CN111771874A - 一种自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法，该自体脂肪细胞冻存液每100mL包括以下含量组分：20‑38mL间充质干细胞培养上清液、3‑5g聚乙烯吡咯烷酮、3‑5mL甘油、1.5‑2g羟基磷灰石纳米颗粒、1.5‑2g海藻糖、0.5‑1g聚乙烯醇、0.01‑0.1g人血清白蛋白、0.05‑0.3g腺嘌呤核苷三磷酸、0.5‑1.5mg全反式维甲酸、0.3‑0.8g维生素C、0.2‑0.6g维生素E、0.2‑0.6g硫辛酸；本发明同现有技术相比,能够有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞。
Description
[技术领域]
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说是一种自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法。
[背景技术]
冷冻保护液是指可以保护细胞在极低温的环境中免受冻伤的物质，也称为细胞冻存液。在细胞悬液中加入冷冻保护剂可以保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合反应，弱化水的结晶，使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
脂肪间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。目前现有技术中，脂肪间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以DMSO和血清为主要成分，另一种是以培养基、DMSO和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存脂肪间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。而且，一般的细胞复苏过程，容易受热不均匀，发生二次结晶的现象，对细胞的损伤较大。
[发明内容]
本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种自体脂肪细胞冻存液，能够有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞，并有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。
为实现上述目的设计一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：
进一步地，本发明优选以下含量的组分：
进一步地，还包括非渗透性冷冻保护剂，所述非渗透性冷冻保护剂的含量为0.1-0.3g/100mL，所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉、葡聚糖中的任一种。
进一步地，还包括润滑剂，所述润滑剂的含量为0.15-0.4g/100mL，所述润滑剂为PEG-4000或PEG-6000中的任一种。
进一步地，本发明自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法，包括以下步骤：
1)称取聚乙烯吡咯烷酮、甘油、羟基磷灰石纳米颗粒、海藻糖、聚乙烯醇溶解于间充质干细胞培养上清液中，轻轻混悬；
2)然后，向步骤1)所得混合液中添加人血清白蛋白、腺嘌呤核苷三磷酸、全反式维甲酸、维生素C、维生素E、硫辛酸，混合均匀；
3)最后，将步骤2)所得混合液用细菌滤器过滤除菌，即得自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明能够避免外源蛋白污染，不会对细胞产生毒害作用，且羟基磷灰石纳米颗粒能有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞；
(2)本发明还联合使用了全反式维甲酸和抗坏血酸，能有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失；
(3)本发明利用该冻存液冻存的细胞具有高复苏率，不影响细胞生长特性，复苏后细胞保持干细胞的多能性等特点；
(4)本发明脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞复苏后不仅在细胞回收率上明显高于其他常规方法，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且减少了对脂肪间充质干细胞的损伤，在冻存过程中对其保护并提高其冻存存活率。
[具体实施方式]
本发明提供了一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：20-38mL/100mL间充质干细胞培养上清液、3-5g/100mL聚乙烯吡咯烷酮、3-5mL/100mL甘油、1.5-2g/100mL羟基磷灰石纳米颗粒、1.5-2g/100mL海藻糖、0.5-1g/100mL聚乙烯醇、0.01-0.1g/100mL人血清白蛋白、0.05-0.3g/100mL腺嘌呤核苷三磷酸、0.5-1.5mg/100mL全反式维甲酸、0.3-0.8g/100mL维生素C、0.2-0.6g/100mL维生素E、0.2-0.6g/100mL硫辛酸。
该自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法为：1)称取聚乙烯吡咯烷酮、甘油、羟基磷灰石纳米颗粒、海藻糖、聚乙烯醇溶解于间充质干细胞培养上清液中，轻轻混悬；2)然后，向步骤1)所得混合液中添加人血清白蛋白、腺嘌呤核苷三磷酸、全反式维甲酸、维生素C、维生素E、硫辛酸，混合均匀；3)最后，将步骤2)所得混合液用细菌滤器过滤除菌，即得自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质。
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：
实施例1
本发明提供了一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：30mL/100mL间充质干细胞培养上清液、4g/100mL聚乙烯吡咯烷酮、4mL/100mL甘油、1.8g/100mL羟基磷灰石纳米颗粒、1.8g/100mL海藻糖、0.6g/100mL聚乙烯醇、0.06g/100mL人血清白蛋白、0.15g/100mL腺嘌呤核苷三磷酸、1mg/100mL全反式维甲酸、0.5g/100mL维生素C、0.4g/100mL维生素E、0.4g/100mL硫辛酸。
实施例2
本发明提供了一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：20mL/100mL间充质干细胞培养上清液、5g/100mL聚乙烯吡咯烷酮、3mL/100mL甘油、2g/100mL羟基磷灰石纳米颗粒、1.5g/100mL海藻糖、1g/100mL聚乙烯醇、0.01g/100mL人血清白蛋白、0.3g/100mL腺嘌呤核苷三磷酸、0.5mg/100mL全反式维甲酸、0.8g/100mL维生素C、0.2g/100mL维生素E、0.6g/100mL硫辛酸。
实施例3
本发明提供了一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：38mL/100mL间充质干细胞培养上清液、3g/100mL聚乙烯吡咯烷酮、5mL/100mL甘油、1.5g/100mL羟基磷灰石纳米颗粒、2g/100mL海藻糖、0.5g/100mL聚乙烯醇、0.1g/100mL人血清白蛋白、0.05g/100mL腺嘌呤核苷三磷酸、1.5mg/100mL全反式维甲酸、0.3g/100mL维生素C、0.6g/100mL维生素E、0.2g/100mL硫辛酸，0.15-0.4g/100mL润滑剂，该润滑剂为PEG-4000或PEG-6000中的任一种。
实施例4
本发明提供了一种自体脂肪细胞冻存液，包括以下含量的组分：32mL/100mL间充质干细胞培养上清液、3.5g/100mL聚乙烯吡咯烷酮、4.5mL/100mL甘油、1.8g/100mL羟基磷灰石纳米颗粒、1.7g/100mL海藻糖、0.6g/100mL聚乙烯醇、0.03g/100mL人血清白蛋白、0.18g/100mL腺嘌呤核苷三磷酸、1.2mg/100mL全反式维甲酸、0.7g/100mL维生素C、0.3g/100mL维生素E、0.3g/100mL硫辛酸，0.1-0.3g/100mL非渗透性冷冻保护剂，该非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉、葡聚糖中的任一种。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种自体脂肪细胞冻存液，其特征在于，包括以下含量的组分：
2.如权利要求1所述的自体脂肪细胞冻存液，其特征在于，包括以下含量的组分：
3.如权利要求1所述的自体脂肪细胞冻存液，其特征在于：还包括非渗透性冷冻保护剂，所述非渗透性冷冻保护剂的含量为0.1-0.3g/100mL。
4.如权利要求3所述的自体脂肪细胞冻存液，其特征在于：所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉、葡聚糖中的任一种。
5.如权利要求1所述的自体脂肪细胞冻存液，其特征在于：还包括润滑剂，所述润滑剂的含量为0.15-0.4g/100mL。
6.如权利要求5所述的自体脂肪细胞冻存液，其特征在于：所述润滑剂为PEG-4000或PEG-6000中的任一种。
7.一种自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取聚乙烯吡咯烷酮、甘油、羟基磷灰石纳米颗粒、海藻糖、聚乙烯醇溶解于间充质干细胞培养上清液中，轻轻混悬；
2)然后，向步骤1)所得混合液中添加人血清白蛋白、腺嘌呤核苷三磷酸、全反式维甲酸、维生素C、维生素E、硫辛酸，混合均匀；
3)最后，将步骤2)所得混合液用细菌滤器过滤除菌，即得自体脂肪细胞冻存液及脂肪间充质干细胞等物质。
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN111869659A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-11-03 | 上海雅酶生物医药科技有限公司 | 一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法 |
| WO2022134434A1 (zh) * | 2020-12-25 | 2022-06-30 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种外泌体冻存保护液及其制备方法 |
| CN115428783A (zh) * | 2022-09-16 | 2022-12-06 | 天津科技大学 | 一种红细胞膜碎片冻干保护液、使用方法及应用 |
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