CN110545665B - 用于活的功能性组织库的大体积组织样品的无冰保存 - Google Patents

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Abstract

通过将细胞材料与含有至少一种糖的冷冻保护剂制剂/培养基/溶液组合，然后使细胞材料经受玻璃化保存方案，可以保存大体积细胞材料。

Description

用于活的功能性组织库的大体积组织样品的无冰保存
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月20日提交的美国临时申请号62/436,642的权益。在先申请的公开内容均通过引用其全部内容纳入本文。
技术领域
本发明涉及细胞、组织和器官保存领域，具体涉及包含糖，例如二糖(例如，海藻糖和蔗糖)的新的无冰制剂(例如，用于玻璃化)，以及改善样品材料性质和生物学活力的方案，即使样品体积增加到大于4mL。更具体地，本发明涉及一种采用糖，例如二糖(例如，海藻糖和蔗糖)补充含有细胞材料(例如，体积大于4mL，例如大于10mL)的大样品的无冰玻璃化制剂的方法，以增强保存后的细胞存活和组织功能。
背景技术
无冰冷冻保存的常规方法已成功用于储存相对小的样品规模。例如，人卵母细胞储存已经彻底改变了临床体外受精实践。
为了保存细胞或组织，通常使用冷冻保护剂溶液来防止在冷却或解冻/升温过程中由于冷冻而造成的损害。为了使冷冻保存有用，保存的样品应保持其完整性和/或活力至保存后的合理水平。因此，保存样品的过程应该避免和/或限制细胞和/或组织结构的损害或破坏。
玻璃化，以“玻璃状”而不是结晶相被冷冻保存，是组织库和再生医学的重要使能方法，提供储存和运输细胞、组织和器官的能力，用于各种生物医学用途。在通过玻璃化进行的无冰冷冻保存中，通过存在称为冷冻保护剂的高浓度化学物质来防止冰的形成，所述化学物质与水相互作用并取代水，因此防止水分子形成冰。该方法基本上停止了在冷冻保护剂制剂玻璃化转变温度(Tg)以下的储存期间的生物学时间，并且成功地用于维持小规模细胞和薄组织样品的活力和功能，但是由于扩散(热和质量传递)和相转变限制而排除在大型体系如器官和大组织中的使用。虽然采用传统的边界对流加温技术的先前的玻璃化技术(以及与其一起使用的冷冻保护剂，例如DSMO)有时可以成功地用于4-5mL的样品，但是当样品体积接近10mL时仍会发生结冰，因为传统的边界对流加温技术不能提供足够快的加温速度。冰的形成导致细胞和组织的破坏。玻璃化对大组织样品的主要限制是潜在的细胞毒性，这是由于长期暴露于所用的冷冻保护剂和复温期间的冰形成。
发明概述
发现用糖，例如二糖(例如，海藻糖和/或蔗糖)补充无冰玻璃化制剂用于大体积细胞材料(例如，体积大于4mL，例如大于10mL)，使得保存后的细胞存活和组织功能增加。
因此，本申请提供了用于处理大体积细胞材料的新方法和新制剂，包括将糖，例如二糖(例如，海藻糖和/或蔗糖)添加到无冰玻璃化冷冻保护剂制剂中。补充这些糖可以降低冷冻保护剂引起的细胞毒性和冷却过程及最重要的复温期间形成冰的风险。
附图说明
图1显示了关于无冰冷冻保存制剂补充实验获得的数据，其中将二糖(海藻糖和蔗糖)加入到各种玻璃化制剂(VS49，DP6和VS55)中。
图2显示了关于新鲜和玻璃化兔颈动脉，(上)去甲肾上腺素和去氧肾上腺素(下)剂量反应曲线的收缩反应获得的数据。
图3显示了关于在猪股动脉上比较VS55±0.6M蔗糖的4和10mL样品(alamarBlue测定)获得的数据。
图4显示了关于在预收缩(生理学测定)后由硝普钠引起的猪平滑肌松弛获得的数据。
图5显示了关于兔胸主动脉样品获得的数据，所述兔胸主动脉样品在含有或不含有0.6M蔗糖、有或没有纳米颗粒的30mL体积的VS55中玻璃化，用于比较对流与纳米加温(nanowarming)。
图6A和6B显示了关于心脏瓣膜组织的活力的比较获得的数据，其中完整的心脏瓣膜保存在30mL的冷冻保护剂体积中并通过对流或纳米加温方法复温。
具体实施方案
术语和定义
在以下详细说明部分，陈述了大量细节以便理解本发明。然而，本领域技术人员可以理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开的方法，并且可以对所描述的实施例进行多种变化或修改。
首先，应该注意的是，在任何实际实施方案的发展中，会做出许多特定的实施决定以达到开发者的特定目标，例如遵从系统相关的和经济相关的限制，这会造成不同实施之间的差异。此外，应理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但是这对于从本发明公开中获益的本领域普通技术人员而言会是常规工作。此外，本文使用/公开的组合物还可包含除所引用的那些之外的一些组分。在概述和该详细描述中，每个数值应该被一次理解为由术语“约”修饰(除非已经明确地如此修饰)，然后再次理解为未如此修饰，除非在上下文中另有说明。
如本文所用，与量结合使用的术语“约”包括所述值并且具有上下文所规定的含义。例如，它至少包括与特定量的测量相关的误差程度。当在范围的上下文中使用时，修饰词“约”也被认为公开了由两端点的绝对值所限定的范围。例如，约“2至约4”的范围也公开了“2至4”的范围。
除非本文另有明确说明，否则关于温度(℃)的修饰词“约”是指所述温度或温度范围，以及所述温度或温度范围所述的(所述温度或者温度范围的终点的)+/-1-4％。关于细胞活力和细胞保留率(％)，除非本文另有明确说明，关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于表达内容，例如，以百万分之一(ppm)或十亿分之一(ppb)为单位，除非本文另有明确说明，否则关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰语“约”指的是所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于以单位μg/mL表达含量，除非本文另有明确说明，关于以μg/mL表示的值的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-4％。关于摩尔浓度(M)，除非本文另有明确说明，关于摩尔浓度(M)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-2％。关于冷却速率(℃/分钟)，除非本文另有明确说明，关于冷却速率(℃/分钟)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。
此外，在概述和该详细描述中，应该理解的是，列出或描述的有用，合适的范围等旨在包括对该范围内的任何可想到的子范围的支持，至少因为该范围中的每个点，包括终点在内的范围应视为已经说明。例如，“1至10的范围”将被读取为指示沿着约1和约10之间的连续区上的每个可能的数字。另外，例如，+/-1-4％将被读取为指示沿着1和4之间的连续区上的每个可能的数字。此外，本示例中的一个或多个数据点可以组合在一起，或者可以与说明书中的数据点之一组合以创建范围，因此包括此范围内的各可能值或数字。因此，(1)即使明确指定了该范围内的许多特定数据点，(2)即使参考该范围内的一些特定数据点，或(3)即使该范围内没有明确指定的数据点，会理解(i)发明人想到并理解该范围内的任何可想到的数据点应被认为已被指定，并且(ii)发明人拥有整个范围，范围内的可想到的每个子范围，以及范围内的每个可想到的点的知识。此外，本文说明性地公开的本申请的主题可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。
除非另有明确说明，否则“或”指的是包含性的或，而不是指排他性的或。例如，条件A或B满足以下任何一个：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
另外，使用“一个”或“一种”来描述本文实施方案的元件和组分。这仅仅是为了方便并且给出根据本公开的概念的一般意义。除非另有说明，否则该描述应理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数。
本文所用的术语和词语是为了描述目的，而不应被视为限制性的。诸如“包括”，“包含”，“具有”，“含有”或“涉及”及其变体的语言旨在广泛并且包括其后列出的主题，等同物和未列举的其他主题。
此外，如本文所用，“一个实施方案”或“一种实施方案”表示结合实施方案描述的具体元件、特征、结构或性质包括在至少一个实施方案中。在说明书中各处出现的短语在“一个实施方案中”不一定是指同一实施方案。
如本文所用，术语“室温”是指在标准压力下约18℃至约25℃的温度。在各种实例中，室温可为约18℃，约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃或约25℃。
如本文所用，“细胞材料”或“细胞样品”是指含有细胞组分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造的，并且包括细胞，组织和器官，无论是天然的还是人造的。这些术语还指任何类型的待冷冻保存的生物材料，例如细胞，组织和器官。在一些实施方案中，细胞，组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人器官)，哺乳动物细胞(例如人细胞)和哺乳动物组织(例如人组织)。
如本文所用，短语“大体积细胞材料”或“大体积样品”或“大体积细胞样品”中使用的“大体积”是指含有细胞组分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造的，包括细胞材料、组织和器官，无论是天然的还是人造的，其中含有细胞成分的活生物材料的体积大于约4mL，例如体积大于约5mL、或体积大于约10mL、或体积大于约15mL、或体积大于约30mL、或体积大于约50mL、或体积大于约70mL、或体积为约4mL至约200mL、例如体积为约4mL至约50mL、体积为约为4mL至约30mL、或体积为约5mL至约100mL、例如体积为约5mL至约50mL、或体积为约5mL至约30mL、或体积为约6mL至约100mL、或体积为约6mL至约50mL、或体积为约6mL至约25mL、或体积为约10mL至约100mL、或体积为约10mL至约50mL、或体积为约10mL至约25mL、或体积为约10mL至约20mL。这些术语还包括具有该体积的任何类型的待冷冻保存的活体材料，例如细胞材料、组织和器官。在一些实施方案中，具有该体积的组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人体器官)、哺乳动物细胞和哺乳动物组织(例如人体组织)。
如本文所用，术语“器官”是指任何器官，例如肝，肺，肾，肠，心脏，胰腺，睾丸，胎盘，胸腺，肾上腺，动脉，静脉，淋巴结，骨或骨骼肌。如本文所用，术语“组织”包括任何组织类型，包括任何种类的细胞类型(例如来自上述器官之一)及其组合，包括例如卵巢组织，睾丸组织，脐带组织，胎盘组织，结缔组织，心脏组织，来自肌肉，软骨和骨骼的组织，内分泌组织，皮肤和神经组织。术语“组织”还可包括脂肪组织或牙髓组织。在一些实施方式中，组织或器官是从人获得的，例如人肝，人肺，人肾，人肠，人心，人胰腺，人睾丸，人胎盘，人胸腺，人肾上腺，人动脉，人体静脉，人神经，人皮肤，人淋巴结，人骨骼或人骨骼肌。
如本文所用，术语“细胞”包括任何类型的细胞，例如体细胞(包括组织或器官中的所有细胞)，成纤维细胞，角质形成细胞，肝细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，干细胞，祖细胞，卵母细胞和生殖细胞。这些细胞可以是组织或器官的形式。在一些实施方式中，细胞来自哺乳动物组织或器官，例如上述人组织或器官。
如本文所用，“保存方案”是指向含细胞的活生物材料提供保质期的方法。保存方案可包括通过冷冻干燥或脱水的玻璃化和/或脱水生物保存进行冷冻保存。
如本文所用，术语“玻璃化”是指没有形成冰晶或没有显著的冰晶形成的固化。在一些实施方案中，待保存的样品(例如，组织或细胞材料)可以玻璃化，使得玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(从初始冷却到复温完成的整个过程)可以在没有任何冰晶形成的情况下实现。在一些实施方案中，待保存的样品(例如，组织或细胞材料)可以玻璃化，从而实现玻璃化和/或玻璃体冷冻保存，其中待保存的样品(例如，组织或细胞材料)的固化可以在没有大量冰晶形成的情况下发生(即，玻璃化和/或玻璃体冷冻保存(从初始冷却到复温完成的整个过程)即使在存在小于对组织造成伤害的量的少量或限制量的冰的情况下也可以实现)。
如本文所用，待保存的样品(例如组织或细胞材料)在达到玻璃化转变温度(Tg)时玻璃化。玻璃化过程涉及冷冻保护剂溶液的粘度显著增加，因为温度降低使得冰成核和生长受到抑制。通常，溶液可以在没有冷冻的情况下过冷却的最低温度是均匀的成核温度Th，在该温度下冰晶成核并生长，并且从溶液中形成结晶固体。玻璃化溶液具有玻璃化转变温度Tg，在该温度下溶质玻璃化，或变成非结晶固体。
如本文所用，“玻璃化转变温度”是指在进行该方法的条件下溶液或制剂的玻璃化转变温度。通常，本发明的方法在生理压力下进行。然而，可以使用更高的压力，只要待保存的样品(例如组织或细胞材料)不会因此而显著损害。
如本文所用，“生理压力”是指组织在正常功能期间经受的压力。因此，术语“生理压力”包括正常的大气条件，以及各种组织(例如血管化组织)在舒张和收缩条件下经受的较高压力。
如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指化学物质，与没有冷冻保护剂的冷冻效果相比，当组织冷却至零下温度时该化学物质使细胞/组织/器官中及其周围的冰晶形成最小化并且在加温后基本上不对组织/器官造成损伤。
如本文所用，术语“糖”可以指任何糖。在一些实施方案中，糖是多糖。如本文所用，术语“多糖”是指含有多于一个单糖单元的糖。即，术语多糖包括寡糖如二糖和三糖，但不包括单糖。糖也可以是糖的混合物，例如其中至少一种糖是多糖。在一些实施方案中，糖是选自二糖和三糖中的至少一种。在一些实施方案中，糖是二糖，例如，其中二糖是选自海藻糖和蔗糖中的至少一种。在一些实施方案中，糖是三糖，例如棉子糖。糖也可以是海藻糖和/或蔗糖和/或棉子糖和/或其他二糖或三糖的组合。在一些实施方案中，糖包含海藻糖。
如本文所用，与冷冻保存的材料相关的术语“冷冻保存后的功能”是指冷冻保存后的经冷冻保存的材料，例如器官或组织，在冷冻保存后保留了可接受的和/或预期的功能。在一些实施方式中，冷冻保存后的细胞材料保留其所有预期功能。在一些实施方式中，通过本公开内容的方法保存的细胞冷冻保存的材料保留预期功能的至少50％，例如预期功能的至少60％，例如预期功能的至少70％，例如预期功能的至少80％，例如预期功能的至少90％，例如预期功能的至少95％，例如预期功能的100％。例如，在保持细胞活力的同时，维持/保持组织/器官的生理功能，例如对于心脏而言的泵送功能，和/或组织(例如，待移植的那些)与周围组织整合的能力可能也是重要的。
如本文所用，术语“无菌”意指不含活的细菌，微生物和能够增殖的其他生物体。
如本文所用，术语“基本上不含冷冻保护剂”是指冷冻保护剂的量小于0.01w/w％。在一些实施方案中，本发明的方法可以使用和/或获得基本上不含冷冻保护剂的培养基/溶液和/或细胞材料，例如基本上不含DMSO的细胞材料(即，DMSO的量小于0.01重量％)。在一些实施方案中，本发明的方法可以使用和/或获得基本上不含除糖(例如蔗糖和/或海藻糖)之外的任何冷冻保护剂的培养基/溶液和/或细胞材料。
实施方式
本公开涉及用于保存大体积生物材料/样品/器官/组织的方法(术语“材料”，“样品”，“器官”和“组织”可互换使用并包括任何含有细胞成分的活生物材料)。
本公开的方法包括使大体积细胞材料与含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)的冷冻保护剂溶液接触。在一些实施方案中，该方法可以包括在含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)(和任选的另外的冷冻保护剂)的冷冻保护剂制剂/溶液中孵育大体积细胞材料，例如在含有至少糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)(和任选的另外的冷冻保护剂)的培养基/溶液中孵育大体积细胞材料(或者使它们接触)。在实施方案中，至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)，可以以有效量存在于冷冻保护剂制剂/溶液中，以提供更有利于冷却和复温过程中大体积细胞材料的细胞存活的环境。
例如，在一些实施方式中，通过本公开内容的方法保存的细胞冷冻保存的材料保留预期功能的至少50％，例如预期功能的至少60％，例如预期功能的至少70％，例如预期功能的至少80％，例如预期功能的至少90％，例如预期功能的至少95％，例如预期功能的100％。例如，在保持组织或器官中的细胞活力的同时，维持/保持细胞/组织/器官的生理功能，例如对于心脏而言的泵送功能，和/或组织/细胞(例如，待移植的那些)与周围组织/细胞整合的能力可能也是重要的。
在本公开的方法中，在冷却至冷冻保存温度和复温期间，大体积细胞材料的细胞(下文中称为“细胞”)在与至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和蔗糖)以及其他冷冻保护剂接触后在冷冻保存期间受到保护。在实施方案中，在冷却和复温期间与至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)以及其他冷冻保护剂接触意味着冰形成的风险被最小化，由于冷冻保护剂溶液已经被冷冻保存制剂/溶液/组合物中的至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)稳定/保护，因此细胞活力不会显著恶化。
在实施方案中，溶液，例如非常适合于细胞、组织和器官的器官储存的已知溶液，可含有任何有效量的糖，其能够在保存方案过程中有效提供更有利于大体积细胞材料的细胞存活的环境。
在一些实施方案中，在本公开的方法中，含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)以及其他冷冻保护剂的培养基(术语“培养基”和“溶液”可互换使用)可以与细胞材料如组织和器官组合以制备冷冻保存组合物。培养基(可以是水性培养基)可以含有任何合适浓度的至少一种糖，例如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)与其它冷冻保护剂的组合用于这些目的。
在一些实施方案中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖,诸如二糖(例如海藻糖和/或蔗糖)与其他冷冻保护剂的组合，使得其导致活细胞材料/样品的活力(冷冻保存后)改善，所述活细胞材料/样品选自器官，细胞和组织，如哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织(包括随后可移植的那些组织)。短语“改善的细胞活力”或“改善的活力”是指，例如，细胞活力(％)为至少60％，例如80％或更高。改善的细胞活力(％)可以是50％或更多，60％或更多，70％或更多，73％或更多，75％或更多，77％或更多，80％或更多，83％或更多，85％或更多，87％或更多，90％或更多，93％或更多，95％或更多，97％或更多，98％或更多，或99％或更多。
在一些实施方案中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)(和任选的其他冷冻保护剂)，使得其有效实现以下一种或多种：抑制冰成核，改变冰结构，减少结冰，防止结冰，以允许使用更快的冷却速度的程度减少/防止冰的形成，以允许减少所需的冷冻保护剂的量的程度减少/防止冰的形成，从而提供更有利于细胞存活的环境。
在一些实施方案中，所述至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)占包含待保存细胞的培养基总重量的约1％至约50％，例如约2至约50％，或约4至约45％，或约5至约20％，或约5至约12％，或约6至约20％，或约6至约12％，或约6至约10％，以用于待保存的细胞的制剂/溶液/培养基的总重量计。
在一些实施方案中，制剂/溶液/培养基含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)，浓度范围为0.01M至5M、0.1M至4M、0.1M至3M、0.1M至2M、0.2M至2M、0.3M至2M、0.4M至2M、0.5M至2M、0.6M至2M、0.1M至1M、0.2M至1M、0.3M至1M、0.4M至1M、0.5M至1M、约0.05M至约6M、约0.1至约3M、约0.25至约6M、约0.25至约1M、约0.25至约2M、约0.25至约3M、约0.25至约4M、约0.25至约5M、约1至约4M、约1至约3M、约1至约2M、约3至约5M、约2至约4M、约0.5至约6M、约0.5至约5M、约0.5至约4M、约0.5至约3M、约0.5至约2M、或约0.5至约1M，其中在上述范围内发生的任何浓度也可用作范围的终点。
在实施方案中，包含至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)的制剂/溶液/培养基可与待保存的样品接触任何所需的持续时间，例如直至所需剂量(例如有效剂量)的至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)存在于细胞或组织上/细胞或组织中，以提供改善的活力(冷冻后保存)，和/或预防/防止组织损伤和/或完成以下一项或多项：抑制冰成核，改变冰结构，减少结冰，防止结冰，以允许使用更慢的冷却和加温速率的程度减少/防止冰的形成，以允许减少所需的冷冻保护剂的量的程度减少/防止冰的形成，从而提供更有利于细胞存活的环境。
在一些实施方式中，待冷冻保存的细胞还可以与冷冻相容的pH缓冲液接触，所述缓冲液包含例如至少碱性盐溶液，能量源(例如葡萄糖)和能够在冷却的温度下维持中性pH的缓冲液。众所周知的这种材料包括例如达氏改良伊氏培养基(DMEM)。该材料也可作为冷冻保存组合物的一部分包括在内。参见，例如，Campbell等，“用双糖冷冻保存贴壁平滑肌和上皮细胞(Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle and Endothelial Cellswith Disaccharides)”于：Katkov I.(编)《冷冻保存前沿》(Current Frontiers inCryopreservation).Croatia:In Tech(2012)；和Campbell等，"胰腺储液的开发：低温储存后β细胞存活和代谢状态的细胞保护性补充剂的初步筛选(Development of PancreasStorage Solutions:Initial Screening of Cytoprotective Supplements forβ-cellSurvival and Metabolic Status after Hypothermic Storage)，Biopreservation andBiobanking 11(1):12-18(2013)。
在一些实施方案中，冷冻保护组合物中存在的冷冻保护剂化合物(包括糖和任何其他冷冻保护剂的总量)的量可以例如为约0.05M至约13M、约0.1至约13M、约0.25至约13M、约1至约13M、约2至约13M、约4至约13M、约6至约13M、约8至约13M、约0.25至约11M、约0.25至约9M、约0.25至约8M、约0.25至约7M、约0.25至约10M、约1至约7M、约1至约8M、约1至约9M、约3至约10M、约2至约10M、约0.5至约10M、约0.5至约9M、约0.5至约9M、约0.5至约8M,或约0.5至约7M、或约6.5至约11M。在一些实施方式中，冷冻保护组合物中存在的冷冻保护剂的量例如为约0.05M至约6M、约0.1至约3M、约0.25至约6M、约1至约6M、约2至约6M、约3至约6M、约4至约6M、约5至约6M。
在一些实施方案中，将待保存的细胞材料在含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)的溶液/培养基/制剂/组合物中孵育之前、期间或之后，待保存的细胞材料可以与含有冷冻保护剂的溶液/培养基/制剂/组合物接触。通过在这种溶液/培养基/制剂/组合物中浸渍和/或灌注接触组织的持续时间将是组织质量的函数。在实施方案中，可以调节这种溶液/培养基/制剂/组合物的冷却速率以提供足够的组织渗透(浓度和时间的函数)以防止结冰。
合适的其他冷冻保护剂可包括，例如，乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇(如2,3-丁二醇)，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(如正二甲基甲酰胺)，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇(如1,2-丙二醇和1,3-丙二醇)，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。可用于本公开的其他冷冻保护剂描述于Fahy等的美国专利号6,395,467；Wowk等的美国专利号6,274,303；Khirabadi等的美国专利号6,194,137；Fahy等的美国专利号6,187,529；Fahy等的美国专利号5,962,214；Calaco等的美国专利号5,955,448；Meryman的美国专利号5,629,145；和/或WO 02/32225A2，其对应于Khirabadi等的美国专利申请号09/691,197，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。
冷冻保护剂组合物还可包含至少一种环己二醇(CHD)化合物，例如1,3-环己二醇(1,3CHD)或1,4-环己二醇(1,4CHD)的顺式或反式形式，或其外消旋混合物，作为冷冻保护剂化合物。
CHD化合物在冷冻保存组合物中的存在量可以为，例如约0.05至约2M，约0.1M至约1M，约0.1至约2M，约0.1至约1M，约0.1至约1.5M，约0.1至约0.5M，约0.1至约0.25M，约1至约2M，约1.5至约2M，约0.75至约2M，约0.75至约1.5M，约0.75至约约1M，约0.05至约1M，约0.05至约0.75M，约0.05至约0.5M，或约0.05至约0.1M。
冷冻保存组合物还可包括(或者基于)非常适合于细胞、组织和器官的储存的溶液。溶液可包括众所周知的pH缓冲剂。在一些实施方案中，该溶液可以是，例如，EuroCollins溶液，其包含右旋糖，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，碳酸氢钠和氯化钾，参见Taylor等人，“Unisol与Euro-Collins溶液作为冷冻保护剂载体溶液的比较(Comparisonof Unisol with Euro-Collins Solution as a Vehicle Solution forCryoprotectants)，Transplantation Proceedings 33:677-679(2001),或“VS55”溶液，这是一种优化的冷冻保护剂混合物，已经证明成功玻璃化许多生物系统。VS55溶液包含在基础Euro-Collins溶液中的3.1M二甲基亚砜(DMSO)，2.2M丙二醇和3.1M甲酰胺，总共8.4M。或者，可以将冷冻保护剂溶液配制在替代溶液中，例如Unisol。
此外，用于本公开的方法的冷冻保存组合物还可包括抗冻糖脂(AFGL)，抗冻蛋白/肽(AFP)，“热滞”蛋白(THP)或冰重结晶抑制剂(IRIS)。这些材料在冷冻保存组合物中的量可为例如组合物的约0.001至约1mg/mL，约0.05至约0.5mg/mL，或约0.1至约0.75mg/mL。
在一些实施方式中，所述至少一种糖(例如，二糖(例如，海藻糖和/或蔗糖)可以作为冷冻保护剂(例如DMSO)的替代物，或作为这种其他冷冻保护剂的补充物以降低其浓度，例如降低至无毒浓度，在该浓度下对于在冷冻保存过程中保留经冷冻保存的材料/样品的同样多功能而言冷冻保护剂实现了相同或更好的保护作用。例如，在一些实施方案中，至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)可以在称为“VS55”的溶液中作为冷冻保护剂(例如DMSO)的替代物，这是一种优化的冷冻保护剂混合物，已经证明成功玻璃化许多生物系统(VS55溶液包含在基础Euro-Collins溶液中的3.1M二甲基亚砜(DMSO)，2.2M丙二醇和3.1M甲酰胺，共8.4M)。在这方面，所述至少一种糖(例如，二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)可以作为VS55溶液中的冷冻保护剂的替代物以降低其浓度，例如降低至无毒浓度，或者作为VS55中其他冷冻保护剂的补充，对于在冷冻保存过程中保留经冷冻保存的材料/样品的同样多功能而言该冷冻保护剂实现了相同或更好的保护作用。
在一些实施方式中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖(例如，二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)，使得其作为活性材料/样品的冷冻保护剂有效，所述活性材料/样品选自器官，细胞和组织，例如哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织(包括随后可移植的那些)。
可以在本公开的方法中使用的细胞材料中的细胞可以是任何合适的细胞组合物。在一些实施方式中，细胞可以是皮肤细胞，角质形成细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肺细胞，肠系膜细胞，脂肪细胞，干细胞，肝细胞，上皮细胞，库普弗细胞，成纤维细胞，神经元，心肌细胞，肌细胞，软骨细胞，胰腺腺泡细胞，朗格汉斯胰岛，骨细胞，成肌细胞，卫星细胞，内皮细胞，脂肪细胞，前脂肪细胞，胆管上皮细胞，祖细胞或任何这些细胞类型的组合。
在一些实施方式中，本公开的方法中使用的细胞可以来自任何合适的动物物种，例如哺乳动物，例如人，犬科(例如狗)，猫科(例如猫)，马科(例如马)，猪科，绵羊，山羊或牛科哺乳动物。
用于制备冷冻保存溶液的制剂/组合物可以以各种方式与至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)组合。在一些实施方案中，细胞材料可以与含有至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)的水性液体介质(例如水溶液)组合。例如，可以进行逐渐组合，任选地轻柔搅拌。
一旦制备了冷冻保存组合物(并且至少一种糖(例如二糖，例如海藻糖和/或蔗糖)与待保存的细胞材料有效缔合)，无冰玻璃化冷冻保存的冷却可以以任何方式进行，并且可以使用上述那些以外的任何其他材料来进行。在以下专利和公开中描述了保存细胞材料的方案：Fahy等的美国专利号6,395,467；Wowk等的美国专利号6,274,303；Khirabadi等的美国专利号6,194,137；Fahy等的美国专利号6,187,529；Toner等的美国专利号6,127,177；Fahy等的美国专利号5,962,214；Calaco等的美国专利号5,955,448；Beattie等的美国专利号5,827,741；Goodrich等的美国专利号5,648,206；Meryman的美国专利号5,629,145；Rudolph等的美国专利号5,242,792；和WO 02/32225A2，其对应于Khirabadi等的美国专利申请号09/691,197，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。
保存方案的冷冻保存部分通常包括将细胞冷却至远低于水的冰点的温度，例如至约-80℃或更低，更通常至约-130℃或更低。可以使用本领域技术人员已知的任何冷冻保存方法。例如，用于冷冻保存的冷却方案可以是任何合适的类型，其中冷冻保存温度可以低于约-20℃、(即更冷)，例如约-80℃或更低(即更冷)，或约-135℃或更低(即更冷)。在一些实施方式中，冷冻保存温度可以是约-20℃至约-200℃、或约-120至约200℃、或约-130℃至约-196℃、或约-140℃至约-190℃、或约-150℃至约-190℃、或约-150℃至约-180℃、或约-30至约-175℃、或约-80℃至约-160℃、或约-85℃至约-150℃、或约-95℃至约-135℃、或约-80℃至约-180℃、或约-90℃至约-196℃、或约-100℃至约-196℃。
在一些实施方式中，保存方案可包括从初始温度(+4至-30℃)到-80℃或任何上述公开的冷却温度的连续受控速率冷却，冷却速率取决于被冷冻保存的细胞/组织的特性。例如，用于冷冻保存的冷却方案可处于任何合适的速率，例如速率(和/或平均冷却速率，例如从样品的初始温度到冷冻保存温度)可以大于约-0.1℃/分钟，或大于约-4.0℃/分钟，或大于约-6.0℃/分钟，或大于约-8.0℃/分钟，或大于约-10.0℃/分钟，或大于约-14.0℃/分钟，或大于每分钟约-25.0℃/分钟，或大于50℃/分钟。冷却速率(和/或平均冷却速率)，例如，对于连续速率冷却(或其他类型的冷却)，可以是，例如，约-0.1℃至约-10℃/分钟或约-1℃至约-2℃/分钟。冷却速率可以是约-0.1至约-9℃/分钟，约-0.1至约-8℃/分钟，约-0.1至约-7℃/分钟，约-0.1至约-6℃/分钟，约-0.1至约-5℃/分钟，约-0.1至约-4℃/分钟，约-0.1至约-3℃/分钟，约-0.1至约-2℃/分钟，约0.1至约-1℃/分钟，约0.1至约-0.5℃/分钟，约-1至约-2℃/分钟，约-1至约-3℃/分钟，约-1至约-4℃/分钟，约-1至约-5℃/分钟，约-1至约-6℃/分钟，约-1至约-7℃/分钟，约-1至约-8℃/分钟，约-1至约-9℃/分钟，约-1至约-10℃/分钟，约-2至约-3℃/分钟，约-2至约-5℃/分钟℃，约-2至约-7℃/分钟，约-2至约-8℃/分钟，约-2至约-20℃/分钟，约-4至约-10℃/分钟，约-4℃/分钟至约-8℃/分钟，约-4至约-6℃/分钟，约-6至约-10℃/分钟，约-6至约-9℃/分钟，约-6至约-8℃/分钟，约-6至约-7℃/分钟，约-7至约-10℃/分钟，约-7至约-9℃/分钟，约-7至约-8℃/分钟，约-8至约-9℃/分钟，约-9至约-10℃/分钟，约-7至约-30℃/分钟，约-10至约-25℃/分钟，约-15至约-25℃/分钟，约-20至约-25℃/分钟，或约-20至约-30℃/分钟。在一些实施方案中，保存方案也可以与冷却速率无关。
一旦待保存的样品(例如，细胞材料和/或组织)通过这种连续速率冷却将细胞冷却至约-40℃至-80℃或更低，它们可以转移至液氮或液氮的气相以进一步冷却至冷冻保存温度，该温度通常低于冷冻溶液的玻璃化转化温度。待保存的样品(例如，细胞材料和/或组织)可以冷却至约-40℃至约-75℃，约-45℃至约-70℃，约-50℃至约-60℃，约-55℃至约-60℃，约-70℃至约-80℃，约-75℃至约-80℃，约-40℃至约-45℃，约-40℃至约-50℃，约-40℃至约-60℃，约-50℃至约-70℃，或约-50℃至约-80℃，然后进一步冷却至冷冻保存温度。然而，预计结果与冷却速率无关，因为不会形成冰。保持细胞活力的限制因素是在接近零摄氏度的温度下冷冻保护剂暴露的持续时间，温度越低，细胞毒性作用的风险越小，直到达到预期不会降低活力的存储温度。
补充有糖(例如海藻糖和/或蔗糖)的冷冻保护剂制剂在暴露于高于玻璃化转变温度的温度期间具有降低的冰成核倾向。因此，这些制剂中的细胞材料可耐受短时间暴露于-80℃的温度，持续数分钟或数小时。精确的持续时间取决于冷冻保护剂/糖制剂。在每个温度下耐受的持续时间将取决于在该温度下使用的冷冻保护剂制剂的相对细胞毒性。此外，预期这些冷冻保护剂制剂可用于储存组织，其中不需要细胞活力(例如一些心脏瓣膜，皮肤，肌腱和周围神经移植物)，温度范围从液氮到低于胶原蛋白的变性温度范围(约60℃)的生理温度。
一些实施方案可以包括逐步冷却过程，包括在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的第一温度下将含有冷冻保护剂的第一溶液中的组织的温度降低至第一温度，然后在第一溶液的玻璃化转变温度和-20℃之间的温度下在含有冷冻保护剂的第二溶液中进一步降低至第二温度，并且该过程可以用第三，第四，第五，第六，第七等溶液重复直至实现所需温度。
在实施方案中，第一溶液(例如冷冻保护剂制剂)的玻璃化转变温度可以设定在任何所需的水平，例如，在约-100℃至约-140℃的范围内，例如约-110℃至约-130℃，或-115℃至约-130℃。在实施方案中，组织可以冷却并随后在玻璃化转变温度和约-20℃之间的温度下储存，例如约-120℃至约-20℃，例如约-110℃至约-30℃，或约-90℃至约-60℃。
在浸入初始溶液后，待保存的样品(例如细胞材料或组织)浸入含有冷冻保护剂的溶液中。可以在逐步冷却过程中达到最终的冷冻保护剂浓度，包括将待保存的样品(例如细胞材料或组织)浸入含有第一冷冻保护剂浓度的第一溶液中，然后将组织浸入含有第二种冷冻保护剂浓度(高于第一种冷冻保护剂浓度)的第二溶液，并且该过程可以用第三，第四，第五，第六，第七等溶液重复直至达到所需的浓度。冷冻保护剂溶液可含有任何冷冻保护剂的组合。在一些实施方案中，最终所需的冷冻保护剂浓度可以在限制冷却期间冰的生长而不会发生冰引起的损伤的任何合适的温度下实现，例如最终所需的冷冻保护剂浓度可以在0℃至约-30℃，例如约-5℃至约-20℃，或约-7℃至约-15℃，或-8℃至约-12℃，或约-10℃的温度下实现。
在实施方案中，待保存的样品(例如细胞材料或组织)可以在保存方案(例如，冷却方案，储存和升温方案)期间保持无冰和/或没有冰引起的损伤。例如，在完成冷却过程之后，待保存的样品(例如细胞材料或组织)可以在储存步骤/阶段期间长时间，例如至少3天的时间，或至少5天的时间，或至少7天的时间，或至少8天的时间，保持无冰和/或没有冰引起的损害。
在一些实施方案中，在开始冷却过程时，待保存的样品(例如细胞材料或组织)可在整个保存方案期间(即，在冷却方案、储存、升温方案期间)保持无冰和/或没有冰引起的损伤，整个保存方案(例如，冷却过程、存储步骤/阶段和升温方案)的持续时间在至少3天至最长约3个月的范围内，或者持续时间在至少5天至最长约2个月的范围内，或者持续时间在至少7天至最长约1个月的范围内，或者持续时间在至少8天到最长约21天的范围内，或持续时间在至少8天到最长约14天的范围内。另外，在实施方案中，在这样的保存方案期间，待保存的样品(例如细胞材料或组织)将在保存方案的持续期间经历最小的细胞毒性。
升温方案可以包括两步升温过程(例如Campbell等，用于解冻冷冻保存细胞的两步方法(Two stage method for thawing cryopreserved cells)中所述；参见例如美国专利号6,596,531，其公开内容通过引用全文纳入本文)。在两步升温方案中，可以从储存冷冻器中取出冷冻保存的细胞材料(在冷冻保存温度下冷冻保存)。冷冻保存的细胞材料首先在两步方案的第一步中的第一环境中缓慢加温。环境不需要经过任何特殊处理或具有任何特殊组成，并且可以使用任何环境。环境可以是气态气氛，例如空气。为实现第一步的缓慢加温，环境可能处于大于冷冻温度的第一升温温度下。第一个升温温度可能低于冰点温度。例如，可以使用-30℃或更低，例如约-15℃至约-30℃，约-20℃至约-25℃，或约-20℃至约-30℃的温度。在第一步中升温至零下摄氏温度的优点是冷冻保护剂制剂在较温暖的温度下的潜在细胞毒性作用将被最小化。
两步升温过程的第二步包括在第二升温温度下的第二升温环境中快速复温细胞材料，第二升温温度高于第一升温步骤中使用的升温温度。第二升温温度可以是32℃或更高，约32℃至约50℃，约35℃至约45℃，约40℃至约50℃，约45℃至约50℃，约32℃至约40℃，约35℃至约40℃，或约37℃。同样，任何合适的环境，例如气体(空气)，液体或流化床可用作第二环境。例如，可以使用升温温度的水浴或二甲基亚砜浴来实现这种快速复温。在该步骤期间，可以使用温热的稀释剂溶液来引发冷冻保护剂的稀释，这也将有助于升温步骤。
在一些实施方案中，可用于加温样品的常规加热方法包括例如对流和微波加热。在本公开的方法之前，包括从外边界加热的对流加热的常规方法对于小的玻璃化样品是有效的，但是由于细胞毒性和结冰而对于大样品(例如体积大于5mL)无效。在一些实施例中，当与分布式生物相容性磁性纳米颗粒(mNP)组合时，低射频和感应加热可用于加热。参见，例如，美国专利申请公开号2016/0015025，其公开内容通过引用整体并入本文。
在实施方案中，待保存的样品(例如，组织或细胞材料)的大部分或全部细胞可以在保存方案后保持存活，因为样品的大部分或全部细胞将暴露于最小的细胞毒性。换句话说，本公开的方法通过避免将待保存的样品暴露于当组织(和溶液)温度接近37℃时发生的冷冻保护剂溶液的细胞毒性的增加来避免一些常规冷冻保护剂溶液的细胞毒性。在实施方案中，本公开的方法避免将待保存的样品暴露于可能杀死待保存的组织的大多数细胞或所有细胞的任何条件和/或冷冻保护剂(例如，通过暴露于极端条件，例如严重的渗透压和/或化学细胞毒性)(例如，由于冷冻保护剂溶液在接近37℃的温度下的细胞毒性水平增加)。然而，应该注意的是，在不需要细胞活力的实施方案中，可以使用化学毒性或严重的渗透胁迫使细胞材料基本上不含活细胞。
在实施方式中，通过本公开的方法保存的冷冻保存的细胞材料可以用于任何合适的用途，包括例如研究或治疗用途。例如，关于治疗用途，可以将冷冻保存的细胞材料给予人或动物患者以治疗或预防疾病或病症，例如主动脉心脏病，退行性关节病，退行性骨病，结肠或肠道疾病，退行性脊髓病，慢性肾功能衰竭疾病，心脏病，椎间盘疾病，角膜疾病，脊柱外伤和更换因外伤而损失的部位如手指、四肢和面部。
冷冻保存的细胞材料可以以任何合适的方式给予患者。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞材料可以局部递送给患者(例如，治疗烧伤、伤口或皮肤病)。在一些实施方式中，可以将冷冻保存的细胞材料递送至患者的局部植入部位。这些给药方式中的任何一种或任何组合可用于治疗患者。
在第一方面，本公开涉及一种用于保存活的大体积细胞材料的方法，包括：将细胞材料暴露于含有至少一种糖的冷冻保护剂制剂/溶液/培养基中，使细胞材料经受保存方案，其中不会发生冰引起的细胞材料损伤，并获得冷冻保存的细胞材料。在第二方面，第一方面的方法可以是其中细胞材料具有大于4mL的体积的方法。在第三方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料的体积大于10mL的方法。在第四方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中细胞材料在使细胞材料经受保存方案后至少7天是无冰的。在第五方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案包括玻璃化策略，该玻璃化策略在冷却和升温期间限制冰的生长，使得在保存方案期间不发生冰引起的损害。在第六方面，任何上述方面的方法可以是其中至少一种糖是二糖的方法。在第七方面，任何上述方面的方法可以是其中所述至少一种糖选自海藻糖和蔗糖的方法。
在第八方面，任何上述方面的方法可以是使细胞材料经受保存方案的方法，包括：冷冻保护剂逐步加入到冷冻保护剂制剂/溶液/培养基中以获得最终的冷冻保护剂制剂/溶液/培养基，其中冷冻保护剂的浓度和/或至少一种糖的浓度能有效避免冰引起的对细胞材料的损害，例如实现最终的冷冻保护剂制剂/溶液/培养基的最后的冷冻保护剂添加步骤在冷冻保护剂制剂/溶液/培养基维持在约-10℃的温度下进行。在第九方面，任何上述方面的方法可以是使细胞材料经受保存方案的方法包括：将细胞材料浸入具有增加浓度的冷冻保护剂和/或增加浓度的至少一种糖的一系列溶液中，以实现浸没在具有冷冻保护剂浓度和/或至少一种糖浓度能有效避免冰引起的对细胞材料的损害的最终溶液中。在第十方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中细胞材料在冷冻保护剂制剂中温育，该冷冻保护剂制剂含有0.1-1M的至少一种糖。在第十一方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案还包括在含有至少一种糖的冷冻保护剂制剂中冷却细胞材料，例如在冷却之前或冷却期间在冷冻保护剂制剂中加入另外的冷冻保护剂，所述另外的冷冻保护剂与糖不同，例如所述另外的冷冻保护剂选自下组：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，冰再结晶抑制剂，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖，并且如果需要，冷冻保护剂制剂可含有浓度为0.1至13.0M的另外的冷冻保护剂。在第十二方面，任何上述方面的方法可以是其中所述细胞材料是天然或人造组织或器官的方法。在第十三方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自哺乳动物器官和哺乳动物组织的方法。在第十四方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自人体器官和人体组织的方法。在第十五方面，任何上述方面的方法可以是在完成保存方案后细胞材料的细胞活力(％)为至少60％的方法。在第十六方面，任何上述方面的方法可以是培养基不含DMSO的方法。在第十七方面，任何上述方面的方法可以是培养基不含甲酰胺的方法。在第十八方面，任何上述方面的方法可以是其中培养基不含丙二醇的方法。
在第十九方面，任何上述方面的方法可以是其中培养基不含DMSO、甲酰胺和/或丙二醇的方法。
在另一方面，本发明还涉及通过在保存方案期间将活的大体积细胞材料暴露于含有至少一种糖和任选的另外的冷冻保护剂的冷冻保护制剂而获得的冷冻保存的细胞材料；其中保存方案后细胞材料的细胞活力(％)至少为50％，细胞材料的体积大于4mL，这种冷冻保存的细胞材料可以通过例如任何上述方面的方法获得，并且可以给予患者。
在另一方面，本发明还涉及提高活的冷冻保存的细胞材料的产量的方法，包括：使大体积细胞材料暴露于冷冻保护剂持续预定的时间以形成冷冻保存制剂，所述冷冻保护剂含有至少一种糖；使冷冻保存制剂经受保存方案，包括在约-80℃或更低的冷冻保存温度下冷冻保存；完成保存方案后，回收冷冻保存的细胞材料；其中回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)至少为60％，并且细胞材料的体积大于4mL。在另一方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自器官和组织的方法。在另一方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自哺乳动物器官和哺乳动物组织的方法。在另一方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自人体器官和人体组织的方法。在另一方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)为至少80％。
在另一方面，本发明还涉及一种用于储存不需要细胞活力的活的大体积细胞材料的方法，包括：使细胞材料暴露于含有至少一种糖的冷冻保护制剂/溶液/培养基中，使细胞材料经受保存方案，其包括将细胞材料储存在从液氮温度到低于胶原蛋白变性温度范围的生理温度的温度范围内，和获得冷冻保存的细胞材料。在另一方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中细胞材料选自心脏瓣膜，皮肤，肌腱和周围神经移植物。在另一方面，任何上述方面的方法可以是从哺乳动物获得细胞材料的方法。在另一方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料从人获得的方法。在另一方面，任何上述方面的方法可以是一种方法，其中细胞材料储存在约-190℃至约60℃的温度范围内。在另一方面，任何上述方面的方法可以是其中回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)为0％的方法。
通过以下实施例可以更好地理解上述内容，提供以下实施例仅是为了说明目的，而非旨在限制本发明的范围。
实施例
第一组实验
在以下无冰冷冻保存制剂补充实验中，将二糖(海藻糖和蔗糖)以图1所示的量添加到各种玻璃化制剂(VS49，DP6和VS55)中，并与(不含海藻糖和/或蔗糖)溶液进行比较，以获得抑制各种组织中冰形成的有效性。
具体说，图1显示由玻璃化制剂的海藻糖和蔗糖补充引起的组织活力显著增加。数据以对照VS55结果的％显示，在4℃下加入最终的冷冻保护剂浓度，N＝6，与没有添加剂的对照相比，通过ANOVA或#T-试验测定*p<0.05。
在该实验中，比较向VS49，DP6和VS55制剂中添加600mM海藻糖或蔗糖。将组织在4mL溶液中玻璃化。海藻糖补充增加VS49和VS55的小叶活力。在所有三种制剂中，蔗糖补充增加了小叶的活力。这些差异显著不同，通过ANOVA或T检验测定p<0.05。DP6在所有处理组中始终具有最佳的肌肉保存，但在该实验中没有达到统计学意义，然而，这一结果表明心肌比其他组织类型(小叶和动脉)更能耐受冰形成，并且甲酰胺可能是引起一些细胞毒性。这导致计划在后来的实验中更彻底地用糖测试DP6。使用补充有蔗糖的VS55进行重复实验，并获得与所示的补充VS55类似的结果。
方法
心脏瓣膜和血管采购：从其他IACUC批准的研究中使用的动物或从食品加工厂死后的动物获得的Bonafide多余心脏瓣膜或血管。解剖组织，冲洗并置于含有抗生素的冰冷组织培养基的无菌杯中过夜，然后分配用于体外研究。图1中的心脏瓣膜组织各自由一组由肺动脉、小叶和心肌组成的组织组成。将它们分离并使用评估下文所述的代谢活性的测定法单独测定活力。
玻璃化方法：使用先前描述的用于血管玻璃化的方法，在4℃下用Euro-Collins溶液中的3.10M DMSO、3.10M甲酰胺和2.21M丙二醇组成的VS55逐渐浸润组织，VS55稀释至由3M DMSO、3M丙二醇组成的DP6或VS49。在冰上增加浓度的五个连续15分钟步骤中加入预冷的稀释玻璃化溶液(4℃)。在最后的第六个添加步骤中，在预冷的-10℃或4℃全强度玻璃化溶液中加入含mNPs的最后的冷冻保护剂浓度，并在-10℃浴中保持15分钟或在4℃下在冰上保持在塑料管中。然后将样品分两步冷却，首先通过置于-135℃的预冷的2-甲基丁烷浴中快速冷却至-100℃，然后转移至气相氮气储存以缓慢冷却至低于-135℃。最后，在测试之前将样品在-130℃下在气相氮气中储存至少24小时。
加温：通过对流加温或纳米加温进行加温。对流加温是一个两阶段过程，包括缓慢升温至-100℃，然后尽快升温至融化。通过将样品置于-135℃冰箱的顶部产生缓慢升温速率，并通过将塑料容器置于室温下30％DMSO/H2O的混合物中来产生受控的升温速率。复温后，在冰上以逐步的方式除去玻璃化溶液，以保持组织冷却并且由于残留的冷冻保护剂的存在而导致的细胞毒性最小化。
活力评估：代谢活性-AlamarBlueTM测定将用于评估对照和处理组织样品的代谢活性。将组织在2ml DMEM+10％FBS培养基中温育1小时以平衡，然后在标准细胞培养条件下加入20％AlamarBlue 3小时。AlamarBlue是一种基于代谢活性检测的无毒荧光指示剂。在544nm的激发波长和590nm的发射波长下测量荧光。在复温(第0天)后进行该评估以证明细胞活力。在每个实验结束时干燥对照和实验组织，称重，并将结果表示为相对荧光单位(RFU)/mg组织干重。
这些实验的结果表明，0.6M的海藻糖或蔗糖阻止了DP6和VS49制剂中可见的冰形成，并且在这些溶液(DP6，VS49和VS55)中增加了玻璃化后的活力，其中小叶活力证明了2-3倍的增加。值得注意的是，VS49或DP6制剂在使用常规对流加温控制结冰方面无效，如美国专利申请公开号2016/0015025中所述。2016/0015025.然而，在采用纳米加温的实验中，在冷却和复温期间，在海藻糖或蔗糖存在下均未观察到冰形成。
第二组实验
使用称为Cryomacroscope的装置(用于在冷冻保存期间可视化事件)，使用具有血管的0.5M蔗糖DP6制剂进行另一组实验。结果显示在图2中(新鲜和玻璃化兔颈动脉的收缩反应，(上)去甲肾上腺素和去氧肾上腺素(下)剂量反应曲线)。
上述研究在使用对流加温而非纳米加温的情况下在4mL样品上进行。如前所述进行制备、玻璃化和复温。将血管切成2mm环用于测试。使用上述第一组实验中描述的方法，通过AlamarBlue测定，补充有0.5M蔗糖的DP6保存的动脉样品产生大于90％的活力(数据未显示)。还检查了样品的平滑肌功能，并观察到对两种收缩药物的极好反应，如图2所示。
方法
血管生理学：制备2mm的新鲜和无冰冷冻保存的血管环用于血管生理学研究，采用一组收缩药物记录兔股动脉环在Radnoti器官浴系统中的功能。使用先前使用的方法，添加增加浓度的每种药物后测量等长收缩张力。生理学结果表示为克张力/mg组织干重。
第三组实验
在VS55±0.6M蔗糖中以4和10mL细胞材料体积进行猪股动脉冷冻保存。所有制剂均在4mL时显示出显著的保存，而在10mL时，不含蔗糖的VS55显示出低活力。相比之下，采用AlamarBlue(图3；4和10mL VS55±0.6M蔗糖样品的猪动脉比较，其中使用AlamarBlue代谢分析评估组织环)和生理学试验(图4；预收缩后硝普钠引起猪平滑肌松弛，其中VS55仅适用于4mL样品，但在10mL样品中失效，蔗糖补充则保留10mL样品的功能(松弛))测定蔗糖补充制剂显示的保存活力。这些结果表明，二糖补充导致组织在大体积(例如，10mL体积)下存活，其中未补充的VS55溶液(即，没有添加二糖)失败(由于形成冰而丧失组织活力)。两种收缩药物获得了类似的结果。
这里使用的方法与使用对流加温的早期实施例中的方法相同。
第四组实验
将兔胸主动脉样品在含有或不含有0.6M蔗糖、含有或不含纳米颗粒(用于比较对流与纳米加温)的30mL体积的VS55中玻璃化。结果如图5所示(30mL兔胸主动脉结果显示，使用对流(中间条)或纳米加温(最右边的条)，蔗糖补充改善了结果)。
该方法如前面关于添加冷冻保护剂和冷却的实施例所述。然而，在这个实验中，我们比较了对流加温和纳米加温。在-130℃下至少24小时后进行纳米加温。用7.69mg/ml Fe纳米颗粒(EMG-308，Ferrotec)将样品玻璃化，并将样品插入感应加热器的线圈中用于复温。更具体地说，我们采用了6.0kW端子，150-400kHz，EASYHEAT 5060LI固态感应电源，带有远程工作头和定制多匝螺旋线圈，6-7圈，在中心产生35kA/m的磁场。只要蔗糖存在于玻璃化溶液中，就可以用对流加热或纳米加温(如美国专利申请公开号2016/0015025中所述进行)获得良好的结果(刚好低于50％的活力)。没有蔗糖的VS55由于在复温过程中观察到的冰形成而表现不佳。
第五组实验
在该组实验中(其结果在图6A和图6B中示出)，比较了心脏瓣膜组织的活力，其中完整心脏瓣膜保存在30mL冷冻保护剂体积中并通过对流或纳米加温方法复温。
从每个小叶和相关的肺动脉和心肌中取出三个组织样品，每个瓣膜的每种组织类型总共9个样品。如前所述进行无冰玻璃化和复温过程，不同之处在于在最后步骤中逐步添加含蔗糖或海藻糖的DP6。在一些情况下，DP6+糖步骤之后在-10℃下浸入VS55+糖中，然后立即玻璃化。应该注意的是，在该实验中，如图1中所观察到的，尽管DP6发生冷冻，但DP6仅导致良好的心肌细胞活力，然而在该实验中，两个冷冻保存组在添加蔗糖后实现了对照值(图6B，底部)。
对于图6A和图6B中所示的数据，各个猪心脏瓣膜加载DP6，然后在单独的DP6，DP6与0.6M海藻糖，0.6M蔗糖或0.3M蔗糖和0.3M海藻糖的混合物中冷冻保存，或在最后时刻从含有糖DP6转移到含有相同的糖的VS55中。组织和溶液的总体积至少为30mL。从上到下的结果是小叶，然后是导管，最后是心肌。图6A中的结果对应于对流加温，图6B中的结果是纳米加温之后(n＝9)。结果表示为未处理的对照心脏瓣膜组织的平均值±1标准误差百分比。
这些结果表明，具有0.6M蔗糖的DP6(EuroCollins溶液中的3.0M二甲基亚砜加3.0M)导致心脏瓣膜中所有三种组织成分的优异保存，特别是在纳米加温之后。几种其他处理组包括用DP6加载然后转移至含蔗糖或海藻糖的VS55，在对流加温或纳米加温后也改善了活力。存在蔗糖处理组比海藻糖处理组更好的趋势。
上述结果(图1-6)结合起来证明，使用糖(例如二糖，例如蔗糖和海藻糖)和VS55及更稀释的冷冻保护剂制剂(DP6，图6)，可以获得意想不到的改善的无冰玻璃化结果。这些糖在对流和快速升温过程中有助于磁性纳米颗粒的感应加热，但高蔗糖和海藻糖制剂似乎不需要快速升温。
使用糖(例如二糖，例如蔗糖和海藻糖)可以保存大体积样品并缓慢升温，同时具有较低的结冰风险和增加的复温后活力。
具有一系列海藻糖和蔗糖浓度的VS55的储存证明在-80℃下1周不会形成冰。在该实验中，将30mL具有增加的糖浓度的VS55样品置于50mL塑料管中并储存在-80℃机械储存冷冻器中7天。每天检查管的冰形成。该管以糖浓度依赖性方式显示冰，最高浓度(例如在0.5-0.6M范围内)在8天后未显示冰形成。一天后，0.4至0.6M海藻糖和0.5-0.6M蔗糖无冰，而7天后0.5-0.6M海藻糖和0.6M蔗糖组无冰。较低浓度的这些糖仍然可以用于无冰玻璃化，但是需要更快速的冷却和加温，因为形成冰的风险将更大并且可能需要纳米加温而不是对流加温。
补充有0-0.4M蔗糖或0-0.6M海藻糖的VS55表现出冰(白色)形成。更高的浓度没有冰。在-80℃下一周后，最高浓度的糖仍然没有冰。
将糖(例如二糖，例如蔗糖和海藻糖)掺入到这种无冰玻璃化制剂中允许使用相对缓慢的冷却和加热速率(例如大约数小时或数天)而不会形成冰并且没有细胞/组织活力的损失。另外，对流加温和纳米加温方法均可用于本公开的方法以及本文所述的制剂。仍然需要快速加温方法，例如纳米加温方法，因为在快速升温速率下，冷冻保护剂暴露引起的细胞毒性的机会较少。这些观察结果还表明，可以开发其他具有糖的冷冻保护剂制剂，其具有甚至更低的冷冻保护剂细胞毒性风险。
贯穿本公开内容引用的所有文献和专利参考文献通过引用整体并入。尽管这里已经参考特定装置、材料和实施例描述了前面的描述，但是并不意图限于这里公开的细节；相反，它扩展到所有功能上等同的结构、方法和用途，例如在所附权利要求的范围内。此外，尽管上面仅详细描述了几个示例性实施例，但是本领域技术人员将容易理解，在示例性实施例中可以进行许多修改而不实质上脱离“用于活的功能性组织库的大体积组织样品的无冰保存”的公开内容。因此，所有这些修改旨在包括在如以下权利要求所限定的本公开的范围内。在权利要求中，装置加功能的条款旨在覆盖这里描述的执行所述功能的结构，不仅包括结构等同物，还包括等同结构。因此，尽管钉子和螺钉可能不是结构等同物，因为钉子采用圆柱形表面将木质部件固定在一起，而螺钉采用螺旋表面，在紧固木质部件的环境中，钉子和螺钉可以是等效结构。申请人的明确意图是不要援引35U.S.C.§112(f)对于本文任何权利要求的任何限制，除了那些权利要求明确使用“用于...的手段”和相关功能的词语之外。

Claims (9)

1.一种保存活的大体积细胞材料的方法，包括：
使所述细胞材料暴露于含有至少0.4M至2M蔗糖和/或至少0.6M至2M海藻糖的冷冻保护剂制剂中，其中，所述细胞材料获自肝、肺、肠、心脏、胰腺、睾丸、胎盘、胸腺、肾上腺、动脉、静脉、淋巴结、骨或骨骼肌，
使所述细胞材料经受其中不会发生冰引起的细胞材料损伤的保存方案，其中所述保存方案包括冷却方案、储存方案和升温方案，在其中在冷却方案期间，使用每分钟0.1至-2℃的连续受控速率将细胞材料从初始温度点冷却至-80℃或更低，初始温度在+4至-30℃的范围内，并且在完成保存方案后获得冷冻保存的细胞材料，其中，所述冷冻保护剂制剂不含DMSO，所述冷冻保护剂制剂不含甲酰胺，所述冷冻保护剂制剂不含丙二醇；
其中，所述细胞材料的体积大于4mL。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞材料具有大于10mL的体积。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞材料在使所述细胞材料经受保存方案后至少7天是无冰的。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞材料在冷冻保护剂制剂中温育，所述冷冻保护剂制剂含有0.6-1M的蔗糖和/或海藻糖。
5.如权利要求1所述的方法，其中
保存方案还包括在含有至少一种糖的冷冻保护剂制剂中冷却所述细胞材料，
在冷却之前或冷却期间将另外的冷冻保护剂加入到冷冻保护剂制剂中，所述另外的冷冻保护剂与所述糖不同，并且
冷冻保护剂制剂含有浓度为6.5至11M的另外的冷冻保护剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述另外的冷冻保护剂选自下组：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，冰再结晶抑制剂，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞材料选自：人体器官和人体组织，所述人体器官和人体组织选自肠、胰腺、睾丸、胎盘、胸腺、肾上腺、动脉、静脉、淋巴结、骨骼或骨骼肌。
8.如权利要求1所述的方法，其中，在完成所述保存方案之后，所述细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。
9.如权利要求1所述的方法获得的冷冻保存的细胞材料，其中，在所述保存方案之后所述细胞材料的细胞活力(％)为至少50％。
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