CN109221092A

CN109221092A - 一种细胞冻存液及其应用

Info

Publication number: CN109221092A
Application number: CN201811354088.1A
Authority: CN
Inventors: 李文东; 宋云庆; 卢瑞珊; 李捷
Original assignee: Guangdong Huaxia Health Life Science Co ltd
Current assignee: Guangdong Huaxia Health Life Science Co ltd
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液及其应用。本发明公开了一种细胞冻存液，包括以下组分：二甲基亚砜、人血白蛋白、低分子右旋糖苷、人间充质干细胞外泌体、羟乙基淀粉和基础培养基。用该细胞冻存液冻存复苏后的细胞活率高，形态变化不大，培养时不出现分化，且表面抗原检测符合标准。另外，本发明通过优化细胞冻存方案，尽可能避免细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致细胞大量死亡，优化了冻存体系，细胞在复苏后可直接回输至人体，不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染，且该细胞冻存液适用广泛，解决了现有的细胞冻存体系冻存的细胞经复苏后细胞活率不高的技术问题。

Description

一种细胞冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液及其应用。

背景技术

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，避免细胞在培养过程中出现衰老、分化等现象。此外，适度地保存一定量的细胞，可防止在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％～15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。其中，间充质干细胞，如脂肪干细胞，骨髓干细胞，脐带干细胞等冻存体系中含有10％左右的DMSO、70-90％左右的营养添加剂，如血清，培养基等，该类型的冻存体系，细胞经过冻存复苏后，细胞活率一般维持在80-85％，细胞活率不高，直接制约冻存细胞的临床应用。

发明内容

本发明提供了一种细胞冻存液及其应用，解决了现有的细胞冻存体系冻存的细胞经复苏后细胞活率不高的技术问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种细胞冻存液，包括：以下组分：

二甲基亚砜、人血白蛋白、低分子右旋糖苷、人间充质干细胞外泌体、羟乙基淀粉和基础培养基。

优选地，按体积分数计，二甲基亚砜30体积份、人血白蛋白10～20体积份、低分子右旋糖苷10～20体积份、人间充质干细胞外泌20体积份和羟乙基淀粉10～20体积份、余量为基础培养基。

更优选地，二甲基亚砜30体积份、人血白蛋白15体积份、低分子右旋糖苷15体积份、人间充质干细胞外泌20体积份体和羟乙基淀粉10体积份。

优选地，所述基础培养基选自RPMI 1640基础培养基、Gibco的DMEM高糖基础培养基、DMEM基础培养基、DMEM/F12基础培养基或a-MEM基础培养。

优选地，所述基础培养基为RPMI 1640基础培养基。

人血白蛋白可直接市购，本发明实施例使用的人血白蛋白购买于广州医药公司，品牌为：杰特贝林，进口药品注册号：S20120070。

1640基础培养基、二甲基亚砜、低分子右旋糖苷和羟乙基淀粉均为市购。

人间充质干细胞外泌体来源于广东华夏健康生命科学有限公司人类干细胞库里的脐带间充质干细胞，经过培养扩增后，收取条件培养基，高速离心后获取人间充质干细胞外泌体。

本发明采用了人血清白蛋白、羟乙基淀粉、低分子右旋糖苷和人间充质干细胞外泌体代替动物血清，既提供了类似动物血清的营养成分，还提供了适合细胞保存的微环境，使得细胞在复苏后可直接回输至人体。且不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染。

人血白蛋白和羟乙基淀粉等大分子物质能在细胞表面形成水化膜，避免冰晶的形成，降低了对细胞的机械损伤，避免了温度下降或上升而造成细胞的损伤死亡。

人间充质干细胞外泌体可极大的增强宫内膜干细胞的抗逆性。低分子右旋糖酐可以很好的维持了渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象。

本发明中，二甲基亚砜30体积份，大幅度提高DMSO的比例，可有效的降低胞内冰晶的体积和数量形成，极大的保护了细胞。

本发明还提供了上述细胞冻存液在冻存干细胞中的应用。

优选地，所述干细胞为宫内膜干细胞或间充质干细胞，更优选为宫内膜干细胞，间充质干细胞优选为脂肪干细胞、骨髓干细胞或脐带干细胞。

宫内膜干细胞，是近年来从女性月经血中分离出来的间充质干细胞，但该类型的干细胞体积较大，且在增殖较慢，受外界的环境影响较大，目前的冻存体系用于冻存宫内膜干细胞，复苏后，细胞活率较低，且细胞经过培养，增殖率低，形态变化大，表面抗原检测不符合标准，故会诱发宫内膜干细胞出现分化。

本发明细胞冻存液应用冻存宫内膜干细胞中，复苏后细胞活率高，且表面抗原符合标准。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种细胞冻存液，由实验数据可知，用该细胞冻存液冻存复苏后的细胞活率高，形态变化不大，培养时不出现分化，且表面抗原检测符合标准。另外，本发明通过优化细胞冻存方案，尽可能避免细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致细胞大量死亡，优化了冻存体系，细胞在复苏后可直接回输至人体，不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染，且该细胞冻存液适用广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存前放大100倍的光学显微照片；

图2为本发明实施例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存1个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图3为本发明实施例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存6个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图4为本发明实施例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存12个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图5为本发明对比例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存前放大100倍的光学显微照片；

图6为本发明对比例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存1个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图7为本发明对比例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存6个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图8为本发明对比例1提供的P4代宫内膜干细胞冻存12个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图9为本发明对比例2提供的P4代宫内膜干细胞冻存前放大100倍的光学显微照片；

图10为本发明对比例2提供的P4代宫内膜干细胞冻存1个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图11为本发明对比例2提供的P4代宫内膜干细胞冻存6个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图12为本发明对比例2提供的P4代宫内膜干细胞冻存12个月复苏后放大100倍的光学显微照片；

图13为本发明实施例7提供的实施例1宫内膜干细胞冻存1个月复苏后免疫表型鉴定结果；

图14为本发明实施例7提供的实施例1宫内膜干细胞冻存6个月复苏后免疫表型鉴定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞冻存液及其应用，用于解决现有的细胞冻存体系冻存的细胞经复苏后细胞活率不高的技术问题。

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1)配制细胞冻存液：

①按体积分数(V％)配置：DMSO 30％，人血白蛋白10％～20％，低分子右旋糖苷10％～20％，人间充质干细胞外泌体20％，羟乙基淀粉10％～20％，余量为RPMI 1640基础培养基。

2)获取宫内膜干细胞

参考文献：周华，宋丽娜，张敏，等.人子宫内膜干细胞体外分离、培养及鉴定，中华中医药学刊[J]，2014，32(8)：1907～1908.中的方法获取子宫内膜干细胞原代细胞，经过传代培养，获取P2～P5的细胞。

3)具体冻存步骤：

用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。取50uL的细胞悬液，按细胞悬液(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；分别用本实施例步骤1)配制的细胞冻存液调整细胞密度至冻存密度为1×10⁶cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存12管。

4)冻存

把装有细胞悬液的冻存管放入至程序降温盒中，放入至-80℃冰箱中，48h后，转入液氮。

5)复苏

分别于1个月、6个月、12个月复苏细胞，每次复苏两管；分具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mL Lonza完全培养基的50mL离心管中，200g离心5min，弃上清后用lonza重悬，并调整密度至1×10⁶cells/mL。

实施例2

1)配制细胞冻存液：10％DMSO，5％～10％人血白蛋白，5％～10％低分子右旋糖苷，20％外泌体，20％羟乙基淀粉，余量为RPMI 1640基础培养基。

步骤2)至步骤6)的操作步骤与实施例1相同。

实施例3

1)配制细胞冻存液：10％DMSO，10％～20％人血白蛋白，10％～20％低分子右旋糖苷，20％外泌体，20％羟乙基淀粉，余量为RPMI 1640基础培养基。

步骤2)至步骤6)的操作步骤与实施例1相同。

实施例4

1)配制细胞冻存液：30％DMSO，5％～10％人血白蛋白，5％～10％低分子右旋糖苷，20％外泌体，20％羟乙基淀粉，余量为RPMI 1640基础培养基。

步骤2)至步骤6)的操作步骤与实施例1相同。

实施例5

1)配制细胞冻存液：10％DMSO和90％FBS。

实施例6

以实施例5为阳性对照，分别计算实施例1至实施例5在1个月、6个月、12个月复苏后的细胞活率(重复3次计数)。

从表1可知，与阳性对照组对比，实施例2在冻存后1个月和6个月的细胞复苏活率有显著性差异，P<0.05；12个月的细胞活率具有极显著性差异，P<0.001；

而实施例3、4则在冻存6个月后，细胞复苏后的活率分别为81.59％和82.29％，与阳性对照组具有显著性差异，P<0.05；12个月的细胞活率分别为73.27％、77.40％，与阳性对照组相比，具有极显著性差异，P<0.001。

实施例1与阳性对照组相比，1个月、6个月、12个月的细胞复苏活率，就没有统计学意义，P>0.05。

表1宫内膜干细胞冻存后在1个月、6个月、12个月复苏后的细胞活率(平均值±标准差)

	冻存前细胞活率	1个月细胞活率	6个月细胞活率	12个月细胞活率
					实施例1	96.52±1.47	94.87±2.66	92.48±3.89	90.48±4.38
实施例2	96.52±1.47	89.78±2.17*	82.64±3.75*	75.46±4.62**
					实施例3	96.52±1.47	91.82±2.59	81.59±1.63*	73.27±2.08**
实施例4	96.52±1.47	90.43±3.08	85.29±2.56*	77.40±5.19**
					实施例5	96.52±1.47	95.63±1.89	93.78±2.46	92.11±4.71

*P表示<0.05，与阳性对照组相比有显著性差异。

**P表示<0.001，与阳性对照组相比有极显著性差异。

对比例1

1)配制细胞冻存液：采用公开号为CN 105532650B的中国专利《一种细胞冻存液》公开的10％的二甲基亚砜、1％的右旋糖酐-40和89％的Lonza基础培养基。

2)获取宫内膜干细胞

参考文献：周华，宋丽娜，张敏，等.人子宫内膜干细胞体外分离、培养及鉴定，中华中医药学刊[J]，2014，32(8)：1907～1908.中的方法获取子宫内膜干细胞原代细胞，经过传代培养，获取P3～P5的细胞。

3)具体冻存步骤：

用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。取50uL的细胞悬液，按细胞悬液(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；分别用本对比例步骤1)配制的细胞冻存液调整细胞密度至冻存密度为1×10⁶cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存12管。

4)冻存

5)复苏

对比例2

1)配制细胞冻存液：采用公开号为CN 105660606B的中国专利《一种细胞冻存液》公开的10％的二甲基亚砜，5％的人血清白蛋白，2％的右旋糖酐-40，2％的葡萄糖，余量为溶剂。

2)获取宫内膜干细胞

3)具体冻存步骤：

用PBS重悬后1500r/min离心5min，弃上清。取50uL的细胞悬液，按细胞悬液(v):0.4％台盼蓝(v)＝1:1混匀后进行细胞活率及数量计算；分别用1对比例步骤1)配制的细胞冻存液调整细胞密度至冻存密度为1×10⁶cells/mL，把细胞悬液分装至冻存管中，1.5mL/管；进行标记，冻存12管。

4)冻存

5)复苏

实施例6细胞活率的检测

分别计算和观测实施例1、对比例1和对比例2宫内膜干细胞冻存后在1个月、6个月、12个月复苏后的细胞活率(重复3次计数)。

如图1～12和表1所示，实施例1复苏后的宫内膜干细胞形态变化不大，且细胞活率明显高于对比例1和对比例2宫内膜干细胞复苏12个月的细胞活率。

表2宫内膜干细胞冻存后在1个月、6个月、12个月复苏后的细胞活率(平均值±标准差)

	冻存前细胞活率	1个月细胞活率	6个月细胞活率	12个月细胞活率
					对比例1	97.41±1.63	92.04±2.86	84.26±4.18	80.41±2.49
对比例2	97.41±1.63	89.78±2.17	82.64±3.75	75.46±4.62
					实施例1	97.41±1.63	97.25±2.50*	95.18±3.87*	95.54±5.47**

*P表示<0.05，与对比例1相比有显著性差异，

**P表示<0.001，与对比例1相比有极显著性差异。

实施7细胞流式检测细胞表面抗原

取实施例1P3-P5的宫内膜干细胞冻存1个月后和6个月后复苏，用10％FBS+PBS重悬，并调整成1×10⁶/mL的细胞悬液，分别取抗人CD90、CD105、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各5μL,加入细胞悬液200μL，室温下避光孵育20min，同时设立同型对照组，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL 1640基础培养基重悬后上机检测。

如图13、14和表3所示，宫内膜干细胞冻存后复苏1个月和6个月后，CD29、CD73、CD90、CD105为阳性，表达率均符合标准，纯度合格，CD34、CD45、CD17、HLA-DR为阴性，表达率小于2.0％，纯度合格，表面抗原检测符合标准。

表3宫内膜干细胞冻存后复苏1个月和6个月后表面抗原纯度

CD29

CD73

CD90

CD105

CD34

CD45

CD117

HLA-DR

1个月

99.6％

98.7％

88.2％

99.7％

0.019％

0.268％

0.039％

6个月

100％

99.8％

98.7％

95.3％

1.21％

0.895％

1.47％

0.568％

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，按体积份数计，

二甲基亚砜30体积份、人血白蛋白10～20体积份、低分子右旋糖苷10～20体积份、人间充质干细胞外泌20体积份和羟乙基淀粉10～20体积份，余量为基础培养基。

3.根据权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，按体积份数计，二甲基亚砜30体积份、人血白蛋白15体积份、低分子右旋糖苷15体积份、人间充质干细胞外泌20体积份体和羟乙基淀粉10体积份，余量为基础培养基。

4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基选自RPMI 1640基础培养基、Gibco的DMEM高糖基础培养基、DMEM基础培养基、DMEM/F12基础培养基或a-MEM基础培养。

5.根据权利要求4所述的细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为RPMI 1640基础培养基。

6.权利要求1至5任意一项细胞冻存液在冻存干细胞中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述干细胞选自宫内膜干细胞或间充质干细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述干细胞为宫内膜干细胞。