CN117279505A - 冷冻保存方案中不含其它冷冻保护剂的使用海藻糖的保存方法 - Google Patents

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CN117279505A CN202280033226.4A CN202280033226A CN117279505A CN 117279505 A CN117279505 A CN 117279505A CN 202280033226 A CN202280033226 A CN 202280033226A CN 117279505 A CN117279505 A CN 117279505A
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Abstract

在冷冻保存方案的过程中，通过将细胞材料与含有有效量海藻糖的冷冻保护剂制剂/培养基/溶液(在不存在DMSO和/或任何其他添加的冷冻保护剂的情况下)组合来保存含有活细胞的细胞材料。也就是说，该冷冻保存方案不含海藻糖以外的其他冷冻保护剂，且该冷冻保存方案包括：使细胞材料暴露于包含有效量的海藻糖充当冷冻保护剂的冷冻保护剂制剂，以‑3℃/分钟至‑50℃/分钟的冷却速率将细胞材料冷却至‑20℃以下的预定温度，获得已升温的冷冻保存的细胞材料。

Description

冷冻保存方案中不含其它冷冻保护剂的使用海藻糖的保存 方法
关于联邦资助研究的说明
本发明是在政府支持下由美国国立卫生研究院的国家心、肺和血液研究所授予的基金号HL142371资助完成。政府对本发明享有一定权利。
相关申请的交叉引用
本非临时申请要求2022年5月4日提交的美国临时申请号63/183,678的权益。在先申请的公开内容均通过引用其全部内容纳入本文。
技术领域
本发明涉及细胞和组织保存领域，具体地，本发明涉及细胞材料的冷冻保存方法，例如，例如，干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(和T细胞亚群及CAR T-细胞)和胰岛，所述方法使用海藻糖，但不包含其他添加的冷冻保护剂，例如二甲亚砜(DMSO)、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等。
背景技术
研究中使用的大多数细胞是在向悬浮液细胞中添加5-10％ DMSO后冷冻保存在冷冻管中的，随后以约-1℃/分钟的缓慢速率冷却，在零下高温(通常高于-10℃)有或没有诱导成核，并在-80℃或低于-135℃储存。
然而，存在难以保存的细胞类型和组织以及细胞产量非常重要的情况，例如，对于细胞治疗应用。仍需要改进细胞活力和产量并允许保存传统上难以保存的细胞类型的替代性方案和办法。由于新型细胞疗法的开发和基于细胞和组织的药物开发筛选试验变得更加普遍，需要有效的保存办法和方案，以便实现干细胞移植和分析等新兴疗法的潜在用途和益处。
随着对更快、更便宜地将药物推向市场的需求增加，需要更优、更具成本效益的高通量筛选技术和服务。缩短发现和验证之间的前置期是一个重要的开发领域，制药公司正在将其重点转向确定潜在药物的毒性。基于细胞和组织的试验是这种筛选的趋势。二十多年前，1997年，全球范围内的制药和生物科技公司已经花费了420亿美元用于研发，其中筛选占约59亿美元。环保公司正在从修复和清理活动转向监测和质量控制。此外，越来越多的公司正在使用外部来源筛选产品和服务。在所有这些领域中，需要能够提供成本效益的、可靠的和定量结果的细胞和组织试验系统。因此，非常需要能够增加细胞产物可用性并提高使用此类产物的效率的保存方法。
DMSO是已发现的最有效且应用最广泛的冷冻保护剂。细胞冷冻保存通常涉及在含有DMSO的培养基中以缓慢冷却速率冻结和在-135℃以下储存备用。细胞产量和活力非常重要的例子包括在生物反应器蛋白质生产运行的培养开始时昂贵延迟的最小化，和涉及将细胞给予患者以治疗多种疾病(例如癌症)的细胞疗法。虽然一些细胞(例如成纤维细胞)容易冷冻保存，但是其他细胞类型(如角质形成细胞、肝细胞和心肌细胞)不能良好地冻结，且细胞产量通常远低于50％。
目前的观点是，应当在将细胞输注给患者之前除去DMSO(Caselli等,造血干细胞移植期间接受二甲亚砜和吗啡的儿童的呼吸抑制和嗜睡(Respiratory depression andsomnolence in children receiving dimethylsulfoxide and morphine duringhematopoietic stem cell transplantation.)Haematologica,94:152–3,2009；Junior等,与二甲亚砜保存的造血祖细胞输注相关的神经毒性(Neurotoxicity associated withdimethyl sulfoxide-preserved hematopoietic progenitor cell infusion.)BoneMarrow Transplant,41:95–6,2008；Mueller等,对患有和不患有已有的脑部疾病的患者输注二甲亚砜冷冻保存的外周血干细胞后的神经毒性(Neurotoxicity upon infusion ofdimethylsulfoxide-cryopreserved peripheral blood stem cells in patients withand without pre-existing cerebral disease.)Eur JHaematol,78:527–31,2007；Otrock等,与输注DMSO冷冻保存的自体血干细胞相关的短暂性全面遗忘症(Transientglobal amnesia associated with the infusion of DMSO-cryopreserved autologousblood stem cells.)Haematologica,93:36–7,2008；和Schlegel等,接受二甲亚砜(DMSO)冷冻保存的外周血干细胞的儿科受者出现短暂意识丧失，与吗啡联合用药无关(Transientloss of consciousness in pediatric recipients of dimethylsulfoxide(DMSO)-cryopreserved peripheral blood stem cells independent of morphine co-medication.)Haematologica,94:1473-5,2009)。因此，增加了有效使用这类细胞所需的时间。
DMSO细胞毒性的机制尚未确定，然而，它被认为调节膜流动性，诱导细胞分化，引起胞质微管改变和金属复合物(Barnett,二甲亚砜和甘油对Na+,K+-ATP酶和膜结构的影响(The effects of dimethylsulfoxide and glycerol on Na+,K+-ATPase and membranestructure.)Cryobiology.1978；15(2):227-9；Katsuda等,二甲亚砜对培养平滑肌细胞的细胞生长和超微结构特征的影响(The influence of dimethyl sulfoxide on cellgrowth and ultrastructural features of cultured smooth muscle cells.)JElectron Microsc(Tokyo).1984；33(3):239-41；Katsuda等,二甲亚砜诱导培养的动脉平滑肌细胞中微管的形成(Dimethyl sulfoxide induces microtubule formation incultured arterial smooth muscle cells.)Cell Biol Int Rep.1987；11(2):103-10；Miranda等,二甲亚砜改变成肌细胞表型(Alteration of myoblast phenotype bydimethyl sulfoxide.)Proc Natl Acad Sci U SA.1978；75(8):3826-30)。DMSO也以剂量依赖方式减少胶原mRNA的表达(Zeng等,二甲亚砜降低人肝星状细胞和人包皮成纤维细胞中I型和III型胶原蛋白的合成(Dimethyl Sulfoxide Decrease Type-I and–IIICollagenSynthesis in Human Hepatic Stellate Cells and Human Foreskin Fibroblasts.)Advanced Science Letters,3:496–499,2010)。最近，已经报道了DMSO对细胞周期进程和减数分裂纺锤体组织(Li等,二甲亚砜扰动猪减数分裂卵母细胞的细胞周期进程和纺锤体组织(Dimethyl Sulfoxide Perturbs Cell Cycle Progression and SpindleOrganization in Porcine Meiotic Oocytes.)PLoS One.2016年6月27日；11(6):e0158074)、蛋白质聚集(Giugliarelli等,细胞中DMSO诱导蛋白质聚集的证据(Evidenceof DMSO-Induced Protein Aggregation in Cells.)J Phys Chem A.2016年7月14日；120(27):5065-70)以及有可能干扰多种细胞过程的总体分子变化的影响(等,低剂量二甲亚砜驱动的总体分子变化有可能干扰多种细胞过程(Low dose dimethyl sulfoxidedriven gross molecular changes have the potential to interfere with variouscellular processes.)Sci Rep.2018；8(1):14828)。
因此，需要能避免或改善使用DMSO作为冷冻保护剂的结果的细胞冷冻保存方法。在这方面，二糖，例如海藻糖作为冷冻保护剂已被广泛研究。海藻糖成为有效冷冻保护剂的主要假说是海藻糖应该存在于细胞膜的两侧。海藻糖不被哺乳动物细胞代谢，不存在摄取海藻糖的主动哺乳动物转运机制。因此，在本公开的方法的发明之前，预期(仅)使用海藻糖具有非常低的活力和代谢功能价值(特别是在不存在DMSO的情况下)。
本公开的方法解决了上述需求，并通过提供用于广泛的潜在应用的更高效、更具成本效益且更安全的储存和运输细胞材料的方法，提供了对现有细胞和组织疗法的改进。见图1。
本公开的方法还寻求增加细胞材料的可用性，该细胞材料例如，例如，干细胞、造血干细胞、间充质干细胞(例如人间充质干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(和T细胞亚群和CAR T细胞)以及胰岛)，并且能够增加这些改变寿命的细胞材料的使用(在一些情况下，该细胞能够在解冻后直接使用和/或输注给患者，无需任何间插步骤)。本公开的方法的应用还包括细胞和组织研究、基于细胞和组织的工程改造再生医学产品以及用于移植和毒理学筛选的细胞和组织建库。
发明内容
本公开提供了改进的保存方法，在冷冻保存方案中，在不存在其他添加的常规冷冻保护剂(例如DMSO、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等，特别是DMSO)的情况下使用海藻糖。
在一些实施方式中，本公开涉及通过置换常规冷冻保护剂(例如，那些已知有毒的，例如DMSO和/或那些设计为在细胞或组织被冷冻保存于-80℃或更低温度复温后去除的冷冻保护剂)，提供了实现对细胞或组织的保护效果和低毒性的冷冻保存方法。本公开的方法提供了一种廉价且安全的冷冻保存方法，无需使用剧毒冷冻保护剂(例如DMSO或其他常规冷冻保护剂，它们在细胞被浸入冷冻保存液并随后在-80℃或更低温冷冻保存时使用)。由于不使用DMSO等常规冷冻保护剂，该细胞(在保存、储存过程中，在复温过程中或之后)经历的毒性保持在低水平，且该细胞能够在解冻后直接使用和/或输注给患者，无需任何间插步骤。在一些实施方式中，解冻的细胞或组织可以悬浮在培养基中以立即(即在复温过程后直接)开始培养过程(例如，在细胞或组织解冻后不进行洗涤)。
在一些实施方式中，本公开的方法涉及以维持所有细胞功能(例如，细胞包括，例如，干细胞、胰岛、间充质干细胞等的细胞)的方式冷冻保存培养的细胞。因此，改进了这些细胞的使用和/或移植的效率。例如，在一些实施方式中，本公开的方法涉及提供按需的、现成的一种或多种骨髓来源的人间充质干细胞(hMSC)，其从储存中复温后无需进一步处理/洗涤即用于治疗用途。在一些实施方式中，本公开的方法涉及泛T-细胞的冷冻保存，该方法使用海藻糖而不包含其他添加的冷冻保护剂，例如DMSO或其他常规的冷冻保存剂(例如丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等)，当细胞被浸入冷冻保存液并随后在-80℃或更低温冷冻保存时。
附图简要说明
图1说明了可能最终受益于细胞和组织疗法的潜在患者群体(美国患者总群体为1.22亿)。
图2是关于实验获得的数据的图示，该实验显示了冷冻保存后，所示浓度的海藻糖(不含DMSO和含DMSO)与仅DMSO的对照相比，冷却速率对hMSC活力的影响；数据显示为平均值±平均值的1个标准误差。
图3A和3B是使用DMSO和海藻糖的组合以-15℃/分钟冷冻保存后关于细胞存活获得的数据的图示(使用多种浓度的DMSO及海藻糖冷冻保存细胞并复温)。含有5％ DMSO的Cryostor-5用作对照。测量了活细胞和死细胞计数(图3A)以及代谢活性(图3B)。数值是来自0.2-0.6M海藻糖的3次实验的9个重复的平均值(±SEM)和来自0.8M海藻糖的Cryostor-5对照的1次实验的3个重复的平均值(±SEM)。
具体实施方式
术语和定义
在以下详细说明部分，陈述了大量细节以便理解本发明。然而，本领域技术人员可以理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开的方法，并且可以对所描述的实施例进行多种变化或修改。
首先，应该注意的是，在任何实际实施方案的发展中，会做出许多特定的实施决定以达到开发者的特定目标，例如遵从系统相关的和经济相关的限制，这会造成不同实施之间的差异。此外，应理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但是这对于从本发明公开中获益的本领域普通技术人员而言会是常规工作。此外，本文使用/公开的组合物还可包含除所引用的那些之外的一些组分(即除了其他冷冻保护剂外)。在概述和该详细描述中，每个数值应该被一次理解为由术语"约"修饰(除非已经明确地如此修饰)，然后再次理解为未如此修饰，除非在上下文中另有说明。
如本文所用，与量结合使用的术语"约"包括所述值并且具有上下文所规定的含义。例如，它至少包括与特定量的测量相关的误差程度。当在范围的上下文中使用时，修饰词"约"也被认为公开了由两端点的绝对值所限定的范围。例如，“约2至约4”的范围也公开了“2至4”的范围。
除非本文另有明确说明，否则关于温度(℃)的修饰词"约"是指所述温度或温度范围，以及所述温度或温度范围所述的(所述温度或者温度范围的终点的)+/-1-4％。关于细胞活力和细胞保留率(％)，除非本文另有明确说明，关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰词约摂是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于表达内容，例如，以百万分之一(ppm)或十亿分之一(ppb)为单位，除非本文另有明确说明，否则关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰语"约"指的是所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于以单位μg/mL表达含量，除非本文另有明确说明，关于以μg/mL表示的值的修饰词"约"是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-4％。关于摩尔浓度(M)，除非本文另有明确说明，关于摩尔浓度(M)的修饰词"约"是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-2％。关于冷却速率(℃/分钟)，除非本文另有明确说明，关于冷却速率(℃/分钟)的修饰词"约"是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。
此外，在概述和该详细描述中，应该理解的是，列出或描述的有用，合适的范围等旨在包括对该范围内的任何可想到的子范围的支持，至少因为该范围中的每个点，包括终点在内的范围应视为已经说明。例如，“1至10的范围”将被读取为指示沿着约1和约10之间的连续区上的每个可能的数字。另外，例如，+/-1-4％将被读取为指示沿着1和4之间的连续区上的每个可能的数字。此外，本示例中的一个或多个数据点可以组合在一起，或者可以与说明书中的数据点之一组合以创建范围，因此包括此范围内的各可能值或数字。因此，(1)即使明确指定了该范围内的许多特定数据点，(2)即使参考该范围内的一些特定数据点，或(3)即使该范围内没有明确指定的数据点，会理解(i)发明人想到并理解该范围内的任何可想到的数据点应被认为已被指定，并且(ii)发明人拥有整个范围，范围内的可想到的每个子范围，以及范围内的每个可想到的点的知识。此外，本文说明性地公开的本申请的主题可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。
除非另有明确说明，否则"或"指的是包含性的或，而不是指排他性的或。例如，条件A或B满足以下任何一个：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
另外，使用"一个"或"一种"来描述本文实施方案的元件和组分。这仅仅是为了方便并且给出根据本公开的概念的一般意义。除非另有说明，否则该描述应理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数。
本文所用的术语和词语是为了描述目的，而不应被视为限制性的。诸如"包括"，"包含"，"具有"，"含有"或"涉及"及其变体的语言旨在广泛并且包括其后列出的主题，等同物和未列举的其他主题。
此外，如本文所用，"一个实施方案"或"一种实施方案"表示结合实施方案描述的具体元件、特征、结构或性质包括在至少一个实施方案中。在说明书中各处出现的短语"在一个实施方案中"不一定是指同一实施方案。
如本文所用，术语"室温"是指在标准压力下约18℃至约25℃的温度。在各种实例中，室温可为约18℃，约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃或约25℃。
如本文所用，"细胞材料"或"细胞样品"是指含有细胞组分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造的，并且包括细胞，组织和器官，无论是天然的还是人造的。这些术语还指任何类型的待冷冻保存的生物材料，例如细胞，组织和器官。在一些实施方案中，细胞，组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人器官)，哺乳动物细胞(例如人细胞)和哺乳动物组织(例如人组织)。
如本文所用，术语"细胞"包括任何类型的细胞，例如干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(以及T细胞亚群和CAR T细胞)、胰岛、体细胞(包括组织或器官中的各种细胞)、成纤维细胞、角质形成细胞、肝细胞、心肌细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、祖细胞、卵母细胞和生殖细胞。这些细胞可以是组织或器官的形式。在一些实施方式中，细胞来自哺乳动物组织或器官，例如上述人组织或器官。
如本文所用，"保存方案"或"冷冻保存方案"是指保存含细胞的活生物材料的保质期的方法。保存方案可包括通过冻结、玻璃化冷冻保存和/或通过冻干或干燥进行脱水(anhydrobiotic)保存。如本文所用，术语“冻结(freezing)”是指促使冰形成的保存方法。随着温度降低和发生冻结，不仅会发生物理变化(水形成冰)，还会发生化学变化，从而影响解冻后细胞和组织的活力和存活。随着温度降低，热量被去除，分子过程减慢，甚至在冻结之前就会导致细胞内的各种结构和功能改变。结果，细胞经历一系列生化和生物物理变化，使细胞对进一步损伤敏感，并可能导致不可逆的损伤。
如果通过冻结方式冷冻保存细胞，冰最初会在胞外空间形成。纯水以冰晶形式分离，使得剩余的溶质浓缩在剩余的液相中。结果，水穿过质膜并流出细胞，以试图在胞外空间内重建渗透平衡。如果细胞冷却得太快，水从细胞中移出的时间就会减少，使得形成胞内冰，这会对细胞造成不可挽回的损伤。如果细胞冷却得太慢，会使得更多的水离开细胞，从而增加细胞内溶质的浓度。细胞内外溶质浓度的增加被称为“溶液效应”损伤，因为它包含许多变化，包括盐浓度的增加(使蛋白质和膜变性)、缓冲液沉淀、pH变化、蛋白质浓度增加允许交联的可能性或结构上重要的水的简单去除。当细胞被形成冰推到一起时，细胞也会以较慢的冷却速率浓缩。最终，细胞被分离在无冰的玻璃化通道中，并能在低温存储温度下储存。最大细胞活力通常在平衡渗透脱水和胞内冰形成风险的中等冷却速率时实现。快速冷却使得胞内冰形成。
在复温期间，过程相反，用水代替冰，且从系统中去除冷冻保护剂(CPA)。然而，使细胞回到生理温度的物理和化学变化仍然会导致损伤。当样品升温时，可能会发生再结晶(recrystallization)。再结晶是在冻结过程中形成的亚稳态冰晶有机会在复温期间再形成更大的晶体。这些冰晶会以与冻结期间形成那些晶体类似的方式对细胞产生损伤。复温期间的另一个问题是冷冻保护剂的去除。在冻结前，CPA被加入样品中，对于像DMSO的化合物，它们取代了从细胞中去除的水。由于DMSO并不像水一样容易穿过细胞膜，可能会产生不平衡，使得细胞将趋于吸收水快于去除DMSO，从而导致溶胀。过于溶胀会对细胞产生不可逆的损伤，因此，即使冻结方案有效，如果复温控制不当，细胞存活仍会不佳。所有这些因素都会影响在冷冻保存过程中细胞的总存活。因此，可能需要针对给定的细胞类型进行优化(Baust JM,Campbell LH,Harbell JW.(2017)冷冻保存、解冻、恢复和评估细胞的最佳实践(Best practices for cryopreserving,thawing,recovering and assessing cells.)InVitro Cell Dev Biol Anim.53(10):855-871)。
如本文所用，术语“玻璃化”指无冰晶生成或无大量冰晶生成的凝固，尽管事实上在通过冻结的冷冻保存中，细胞被保存在以其他方式冻结的样品内的玻璃化通道中。在一些实施方式中，待保存的样品(例如组织或细胞材料)可以被玻璃化，使得玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(其整体——从起始冷却至复温完成)可以在没有任何冰晶形成的情况下实现。在一些实施方式中，待保存的样品(例如组织或细胞材料)可以被玻璃化，使得玻璃化和/或玻璃体冷冻保存即使在小、或有限量的冰(其量小于对组织产生损伤的量)存在的情况下实现，待保存的样品(例如组织或细胞材料)可以实现发生凝固而无大量冰晶形成(即玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(其整体——从起始冷却至复温完成))。
如本文所用，待保存的样品(例如器官、组织或细胞材料)在达到玻璃化转变温度(Tg)时被玻璃化。玻璃化过程包括冷冻保护剂溶液的粘度随着温度的降低而显著增加，从而抑制了冰的成核和生长。通常，溶液在不冻结的情况下可能过冷的最低温度是均相成核温度Th，在此温度下冰晶成核并生长，并由溶液形成结晶固体。玻璃化溶液具有玻璃化转变温度Tg，在此温度下溶质玻璃化或成为非晶固体。
如本文所用，“玻璃化转变温度”是指溶液或制剂的玻璃化转变温度，在该条件下，样品从更液相转变为固相，其中所有分子运动停止，在玻璃化和冻结样品中都观察到玻璃化转变。通常，本公开的方法是在生理压力下进行的。然而，可以使用更高的压力，只要待保存的样品(例如组织或细胞材料)不会因此而显著损害。
如本文所用，“生理压力”是指组织在正常功能过程中所承受的压力。因此，术语“生理压力”包括正常的大气条件，以及各种组织，如血管化组织，在舒张和收缩条件下承受的更高压力。
如本文所用，术语“糖”可以指任何糖。在一些实施方式中，糖是多糖。如本文所用，术语“多糖”指含有多于一个单糖单元的糖。即，术语多糖包括寡糖，例如二糖和三糖，但不包括单糖。糖还可以是糖的混合物，例如其中至少一种糖是多糖。在一些实施方式中，糖(除了海藻糖)可以是选自二糖和三糖的至少一种。在一些实施方式中，糖(除了海藻糖)是二糖，例如蔗糖。在一些实施方式中，糖(除了海藻糖)是三糖，例如棉子糖。糖(除了海藻糖)还可以与蔗糖和/或棉子糖和/或其他二糖或三糖组合。
如本文所用，涉及冷冻保存的材料的术语"冷冻保存后有功能的"，意指冷冻保存的材料(例如器官或组织或细胞)在冷冻保存之后保持冷冻保存之后可接受的和/或预期的功能。在一些实施方式中，冷冻保存后的细胞材料保留其所有预期功能。在一些实施方式中，通过本公开内容的方法保存的细胞冷冻保存的材料保留预期功能的至少50％，例如预期功能的至少60％，例如预期功能的至少70％，例如预期功能的至少80％，例如预期功能的至少90％，例如预期功能的至少95％，例如预期功能的100％。例如，除了保留细胞活力，维持/保留细胞的生理功能和/或组织/细胞(例如，待移植的组织/细胞)与周围组织整合的能力也可能很重要。
如本文所用，术语"无菌"意指不含活的细菌，微生物和能够增殖的其他生物体。
如本文所用，术语"除了海藻糖基本上不含冷冻保护剂"是指冷冻保护剂(除了海藻糖)的量小于0.01w/w％。在一些实施方式中，本公开的方法可以使用和/或实现基本上不含冷冻保护剂(除了海藻糖)的培养基/溶液和/或细胞材料，例如基本上不含DMSO的细胞材料(即DMSO的量低于0.01w/w％)。在一些实施方式中，本公开的方法可以使用和/或实现除了海藻糖基本上不含任何添加的冷冻保护剂的培养基/溶液和/或细胞材料。在这方面可以排除的除海藻糖之外的冷冻保护剂可以是当将细胞浸入冷冻保存液中然后在-80℃或以下冷冻保存时常规使用的一种或多种冷冻保护剂，或者以下冷冻保护剂中的一种或多种(通常添加用于该功能)：DMSO、甘油、乙酰胺、琼脂糖、藻酸盐、丙氨酸、白蛋白、乙酸铵、抗冻蛋白、丁二醇(例如2,3-丁二醇)、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、环己二醇、环己二酮类、环己三醇类、葡聚糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺(例如n-二甲基甲酰胺)、二甲亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、甲酰胺、葡萄糖、甘油、甘油磷酸酯、单乙酸甘油酯、甘氨酸、糖蛋白、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化镁、硫酸镁、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲氧基丙二醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、甲基葡萄糖、甲基甘油、苯酚、复合多元醇(pluronic polyols)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇(例如1,2-丙二醇和1,3-丙二醇)、吡啶N-氧化物、棉子糖、核糖、丝氨酸、硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸钠、山梨糖醇、三甘醇、乙酸三甲胺(trimethylamine acetate)、尿素、缬氨酸和木糖。
实施方式
本公开描述了方法(包括，例如，快速冷却速率，即，比用于有核哺乳动物细胞的约1℃/分钟速率的传统慢速冷却更快的冷却速率)和含有海藻糖的组合物，冷冻保存方案中不存在任何其他常规冷冻保护剂，例如DMSO、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等，或不含和/或基本上不含除海藻糖之外的冷冻保护剂的方法和组合物。
本文描述的冷冻保存方法使用海藻糖。待保存的样品可以在不存在常规冷冻保护剂例如DMSO的情况下浸入或灌注以包含海藻糖的冷冻保护制剂，或者不含或基本上不含除海藻糖之外的冷冻保护剂的方法和组合物，或被浸入或灌注以不含或基本不含除海藻糖之外的添加冷冻保护剂的冷冻保护制剂。海藻糖的使用与快速冷却速率结合，其中快速冷却速率在大于1℃/分钟至约80.0℃/分钟的范围内(例如从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-80℃或更低的过程中，或从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-135℃或更低的过程中)，或在约3℃/分钟至约50.0℃/分钟的范围内(例如从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-80℃或更低的过程中，或从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-135℃或更低的过程中)，或在约10℃/分钟至约30.0℃/分钟的范围内(例如从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-80℃或更低的过程中，或从约37℃-0.0℃范围内的温度冷却至约-135℃或更低的过程中)，或在约15℃/分钟至约25.0℃/分钟的范围内(例如从约37℃冷却至约-80℃或更低的过程中，或从约37℃冷却至约-135℃或更低的过程中)。
在一些实施方式中，快速/迅速冷却可以在将细胞转移到其最终储存温度的冷冻箱之前通过在液氮中速冻进行。
在本公开的方法中，被保存的细胞材料的代谢活性可以在复温6小时内，复温24小时内，或复温48小时内或复温96小时内完全恢复至对照值(即，解冻后无需中间洗涤步骤；因此，减少处理时间和变化)。使用与在适合保存的特定组织的生长培养基中暴露于海藻糖制剂的细胞材料类型相同的新鲜细胞材料评估/设定对照值。维持恢复的代谢活性(例如持续数小时、数天或至少3天的时间段，或至少5天的时间段或至少7天的时间段)直到通过本发明的方法保存的冷冻保存的细胞材料被投入其预期用途，包括，例如，研究或治疗用途(例如移植)。
在实施方式中，该公开描述了包含海藻糖而不存在常规冷冻保护剂(例如DMSO)的冷冻保护组合物、基本上不含除海藻糖之外的添加的冷冻保护剂的冷冻保护组合物，其有效解冻冷冻保存的样品，所述样品包括组织/细胞材料，对组织/细胞材料的损害最小。冷冻保护剂/制剂可以包含其他适合用于生物材料的冷冻保存的任何材料(除了其他冷冻保护剂、除了其他糖之外)。
本公开的方法包括将细胞材料(例如，干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(和T细胞亚群和CAR T细胞)和胰岛)与包含有效量的海藻糖而不存在常规冷冻保护剂(例如DMSO)的冷冻保护溶液接触。在一些特定的实施方式中，至少一种其他糖，例如二糖(例如蔗糖)，可以有效提供更有利于细胞材料的细胞(例如，干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(和T细胞亚群和CAR T细胞)和胰岛)在冷却和复温期间存活的环境的量存在于冷冻保护剂制剂/溶液中。
在一些实施方式中，通过本公开的方法保存的细胞冷冻保存的材料(例如，干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、T细胞(和T细胞亚群和CAR T细胞)和胰岛)保留预期功能的至少50％，例如预期功能的至少60％，例如预期功能的至少70％，例如预期功能的至少80％，例如预期功能的至少90％，例如预期功能的至少95％，例如预期功能的100％。
在实施方式中，包含海藻糖的制剂/溶液/培养基可以与待保存的样品接触持续任何期望的持续时间，例如直到细胞或组织上/内存在期望剂量(例如有效量)的海藻糖以提供改善的活力(冷冻保存后)和/或防止/保护升温时组织损伤。
在一些实施方式中，待冷冻保存的细胞还可以与冷冻相容的pH缓冲液接触，所述缓冲液包含例如至少碱性盐溶液，能量源(例如葡萄糖)和能够在冷却的温度下维持中性pH的缓冲液。众所周知的这种材料包括例如达氏改良伊氏培养基(DMEM)。该材料也可作为冷冻保存组合物的一部分包括在内。参见，例如，Campbell等，“用二糖冷冻保存贴壁平滑肌和上皮细胞(Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle and Endothelial Cellswith Disaccharides)”于：Katkov I.(编)《冷冻保存前沿》(Current Frontiers inCryopreservation).Croatia:In Tech(2012)；和Campbell等，"胰腺储液的开发：低温储存后β细胞存活和代谢状态的细胞保护性补充剂的初步筛选(Development of PancreasStorage Solutions:Initial Screening of Cytoprotective Supplements forβ-cellSurvival and Metabolic Status after Hypothermic Storage)，Biopreservation andBiobanking 11(1):12-18(2013)。其公开各自通过引用全文纳入此处。
在一些实施方式中，海藻糖和/或任选的其他糖(总计，包括海藻糖和任何其他糖，如果存在)可以以任何有效量存在(即，在不存在常规冷冻保护剂(例如DMSO)的情况下)于冷冻保存组合物中，例如以约100mM至约900mM、约150mM至约800mM、约200mM至约700mM、约250mM至约600mM、约275mM至约500M、约300mM至约450mM的量。
冷冻保存组合物还可以包括(或基于)非常适合储存细胞、组织和器官的溶液。溶液可包括众所周知的pH缓冲剂。在一些实施方式中，该溶液可以是，例如，EuroCollins溶液，其包含右旋糖，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，碳酸氢钠和氯化钾，参见Taylor等人，“Unisol与Euro-Collins溶液作为冷冻保护剂载剂溶液的比较(Comparison of Unisolwith Euro-Collins Solution as a Vehicle Solution for Cryoprotectants)，Transplantation Proceedings 33:677-679(2001)。其公开通过引用全文纳入此处。或者，可以将冷冻保护剂溶液配制在替代溶液中，例如Unisol、Hypothermosol(BioLifeSolutions)和Lifor(Detraxi,Inc)。
可以用于本公开的方法的细胞材料中的细胞可以是任何合适的细胞组合物。在一些实施方式中，细胞可以是干细胞，造血干细胞，淋巴细胞，白细胞，T细胞(和T细胞亚群和CAR T细胞)，皮肤细胞，角质形成细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肺细胞，肠系膜细胞，脂肪细胞，干细胞，肝细胞，上皮细胞，库普弗细胞，成纤维细胞，神经元，心肌细胞，肌细胞，软骨细胞，胰腺腺泡细胞，朗格汉斯胰岛，骨细胞，成肌细胞，卫星细胞，内皮细胞，脂肪细胞，前脂肪细胞，胆管上皮细胞，和任何这些细胞类型的组合或祖细胞。在一些实施方式中，本公开的方法中使用的此类细胞/组织可以来自任何合适的动物物种，例如哺乳动物，例如人，犬科(例如狗)，猫科(例如猫)，马科(例如马)，猪科，绵羊，山羊或牛科哺乳动物。
一旦制备了冷冻保存组合物(并且在不存在任何其他添加的常规冷冻保护剂(例如DMSO、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等)的情况下将海藻糖与待保存的细胞材料结合)，则冷冻保存的冷却可以以上述快速冷却速率进行(例如，如果冷却速率比那些常规的使用DMSO的更快，则在待保存的细胞材料周围的介质中仅使用海藻糖，而不将其放入细胞内(即，胞外海藻糖))，并且可以使用除上述材料之外的任何其他材料。用于保存细胞材料的方案中讨论的那些其他材料描述于以下专利和公开：Fahy等的美国专利号6,395,467；Wowk等的美国专利号6,274,303；Khirabadi等的美国专利号6,194,137；Fahy等的美国专利号6,187,529；Toner等的美国专利号6,127,177；Fahy等的美国专利号5,962,214；Calaco等的美国专利号5,955,448；Beattie等的美国专利号5,827,741；Goodrich等的美国专利号5,648,206；Meryman的美国专利号5,629,145；Rudolph等的美国专利号5,242,792；和WO 02/32225A2，其对应于Khirabadi等的美国专利申请号09/691,197，其公开各自通过引用全文纳入此处。
保存方案的冷冻保存部分通常包括将细胞/组织冷却至远低于水的冰点的温度，例如至约-80℃或更低，更通常至约-135℃或更低。可以使用本领域从业者已知的冷冻保存的任何方法(即能实现所需快速/迅速冷却速率的那些)。例如，用于冷冻保存的冷却方案可以是任何合适的类型，其中冷冻保存温度可以比约-20℃更低(即更冷)，例如约-80℃或更低(即更冷)，或约-135℃或更低(即更冷)。
在一些实施方式中，保存方案可包括从对照初始温度点(+4至-30℃)到-80℃或任何上述公开的冷却温度的连续受控速率冷却，快速冷却速率设置取决于被冷冻保存的细胞/组织的特性。例如，冷冻保存的冷却方案可以是速率(和/或平均冷却速率，例如从样品的初始温度冷却至冷冻保存温度)大于约-1.0℃每分钟，大于约-4.0℃每分钟，或大于约-6.0℃每分钟，或大于约-8.0℃每分钟，或大于约-10.0℃每分钟，或大于约-14.0℃每分钟，或大于约-25.0℃每分钟，或大于-30℃每分钟，例如-35℃每分钟或通过在液氮中骤然冷冻。
冷却速率(和/或平均冷却速率)，例如对于连续速率冷却(或其他类型的冷却)，可以是例如约-1至约-80℃每分钟、约-3至约-50℃每分钟、约-5至约-35℃每分钟、约-7至约-30℃每分钟、或约-10至约-25℃每分钟；或约-4至约-10℃每分钟、约-4°每分钟至约-8℃每分钟、约-4至约-6℃每分钟、约-6至约-10℃每分钟、约-6至约-9℃每分钟、约-6至约-8℃每分钟、约-6至约-7℃每分钟；或约-7至约-10℃每分钟、约-7至约-9℃每分钟、约-7至约-8℃每分钟、约-8至约-9℃每分钟、约-9至约-10℃每分钟。
一旦待保存的样品(例如细胞材料和/或组织)通过连续冷却被冷却至约-40℃至-80℃或更低，它们可以被转移到液氮或液氮气相中进行进一步冷却至冷冻保存温度，其通常低于冷冻溶液的玻璃化转变温度。待保存的样品(例如细胞材料和/或组织)可以被冷却至约-40℃至约-75℃、约-45℃至约-70℃、约-50℃至约-60℃、约-55℃至约-60℃、约-70℃至约-80℃、约-75℃至约-80℃、约-40℃至约-45℃、约-40℃至约-50℃、约-40℃至约-60℃、约-50℃至约-70℃、或约-50℃至约-80℃然后进一步冷却至冷冻保存温度。或者，在进一步冷却至所需的冷冻保存温度之前，样品可以被冷却至-120℃。
在实施方式中，可以使用加热方法来升温样品。此类方法可包括，例如，对流、电磁和微波加热。
在实施方式中，通过本公开的方法保存的冷冻保存的细胞材料可以用于任何合适的用途，包括，例如，研究或治疗用途和/或产生大量冷冻保存的细胞材料(例如hMSC)用于按需用途作为医疗对策和/或再生医学。关于治疗用途，冷冻保存的细胞材料可以被给予人或动物患者以治疗或预防疾病或病状。例如，当冷冻保存的细胞材料是hMSC时，冷冻保存的细胞材料将改善同种异体hMSC移植中严重的健康差异，特别是对于少数族裔和已生育的妇女(Donnenberg AD,Gorantla VS,Schneeberger S,Moore LR,Brandacher G,StanczakHM,Koch EK,Lee WA.从尸体椎体制备骨髓细胞的程序的临床实施(Clinicalimplementation of a procedure to prepare bone marrow cells fromcadavericvertebral bodies.)Regen Med.2011；6(6):701-6；Gragert L,Eapen M,Williams E,Freeman J,Spellman S,Baitty R,Hartzman R,Rizzo JD,Horowitz M,Confer D,MaiersM.在美国登记处造血干细胞移植的HLA匹配可能性(HLA match likelihoods forhematopoietic stem-cell grafts in the U.S.registry.)N Engl JMed.2014；371(4):339-48；Ustun C,Bachanova V,Shanley R,MacMillan ML,Majhail NS,Arora M,Brunstein C,Wagner JE,Weisdorf DJ.捐献者种族/族裔匹配在无关成人和脐带血同种异体造血细胞移植中的重要性(Importance of donor ethnicity/race matching inunrelated adult and cord blood allogeneic hematopoietic cell transplant.)LeukLymphoma.55(2):358-64,2014)—在骨髓登记中发现hMSC匹配机会对于少数种族和族裔来说明显较低(the chance of finding amatch in the bone marrow registry for hMSCbeing markedly lower for racial and ethnic minorities)(参见Gragert,2014)。
冷冻保存的细胞材料可以以任何合适的方式给予患者。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞材料可以局部递送给患者(例如，在烧伤、伤口或皮肤病的治疗中)。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞材料可以被递送至患者体内的局部植入位点或通过静脉内输注。这些给药方式中的任何一种或任何组合可用于治疗患者。
实施例
使用来自多种商业来源的骨髓来源的人间充质干细胞(hMSC)。人骨髓来源的间充质干/基质细胞(hBM-MSC)分离自正常健康成年供者(购自商业来源(例如Rooster-Bio)与合适的生长培养基一起)进行实验。细胞按照制造商的说明生长)。
虽然确实使用海藻糖作为冷冻保护剂(CPA)进行了大量工作，但在大多数情况下，海藻糖并未用作主要CPA，而是通常作为冷冻保护剂混合物的一部分。使用海藻糖作为主要CPA的努力主要涉及通过各种方法将海藻糖引入细胞中从而使海藻糖存在于膜的两侧(Stewart等,用于细胞建库的海藻糖的胞内递送(Intracellular Delivery of Trehalosefor Cell Banking),Langmuir,2019,35(23):7414–7422)(表1)，发明人之前的工作涉及开发方法以在保存之前将海藻糖引入细胞(Brockbank等,哺乳动物细胞、组织和器官保存的性质课(Lessons from nature for preservation of mammalian cells,tissues,andorgans),In Vitro Cell.Dev.Biol.,2011；美国专利号8,017,311；Campbell等,用二糖冷冻保存贴壁平滑肌和内皮细胞(Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle andEndothelial Cells with Disaccharides),Current Frontiers in Cryopreservation,2012；Campbell等,电穿孔和ChariotTM将β-半乳糖苷酶递送至哺乳动物细胞的比较：在细胞保存中使用海藻糖的策略(Comparison of electroporation and ChariotTMfor deliveryofβ-galactosidase into mammalian cells:strategies to use trehalose in cellpreservation),In Vitro Cell.Dev.Biol.,2010；Campbell等,用海藻糖培养在冷冻保存后产生活的内皮细胞(Culturing with trehalose produces viable endothelial cellsafter cryopreservation),Cryobiology 64(2012)240–244)。有关文献中已被确认为可能导致二糖的胞内递送的各种其他方法参见表II(如下)。
在开发本公开的方法之前，在细胞膜两侧都需要海藻糖在很长时间内被认为是在冷冻保存过程中通过海藻糖最大限度保护的最佳策略(Stewart等,用于细胞艰苦的海藻糖的胞内递送(Intracellular Delivery of Trehalose for Cell Banking),Langmuir,2019,35(23):7414–7422)。尽管开发了多种将海藻糖引入细胞的方法，每种方案都有缺点，并且关于这些方法能否持续保护细胞的结果不一。还进行了利用海藻糖以快速冷却速率(>50℃/分钟)的研究(Heo等,通过超快速冷却对细胞进行“通用”玻璃化(“Universal”vitrification of cells by ultra-fast cooling),Technology(Singap World Sci),2015,3(1),64–71；Liebermann等,玻璃化在生殖医学中的潜在重要性(PotentialImportance of Vitrification in Reproductive Medicine),Biology ofReproduction,第67卷,第6期,2002,第1671–1680页)。然而，更快的冷却速率与小的冷却体积(≤300μL)结合使用，使这些样品玻璃化(不形成冰)。这些类型的方案主要用于生殖组织处理，通常涉及使用含有海藻糖的冷冻保护剂混合物。也使用了某种程度上更慢的冷却速率(-5至-60℃/分钟)，但这些研究涉及使用海藻糖作为与DMSO混合的补充冷冻保护剂(Barbas等,家畜精子细胞的冷冻保存(Cryopreservation of domestic animal spermcells),Cell and Tissue Banking,2008,10(1),49-62)而本公开中使用的方法使用胞外海藻糖作为唯一冷冻保护剂。
在开发本公开的方法之前，本申请的发明人先前评估了马里兰大学的XiaomingHe教授开发的用于胞内海藻糖递送纳米技术(Zhang等,冷反应性纳米颗粒可实现海藻糖的胞内递送和快速释放，用于无有机溶剂冷冻保存(Cold-Responsive NanoparticleEnables Intracellular Delivery and Rapid Release of Trehalose for Organic-Solvent-Free Cryopreservation),Nano Lett.2019,19,9051-9061；Rao等,纳米颗粒介导的胞内递送实现了以海藻糖作为唯一冷冻保护剂的人类脂肪来源干细胞的冷冻保存(Nanoparticle-Mediated Intracellular Delivery Enables Cryopreservation ofHuman Adipose-Derived Stem Cells Using Trehalose as the Sole Cryoprotectant),ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(8),5017–5028)，已经证明了其促进脂肪组织来源的hMSC的冷冻保存，用于骨髓来源的MSC。不幸的是，海藻糖纳米技术在这些研究中失败了，可能是由于海藻糖纳米颗粒在储存和从马里兰大学到南卡罗莱纳州查尔斯顿的运输过程中不稳定。在这些研究中观察到当海藻糖仅存在于胞外时MSC在低温保存中存活得很好，被用作阴性对照。受这些意料之外的结果的鼓舞，所使用的外源海藻糖的范围被扩大到0.2-0.8M，并比较了-1、-5和-15℃/分钟的冷却速率。
0.2M海藻糖组在-5和-15℃/分钟冷却速率下具有与DMSO对照组在各个冷却速率下相同或更高的活力。图2显示了两个实验的汇集结果，该实验显示了冷冻保存后，所示浓度的海藻糖(不含DMSO和含DMSO)与仅DMSO的对照相比，冷却速率对hMSC活力的影响；数据显示为平均值±平均值的1个标准误差。
在初步实验中，DMSO对照在1℃/分钟的冷却速率下显然是最好的(未处理对照的65.3±2.7％)，然而，最好的总体结果是0.2M海藻糖组在-15℃/分钟的冷却速率下(未处理对照的78.9±3.5％)。DMSO组在-1℃/分钟下和海藻糖组在-15℃/分钟下的结果之间存在统计学显著性差异(p<0.05，通过T检验，图2)。这些结果证明了意料之外的胞外海藻糖的益处，其在更快的冷却速率之下优于通常使用±1℃/分钟的用DMSO冻结的细胞冷冻保存。
对于泛T细胞，使用外源海藻糖以-15℃/分钟的冷却速率获得了与上述结果类似的结果，这反映出该方法预计可扩展到本公开中讨论的其他细胞材料(例如，包括但不限于T细胞亚群和CAR T细胞)。
进行实验以评估0.2-0.8M浓度的胞外海藻糖与几种浓度的0-5％ DMSO的组合，并与含有5％ DMSO的阳性对照Cryostor-5进行比较。
泛T细胞生长并扩增。然后收获T细胞并计数。每个样品使用约10x106个细胞。将细胞重悬于1mL的DMSO和海藻糖的多种组合中，并在冰上平衡20分钟。样品在CRF中以-15℃/分钟冷却至-80℃，然后移到液氮气相中储存约10天。储存后，样品在37℃水浴中快速解冻，转移至15mL离心管中，并用10mL培养基稀释。取出等分试样用于细胞计数。然后将细胞沉淀，用3mL培养基重悬，并放入12孔板中，1个样品/孔。允许细胞在37℃培养箱中恢复60分钟，然后使用刃天青染料(300μl)测量活力。将细胞在37℃下放置3小时，然后使用荧光酶标仪在544nm的激发波长和590nm的发射波长下读取板。通过将20μl细胞等分试样与20μl台盼蓝混合来进行细胞计数。获得活细胞和死细胞的计数。该实验进行2-3次并合并结果。结果示于图3A和3B。
在图3A和3B中，以-15℃/分钟使用DMSO和海藻糖的组合冷冻保存后细胞存活。使用不同浓度的DMSO和海藻糖对细胞进行冷冻保存和复温。含有5％ DMSO的Cryostor-5用作对照。测量了活细胞和死细胞计数(A)以及代谢活性(B)。数值是来自0.2-0.6M海藻糖的3次实验的9个重复的平均值(±SEM)和来自0.8M海藻糖的Cryostor-5对照的1次实验的3个重复的平均值(±SEM)。
这些实验证明了不需要DMSO的存在。
即，仅海藻糖就提供了与对照Cryostor-5类似的充分的保护。细胞计数的统计分析显示，除了两个实例之外，对照和实验组之间没有显著差异。对于活细胞计数，在对照和含有0.2M海藻糖的5％ DMSO之间观察到显著差异(p<0.05)(图3A)，在死细胞计数方面，在对照和含有0.2M海藻糖的0％ DMSO之间观察到显著差异(p<0.05)(图3A)。细胞代谢活性分析显示，除0.2M海藻糖观察到显著差异外，所有0％ DMSO组均无统计学显著性差异(p>0.05)(图3B)。除了对照和含有0.2M海藻糖的0％ DMSO、含有0.2M和0.6M海藻糖的1％DMSO以及含有0.2M海藻糖的5％DMSO之间，对照和含有多种浓度DMSO的组之间的比较并未显示出显著差异(p>0.05)。最有趣和意想不到的结果是仅使用海藻糖而无DMSO保存的组。没有尝试将海藻糖引入细胞中，而这在文献中被认为是必要的。除了最低的外源浓度外，海藻糖具有与阳性对照相似的细胞计数、活力和代谢活性。
这些实验证明，单独的外源海藻糖能够在冷冻保存过程中保护细胞，并且可以作为替代DMSO的合适的冷冻保护剂。预计与DMSO相比，海藻糖对患者的副作用较小，并且细胞可以在解冻后直接输注到患者体内而无需任何间插步骤。
贯穿本公开所引用的所有文献和专利参考文献全部通过引用纳入。尽管在本文中前述说明书已经参考特定手段、材料和实施方式进行了描述，但其并不旨在限于本文所公开的具体内容；相反，它延伸到所有功能上等同的结构、方法和用途，例如在所附权利要求的范围内。此外，虽然上文仅详细描述了几个示例性实施方式，但是本领域技术人员将容易理解，在实质上不背离冷冻保存方案中不含其他冷冻保护剂的使用海藻糖的保存方法的公开内容的情况下，可以对示例性实施方式进行许多修改。因此，所有这样的修改都旨在包括在所附权利要求限定的本公开的范围内。在权利要求中，功能性限定权利要求旨在覆盖本文描述的执行所列举的功能的结构，并且不仅覆盖结构上的等效物，而且覆盖等效结构。因此，尽管钉子和螺钉在结构上可能不等效，因为钉子采用圆柱形表面将木质部件固定在一起，而螺钉采用螺旋表面，但在紧固木质部件的环境中，钉子和螺钉可以是等效结构。申请人明确表示不援引35U.S.C.§112(f)对于本文任何权利要求的任何限制，除非权利要求中明确将‘用于……的手段(means for)’一词与相关功能一起使用。

Claims (15)

1.一种保存细胞材料的方法，包括：
使包含活细胞的细胞材料经历冷冻保存方案；其中
所述冷冻保存方案不含除海藻糖之外的添加的冷冻保护剂，和
所述冷冻保存方案包括：
使所述细胞材料暴露于含有有效量的海藻糖作为冷冻保护剂的冷冻保护剂制剂，
以-3℃/分钟至-50℃/分钟范围内的冷却速率将所述细胞材料冷却至-20℃以下的预定温度，和
获得已升温的冷冻保存的细胞材料；其中
在所述冷冻保存的细胞材料被升温后所述冷冻保存的细胞材料的细胞活力百分比大于50％。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述海藻糖的有效量在200-800mM范围内。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述冷却速率在-5℃/分钟至-30℃/分钟的范围内。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述冷冻保存方案包括将所述细胞材料在-80℃或更低温度下储存大于一小时的预定的持续时间。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述冷冻保存方案包括将所述细胞材料在-135℃或更低温度下储存大于一小时的预定的持续时间。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞材料包括T细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞材料包括间充质干细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述间充质干细胞是人间充质干细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中在所述冷冻保存的细胞材料被升温后所述冷冻保存的细胞材料的细胞活力百分比至少为60％。
10.如权利要求1所述的方法，其中在所述冷冻保存的细胞材料被升温后所述冷冻保存的细胞材料的细胞活力百分比至少为70％。
11.一种保存细胞材料的方法，包括：
使包含活细胞的细胞材料经历冷冻保存方案；其中所述冷冻保存方案包括：
使所述细胞材料暴露于含有有效量的海藻糖作为冷冻保护剂的冷冻保护剂制剂，
以-3℃/分钟至-50℃/分钟范围内的冷却速率将所述细胞材料冷却至-20℃以下的预定温度，和
获得已升温的冷冻保存的细胞材料；
其中
在所述冷冻保存的细胞材料被升温后所述冷冻保存的细胞材料的细胞活力百分比(细胞活力(％))大于50％；和
所述冷冻保存方案不添加DMSO、甘油、乙酰胺、琼脂糖、藻酸盐、丙氨酸、白蛋白、乙酸铵、抗冻蛋白、丁二醇、2,3-丁二醇、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、环己二醇、环己二酮、环己三醇、葡聚糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、甲酰胺、甘油、甘油磷酸酯、单乙酸甘油酯、甘氨酸、糖蛋白、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化镁、硫酸镁、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲氧基丙二醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、甲基葡萄糖、甲基甘油、苯酚、复合多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、1,2-丙二醇和1,3-丙二醇、吡啶N-氧化物、棉子糖、核糖、丝氨酸、硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸钠、山梨糖醇、三甘醇、乙酸三甲胺、尿素、缬氨酸和木糖。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述海藻糖的有效量在200-800mM范围内，所述冷冻保存方案包括以-5℃/分钟至-30℃/分钟范围内的冷却速率冷却所述细胞材料。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述冷冻保存方案包括将所述细胞材料在-135℃或更低温度下储存大于一小时的预定的持续时间。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞材料包括T细胞。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞材料包括间充质干细胞，所述间充质干细胞是人间充质干细胞。
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