CN104488853A

CN104488853A - 一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法

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Publication number: CN104488853A
Application number: CN201510015346.3A
Authority: CN
Inventors: 朱士恩; 傅祥伟; 周艳华; 张有文
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2035-01-12
Also published as: CN104488853B

Abstract

本发明提供一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法，属于胚胎低温生物学技术领域。本发明方法包括：(1)牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液，然后装入一段空气；(2)装入一段冷冻液，再装入一段空气；(3)装入一段冷冻液，并在该段冷冻液中置入牛胚胎，再装入一段空气；(4)装入一段解冻液并封闭管口，冷冻；(5)甩管解冻，直接移植；冷冻液为含有EG、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液，解冻液为含FBS的mPBS溶液。本发明方法操作简便，对操作人员技术要求不高，冷冻后的牛胚胎甩管解冻后可直接移植，解冻后的胚胎存活率100％，扩张率94％，移植后妊娠率达57％，是一种高效、简便易行的方法，适用于产业化推广。

Description

一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法

技术领域

本发明涉及动物胚胎冷冻保存及胚胎移植技术领域，具体地涉及一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法。

背景技术

自从Rall等(1985)发明胚胎玻璃化冷冻保存方法以来，使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作，程序得到极大地简化。后经许多研究者的改进，目前卵母细胞/胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左右即可完成一个程序。在此过程中，许多研究者创造性地发明了许多冷冻的承载物体，并被命名为多种方法。如今常用的主要有以下几种方法：尼龙环玻璃化法(Cryoloop)、开放式拉管法(OPS，Open Pulled Straw)、微细玻璃管法(GMP)、微滴法(Microdrops)、半细管法(hemi-straw)。但上述方法在应用中仍存在着诸多的问题，如：尼龙环玻璃化法一次冷冻卵母细胞/胚胎数量有限，且需要特殊的冷冻管固定装置才易于长期保存。开放式拉管法(OPS)由于细管重量较轻，冷冻时易漂浮在液氮面，且该方法的细管管壁较薄，易断裂，在液氮中极易断裂而造成卵母细胞/胚胎丢失，不利于卵母细胞/胚胎的长期保存。微细玻璃管法(GMP)突出问题是冷却速率慢(最高限制在20000℃/min左右)，易造成卵母细胞/胚胎损伤；并且GMP在冷冻中容易断裂，造成卵母细胞/胚胎丢失；且GMP的直径和体积很小，限制了一次冷冻卵母细胞/胚胎的数量；而且GMP的虹吸效果十分显著，这也增加了操作的难度。微滴法(Microdrops)缺点是在贮存过程中无法进行标识，容易污染，不利于卵母细胞/胚胎的长期贮存。半细管玻璃化冷冻法(hemi-straw)缺点是操作较难，对专业技术人员的水平要求较高，需要有操作熟练的技术人员，不太适用于初学者。国内外对牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法的研究还存在操作比较复杂，冷冻液毒性较高及冷冻效率较低等诸多问题。这些因素影响了玻璃化冷冻方法在牛胚胎移植生产中的推广应用。

为了适应牛胚胎移植大规模生产需要，简化胚胎冷冻解冻操作程序，降低生产成本，提高胚胎移植效率，国内外研究人员进行了牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法的试验。该方法的共同点是以牛冻精细管做为玻璃化冷冻载体，稀释液(即解冻液)段占比较大，牛胚胎在管外经预处理液平衡后，置于玻璃化冷冻液段中，投入液氮冷冻保存。解冻时从液氮中取出细管，经空气浴，水浴解冻后，甩管混匀管内液体。牛胚胎在管内平衡一段时间后，剪掉封口端，然后直接装入移植枪进行胚胎移植。表1为国内外牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法的研究进展。

表1国内外牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法研究进展

从上表中可以看出，尽管国内外研究人员对牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法进行了大量研究，但是还存在许多问题：(1)操作比较复杂，如方法2、4、5和8的冷冻操作需要在4℃条件下进行；(2)冷冻液毒性较高，如方法2，4，9和10的玻璃化液都用到了两种或两种以上渗透性抗冻保护剂，其中DMSO和丙三醇的化学毒性较乙二醇高，容易对胚胎造成损害。另外，方法1，3，5，7和8所用单独渗透性抗冻保护剂浓度相对较高，增加了冷冻液对胚胎的化学毒性；(3)冷冻效率较低，表中所列方法胚胎解冻后体外培养的扩张率都小于90％，移植受体头数相对较少，受体牛头数在10头以上的妊娠率最高为55％(方法4)，最低仅为20％(方法6)。因此，提供一种操作简便、标识清楚、便于长期贮存、避免污染和胚胎丢失的牛胚胎冷冻、解冻和直接移植方法是目前科研人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻，以克服了上述几种方法中的冷冻效率低、技术难度大、标识不清、不利于长期储存和对生产设备要求高等问题，为提高牛胚胎冷冻保存效率，解决畜牧业生产中胚胎移植产业化提供了新途径。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于牛胚胎玻璃化冷冻的冷冻液，命名为EFS35，其为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液(Whittingham,1971)，通过以下方法配制得到：

a)mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖，使其终浓度分别为300g/L和0.5mol/L，得到FS溶液；

b)向FS溶液中加入乙二醇，二者体积比为65：35，得到EFS35溶液即为冷冻液。

本发明提供了上述EFS35冷冻液在冷冻牛胚胎中的应用，是将牛胚胎置于该冷冻液中，于液氮中冷冻保存。

本发明接着提供一种用于解冻牛胚胎的解冻液，其为向mPBS溶液中加入胎牛血清(FBS)，二者体积比为9:1。

进一步地，本发明提供了上述解冻液在冷冻甩管解冻牛胚胎中的应用，包括以下步骤：

(1)牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液，然后装入一段空气；

(2)接着装入一段冷冻液，再装入一段空气；

(3)装入一段冷冻液，并在该段冷冻液中置入牛胚胎，再装入一段空气；

(4)装入一段解冻液并封闭管口，投入液氮冷冻；

(5)甩管解冻，直接移植；

所述冷冻液为ESF35，为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。

本发明提供一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法，包括如下步骤：(1)牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液，然后装入一段空气；

(2)接着装入一段冷冻液，再装入一段空气；

(4)装入一段解冻液并封闭管口，投入液氮冷冻；

(5)甩管解冻，直接移植；

所述冷冻液为EFS35，其为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液；所述解冻液为含10％(V/V)胎牛血清的mPBS溶液。

进一步地，冷冻液EFS35通过以下方法配制得到：

本发明的牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法中，步骤(1)加入的解冻液长度为7.5cm，空气为0.5cm；

步骤(2)中加入的冷冻液长度为0.4cm，空气长度为0.5cm；

步骤(3)中加入的冷冻液长度为0.5-0.7cm，空气长度为0.5cm；

步骤(4)中加入的解冻液长度为0.9-1.1cm。

优选地，步骤(3)中冷冻液长度为0.6cm，步骤(4)中解冻液长度为1.0cm。

本发明的上述方法中，在牛胚胎置入冷冻液EFS35之前，还包括在20-25℃下，将牛胚胎移入乙二醇溶液中平衡2.5-3min，然后移入步骤(3)的冷冻液中；所述乙二醇溶液为乙二醇(EG)与mPBS溶液按照体积比1:9混合配制而成。

进一步地，平衡牛胚胎后，迅速将牛胚胎移入长度为0.5-0.7cm的EFS35冷冻液中，装管，封口投入液氮中冷冻，这个过程应在30秒之内完成。因为平衡时间越长对胚胎的化学毒性越大，损伤越严重。

本发明方法的步骤(5)甩管解冻的方法是，从液氮中取出冷冻牛胚胎的细管，在空气中停留5-10秒，然后浸入20-25℃水浴中平行晃动，待细管内的溶液融化后，手持细管快速甩动使管内的冷冻液和稀释液充分混匀，细管自解冻后于室温下平衡6-15min移植于受体。

具体地，是从液氮中取出细管，在空气浴中停留5-10秒，然后浸入20-25℃水浴中平行晃动，待细管内的溶液融化后，取出细管，擦干表面水分。手持细管的封口端快速甩动，使管内溶液在细管的端部融合；再换持细管的棉栓端，同样甩动细管，反复3～4次，使管内的冷冻液和稀释液充分混匀；细管自解冻后于室温下平衡6-15min，剪掉封口端后直接移植于受体牛。

本发明的有益效果在于：

(1)操作简单、避免污染和胚胎的丢失采用牛冻精细管作为冷冻载体，装管操作简单。冷冻和解冻均在室温(20-25℃)条件下操作，解冻后甩管法混匀，不出管直接移植，避免过去出管后胚胎被污染或丢失现象，尤其适合畜牧生产条件下推广应用。

(2)对操作人员要求不高，不需要复杂的设备，成本低，效率高。冷冻时不需要程序冷冻仪，解冻时不需要显微镜及其他复杂仪器，在不具备实验条件的牛场也可完成胚胎移植。

(3)冷冻液配方适合牛胚胎的冷冻，效果显著，且不影响胚胎的生物活性。在本发明方法的步骤(3)中，冷冻液的长度选择0.5-0.7cm，是因为发明人在实验研究中发现，若长度大于0.7cm，则由于冷冻液中乙二醇(EG)有毒性，EG含量高则会对牛胚胎造成伤害，选择冷冻液长度在0.7cm以内，则其含有的EG浓度对牛胚胎的损伤很微弱；若选择冷冻液长度短于0.5cm，则在实际操作中，由于较短而很容易造成置入牛胚胎时冷冻液空间小导致胚胎置入空气段中，造成冷冻失败。因此，本发明选择在步骤(3)中EFS35冷冻液最佳冷冻长度为0.5-0.7cm。

在中国专利CN1308441C中，公开了使用ESF30作为冷冻液冻存小鼠胚胎的方法，本发明尝试采用ESF30用于牛胚胎冻存时，发现效果不理想，因为牛胚胎的细胞膜构造与小鼠胚胎不同，当使用ESF30冻存牛胚胎时，ESF30中的EG无法完全渗透入牛胚胎中，导致冷冻效果不佳。而采用ESF35冻存牛胚胎后发现效果最佳。又由于EFS35冷冻液中EG浓度较ESF30中的EG浓度高，因此在将牛胚胎移入冻存液之前，先在10％(V/V)的EG溶液中平衡3min，时间不能超过3min，这样可以减少抗冻保护剂对胚胎的化学毒性损伤。

采用本方法对牛体内胚胎进行了玻璃化冷冻管内解冻，甩管混合后EG浓度仅为0.66mol/L，毒性很低，在管内平衡6-15min，脱出胚胎内部抗冻保护剂毒性后直接移植，与鲜胚移植相比，妊娠率无显著差异。

(4)解冻液效率高，配方温和，不对胚胎造成负面影响。在中国专利CN1308441C中，公开了小鼠胚胎的解冻液为0.5mol/L蔗糖。如果以0.5mol/L蔗糖为解冻液，甩管混匀后溶液摩尔浓度为1.14mol/L；而以本发明的添加10％FBS的mPBS为解冻液，甩管混匀后溶液摩尔浓度为0.69mol/L。由于胚胎从甩管解冻后到移植进受体牛子宫内需要较长时间(6-15min)，当处于较高渗透压的外液中较长时间会使胚胎脱水变形，同时导致胚胎内部的抗冻剂(EG)浓度相对升高，造成对胚胎物理和化学毒性的双重损伤，影响后期胚胎的发育能力。因此，本发明选用添加10％FBS的mPBS溶液代替0.5mol/L蔗糖溶液能够解决上述问题。

另外，mPBS中添加10％(V/V)FBS有利于解冻后胚胎活力的恢复和维持，FBS包含能量物质，生长因子，细胞因子，激素和氨基酸等，对于维持细胞外液的胶体渗透压、pH值的稳定，以及细胞的正常代谢具有重要作用。

(5)效果与鲜胚移植相当。采用本发明方法对牛体内外生产的胚胎进行了冷冻和甩管解冻后，试验发现胚胎冷冻-解冻后的存活率100％(33/33)，扩张率94％(31/33)。采用本方法对牛胚胎进行了冷冻、甩管解冻后直接移植，共移植牛46头，其中妊娠牛26头，妊娠率57％，与鲜胚移植相比，妊娠率(59％，30/51)差异不显著。证明本发明的冷冻-解冻方法效果优异，冷冻-解冻后的胚胎移植效果可达到鲜胚移植效果。

(6)标识清楚，适合产业化生产。采用本发明的玻璃化冷冻保存法可对牛胚胎的编号、数量、日期等加以标记，贴于细管外壁，于液氮中可长期贮存，适合长途运输。

说明书附图

图1为本发明牛胚胎玻璃化冷冻装管示意图，其中1为牛胚胎冷冻用细管的可移动塞子，2为解冻液，3为空气，4为冷冻液EFS35，5为牛胚胎，6为封口。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的化学试剂均为市售。本发明的牛胚胎冷冻用细管购自法国I.V.M.,Aigle,管内容积为0.25mL。

实施例1 溶液的制备

1、EFS35冷冻液的制备

mPBS溶液(Whittingham,1971)中加入聚蔗糖和蔗糖，使其终浓度分别为300g/L和0.5mol/L，得到FS溶液；向FS溶液中加入乙二醇，二者体积比为65：35，得到EFS35溶液即为冷冻液。该EFS35冷冻液中，聚蔗糖的最终质量百分比为18％，蔗糖终浓度为0.3mol/L。

2、解冻液的制备

解冻液为含10％(V/V)胎牛血清(FBS)的mPBS溶液，即向mPBS溶液中加入胎牛血清，二者体积比为9:1。

3、平衡预处理液的制备

乙二醇(EG)与mPBS溶液按照体积比1:9混合配制而成。

实施例2 牛胚胎冷冻甩管解冻和直接移植法与结果

将实施例1中的冷冻液、解冻液、平衡预处理液均应用于本实施例对应的方法步骤中。装管示意图见图1。

(1)牛胚胎冷冻用细管中先加入一段解冻液长度为7.5cm，然后装入一段0.5cm的空气；

(2)接着装入一段EFS35冷冻液长度为0.4cm，再装入一段0.5cm的空气；

(3)装入一段长度为0.6cm的EFS35冷冻液，在25℃下，将牛胚胎移入平衡预处理液中平衡3min后迅速移入长度为0.6cm的EFS35冷冻液中，并在该段冷冻液中置入1枚牛胚胎，再装入一段0.5cm的空气；

(4)装入一段1.0cm的解冻液并封闭管口，投入液氮冷冻保存；步骤(3)从把牛胚胎置入冷冻液起，到投入液氮冷冻，整个过程控制在30秒之内；

(5)从液氮中取出细管，在空气浴中停留5-10秒，然后浸入20-25℃水浴中平行晃动，待细管内的溶液融化后，取出细管，擦干表面水分。手持细管的封口端快速甩动，使管内溶液在细管的端部融合；再换持细管的棉栓端，同样甩动细管，反复多次，使管内的冷冻液和稀释液充分混匀；细管自解冻后于室温下平衡6-15min，剪掉封口端后直接移植于受体牛的子宫内。

采用本实施例的方法，胚胎冷冻-解冻后的存活率为100％(33/33)，体外培养扩张率达到94％(31/33)；共移植46头牛，其中妊娠牛26头，妊娠率为57％。与鲜胚移植妊娠率(59％，30/51)相比差异不显著。证明本发明的冷冻-解冻方法效果优异，冷冻解冻后的胚胎移植效果可达到鲜胚移植效果。

实施例3 不同冷冻液对牛胚胎的影响

分别采用EFS30(向FS溶液中加入乙二醇，二者体积比为70：30)、EFS35和EFS40(向FS溶液中加入乙二醇，二者体积比为60：40)作为冷冻液，按照实施例2的方法冷冻保存牛胚胎。

结果发现，使用EFS30为冷冻液后，解冻后牛胚胎的存活率为90％，体外培养扩张率为87％(26/30)；而采用EFS40冷冻保存牛胚胎，解冻后的存活率为94％，体外培养扩张率为90％(28/31)。上述EFS30和EFS40两种冷冻液的冷冻保存效果均低于EFS35，原因在于EFS30中EG的浓度较低，平衡时EG作为抗冻保护剂不能充分渗透到牛胚胎细胞内部，导致内部的水在低温下生成冰晶，冰晶会造成胚胎的物理性损伤。而EFS40中EG的浓度较高，平衡时EG会过度渗透到胚胎细胞内部，由于过量的EG存在胚胎细胞内，其化学毒性可造成对胚胎损伤。因此，EFS35作为冷冻液保存牛胚胎是最适宜的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种玻璃化冷冻液在冷冻牛胚胎中的应用，其特征在于，将牛胚胎置于该冷冻液中，于液氮中冷冻保存；所述冷冻液为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，冷冻液通过以下方法配制得到：

3.一种用于解冻牛胚胎的解冻液，其特征在于，其为向mPBS溶液中加入胎牛血清，二者体积比为9:1。

4.权利要求3所述的解冻液在冷冻甩管解冻牛胚胎中的应用，其特征在于，含有以下步骤：

(2)接着装入一段冷冻液，再装入一段空气；

(4)装入一段解冻液并封闭管口，投入液氮冷冻；

(5)甩管解冻，直接移植；

所述冷冻液为EFS35，其为含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。

5.一种牛胚胎玻璃化冷冻甩管解冻和直接移植方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)接着装入一段冷冻液，再装入一段空气；

(4)装入一段解冻液并封闭管口，投入液氮冷冻；

(5)甩管解冻，直接移植；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冷冻液通过以下方法配制得到：

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)加入的解冻液长度为7.5cm，空气为0.5cm；

步骤(2)中加入的冷冻液长度为0.4cm，空气长度为0.5cm；

步骤(3)中加入的冷冻液长度为0.5-0.7cm，空气长度为0.5cm；

步骤(4)中加入的解冻液长度为0.9-1.1cm。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在牛胚胎置入冷冻液之前，还包括在20-25℃下，将牛胚胎移入乙二醇溶液中平衡2.5-3min，然后移入步骤(3)的冷冻液中；所述乙二醇溶液为乙二醇与mPBS溶液按照体积比1:9混合配制而成。

9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，从牛胚胎移入冷冻液到投入液氮中冷冻应在30秒之内完成。

10.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，从液氮中取出冷冻牛胚胎的细管，在空气中停留5-10秒，然后浸入20-25℃水浴中平行晃动，待细管内的溶液融化后，手持细管快速甩动使管内的冷冻液和稀释液充分混匀，细管自解冻后于室温下平衡6-15min移植于受体。