CN111345285A - 一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法 - Google Patents

一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法，包括脐带血自体血清、右旋糖苷‑40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷‑40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％‑90％、2％‑15％、2％‑18％,无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1，本发明使用了人工合成抗冻蛋白I作为辅助原料来帮助干细胞提高抗冻效果，提高冻存后干细胞活率；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP是一种抑制冰晶生长的蛋白质，其机理是能以非依数性形式降低水溶液的冰点，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性或抗冻活性，差值越大，抗冻活性就越大。

Description

一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，具体是一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法。
背景技术
低温保存技术是一种广泛采用的长时间保存生物样本的方法。通常我们所述的低温保存技术是指低温条件下，照样能够维持生物样本活性暂停的技术。通常都是将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温(-196℃)，并长期保存，待需要之时，可将生物体按照特殊的方法加热至正常问题，仍然可以获得活的生物体。干细胞(stem cell)是一种能够具有自我更新、复制、多潜能行细胞。脐带间充质干细胞是干细胞家族中的重要一员，也是目前阶段众多研究者的热点。它能在体外无限的扩增，被认为是细胞治疗最有潜力的细胞来源之一。
现有冻存保护剂发明与本发明最相近的方案，其冻存液其主要成分包括DMSO、右旋糖苷、无血清培养基构成，现有技术明显的两个缺点，一是绝大部分的干细胞冻存液都是采用胎牛血清FBS作为冻存保护剂的主要原料，该冻存保护剂的最大缺陷在于该细胞存在动物血清来源，无法避免病原菌的污染。本发明使用的是自体脐带血血清替代胎牛血清FBS作为其保护液的主要原料，减少病原菌的污染，更安全；二是不管是含胎牛血清FBS的冷冻保护剂还是无血清的冷冻保护剂，它们在干细胞降温冻存的过程中都无法避免干细胞活率降低，最主要的原因在于干细胞抗冻效果低，本发明冻存液中含无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，其作用就是降低水溶液的冰点，提高干细胞的抗冻活性，从而提高干细胞活率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP。
作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％-90％、2％-15％、2％-18％；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1。
作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：70％-85％、3％-13％、4％-15％。
作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：80％、10％、10％。
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：
步骤一：按上述配方量配置得到冷冻液A；
步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；
步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；
步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存。
作为本发明再进一步的方案：步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温。
作为本发明再进一步的方案：步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用自体脐带血血清替代胎牛血清FBS，减少冻存液的动物免疫源性；增加无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，提高干细胞的抗冻性，保证了干细胞冻存活性；干细胞在液氮中冻存更加稳定，时间影响降低；能够提高复苏后干细胞的活力及质量；能够节约大量细胞的冻存成本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％、2％、2％，其余为生理盐水；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1。
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：步骤一：按上述的配方量配置得到冷冻液A；步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存；
步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温；
步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
实施例2
一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：90％、7％、3％；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1；
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：步骤一：按上述的配方量配置得到冷冻液A；步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存；
步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温；
步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
实施例3
一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：72％、13％、15％；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1；
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：步骤一：按上述的配方量配置得到冷冻液A；步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存；
步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温；
步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时；
实施例4
一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：85％、13％、7％，无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1；
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：步骤一：按上述的配方量配置得到冷冻液A；步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存；
步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温；
步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
实施例5
一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：80％、10％、10％，无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1。
一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：步骤一：按上述的配方量配置得到冷冻液A；步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存；
步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温；
步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
表一记载了实施例1-5以及对比例中细胞复苏一定天数后的成活率；
对比例1为现有技术冷冻液的冷冻复苏，对比例2与实施例5中的区别是将其中的无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP替换成生理盐水。
表一：
0d 10d 30d 60d
实施例1 90％ 88％ 85％ 86％
实施例2 89％ 85％ 83％ 81％
实施例3 91％ 90％ 88％ 88％
实施例4 89％ 89％ 88％ 87％
实施例5 96％ 96％ 96％ 95％
对比例1 85％ 80％ 78％ 75％
对比例2 75％ 74％ 72％ 70％
由表一可以看出，本申请所记载的冷冻液的冻存效果相比现有技术更好，并且其中的无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP具有重要的作用。
本发明的工作原理是：本发明使用了人工合成抗冻蛋白I作为辅助原料来帮助干细胞提高抗冻效果，提高冻存后干细胞活率。无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP是一种抑制冰晶生长的蛋白质，其机理是能以非依数性形式降低水溶液的冰点，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性或抗冻活性，差值越大，抗冻活性就越大。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP。
2.根据权利要求1所述的不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％-90％、2％-15％、2％-18％；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1。
3.根据权利要求2所述的不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：70％-85％、3％-13％、4％-15％。
4.根据权利要求2所述的不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：80％、10％、10％。
5.一种干细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：按权利要求1-4任一所述的配方量配置得到冷冻液A；
步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；
步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；
步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存。
6.根据权利要求5所述的干细胞冻存方法，其特征在于，步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温。
7.根据权利要求5所述的干细胞冻存方法，其特征在于，步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。
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