CN109644993A - 一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具 - Google Patents

一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在‑80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。其中，方法包括S1、将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min；S2、首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液、间隔空气柱和混合有胚胎的保存液等；S3、将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，再将麦管传热容器置于盛装有乙醇溶液的真空保温容器中，使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、将真空保温容器迅速放置于‑80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。本发明通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用及优化保存方法步骤形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于‑80摄氏度的冰箱中的模式，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。

Description

一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。
背景技术
辅助生殖技术是一种集胚胎分割、嵌合、移植、体外受精、转基因等技术于一体的综合性技术，不但是动物繁殖领域的重要技术革命，也是治疗人类不孕不育的重要技术手段，利用此技术可以充分挖掘动物的遗传和繁殖能力、增加纯种家畜和优秀个体的后代数量、缩短家畜的改良周期以及保存具有优良遗传特性的胚胎和基因，在生物学及医学领域的被广泛地研究和应用。
近些年来，人类不孕不育已经成为继癌症、心血管病之后的第三大疾病。部分患者不得不借助于人类辅助生殖技术来解决生育问题，还有部分肿瘤患者非常需要在癌症治疗之前保留生育能力，经济动物胚胎的胚胎移植以及重要物种的种质资源保存等等。
目前，业内最常用的胚胎保存方法是玻璃化保存方法，所谓的玻璃化保存方法即是指将胚胎置于高浓度的保存液中进行短时间处理，然后再快速移放于液氮中进行冷冻保存的方法。而通过玻璃化保存方法来保存的胚胎，其细胞内外的水分不会形成结晶，使细胞结构不会受到破坏而得以存活；这种方法操作简单，因此获得了广泛的应用。然而，此方法存在的一个最大缺陷在于：冷冻保存的胚胎必须放在液氮温度中才能维持胚胎复苏后的成活率，这给胚胎的解冻和运输都带来了严格的要求，无法满足胚胎移植及实验研究的需要。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法；本发明的第二个目的在于提供一种适用于此方法的保存玻璃化冷冻胚胎的器具。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，它包括以下步骤：
S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；
S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；
S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；
S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。
优选地，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。
优选地，在步骤S2中，对容积为0.25ML的麦管作紫外线照射消毒处理以获得无菌麦管，置入的混合有胚胎的保存液的长度为2cm。
优选地，预先将麦管传热容器和盛装有乙醇溶液的真空保温容器置于-80摄氏度的冰箱中作冷冻平衡处理，冷冻平衡处理时间不少于24h。
一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，它包括真空保温容器、盛装于真空保温容器内的乙醇溶液、置于真空保温容器内并位于乙醇溶液的液面内的麦管传热容器以及封装于麦管传热容器内且内部填充有胚胎的无菌麦管，所述无菌麦管的两个端口作密封处理。
优选地，所述麦管传热容器为由铝合金材料制成的圆筒状结构体。
优选地，所述无菌麦管内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段、经填充空气所形成的间隔空气段以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段，所述保存液段位于相邻的两个间隔空气段之间，且所述营养液段与间隔空气段相邻并位于无菌麦管的至少一端。
优选地，所述保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成。
由于采用了上述方案，本发明实施例通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用以及优化保存方法步骤，形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于-80摄氏度的冰箱中的模式，一方面能够使胚胎在保存的过程中处于稳定的状态，减轻胚胎在冷冻过程中其内部的过冷化程度，从而获得相比于传统方式相同或者更加稳定的成活率，另一方面使胚胎可以被暂存于冰箱中，避免因利用液氮进行保存而产生的保存标准要求高、繁琐不便等系列问题，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。
附图说明
图1是本发明实施例的保存器具的截面结构示意图；
图2是本发明实施例的无菌麦管的内部填充物分布示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本实施例提供的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，它包括以下步骤：
S1、胚胎预处理：准备一份平衡液和两份保存液，将获取的胚胎(包括但不限于如自然胚胎、体外受精胚胎、克隆胚胎等)置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于其中一份保存液处理至少1min(此时另一份保存液最好置于-80摄氏度的冰箱中进行暂存)，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液(即：PBS溶液(Phosphate BufferSaline))、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；
S2、胚胎入管：如图1所示，将经步骤S1处理的胚胎浸入另一份保存液中，按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液(其与步骤S1中所使用的保存液的成分比例相同，并且最好在3min之内入管)，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；在具体实施时，可将上述材料吸入的一端用密封塞塞住、相对端则可利用酒精等加热后作热压封口处理)，从而不但可以利用位于胚胎两侧的空气和蔗糖培养液实现对胚胎的隔离，而且保证胚胎具有充足的营养和气体供给；
S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器(其可根据实际情况采用具有良好导热性能的材料制作而成)内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内(所述及的液面内即是指液面下或者处于乙醇溶液的浸泡状态下)；
S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。
基于现有的玻璃化保存方法仅能使用液氮来实现，而不便于对冷冻胚胎进行灵活、便捷地保存的现状，本发明实施例通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用以及优化保存方法步骤，形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于-80摄氏度的冰箱中的模式，利用以PBS溶液为基础液并通过将乙二醇、蔗糖、聚蔗糖等成分溶解为一体所形成的平衡液对胚胎进行预处理，可利用乙二醇在低浓度时候的低毒性的特性，在较长的处理时间内使乙二醇充分渗透至胚胎内部以形成对胚胎的内部保护，而利用蔗糖和聚蔗糖在平衡液中所起到的促进胚胎脱水的作用，来降低胚胎内部的水分含量；利用保存液所具有的高浓度冷冻保护成分的特点，不但可以在短时间内使乙二醇迅速渗透至胚胎内部并促进胚胎内部的水分快速渗出，同时利用高浓度的保存液也可在对胚胎进行冷冻后使胚胎的内外部不会形成冰晶，形成一个稳定的玻璃化冷冻状态，以为将胚胎置于冰箱中进行保存创造条件。基于此，一方面能够使胚胎在保存的过程中处于稳定的状态，减轻胚胎在冷冻过程中其内部的过冷化程度，从而获得相比于传统方式相同或者更加稳定的成活率，另一方面使胚胎可以被暂存于冰箱中，避免因利用液氮进行保存而产生的保存标准要求高、繁琐不便等系列问题，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。
为满足在实施本方法的实际动作流程的需要，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理(即：相当于将其暂存于出发地的实验室内的液氮保存容器中)，以为执行步骤3提供缓冲时间。
作为优选方案，在步骤S2中，可通过对容积为0.25ML的麦管作紫外线照射消毒处理来获得无菌麦管，此时，置入的混合有胚胎的保存液的长度为最好为2cm。由此，可为蔗糖培养液以及间隔空气柱植入麦管中提供充裕的空间并保证足够的用量，从而保证胚胎在运输的过程中能够获取充足的养分和气体。当然，在具体实施时，混合有胚胎的保存液在麦管内的长度可按上述参数比例，根据麦管的具体容积作反比选择处理。当然，真空保温容器、麦管传热容器等均可预先进行紫外线照射消毒。
为增强整个方法在实施后，能够为胚胎创造平衡的温度环境，可预先将麦管传热容器和盛装有乙醇溶液的真空保温容器置于-80摄氏度的冰箱中作冷冻平衡处理，冷冻平衡处理时间不少于24h。由此，通过将真空保温容器完成对无菌麦管的封装后，再将整个器皿置于冰箱中，可保证胚胎不会发生剧烈或缓慢的温度变化，即保证胚胎的环境温度相对平衡并接近冰箱所产生的温度。
为对本实施例的方法进行可实施性的充分验证并充分体现出其有益效果，选取对温度敏感性相对较高的小鼠的胚胎(具体为桑椹胚)作为实验对象(主要是基于小鼠胚胎比野生型动物的胚胎对温度的敏感性更高的特点)，将处于新鲜状态下和利用本实施例的保存液和平衡液进行预处理以及利用本实施例的方法进行保存下的小鼠胚胎为对比对象；具体实验验证方法如下：
1、胚胎来源：选取诱导促排的小鼠，在HCG(即：β-HCG(人绒毛膜促性腺激素))注射76小时后从子宫中回收桑葚胚。
2、胚胎处理：依上述方法将胚胎进行处理并保存于-80摄氏度的冰箱中。
3、存放一周之后，对胚胎作解冻处理(如室温水浴解冻复苏处理)，观察胚胎的形态学和移植后的效率等(详见表一，即：小鼠胚胎的成活率以及移植的活产率数据表)。
从表一所显示的实施结果来看，与新鲜的小鼠胚胎相比，采用本实施例的方法进行保存处理后，桑葚胚形态成活率为95％、产仔率为64％。数据表明在-80度冰箱存放的胚胎成活率没有任何下降，而移植实验结果也表明，胚胎移植后的产仔率跟新鲜的胚胎没有过大的差异。基于此，可以确定：本实施例的方法能够作为一种全新的胚胎保存模式，一方面能够使胚胎在保存的过程中处于稳定的状态，减轻胚胎在冷冻过程中其内部的过冷化程度，从而获得相比于传统方式相同或者更加稳定的成活率，另一方面使胚胎可以被暂存于冰箱中，避免因利用液氮进行保存而产生的保存标准要求高、繁琐不便等系列问题，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。
基于上述方法，如图1和图2所示，本发明实施例还提供了一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，它包括真空保温容器1(如真空保温杯等)、盛装于真空保温容器1内的100％乙醇溶液2、置于真空保温容器1内并位于乙醇溶液2的液面内的麦管传热容器3以及封装于麦管传热容器3内且内部填充有胚胎的无菌麦管4，并且无菌麦管4的两个端口作密封处理。由此，利用麦管传热容器3作为封装有胚胎的无菌麦管4的装载器具可避免无菌麦管4直接接触乙醇溶液2，同时利用乙醇溶液2在无菌麦管4的周围形成相对均衡且密闭的冷冻保温层，使经由乙醇溶液2所传递的冷量能够均匀地分布在无菌麦管4的周围，而利用真空保温容器1则可为其内部的部件创造一个真空无菌环境，并作为整个器具的整体外构件；在具体实施时，可以上述方法对胚胎进行预处理及入管处理后，将整个器具置于-80摄氏度的冰箱中进行暂存，即可保证胚胎处于稳定的玻璃化状态，便于在实验室内对胚胎进行便捷灵活的取用、操作及移植等等。
为保证无菌麦管4能够均匀且平衡的受冷，同时增强整个器具内部部件之间的热传递效果，本实施例的麦管传热容器3优选为为由铝合金材料制成的圆筒状结构体。以通过对其材料的选择以及形状构造的设置来吻合无菌麦管4的形态构造，从而使无菌麦管4能够处于一个温度相对均衡的空间内。
作为优选方案，为保证胚胎能够获取充分的营养和气体，本实施例的无菌麦管4内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段a1、经填充空气所形成的间隔空气段b1以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段c，其中，保存液段c位于相邻的两个间隔空气段b1之间，而营养液段a1与间隔空气段b1相邻并位于无菌麦5管的至少一端；从而通过对无菌麦管5的内部成分的优化选择，可为胚胎创造一个相对完备的营养及气体供给系统，进而为胚胎的保存创造条件。在此基础上，本实施例的保存液采用以HTF培养基为基础液并由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成的液剂，以提高保存液的浓度并降低其毒性，从而减轻胚胎在冷冻过程中其内部的过冷化程度，为胚胎的冷冻、复苏及移植等创造条件。
另外，需要指出的是：本实施例所述及的HTF基础液是指人输卵管液(HTF)培养基(英文为Human Tubal Fluid(HTF)Medium)，其可参见表二作成分配置。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；
S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；
S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；
S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。
2.如权利要求1所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。
3.如权利要求1所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：在步骤S2中，对容积为0.25ML的麦管作紫外线照射消毒处理以获得无菌麦管，置入的混合有胚胎的保存液的长度为2cm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，其特征在于：预先将麦管传热容器和盛装有乙醇溶液的真空保温容器置于-80摄氏度的冰箱中作冷冻平衡处理，冷冻平衡处理时间不少于24h。
5.一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，其特征在于：它包括真空保温容器、盛装于真空保温容器内的乙醇溶液、置于真空保温容器内并位于乙醇溶液的液面内的麦管传热容器以及封装于麦管传热容器内且内部填充有胚胎的无菌麦管，所述无菌麦管的两个端口作密封处理。
6.如权利要求5所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，其特征在于：所述麦管传热容器为由铝合金材料制成的圆筒状结构体。
7.如权利要求5所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，其特征在于：所述无菌麦管内形成有经填充蔗糖培养液所形成的营养液段、经填充空气所形成的间隔空气段以及经填充保存液所形成以用于混合胚胎的保存液段，所述保存液段位于相邻的两个间隔空气段之间，且所述营养液段与间隔空气段相邻并位于无菌麦管的至少一端。
8.如权利要求7所述的一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的器具，其特征在于：所述保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成。
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