应用前景。细胞复苏后的活性达到90％左右，细胞表型基本没有变化，从而保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能，本发明适用于单个核细胞及其他种类细胞的冷冻储存。添加冻存液后，可直接将细胞放入‑80℃冰箱冻存，无需复杂的程序冻存，大大缩短的细胞冻存时间，提高了冻存效率，极为适用于大量细胞的冻存。冻存后的细胞复苏率高，复苏后细胞的生长和分化正常；细胞冻存液成分稳定，保质期长；使用前无需另行配制或稀释，批次间稳定性好。

Description

一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，特别涉及一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液及其使用方法。

背景技术

细胞冻存是细胞长期保存的方法之一，对供体的细胞深低温保存可保持其活力和功能，这样在需要的时候再复苏使用。无论对临床还是基础研究均具有重要的意义。影响细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤将至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程。细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会伴随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学几乎停止，因此要长期保存细胞，液氮温度是最佳的存储温度，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前最常用的的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)和甘油两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的细胞存活率较低，DMSO可迅速投入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，为细胞冻存最理想的冷冻保护剂。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。

目前细胞冻存液中所使用的胎牛血清增加动物病原污染的可能性，比如欧洲多个国家发生疯牛病，其血清中含有导致疯牛病的病毒，用于冻存细胞会导致此类病毒传播。此外，有研究表明长期与胎牛血清接触的细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物蛋白引起的免疫反应，不能直接用于临床输注。因此，中国药品和食品质量监督管理局2003年发布的《人体细胞治疗临床研究和质量控制指导原则》明确指出，应尽量避免使用动物血清培养细胞。另外，细胞培养基因其成分复杂，与人体环境相差甚远，为被临床批准使用，也不能直接临床输注，通常被科研机构用来体外培养基冻存细胞。

此外，现有冻存液的冻存程序复杂，需要使用昂贵的专用冻存仪器进行程序性降温，整个冻存过程耗时长达3～4小时，以保证冻存细胞的复苏率。这种冻存操作复杂、处理量小，冻存成本较高，不能满足大规模细胞快速冻存的需要。

发明内容

本发明的目的是：

1)提供一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液，该细胞冻存液不含动物血清，降低了动物病原污染的可能性，冻存复苏后在用于继续培养或临床直接回输，安全有效，制备方法简单，成本低廉，具有良好的临床应用前景。

2)提供一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液，该细胞冻存液对细胞保护效果好，添加冻存液后，可直接将细胞放入-80℃冰箱冻存，无需复杂的程序冻存，大大缩短的细胞冻存时间，提高了冻存效率，极为适用于大量细胞的冻存。

一种无动物源血清的细胞冻存液包含以下体积百分比成分：

人血清白蛋白 5-15％

二甲基亚砜 5-15％

羟乙基淀粉 70-90％。

所述人血清白蛋白是：20％人血清白蛋白

所述的羟乙基淀粉为临床应用血液容器扩充剂，平均分子量为13万，置换度为0.4。

所述二甲基亚砜为临床级细胞冻存渗透性保护剂。

本发明的有益效果

1)本发明的细胞冻存液能够有效的保护细胞受冷冻损伤，而且避免了细胞培养基、胎牛血清等不安全成分，降低了动物病原污染的可能性，冻存复苏后在用于继续培养或临床直接回输，安全有效，制备方法简单，成本低廉，具有良好的临床应用前景。

2)细胞复苏后的活性达到90％左右，细胞表型基本没有变化，从而保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能，本发明适用于单个核细胞及其他种类细胞的冷冻储存。

3)添加冻存液后，可直接将细胞放入-80℃冰箱冻存，无需复杂的程序冻存，大大缩短的细胞冻存时间，提高了冻存效率，极为适用于大量细胞的冻存。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

细胞培养(以细胞CIK为例)

使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。生理盐水500g离心5分钟，去除上清液。计数细胞，用相应的培养基配成1*106/ml细胞悬液。按每孔2ml培养基细胞悬液加入6孔板中，每组3个平行孔。第一天加入1000IU/ml的INF-r，放于二氧化碳培养箱中培养，24小时后加入50ng/ml CD3单抗和500IU/ml的IL-2。以后每隔48小时，补加相应培养基和500IU/ml的IL-2，计数至1*10⁶/ml细胞浓度。共培养14天观察细胞形态，并检测14d时CIK细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

实施例2

按体积比，将5％的人血清白蛋白与90％的HES和5％的DMSO混匀，制得细胞冻存液1，于4℃保存备用。

将实施例1中扩增的CIK细胞以浓度5×10⁷/ml的浓度丛悬与上述冻存液1中，直接置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮中冷冻保存。

在冻存后的1月、3月、6月和1年后，37℃水浴复苏的细胞。培养5d后检测细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

实施例3

按体积比，将10％的人血清白蛋白与85％的HES和5％的DMSO混匀，制得细胞冻存液1，于4℃保存备用。

将实施例1中扩增的CIK细胞以浓度5×10⁷/ml的浓度丛悬与上述冻存液2中，直接置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮中冷冻保存。

在冻存后的1月、3月、6月和1年后，37℃水浴复苏的细胞。培养5d后检测细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

实施例4

按体积比，将15％的人血清白蛋白与80％的HES和5％的DMSO混匀，制得细胞冻存液1，于4℃保存备用。

将实施例1中扩增的CIK细胞以浓度5×10⁷/ml的浓度丛悬与上述冻存液3中，直接置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮中冷冻保存。

在冻存后的1月、3月、6月和1年后，37℃水浴复苏的细胞。培养5d后检测细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

对比例1

按体积比，将90％的胎牛血清和10％的DMSO混匀，制得细胞冻存液4，于4℃保存备。

将实施例1中扩增的CIK细胞以浓度5×10⁷/ml的浓度丛悬与上述冻存液4中，放程序降温盒置-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮中冷冻保存。

在冻存后的1月、3月、6月和1年后，37℃水浴复苏的细胞。培养5d后检测细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

对比例2

将实施例1中扩增的CIK细胞以浓度5×10⁷/ml的浓度丛悬与上述冻存液4中，直接置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮中冷冻保存。

在冻存后的1月、3月、6月和1年后，37℃水浴复苏的细胞。培养5d后检测细胞表型与活率。具体检测结果如表1所示。

表1

由上表所示本发明的直接静脉使用的非程序细胞冻存液对细胞的活率和表型有更好的效果，当按体积比，将10％的人血清白蛋白与85％的HES与5％的DMSO混匀时，效果达到最好。

Claims (4)

1.一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包含以下体积百分比成分：

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：所述人血清白蛋白为20％人血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：所述的羟乙基淀粉为临床应用血液容器扩充剂，平均分子量为13万，置换度为0.4。

4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：所述二甲基亚砜为临床级细胞冻存渗透性保护剂。