BR112019012742A2

BR112019012742A2 - conservação livre de gelo de amostras de tecido de grande volume para produtos de banco de tecido funcional viável

Info

Publication number: BR112019012742A2
Application number: BR112019012742A
Authority: BR
Inventors: Gm Brockbank Kelvin; H Campbell Lia
Original assignee: Tissue Testing Tech Llc
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-11-26
Also published as: BR112019012742B1; US20180192639A1; CN110545665A; CN110545665B; JP7061610B2; WO2018118799A1; US11246308B2; CA3047978A1; JP2020504725A; EP3557989A1

Abstract

a presente invenção revela um material celular de grande volume que pode ser preservado combinando-se o material celular com uma formulação de agente crioprotetor/meio/solução contendo pelo menos um açúcar e então submetendo o material celular a um protocolo de conservação de vitrificação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CONSERVAÇÃO LIVRE DE GELO DE AMOSTRAS DE TECIDO EM GRANDE VOLUME PARA DEPOSTO EM BANCO DE TECIDO VIÁVEL E FUNCIONAL.

REERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO [0001] Este pedido não provisório reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 62/436.642, depositado em 20 de dezembro de 2016. A descrição do pedido anterior é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO [0002] A presente invenção refere-se ao campo de conservação de células, tecidos e órgãos, particularmente, novas formulações livres de gelo (por exemplo, para vitrificação) incorporando açúcares, tais como dissacarídeos (por exemplo, trealose e sacarose), e protocolos que melhoram as propriedades do material da amostra e a viabilidade biológica, mesmo quando os volumes de amostra são aumentados em mais do que 4 ml. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método para suplementar formulações de vitrificação livres de gelo para grandes amostras contendo materiais celulares (por exemplo, tendo um volume maior do que 4 ml, tal como maior do que 10 ml) com açúcares, tais como dissacarídeos (por exemplo, trealose e sacarose), em um esforço para aumentar a sobrevivência celular e as funções tecíduals após a conservação.

ANTECEDENTES [0003] Abordagens convencionais para a crioconservação livre de gelo têm sido bem-sucedidas para o armazenamento de tamanhos de amostra relativamente pequenos. Por exemplo, o armazenamento de oócito humano em que possui uma prática clinica de fertilização in vitro revolucionária.

[0004] A fim de que as células ou tecidos sejam conservadas, as

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2/47 soluções crioprotetoras são tipicamente utilizadas para evitar danos devidos ao congelamento durante o processo de esfriamento ou descongelamento/aquecimento. Para a crioconservação ser útil, a amostra conservada deve reter a sua integridade e/ou viabilidade em um nível razoável após a conservação. Assim, o processo de conservação da amostra deve evitar e/ou limitar o dano ou destruição das células e/ou da arquitetura do tecido.

[0005] A vitrificação, armazenagem crioconservada em uma fase vítrea em vez de cristalina, é uma abordagem de capacitação importante para o depósito em banco de tecidos e para a medicina regenerativa, oferecendo a capacidade de armazenar e transportar células, tecidos e órgãos para uma variedade de usos biomédicos. Na crioconservação livre de gelo por vitrificação, a formação de gelo é evitada pela presença de altas concentrações de produtos químicos conhecidos como crioprotetores que tanto interagem com água e a substituem quanto, portanto, impedem que as moléculas de água formem gelo. Esta abordagem interrompe essencialmente o tempo biológico durante o armazenamento abaixo da temperatura de transição vítrea (Tg) das formulações crioprotetoras, e tem sido utilizada com sucesso para manter a viabilidade e função da célula em pequena escala e amostras de tecido fino devido à difusão (calor e transferência de massa) e limitações de mudança de fase que impedem o uso em sistemas volumosos tais como órgãos e tecidos maiores. Embora as técnicas de vitrificação anteriores (e os agentes de crioconservação utilizados com estas técnicas, tais como DSMO) que empregam técnicas convencionais de aquecimento por convecção limite possam às vezes ser bemsucedido para amostras de até 4 a 5 ml, a formação de gelo ainda ocorre quando o volume de amostra se aproxima de 10 ml, visto que o aquecimento por convecção limite convencional em um banho não fornece taxas de aquecimento rápidas o suficiente. A formação de gelo

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3/47 resulta em destruição de células e tecidos. As principais limitações da vitrificação para grandes amostras de tecido são a citotoxicidade potencial devido à exposição prolongada aos crioprotetores empregados e a formação de gelo durante o reaquecimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] Observou-se que a suplementação de formulações de vitrificação livres de gelo empregadas para materiais celulares de grande volume (por exemplo, tendo um volume maior do que 4 ml, tal como maior do que 10 ml) com açúcares, tais como dissacarídeos (por exemplo, trealose e/ou sacarose), resultou no aumento da sobrevivência celular pós-conservação e das funções teciduais.

[0007] O presente pedido fornece assim nova metodologia e novas formulações para o tratamento de materiais celulares de grande volume em que os açúcares, tais como dissacarídeos (por exemplo, trealose e ou sacarose) são adicionados nas formulações crioprotetoras de vitrificação livres de gelo. A suplementação com estes açúcares reduz tanto a citotoxicidade induzida por crioprotetor quanto o risco de formação de gelo durante o esfriamento e o mais importante durante o reaquecimento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0008] A Figura 1 é uma ilustração dos dados obtidos com relação aos experimentos de suplementação de formulação de crioconservação livre de gelo em que os dissacarídeos (trealose e sacarose) são adicionados a várias formulações de vitrificação (VS49, DP6 e VS55).

[0009] A Figura 2 é uma ilustração dos dados obtidos com relação às respostas contrateis das artérias carótidas de coelho novas e vitrificadas, curvas de resposta de dose de Norepinefrina (parte superior) e Fenilefrina (inferior).

[0010] A Figura 3 é uma ilustração dos dados obtidos com relação à comparação da artéria femoral suína de amostras de 4 e 10 ml de

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4/47 sacarose VS55 ± 0,6 M (ensaio alamarBlue).

[0011] A Figura 4 é uma ilustração dos dados obtidos com relação ao relaxamento do músculo liso suíno induzido por nitroprussiato de sódio após a pré-contração (ensaio de fisiologia).

[0012] A Figura 5 é uma ilustração dos dados obtidos com relação às amostras da aorta torácica de coelho que foram vitrificadas em volumes de 30 ml de VS55 com ou sem sacarose 0,6 M com ou sem nanopartículas para comparação da convecção versus nanoaquecimento.

[0013] As Figuras 6A e 6B é uma ilustração dos dados obtidos com relação a uma comparação da viabilidade dos tecidos da válvula cardíaca em que as válvulas cardíacas intactas foram conservadas em volumes de crioprotetor de 30 ml e reaquecidas por métodos de convecção ou nanoaquecimento.

DESCRIÇÃO DETALHADA Terminologia e Definições [0014] Na seguinte descrição, numerosos detalhes são apresentados para fornecer uma compreensão da presente invenção. No entanto, pode ficar entendido por aqueles versados na técnica que os métodos da presente invenção podem ser praticados sem estes detalhes e que numerosas variações ou modificações das modalidades descritas podem ser possíveis.

[0015] No inicio, deve ser observado que no desenvolvimento de qualquer tal modalidade objetiva, numerosas decisões específicas de implementação podem ser efetuadas para atingir os objetivos específicos do inventor, tais como a concordância com restrições relacionadas ao sistema e relacionadas com o negócio, que irão variar de uma implementação para outra. Além do mais, deve-se considerar que tal esforço de desenvolvimento pode ser complexo e demorado, mas, no entanto, seria uma tarefa rotineira para aqueles de habilidade prática na técnica que possuem o benefício desta descrição. Além disso, a

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5/47 composição utilizada/divulgada nesta invenção também pode compreender alguns componentes diferentes daqueles citados. No resumo e nesta descrição detalhada, cada valor numérico deve ser lido uma vez como modificado pelo termo cerca de (a menos que já expressamente modificado), e depois lido novamente como não tão modificado, a não ser que de outra maneira indicada no contexto.

[0016] Como aqui utilizado, o termo cerca de” utilizado em conexão com uma quantidade é inclusive do valor declarado e possui o significado ditado pelo contexto. Por exemplo, ele inclui pelo menos o grau de erro associado com a medição da quantidade particular. Quando utilizado no contexto de uma faixa, o modificador cerca de também deve ser considerado como apresentando a faixa definida pelos valores absolutos dos dois pontos finais. Por exemplo, a faixa de cerca de 2 a cerca de 4 também divulga a faixa de 2 a 4.

[0017] A menos que de outra forma expressamente mencionada nesta invenção, o limitador cerca de com relação às temperaturas (°C), refere-se à temperatura ou faixa de temperaturas mencionada, assim como a temperatura ou faixa de temperaturas estabelecida +/-1 a 4% (da temperatura estabelecida ou pontos finais de uma faixa de temperaturas) da mencionada. Com relação à viabilidade celular e retenção da célula (%), a não ser que de outra maneira expressamente mencionada, o limitador cerca de com relação à viabilidade celular e retenção da célula (%) refere-se ao valor ou faixa de valores estabelecido assim como o valor ou faixa de valores mencionado +/- | a 3%. Com relação à expressão teores, tal como, por exemplo, com as unidades em partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb), a menos que de outra forma expressamente declarado nesta invenção, o limitador cerca de com relação à viabilidade celular e a retenção de célula (%) refere-se ao valor ou faixa de valores estabelecido assim como o valor ou faixa de valores mencionado +/- 1 a 3%. Com relação à ex

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6/47 pressão de teores com as unidades pg/ml, salvo indicação ao contrário expressamente aqui mencionada, o limitador cerca de^!! com relação ao valor em pg/ml refere-se ao valor ou faixa de valores estabelecido assim como o valor ou faixa de valores mencionadas +/- 1 a 4%. Com relação à molaridade (M), a menos que de outra forma expressamente aqui mencionada, o limitador cerca de^ss com relação à molaridade (M) refere-se ao valor ou faixa de valores estabelecido assim como o valor ou faixa de valores mencionado de +/- 1 a 2%. Com relação às taxas de esfriamento (°C/min), a não ser que de outra maneira expressamente declarada, o limitador cerca de em relação às taxas de resfriamento (°C/min) refere-se ao valor ou faixa de valores estabelecido assim como o valor ou faixa de valores mencionado +/-1 a 3%.

[0018] Da mesma forma, no sumário e nesta descrição detalhada, deve ficar entendido que uma faixa listada ou descrita como sendo útil, adequada ou coisa parecida, destina-se a incluir suporte para qualquer sub-faixa concebível dentro da faixa, pelo menos em virtude de cada ponto dentro da faixa, incluindo os pontos finais, deve ser considerado como de ter sido mencionada. Por exemplo, uma faixa de 1 a 10” deve ser lida como indicando cada número possível ao longo da sequência contínua entre cerca de 1 e cerca de 10. Adicionalmente, por exemplo, +/- 1 a 4% deve ser lida como indicando cada número possível ao longo da sequência contínua entre 1 e 4. Além disso, um ou mais dos pontos de dados nos presentes exemplos podem ser combinados entre si, ou podem ser combinados com um dos pontos de dados no relatório descritivo para criar uma faixa, e assim incluir cada valor ou número possível dentro desta faixa. Assim, (1) mesmo se numerosos pontos de dados específicos dentro da faixa forem explicitamente identificados, (2) mesmo se for feita referência a alguns pontos de dados específicos dentro da faixa, ou (3) mesmo quando nenhum ponto de dado dentro da faixa for explicitamente identificado, deve ser

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7/47 entendido (i) que os inventores irão observar e compreender que qualquer ponto de dados concebível dentro da faixa deve ser considerado de ser especificado, e (ii) que os inventores possuíam conhecimento da faixa inteira, cada subfaixa concebível dentro da faixa e cada ponto concebível dentro da faixa. Além disso, o assunto deste pedido ilustrativamente aqui divulgado pode ser praticado na ausência de quaisquer elementos que não são especificamente divulgadas nesta invenção. [0019] A menos que expressamente declarado ao contrário, ou refere-se a um inclusivo ou e não a um exclusivo ou. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e tanto A quanto B são verdadeiros (ou presentes).

[0020] Além disso, o uso do um ou uma é empregado para descrever elementos e componentes das modalidades nesta invenção. Isto é feito meramente por conveniência e para dar um sentido geral de conceitos de acordo com a presente invenção. Esta descrição deve ser lida para incluir um ou pelo menos um e o singular também inclui o plural, a menos que especificado de outra forma.

[0021] A terminologia e a fraseologia aqui utilizadas são para propósitos descritivos e não devem ser interpretadas como limitativas no escopo. A linguagem tal como incluindo, compreendendo, tendo, contendo ou envolvendo, e suas variações, destina-se de ser ampla e englobe o assunto em questão listado a seguir, equivalentes, e o assunto adicional não citado.

[0022] Da mesma forma, como aqui utilizado, quaisquer referências a uma modalidade ou uma modalidade significa que um elemento particular, aspecto, estrutura ou característica descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade. As aparências da expressão em uma modalidade em vários locais no

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8/47 relatório descritivo não estão necessariamente referindo-se à mesma modalidade.

[0023] Como utilizado nesta invenção, o termo temperatura ambiente refere-se a uma temperatura de cerca de 18°C a cerca de 25°C na pressão padrão. Em vários exemplos, a temperatura ambiente pode ser ao redor de 18°C, ao redor de 19°C, ao redor de 20^cC, ao redor de 21^OC, ao redor de 22°C, ao redor de 23°C, ao redor de 24°C ou ao redor de 25°C.

[0024] Como aqui utilizado, material celular ou amostra celular refere-se ao material biológico vivo contendo componentes celulares, quer o material seja natural quer seja artificial e inclui células, tecidos e órgãos, naturais ou artificiais. Tais termos também significam qualquer espécie de material vivo a ser crioconservado, tais como células, tecidos e órgãos. Em algumas modalidades, as células, tecidos e órgãos podem ser órgãos de mamífero (tais como órgãos humanos), células de mamífero (tais como células humanas) e tecidos de mamífero (tais como tecidos humanos).

[0025] Como aqui utilizado, grande volume” como utilizado na expressão material celular de grande volume ou amostra de grande volume ou amostra celular de grande volume refere-se ao material biológico vivo contendo componentes celulares, quer o material seja natural quer seja artificial e inclui materiais celulares, tecidos e órgãos, naturais ou artificiais, onde tal material biológico vivo contendo componentes celulares possui um volume maior do que cerca de 4 ml, tal como um volume maior do que cerca de 5 ml , ou um volume maior que cerca de 10 ml, ou um volume maior do que cerca de 15 ml, ou um volume maior do que cerca de 30 ml, ou um volume maior do que cerca de 50 ml, ou um volume maior do que cerca de 70 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 4 ml a cerca de 200 ml, tal como um volume em uma faixa de cerca de 4 ml a cerca de 50 ml, um volume

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9/47 em uma faixa de cerca de 4 ml a cerca de 30 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 5 ml a cerca de 100 ml, tal como um volume em uma faixa de cerca de 5 ml a cerca de 50 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 5 ml a cerca de 30 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 6 ml a cerca de 100 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 6 ml a cerca de 50 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 6 ml a cerca de 25 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 10 ml a cerca de 100 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 10 ml a cerca de 50 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 10 ml a cerca de 25 ml, ou um volume em uma faixa de cerca de 10 ml a cerca de 20 ml. Tais termos também incluem qualquer tipo de material vivo tendo um tal volume a ser crioconservado, tal como materiais celulares, tecidos e órgãos. Em algumas modalidades, os tecidos e órgãos tendo um tal volume podem ser órgãos de mamífero (tais como órgãos humanos), células de mamífero e tecidos de mamífero (tais como tecidos humanos).

[0026] Como aqui utilizado, o termo órgão refere-se a qualquer órgão, tal como, por exemplo, fígado, pulmão, rins, intestino, coração, pâncreas, testículos, placenta, timo, glândula adrenal, artérias, veias, nódulos linfáticos, ossos ou músculos esqueléticos. Conforme aqui utilizado, o termo tecido” ou tecidos” compreende qualquer tipo de tecido compreendendo qualquer espécie de tipo celular (tal como de um dos órgãos acima mencionados) e suas combinações, incluindo, por exemplo, tecido ovariano, tecido testicular, tecido do cordão umbilical, tecido placentário, tecido conjuntivo, tecido cardíaco, tecidos do músculo, cartilagem e osso, tecido endócrino, pele e tecido neural. O termo tecido ou tecidos também pode compreender tecido adiposo ou tecido da polpa dental. Em algumas modalidades, o tecido ou o órgão é obtido a partir de um ser humano tal como um fígado humano, pulmão humano, rim humano, intestino humano, coração humano, pâncreas

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10/47 humano, testículos humanos, placenta humana, timo humano, glândula adrenal humana, artérias humanas, veias humanas, nervos humanos, pele humana, gânglios linfáticos humanos, ossos humanos ou músculos esqueléticos humanos.

[0027] Como aqui utilizado, o termo célula(s) compreende qualquer tipo de célula, tal como, por exemplo, células somáticas (incluindo todos os tipos de células em tecido ou órgãos), fibroblastos, ceratinócitos, hepatócitos, miócitos cardíacos, células do músculo liso, células tronco, células progenitoras, oócitos e células germinativas. Tais células podem estar na forma de um tecido ou órgão. Em algumas modalidades, as células são de um tecido ou órgão mamífero, tal como um tecido humano ou órgão descrito acima.

[0028] Como utilizado nesta invenção, protocolo de conservação refere-se a um processo para a provisão de vida de prateleira a uma célula contendo material biológico vivo. Os protocolos de conservação podem incluir a crioconservação por vitrificação e ou conservação anidrobiótica por liofilização ou dessecação.

[0029] Como aqui utilizado, o termo vitrificação” refere-se à solidificação sem formação de cristais de gelo ou sem formação substancial de cristais de gelo. Em algumas modalidades, uma amostra a ser conservada (por exemplo, tal como um tecido ou material celular) pode ser vitrificada de tal modo que a vitrificação e/ou a crioconservação vítrea (em sua totalidade - a partir do esfriamento inicial até o término do re~ aquecimento) pode ser obtida sem qualquer formação de cristais de gelo. Em algumas modalidades, uma amostra a ser conservada (por exemplo, tal como um tecido ou material celular) pode ser vitrificada de tal modo que a vitrificação e/ou a crioconservação vítrea pode ser obtida onde a solidificação da amostra a ser conservada (por exemplo, tal como um tecido ou material celular) pode ocorrer sem formação substancial de cristais de gelo (isto é, a vitrificação e/ou a crioconser

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11/47 vação vítrea (em sua totalidade - a partir do esfriamento inicial até o término do reaquecimento) pode ser obtida mesmo na presença de uma pequena quantidade ou quantidade restrita de gelo, que é menor do que uma quantidade que causa danos ao tecido).

[0030] Como aqui utilizado, uma amostra a ser conservada (por exemplo, tal como um tecido ou material celular) é vitrificada quando ela alcança a temperatura de transição vítrea (Tg). O processo de vitrificação envolve um aumento acentuado na viscosidade da solução crioprotetora à medida que a temperatura é diminuída de tal modo que a nucleação e o crescimento de gelo são inibidos. Geralmente, a temperatura mais baixa de uma solução que possivelmente pode superesfriar sem congelamento é a temperatura de nucleação homogênea Th, em que os cristais de gelo da temperatura nucleiam e crescem, e um sólido cristalino é formado a partir da solução. As soluções de vitrificação possuem uma temperatura de transição vítrea T_g, em cuja temperatura o soluto vitrifica, ou torna-se um sólido não cristalino.

[0031] Como aqui utilizado, a temperatura de transição vítrea re~ fere-se à temperatura de transição vítrea de uma solução ou formulação sob as condições nas quais o processo está sendo conduzido. Em geral, a metodologia da presente invenção é conduzida em pressões fisiológicas. Entretanto, pressões mais elevadas podem ser utilizadas contanto que a amostra a ser conservada (por exemplo, tal como um tecido ou material celular) não seja significativamente danificada desse modo.

[0032] Como aqui utilizado, pressões fisiológicas referem-se às pressões que os tecidos sofrem durante a função normal. O termo pressões fisiológicas assim inclui as condições atmosféricas normais, assim como as pressões mais elevadas que vários tecidos, tais como tecidos vascularizados, sofrem sob condições diastólicas e sistólicas.

[0033] Como aqui utilizado, o termo crioprotetor significa um proPetição 870190068402, de 19/07/2019, pág. 26/67

12/47 duto químico que minimiza a formação de cristais de gelo em e ao redor de um tecido/órgão quando o tecido é esfriado para as temperaturas subzero e não resulta substancialmente em nenhum dano ao tecido/órgão após o aquecimento, em comparação com o efeito do esfriamento sem crioprotetor.

[0034] Como aqui utilizado, o termo açúcar pode se referir a qualquer açúcar. Em algumas modalidades, o açúcar é um polissacarídeo. Como aqui utilizado, o termo polissacarídeo refere-se a um açúcar contendo mais de uma unidade de monossacarídeo. Isto é, o termo polissacarídeo inclui oligossacarídeos tais como díssacarídeos e trissacarídeos, mas não inclui monossacarídeos. O açúcar também pode ser uma mistura de açúcares, tal como onde pelo menos um dos açúcares é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, o açúcar é pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um dissacarídeo e um trissacarídeo. Em algumas modalidades, o açúcar é um dissacarídeo, tal como, por exemplo, onde o dissacarídeo é pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em trealose e sacarose. Em algumas modalidades, o açúcar é um trissacarídeo, tal como rafinose. O açúcar também pode ser uma combinação de trealose e/ou sacarose e/ou rafinose e/ou outros díssacarídeos ou trisacarídeos. Em algumas modalidades, o açúcar compreende trealose.

[0035] Como aqui utilizado, o termo funcional após a crioconservação em relação a um material crioconservado significa que o material crioconservado, tal como órgãos ou tecidos, após a crioconservação retém uma função aceitável e/ou planejada após a crioconservação. Em algumas modalidades, o material celular após a crioconservação retém toda a sua função planejada. Em algumas modalidades, o material crioconservado celular conservado pelos métodos da presente invenção retém pelo menos 50% da função planejada, tal como pelo menos 60% da função planejada, tal como pelo menos 70% da função

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13/47 planejada, tal como pelo menos 80% da função planejada, tal como pelo menos 90% da função planejada, tal como pelo menos 95% da função planejada, tal como 100% da função planejada. Por exemplo, junto com a conservação da viabilidade das células, pode ser importante também manter/preservar a função fisiológica do tecido/órgão, por exemplo, para um coração a função de bombeamento, e/ou a capacidade de um tecido (por exemplo, aquele a ser transplantado) de se integrar com o tecido circundante.

[0036] Como aqui utilizado, o termo ’’estéril significa livre de germes vivos, microrganismos e outros organismos capazes de proliferação.

[0037] Como aqui utilizado, o termo substancialmente livres de crioprotetor significa um crioprotetor em uma quantidade menor do que 0,01% p/p. Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção podem utilizar e/ou obter um meio/solução e/ou material celular que é substancialmente livre de crioprotetor, tal como um material celular que é substancialmente livre de DIVISO (isto é, o DIVISO está em uma quantidade menor do que 0,01% p/p). Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção podem utilizar e/ou alcançar um valor meio/solução e/ou material celular que é substancialmente livre de qualquer crioprotetor diferente do açúcar, tal como sacarose e/ou trealose).

Modalidades [0038] A presente invenção refere-se a métodos para a conservação de materiais vivos/amostras/órgãos/tecidos em grande volume (os termos materiais, amostras, órgãos e tecidos são utilizados de modo trocável e englobam qualquer material biológico vivo contendo componentes celulares).

[0039] Os métodos da presente invenção compreendem colocar um grande volume de material celular em contato com uma solução

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14/47 crioprotetora contendo peto menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose). Em algumas modalidades, isto pode compreender a incubação de um material celular de grande volume em uma formulação/solução crioprotetora contendo pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) (e opcionalmente um crioprotetor adicional), tal como incubação (ou colocação em contato) de um material celular de grande volume em um meio/solução contendo pelo menos açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) (e opcionalmente um outro crioprotetor). Nas modalidades, o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), pode estar presente na formulação/solução crioprotetora em uma quantidade eficaz para fornecer um ambiente mais conducente para a sobrevivência das células do material celular em grande volume durante o esfriamento e a reaquecimento.

[0040] Por exemplo, em algumas modalidades, o material crioconservado celular conservado pelos métodos da presente invenção retém pelo menos 50% da função planejada, tal como pelo menos 60% da função planejada, tal como pelo menos 70% da função planejada, tal como pelo menos 80% da função planejada, tal como peto menos 90% da função planejada, tal como pelo menos 95% da função planejada, tal como 100% da função planejada. Por exemplo, junto com a conservação da viabilidade das células nos tecidos e órgãos, pode ser importante também manter/conservar a função fisiológica da célula/tecido/órgão, por exemplo, para um coração a função de bombeamento, e/ou a capacidade de um tecido/célula (por exemplo, aquela a serem transplantada) de integrar com o tecido/célula circundante.

[0041] Nos métodos da presente invenção, as células do material celular de grande volume (doravante referidas como células) são protegidas durante a crioconservação após serem colocadas em contato

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15/47 com o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) em combinação com outros crioprotetores durante o esfriamento para a temperatura de crioconservação e reaquecimento. Nas modalidades, que são colocadas em contato com pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) em combinação com outros crioprotetores durante o esfriamento e reaquecimento, significa que os riscos de formação de gelo são minimizados de tal modo que a viabilidade das células não se deteriora significativamente porque a solução crioprotetora foi estabilizada/protegida por pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) na formulação/solução/composição de crioconservação.

[0042] Nas modalidades, a solução, tal como uma solução conhecida bem adequada para o armazenamento de órgãos de células, tecidos e órgãos, pode conter qualquer quantidade eficaz de açúcar que seja eficaz para fornecer um ambiente mais conducente à sobrevivência das células do material celular de grande volume durante o protocolo de conservação.

[0043] Em algumas modalidades, nos métodos da presente invenção, um meio (os termos meio e solução são utilizados de modo trocável) contendo pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) em combinação com outros crioprotetores, pode ser combinado com materiais celulares tais como tecidos e órgãos para preparar uma composição de crioconservação. O meio (que pode ser um meio aquoso) pode conter qualquer concentração adequada do pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) em combinação com outros crioprotetores para estes propósitos.

[0044] Em algumas modalidades, pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e ou sacarose) em combina

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16/47 ção com outros crioprotetores, é utilizado em uma quantidade nos métodos da presente invenção de tal modo que resulta em uma viabilidade melhorada (pós-crioconservação) do material/ amostra celular vivo selecionado do grupo que consiste em órgãos, células e tecidos, tais como órgãos de mamífero, células de mamífero e tecidos de mamífero (incluindo aqueles que podem ser subsequentemente transplantados). As frases, viabilidade celular melhorada ou viabilidade melhorada referem-se, por exemplo, a uma viabilidade celular (%) de pelo menos 60%, tal como 80% ou mais. A viabilidade celular melhorada (%) pode ser em 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 73% ou mais, 75% ou mais, 77% ou mais, 80% ou mais, 83% ou mais, 85% ou mais, 87% ou mais, 90% ou mais, 93% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais.

[0045] Em algumas modalidades, pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) (e opcionalmente um crioprotetor adicional) é utilizado em uma quantidade nos métodos da presente invenção de tal modo que este é eficaz para executar um ou mais dos seguintes: inibir a nucleação de gelo, modificar a estrutura de gelo, diminuir a formação de gelo, evitar a formação de gelo, diminuir a formação de gelo até uma medida em que permitiría o uso de taxas de esfriamento mais rápidas, diminuir/impedir a formação de gelo até uma medida em que permitiría uma redução na quantidade de crioprotetor necessária que fornece um ambiente mais conducente à sobrevivência celular.

[0046] Em algumas modalidades, o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) representa de cerca de 1 a cerca de 50% do peso total do meio compreendendo as células a serem conservadas, tal como de cerca de 2 a cerca de 50%, ou de cerca de 4 a cerca de 45%, ou de cerca de 5 a 20%, ou de cerca de 5 a cerca de 12%, ou de cerca de 6 a 20%, ou de cerca de

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17/47 a cerca de 12%, ou de cerca de 6 a cerca de 10% do peso total da formulação/solução/meio sendo utilizado com as células a serem conservadas.

[0047] Em algumas modalidades, a formulação/solução/meio contém pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) em uma concentração que varia de 0,01 M a 5 M, de 0,1 M a 4 M, de 0,1 M a 3 M, de 0,1 M a 2 M, de 0,2 M a 2 M, de 0,3 M a 2 M, de 0,4 M a 2 M, de 0,5 M a 2 M, de 0,6 M a 2 M, de 0,1 M a 1 M, de 0,2 M a 1 M, de 0,3 M a 1 M, de 0,4 M a 1 M, de 0,5 M a 1 M, de cerca de 0,05 M a cerca de 6 M, cerca de 0,1 a cerca de 3 M, cerca de 0,25 a cerca de 6 M, cerca de 0,25 a cerca de 1 M, cerca de 0,25 a cerca de 2 M, cerca de 0,25 a cerca de 3 M, cerca de 0,25 a cerca de 4 M, cerca de 0,25 a cerca de 5 M, cerca de 1 a cerca de 4 M, cerca de 1 a cerca de 3 M, cerca de 1 a cerca de 2 M, cerca de 3 a cerca de 5 M, cerca de 2 a cerca de 4 M, cerca de 0,5 a cerca de 6 M, cerca de 0,5 a cerca de 5 M, cerca de 0,5 a cerca de 4 M, cerca de 0,5 a cerca de 3 M, cerca de 0,5 a cerca de 2 M, ou cerca de 0,5 a cerca de 1M, em que qualquer concentração que ocorre dentro das faixas acima também pode servir como um ponto final para uma faixa.

[0048] Nas modalidades, a formulação/solução/meio compreendendo o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) pode ser colocada em contato com a amostra a ser conservada por qualquer duração desejada, tal como até uma dosagem desejada (tal como uma dosagem eficaz) do pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), está presente sobre/nas células ou tecidos para proporcionar uma viabilidade melhorada (pós-crioconservação) e/ou para prevenir/proteger contra danos ao tecido e/ou executar um ou mais dos seguintes: inibir a nucleação de gelo, modificar a estrutura do gelo, diminuir a formação de gelo, evitar a formação de gelo, diminu

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18/47 ir/prevenir a formação de gelo até uma medida que permitiría o uso de taxas de esfriamento e aquecimento mais lentas, diminuir/prevenir a formação de gelo até uma medida que permitiría uma redução na quantidade de crioprotetor requerida para fornecer um ambiente mais conducente à sobrevivência celular para conservar os tecidos.

[0049] Em algumas modalidades, as células a serem crioconservadas também podem ser utilizadas em contato com um tampão de pH compatível com o congelamento compreendido de, por exemplo, pelo menos uma solução de sal básica, uma fonte de energia (por exemplo, glicose) e um tampão capaz de manter um pH neutro nas temperaturas esfriadas. Tais materiais bem conhecidos incluem, por exemplo, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Este material também pode ser incluído como parte da composição de crioconservação. Ver, por exemplo, Campbell et al., Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle and Endothelial Cells with Disaccharides, In: Katkov I. (ed.) Current Frontiers in Cryopreservation. Croatia: In Tech (2012); e Campbell et al., Development of Pancreas Storage Solutions: Initial Screening of Cytoprotective Supplements for β-cell Survival and Metabolic Status after Hypothermic Storage, Biopreservation and Biobanking 11(1): 12-18 (2013).

[0050] Em algumas modalidades, os compostos crioprotetores (no total, incluindo os açúcares e qualquer outro crioprotetor) podem estar presentes na composição de crioconservação em uma quantidade de, por exemplo, cerca de 0,05 M a cerca de 13 M, cerca de 0,1 a cerca de 13 M, cerca de 0,25 a cerca de 13 M, cerca de 1 a cerca de 13 M, cerca de 2 a cerca de 13 M, cerca de 4 a cerca de 13 M, cerca de 6 a cerca de 13 M, cerca de 8 a cerca de 13 M, cerca de 0,25 a cerca de 11 M, cerca de 0,25 a cerca de 9 M, cerca de 0,25 a cerca de 8 M, cerca de 0,25 a cerca de 7 M, cerca de 0,25 a cerca de 10 M, cerca de 1 a cerca de 7 M, cerca de 1 a cerca de 8 M, cerca de 1 a cerca de 9

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M, cerca de 3 a cerca de 10 M, cerca de 2 a cerca de 10 M, cerca de 0,5 a cerca de 10 M, cerca de 0,5 a cerca de 9 M, cerca de 0,5 a cerca de 9 M, cerca de 0,5 a cerca de 8 M, ou cerca de 0,5 a cerca de 7 M, ou cerca de 6,5 a cerca de 11 M. Em algumas modalidades, os compostos crioprotetores podem estar presentes na composição de crioconservação em uma quantidade de, por exemplo, cerca de 0,05 M a cerca de 6 M, cerca de 0,1 a cerca de 3 M, cerca de 0,25 a cerca de 6 M, cerca de 1 a cerca de 6 M, cerca de 2 a cerca de 6 M, cerca de 3 a cerca de 6 M, cerca de 4 a cerca de 6 M, cerca de 5 a cerca de 6M.

[0051] Em algumas modalidades, o material celular a ser conservado pode ser colocado em contato com uma solução/meio/formulação/formulação contendo crioprotetores antes, durante ou após a incubação do material celular a ser conservado em uma solução/meio/ formulação/composição contendo pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e ou sacarose). A duração de que o tecido pode ser colocado em contato por imersão e/ou perfusão em tal solução/meio/formulação/composição será uma função da massa do tecido. Nas modalidades, as taxas de esfriamento de tais soluções/meios/formulações/composições podem ser ajustadas para fornecer permeação de tecido adequada (função de concentração e tempo) para impedir a formação de gelo.

[0052] Os crioprotetores adicionais adequados podem incluir, por exemplo, acetamida, agarose, alginato, alanina, albumina, acetato de amônio, proteínas anticongelantes, butanodióis (tais como 2,3-butanodiol), sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodióis, ciclo-hexanodionas, ciclo-hexatrióis, dextranos, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida (tal como n-dimetil formamida), sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico de etileno glicol, formamida, glicose, glicerol, glicerofosfato, monoacetato de glicerila, glícina, glicoproteínas, amido de hidroxietila, inositol, lactose,

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20/47 cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metóxi propanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil uréias, metil glicose, metil glicerol, fenol, polióis pluronic, polietileno glicol, polivinilpirralidona, prolina, propanodióis (tais como 1,2-propanodiol e 1, 3~propanodiol), N-óxido de piridina, rafinose, ribose, serina, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, uréia, valina e xilose. Outros crioprotetores que podem ser utilizados na presente invenção são descritos nas Patente U.S. No. 6.395.467 de Fahy et al.; Patente U.S. No. 6.274.303 de Wowk et al.; Patente U.S. No. 6.194.137 de Khirabadi et al.; Patente U.S. No. 6.187.529 de Fahy et al.; Patente U.S. No. 5.962.214 de Fahy et al.; Patente U.S. No. 5.955.448 de Calaco et al.; Patente U.S. No. 5.629.145 de Meryman; e/ou WO 02/32225 A2, que corresponde ao Pedido de Patente U.S. No. 09/691.197 de Khirabadi et al., cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

[0053] A composição crioprotetora também pode incluir pelo menos um composto de ciclo-hexanodiol (CHD), por exemplo, as formas cis ou trans de 1,3-ciclo-hexanodiol (1,3CHD) ou 1,4-ciclo-hexanodiol (1.4CHD), ou suas misturas racêmicas, como um composto crioprotetor.

[0054] O composto de CHD pode estar presente na composição de crioconservação em uma quantidade de, por exemplo, cerca de 0,05 a cerca de 2 M, cerca de 0,1 Ma cerca de 1 M, cerca de 0,1 a cerca de 2 M, cerca de 0,1 a cerca de 1 M, cerca de 0,1 a cerca de 1,5 M, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 M, cerca de 0,1 a cerca de 0,25 M, cerca de 1 a cerca de 2 M, cerca de 1,5 a cerca de 2 M, cerca de 0,75 a cerca de 2 M, cerca de 0,75 a cerca de 1,5 M, cerca de 0,75 a cerca de 1 M, cerca de 0,05 a cerca de 1 M, cerca de 0,05 a cerca de 0,75 M, cerca de 0,05 a cerca de 0,5 M, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,1 M.

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21/47 [0055] A composição de crioconservação também pode incluir (ou ser baseada em) uma solução bem adequada para armazenamento de células, tecidos e órgãos. A solução pode incluir tampões de pH bem conhecidos. Em algumas modalidades, a solução pode ser, por exemplo, a EuroCollins Solution, que é composta de dextrose, fosfato de potássio monobáslco e dibáslco, bicarbonato de sódio e cloreto de potássio, descrito em Taylor et ah, Comparison of Unisol with EuroCollins Solution as a Vehicle Solution for Cryoprotectants, Transplantation Proceedings 33: 677-679 (2001), ou uma solução VS55, que é um coquetel crioprotetor otimizado que demonstrou a vitrificação bem sucedida de muitos sistemas biológicos. A solução VS55 é composta de sulfóxido de dimetila 3,1 M (DMSO), propileno glicol 2,2 M e formamida 3,1 M em uma solução de Euro-Collins de base, para um total de 8,4 M. Alternativamente, a solução crioprotetora pode ser formulada em uma solução alternativa, tal como Unisol.

[0056] Ainda mais, a composição de crioconservação para uso nos métodos da presente invenção também pode incluir um glicolipídeo anticongelante (AFGL), proteína/peptídeo anticongelante (AFP), proteínas de histerese térmica, (THPs) ou inibidores da recristalização de gelo (IRIs). Tais materiais podem estar presentes na composição de crioconservação em uma quantidade de, por exemplo, cerca de 0,001 a cerca de 1 mg/ml, cerca de 0,05 a cerca de 0,5 mg/ml, ou cerca de 0,1 a cerca de 0,75 mg/ml de composição.

[0057] Em algumas modalidades, pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), pode atuar como uma substituição para um crioprotetor, tal como, por exemplo, DMSO, ou como um suplemento para tais outros crioprotetores para reduzir a sua concentração, tal como as concentrações não tóxicas, em que o crioprotetor alcança os mesmos ou melhores efeitos protetores com relação à conservação da mesma funcionalidade do materi

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22/47 ai/amostra crioconservada durante o procedimento de crioconservação. Por exemplo, em algumas modalidades, o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e ou sacarose), pode atuar como uma substituição para um crioprotetor, tal como, por exemplo, DMSO, em uma solução conhecida como VS55, que é um coquetel crioprotetor otimizado que demonstrou a vitrificação bem sucedida de muitos sistemas biológicos (a solução VS55 é composta de dimetil sulfóxido 3,1 M (DMSO), propileno glicol 2,2 M e formamida 3,1 M em uma solução Euro-Collins de base, para um total de 8,4M). A este respeito, o pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), pode atuar como uma substituição para o crioprotetor na solução VS55, para reduzir a sua concentração, tal como às concentrações não tóxicas, ou como suplemento para os outros crioprotetores em VS55 em que o crioprotetor alcança os mesmos ou melhores efeitos protetores com relação à conservação da mesma funcionalidade do material/amostra crioconservada durante o procedimento de crioconservação.

[0058] Em algumas modalidades, pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), é utilizado em uma quantidade nos métodos da presente invenção de tal modo que seja eficaz para atuar como um crioprotetor para um material/amostra vivo selecionado a partir do grupo que consiste em órgãos, células e tecidos, tais como órgãos de mamífero, células de mamífero e tecidos de mamífero (incluindo aqueles que podem ser subsequentemente transplantados).

[0059] As células nos materiais celulares que podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser qualquer composição celular adequada. Em algumas modalidades, as células podem ser células da pele, ceratinócitos, células do músculo esquelético, células de músculo cardíaco, células pulmonares, células mesentéricas, célu

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23/47 las adiposas, células tronco, hepatócitos, células epiteliais, células de Kupffer, fibroblastos, neurônios, miócitos cardianos, miócitos, condrócitos, células acinares pancreátlcas, ilhotas de Langerhans, osteócitos, mioblastos, células satélites, células endoteliais, adipócitos, preadipócitos, células epiteliais biliares e células progenitoras ou combinações de qualquer um destes tipos de células.

[0060] Em algumas modalidades, as células utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser de qualquer espécie adequada de animal, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano, canino (por exemplo, cachorro), felino (por exemplo, gato), equino (por exemplo, cavalo), porcino, ovino, caprino, ou mamífero bovino.

[0061] A formulação/composição utilizada para preparar a solução de crioconservação pode ser combinada com pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose), em uma variedade de modos. Em algumas modalidades, um material celular pode ser combinado com um meio líquido aquoso, tal como uma solução aquosa, contendo pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose). Por exemplo, uma combinação gradual, opcionalmente com agitação suave, pode ser conduzida.

[0062] Assim que a composição de crioconservação tenha sido preparada (e pelo menos um açúcar, tal como um dissacarídeo (por exemplo, trealose e/ou sacarose) e associada com o material celular a ser conservado), o esfriamento para a crioconservação vitrificada livre de gelo pode ser conduzido de qualquer maneira, e pode utilizar quaisquer materiais adicionais como aqueles descritos acima. Os protocolos para a conservação do material celular são descritos nas seguintes patentes e publicações: Patente U.S. No. 6.395.467 de Fahy et al.; Patente U.S. No. 6.274.303 de Wowk et al.; Patente U.S. No. 6.194.137 de Khirabadi et al.; Patente U.S. No. 6.187.529 de Fahy et

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24/47 al·; Patente U.S. No. 6.127.177 de Toner et al·; Patente U.S. No. 5.962.214 de Fahy et al·; Patente U.S. No. 5.955.448 de Calaco et al·; Patente U.S. No. 5.827.741 de Beattie et ai.; Patente U.S. No. 5.648.206 de Goodrich et al.; Patente U.S. No. 5.629.145 de Meryman; Patente U.S. No. 5.242.792 de Rudolph et al.; e WO 02/32225 A2, que corresponde ao Pedido de Patente U.S. No. 09/691.197 de Khirabadi et al., isto é, cujas divulgações são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

[0063] A parte de crioconservação do protocolo de conservação tipicamente envolve o esfriamento das células para temperaturas bem abaixo do ponto de congelamento da água, por exemplo, para cerca de 80°C ou mais baixa, mais tipicamente para cerca de ~130°C ou mais baixa. Qualquer método de crioconservação conhecido pelos profissionais na técnica pode ser utilizado. Por exemplo, o protocolo de esfriamento para crioconservação pode ser qualquer tipo adequado no qual a temperatura de crioconservação pode ser mais baixa (isto é, mais fria) do que cerca de -20°C, tal como cerca de -80°C ou mais baixa (isto é, mais fria), ou cerca de ~135°C ou mais baixa (isto é, mais fria). Em algumas modalidades, a temperatura de crioconservação pode estar em uma faixa de cerca de -20°C a cerca de -200^cC, ou cerca de -120 a cerca de 200°C, ou cerca de -130°C a cerca de -196°C, ou cerca de -140^cC a cerca de -190°C, ou cerca de -150°C a cerca de 190°C, ou cerca de -150°C a cerca de -180°C, ou cerca de -30 a cerca de -175°C, ou cerca de -80°C a cerca de -160°C, ou cerca de -85°C a cerca de -150°C, ou cerca de -95°C a cerca de -135°C, ou cerca de 80°C a cerca de -180°C, ou cerca de -90°C a cerca de -196°C, ou cerca de -100°C a cerca de -196°C.

[0064] Em algumas modalidades, o protocolo de conservação pode incluir um esfriamento contínuo de taxa controlada a partir do ponto da temperatura de início (+4 a -30°C) até -80°C ou qualquer uma das

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25/47 temperaturas de esfriamento divulgadas acima, com a taxa de esfriamento dependendo das características das células/tecidos que são crioconservados. Por exemplo, o protocolo de esfriamento para a crioconservação pode estar em qualquer taxa adequada, tal como uma taxa (e/ou taxa de esfriamento média, por exemplo, a partir da temperatura inicial da amostra até a temperatura de crioconservação) pode ser pode ser maior do que cerca de -0,1 °C por minuto, ou maior do que cerca de -4,0°C por minuto, ou maior do que cerca de -6,0°C por minuto, ou maior do que cerca de -8,0°C por minuto, ou maior do que cerca de -10,0°C por minuto, ou maior do que cerca de -14,0°C por minuto, ou maior do que cerca de -25,0^cC por minuto, ou maior do que 50°C por minuto. A taxa de esfriamento (e/ou taxa de esfriamento média) tal como, por exemplo, para um esfriamento em taxa contínua (ou outros tipos de esfriamento) pode ser, por exemplo, de cerca de 0,1°C a cerca de -10°C por minuto ou de cerca de -1°C a cerca de ~2°C por minuto. A taxa de esfriamento pode ser de cerca de -0,1 a cerca de 9°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -8°C por minuto, cerca de 0,1 a cerca de -7°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -6°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -5°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -4°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -3°C por minuto, cerca de -0,1 a cerca de -2°C por minuto, cerca de 0,1 a cerca de -1°C por minuto, cerca de 0,1 a cerca de -0,5°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -2°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -3°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -4°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -5°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -6°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -7°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -8°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -9°C por minuto, cerca de -1 a cerca de -10°C por minuto, cerca de -2 a cerca de -3°C por minuto, cerca de -2 a cerca de -5°C por minuto, cerca de -2 a cerca de -7°C por minuto, cerca de -2 a cerca de -8°C por minuto, cerca de -2 a cerca de -20°C por minuto, cerca de -4 a

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26/47 cerca de -10°C por minuto, cerca de -4 por minuto a cerca de -8°C por minuto, cerca de -4 a cerca de -6°C por minuto, cerca de -6 a cerca de -10°C por minuto, cerca de -6 a cerca de ~9°C por minuto, cerca de -6 a cerca de -8°C por minuto, cerca de -6 a cerca de -7°C por minuto, cerca de -7 a cerca de -10°C por minuto, cerca de -7 a cerca de -9°C por minuto, cerca de -7 a cerca de -8°C por minuto, cerca de -8 a cerca de -9°C por minuto, cerca de -9 a cerca de -10°C por minuto, cerca de -7 a cerca de -30°C por minuto, cerca de -10 a cerca de -25°C por minuto, cerca de -15 a cerca de ~25°C por minuto, cerca de -20 a cerca de -25°C por minuto ou cerca de -20 a cerca de -30°C por minuto. O protocolo de conservação também pode ser independente da taxa de esfriamento em algumas modalidades.

[0065] Visto que as amostras a serem conservadas (por exemplo, materiais celulares e/ou tecidos) são esfriadas para ao redor de -40°C a -80°C ou mais baixo por este esfriamento em taxa contínua, elas podem ser transferidas para nitrogênio líquido ou fase vapor de nitrogênio líquido para esfriamento adicional até a temperatura de crioconservação, que está tipicamente abaixo da temperatura de transição vítrea da solução de congelamento. As amostras a serem conservadas (por exemplo, materiais celulares e ou tecidos) podem ser esfriadas para cerca de -40°C a cerca de -75°C, cerca de -45°C a cerca de -70°C, cerca de -50°C a cerca de -60°C, cerca de -55°C a cerca de -60^cC, cerca de ~70°C a cerca de -80^cC, cerca de -75°C a cerca de ~80°C, cerca de -40°C a cerca de -45°C, cerca de -40°C a cerca de -50°C, cerca de -40°C a cerca de -60°C, cerca de -50°C a cerca de -70°C, ou cerca de -50°C a cerca de -80°C antes do esfriamento adicional até a temperatura de crioconservação. No entanto, antecipa-se que o resultado é independente da taxa de esfriamento porque a formação de gelo não ocorrerá. O fator limitative para a retenção da viabilidade celular será a duração da exposição de crioprotetor em temperaturas próxi

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27/47 mas a zero grau centígrado, quanto mais baixa a temperatura tanto menor o risco de efeitos citotóxicos até que as temperaturas de armazenamento sejam alcançadas nas quais nenhuma deterioração da viabilidade é antecipada.

[0066] As formulações crioprotetoras suplementadas com açúcares (tais como trealose e/ou sacarose) possuem uma propensão reduzida para a nucleação de gelo durante a exposição às temperaturas acima da temperatura de transição vítrea. Assim, os materiais celulares nessas formulações irão tolerar a exposição a curto prazo nas temperaturas tais como -80°C, durante minutos ou horas. A duração exata dependendo da formulação de crioprotetor/ açúcar. A duração tolerada em cada temperatura dependerá da citotoxicidade relativa da formulação crioprotetora empregada nessa temperatura. Além disso, prevê-se que estas formulações crioprotetoras podem ser utilizadas para armazenamento de tecidos, onde a viabilidade celular não é desejada (algumas válvulas cardíacas, pele, tendões e enxertos nervosos periféricos, por exemplo), em temperaturas que variam do nitrogênio líquido a temperaturas fisiológicas abaixo da faixa de temperatura de desnaturação do colágeno (aproximadamente 60°C).

[0067] Algumas modalidades podem compreender um processo de esfriamento de maneira gradativa, no qual a temperatura do tecido é diminuída para uma primeira temperatura em uma primeira solução contendo crioprotetor em uma primeira temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20°C, depois é ainda diminuída para uma segunda temperatura em uma segunda solução contendo crioprotetor na temperatura entre a temperatura de transição vítrea da primeira solução e -20°C, e este processo pode ser repetido com uma terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, etc. solução até que a temperatura desejada seja alcançada.

[0068] Nas modalidades, a temperatura de transição vítrea da pri

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28/47 meira solução (tal como uma formulação crioprotetora) pode estar em curso em qualquer nível desejado, tal como, por exemplo, em uma faixa de cerca de -100°C a cerca de ~140°C, tal como cerca de -110°C a cerca de -130°C ou -115°C a cerca de -130°C. Nas modalidades, o tecido pode ser esfriado e subsequentemente armazenado em temperaturas entre a temperatura de transição vítrea e ao redor de -20°C, tal como de cerca de 120°C a cerca de -20°Ο, tal como entre cerca de 110°C e cerca de -30^cC ou entre cerca de -90°C e cerca de -60°C.

[0069] Após ser imersa em uma solução inicial, a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) pode ser imersa em uma solução contendo crioprotetor. A concentração de crioprotetor final pode ser alcançada em um processo de esfriamento de maneira gradativa no qual a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) pode ser imersa em uma primeira solução contendo uma primeira concentração de crioprotetor, depois o tecido pode ser imerso em uma segunda solução contendo uma segunda concentração de crioprotetor (que é maior do que a primeira concentração de crioprotetor), e este processo pode ser repetido com uma terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, etc. solução até que a concentração desejada seja alcançada. A solução crioprotetora pode conter qualquer combinação de crioprotetores. Em algumas modalidades, a concentração de crioprotetor final desejada pode ser obtida em qualquer temperatura adequada que limita o crescimento de gelo durante o esfriamento de tal modo que danos induzidos por gelo não ocorram, por exemplo, a concentração de crioprotetor final desejada pode ser obtida em uma temperatura na faixa de 0°C a cerca de -30°C, tal como cerca de 5°C a cerca de -20°C, ou cerca de -7°C a cerca de -15°C, ou -8°C a cerca de -12^CC, ou um temperatura ao redor de -10°C.

[0070] Nas modalidades, a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) pode permanecer livre de gelo e/ou livre

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29/47 de danos induzidos por gelo durante o protocolo de conservação (por exemplo, protocolo de esfriamento, armazenamento e protocolo de aquecimento). Por exemplo, após o término do processo de esfriamento, a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) pode permanecer livre de gelo e/ou livre de danos induzidos por gelo durante a etapa/fase de armazenagem durante um longo período de tempo, tal como um período de pelo menos 3 dias, ou um período de pelo menos 5 dias, ou um período de pelo menos 7 dias, ou um período de pelo menos 8 dias.

[0071] Em algumas modalidades, após o início do processo de resfriamento, a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) pode permanecer livre de gelo e/ou livre de danos induzidos por gelo durante todo o protocolo de conservação (isto é, durante o protocolo de esfriamento, armazenamento e protocolo de aquecimento), em que todo o protocolo de conservação (por exemplo, o protocolo de esfriamento, etapa/fase de armazenamento, e protocolo de aquecimento) possui uma duração em uma faixa de pelo menos 3 dias até cerca de 3 meses, ou uma duração em uma faixa de pelo menos 5 dias até cerca de 2 meses, ou uma duração em uma faixa de pelo menos 7 dias até cerca de 1 mês, ou uma duração em uma faixa de pelo menos 8 dias até cerca de 21 dias, ou uma duração em uma faixa de pelo menos 8 dias até cerca de 14 dias. Adicionalmente, nas modalidades, durante tais protocolos de conservação, a amostra a ser conservada (tal como um material celular ou tecido) experimentará a citotoxicidade mínima durante a duração do protocolo de conservação.

[0072] O protocolo de aquecimento pode envolver um procedimento de aquecimento de duas etapas (tal como aquele descrito por Campbell et al., Two stage method for thawing cryopreserved cells; ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.596.531, cuja descrição é aqui incorporada por referência na sua totalidade. No protocolo de aqueci

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30/47 mento de duas etapas, os materiais celulares crioconservados (crioconservados na temperatura de crioconservação) podem ser removidos do congelador de armazenagem. Os materiais celulares crioconservados são deixados para em primeiro lugar aquecer lentamente em um primeiro ambiente na primeira etapa do protocolo de duas etapas. Não é necessário que o ambiente seja submetido a qualquer tratamento especial ou tenha qualquer preparação em particular, e qualquer ambiente pode ser utilizado. O ambiente pode ser uma atmosfera gasosa, por exemplo, ar. Para efetuar o aquecimento lento do primeiro estágio, o ambiente pode estar em uma primeira temperatura de aquecimento maior do que a temperatura de crioconservação. A primeira temperatura de aquecimento pode estar abaixo da temperatura de congelamento. Por exemplo, temperaturas de -30°C ou, tais como cerca de -15°C a cerca de -30^cC, cerca de -20°C a cerca de -25°C ou cerca de ~20°C a cerca de -30°C podem ser utilizadas. A vantagem de aquecimento na primeira etapa para uma temperatura sub-zero centígrados é aquela em que os efeitos citotóxicos potenciais da formulação crioprotetora em temperaturas mais quentes serão minimizados.

[0073] A segunda etapa do procedimento de aquecimento de duas etapas envolve reaquecer o material celular rapidamente em um segundo ambiente em uma segunda temperatura de aquecimento que é maior do que a temperatura de aquecimento utilizada na primeira etapa de aquecimento. A segunda temperatura de aquecimento pode ser de 32°C ou mais, de cerca de 32°C a cerca de 50°C, de cerca de 35°C a cerca de 45°C, de cerca de 40°C a cerca de 50^cC, de cerca de 45°C a cerca de 50°C, de cerca de 32°C a cerca de 40°C, de cerca de 35°C a cerca de 40°C, ou ao redor de 37°C. Novamente, qualquer ambiente adequado tal como gás (ar), líquido ou leito fluido pode ser utilizado como o segundo ambiente. Por exemplo, um banho de água ou dimetilsulfóxido na temperatura quente pode ser utilizado para efetuar este

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31/47 rápido reaquecimento. Durante esta etapa, a diluição dos crioprotetores pode ser iniciada utilizando soluções diluentes quentes que também contribuirão para a etapa de aquecimento.

[0074] Em algumas modalidades, os métodos de aquecimento convencionais que podem ser utilizados para aquecer as amostras incluem, por exemplo, aquecimento por convecção e microondas. Antes da metodologia da presente descrição, a metodologia convencional incluindo aquecimento por convecção, que aquece a partir do limite externo, é eficaz para pequenas amostras vitrificadas, mas ineficazes para amostras grandes (por exemplo, tendo um volume maior do que 5 ml) devido à citotoxicidade e formação de gelo. Em algumas modalidades, radiofrequências baixas e aquecimento indutivo podem ser utilizados para aquecer quando combinado com nanopartículas magnéticas biocompatíveis distribuídas (mNPs). Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2016/0015025, cuja descrição é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0075] Nas modalidades, a maior parte ou todas as células da amostra (por exemplo, tecido ou material celular) a serem conservadas, podem permanecer viáveis após o protocolo de conservação, já que a maioria ou todas as células da amostra serão expostas à citotoxicidade mínima. Em outras palavras, os métodos da presente invenção evitam a citotoxicidade de algumas soluções crioprotetoras convencionais, evitando a exposição da amostra a ser conservada ao aumento da citotoxicidade da solução crioprotetora que ocorre quando as temperaturas do tecido (e da solução) se aproximam a 37°C. Nas modalidades, os métodos da presente invenção evitam a exposição da amostra a ser conservada a quaisquer condições e/ou crioprotetores (por exemplo, através da exposição às condições extremas, tais como estresses osmóticos severos e/ou citotoxicidade química) que possam aniquilar uma maioria ou todas as células (por exemplo, por causa do

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32/47 nível aumentado de citotoxicidade da solução crioprotetora em temperaturas que se aproximam de 37°C) do tecido a ser conservado. No entanto, deve ser observado que nas modalidades onde a viabilidade celular não é desejada, a toxidade química ou estresses osmóticos severos podem ser empregados para tornar os materiais celulares essencialmente livres de células vivas.

[0076] Nas modalidades, os materiais celulares crioconservados conservados pelos métodos da presente invenção podem ser submetidos a qualquer uso adequado, incluindo, por exemplo, usos de pesquisa ou terapêuticos. Por exemplo, com relação aos usos terapêuticos, os materiais celulares crioconservados podem ser administrados a um paciente humano ou animal para tratar ou prevenir uma doença ou condição tal como doença cardíaca aórtica, doença de articulação degenerativa, doença óssea degenerativa, doenças do cólon ou intestinais, mielopatia degenerativa, doença de insuficiência renal crônica, doença cardíaca, doença do disco intervertebral, doença da córnea, trauma espinhal e substituição de partes perdidas devido ao trauma, tais como dedos, extremidades dos membros e faces.

[0077] Os materiais celulares crioconservados podem ser administrados a um paciente de qualquer maneira adequada. Em algumas modalidades, os materiais celulares crioconservados podem ser aplicados topicamente ao paciente (por exemplo, no tratamento de queimaduras, feridas ou distúrbios da pele). Em algumas modalidades, os materiais celulares crioconservados podem ser liberados a um sítio de implante local dentro de um paciente. Qualquer um destes ou qualquer combinação destes modos de administração podem ser utilizados no tratamento de um paciente.

[0078] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para conservar o material celular de grande volume vivo, compreendendo: expor o material celular a uma formulação/solução/

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33/47 meio crioprotetor contendo pelo menos um açúcar, submeter o material celular a um protocolo de conservação em que o dano induzido por gelo ao material celular não ocorre, e obter um material celular crioconservado. Em um segundo aspecto, o método do primeiro aspecto pode ser um método no qual o material celular possuí um volume maior do que 4 ml. Em um terceiro aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o volume do material celular é maior do que 10 ml· Em um quarto aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que o método celular está livre de gelo durante pelo menos 7 dias após submeter o material celular ao protocolo de conservação. Em um quinto aspecto, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método no qual o protocolo de conservação inclui uma estratégia de vitrificação que limita o crescimento de gelo durante o esfriamento e aquecimento de tal modo que o dano induzido por gelo não ocorre durante o protocolo de conservação. Em um sexto aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o pelo menos um açúcar é um dissacarídeo. Em um sétimo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o pelo menos um açúcar é selecionado do grupo que consiste em trealose e sacarose. Em um oitavo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual submeter o material celular a um protocolo de conservação compreende: a adição de crioprotetor de maneira gradativa à formulação/solução/meio crioprotetor para obter uma formulação/solução/meio crioprotetor final com uma concentração crioprotetora e/ou pelo menos uma concentração de açúcar eficaz para evitar danos induzidos por gelo ao material celular, tal como onde a última etapa de adição de crioprotetor que alcança a formulação/solução/meio crioprotetor final é executada enquanto a formulação/solução/meio crioprotetor está sendo mantido em uma temperatura ao re

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34/47 dor de -10°C. Em um nono aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que submeter o material celular a um protocolo de conservação compreende: imersão do material celular em uma série de soluções tendo concentrações crescentes do crioprotetor e/ou concentrações crescentes de pelo menos um açúcar para conseguir a imersão em uma solução final com uma concentração de crioprotetor e/ou pelo menos uma concentração de açúcar eficaz para evitar o dano induzido por gelo ao material celular. Em um décimo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é incubado em uma formulação crioprotetor, a formulação crioprotetora contendo de 0,1 a 1 M do pelo menos um açúcar. Em um décimo primeiro aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o protocolo de conservação ainda compreende o esfriamento do material celular em uma formulação crioprotetora contendo pelo menos um açúcar, tal como onde um crioprotetor adicional é adicionado à formulação crioprotetora antes ou durante o esfriamento, o crioprotetor adicional sendo diferente do açúcar, tal como onde o crioprotetor adicional é selecionado do grupo que consiste em acetamida, agarose, alginato, alanina, albumina, acetato de amônio, proteínas anticongelantes, bu~ tanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodióis, ciclo-hexanodiona, ciclo-hexanotrióis, dextrans, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico de etileno glicol, formamida, glicose, glicerol, glicerofosfato, monoacetato de glicerila, glicina, glicoproteínas, amido de hidroxietila, inibidores da recristalização de gelo, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metóxi propanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil uréias, metil glicose, metil glicerol, fenol, polióis pluronic, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, N-óxido de piridina,

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35/47 rafinose, ribose, serina, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, uréia, valina e xilose e, se desejável, a formulação crioprotetora pode conter o crioprotetor adicional em uma concentração de 0,1 a 13,0 M. Em um décimo segundo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual dito material celular é um tecido ou órgão natural ou artificial. Em um décimo terceiro aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos de mamífero e tecidos de mamífero. Em um décimo quarto aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos humanos e tecidos humanos. Em um décimo quinto aspecto, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método no qual uma viabilidade celular (%) do material celular após a conclusão do protocolo de conservação é de pelo menos 60%. Em um décimo sexto aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o meio não contém DMSO. Em um décimo sétimo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o meio não contém formamida. Em um décimo oitavo aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o meio não contém propileno glicol. Em um décimo nono aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o meio não contém DMSO, formamida e/ou propileno glicol.

[0079] Em um outro aspecto, a presente invenção também referese a um material celular crioconservado obtido através da exposição de um material celular de grande volume vivo à uma formulação crioprotetora contendo pelo menos um açúcar, e opcionalmente um crioprotetor adicional, durante um protocolo de conservação; em que uma

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36/47 viabilidade celular (%) do material celular após o protocolo de conservação ser de pelo menos 50%, e o material celular ter um volume maior do que 4 ml, tal material celular crioconservado pode ser obtido, por exemplo, por um método de qualquer um dos aspectos acima, e pode ser administrado a um paciente.

[0080] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se também a um método para aumentar o rendimento de produção do material celular crioconservado viável, que compreende: a exposição de um material celular de grande volume a um crioprotetor, o crioprotetor contendo pelo menos um açúcar, durante um período de tempo predeterminado para formar uma formulação de crioconservação; sujeição da formulação de crioconservação a um protocolo de conservação que compreende a crioconservação em uma temperatura de crioconservação ao redor de -80^cC ou mais baixa; e após a conclusão do protocolo de conservação, a recuperação do material celular crioconservado; em que uma viabilidade celular (%) do material celular crioconservado recuperado é de pelo menos 60% e o material celular possui um volume maior do que 4 ml. Em um aspecto adicional, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos e tecidos. Em um aspecto adicional, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos de mamíferos e tecidos de mamíferos. Em um outro aspecto, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método em que o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos humanos e tecidos humanos. Em um aspecto adicional, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método em que a viabilidade celular (%) do material celular crioconservado recuperado é de pelo menos 80%.

[0081] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se tam

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37/47 bém a um método para o armazenamento de material celular de grande volume vivo no qual a viabilidade celular não é desejada, que compreende: expor o material celular a uma formulação/solução/meio crioprotetor contendo pelo menos um açúcar, submeter o material celular a um protocolo de conservação, o qual compreende o armazenamento do material celular em temperaturas que variam da temperatura do nitrogênio líquido até temperaturas fisiológicas abaixo da faixa de temperatura de desnaturação do colágeno, e obter um material celular crioconservado. Em um aspecto adicional, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é selecionado do grupo que consiste em válvulas cardíacas, pele, tendões e enxertos de nervos periféricos. Em um aspecto adicional, o método de qualquer um dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é obtido de um mamífero. Em um outro aspecto, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é obtido de um ser humano. Em um aspecto adicional, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método no qual o material celular é armazenado em temperaturas que variam de cerca de -190°C a cerca de 60°C. E um outro aspecto, o método de qualquer dos aspectos acima pode ser um método no qual a viabilidade celular (%) do material celular crioconservado recuperado é 0%.

[0082] O precedente é ainda ilustrado por referência aos seguintes exemplos, que são apresentados para propósitos de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção.

EXEMPLOS

1^o conjunto de Experimentos [0083] Nos seguintes experimentos de suplementação de formulação de crioconservação livre de gelo, dissacarídeos (trealose e sacarose) são adicionados às várias formulações de vitrificação (VS49, DP6 e VS55) nas quantidades mostradas na Figura 1 e comparadas

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38/47 com uma solução (sem trealose e/ou sacarose) para acessar à eficácia na inibição da formação de gelo em vários tecidos.

[0084] Em particular, a Figura 1 mostra que existem aumentos significativos na viabilidade do tecido induzidos pela suplementação de trealose e sacarose das formulações de vitrificação. Os dados mostrados em % de controle VS55 foram executados com a concentração de crioprotetor final adicionada a 4°C, N = 6, *p < 0,05 por ANOVA ou #teste T em comparação com nenhum controle de aditivo.

[0085] Neste experimento, a adição de 600 mM de trealose ou sacarose às formulações de VS49, DP6 e VS55 foi comparada. Os tecidos foram vitrificados em 4 ml de solução. A suplementação de trealose aumentou a viabilidade da cúspide em VS49 e VS55. A suplementação de sacarose aumentou a viabilidade em todas as três formulações. Estas diferenças foram significativamente diferentes, p < 0,05 por ANOVA ou teste T. O DP6 teve consistentemente a melhor conservação muscular em todos os grupos de tratamento, mas não conseguiu uma significância estatística neste experimento, entretanto, este resultado sugeriu que o músculo cardíaco é mais tolerante à formação de gelo do que os outros tipos de tecido (cúspide e artéria) e essa formamida pode provocar alguma citotoxicidade. Isto levou a planejamentos de teste DP6 com açucares mais completamente em experimentos posteriores. Experimentos repetitivos foram executados utilizando o VS55 suplementado com sacarose e resultados obtidos similares àqueles para o VS55 suplementado foram mostrados nesta invenção.

Métodos [0086] Aquisição de Válvula Cardíaca e Vaso Sanguíneo: Válvulas cardíacas ou vasos sanguíneos em excesso genuínos foram obtidos de animais empregados em outros estudos de pesquisa aprovados pela IACUC ou de uma unidade de processamento de alimentos após

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39/47 a morte. Os tecidos foram dissecados, enxaguados e colocados em copos estéreis com meio de cultura de tecido gelado contendo antibióticos durante a noite e depois alocados para estudos in vitro. Tecidos da válvula cardíaca na Figura 1, cada qual consistia de um pedaço de tecido consistindo de artéria pulmonar, cúspide e músculo cardíaco. Eles foram separados e individualmente analisados quanto a viabilidade utilizando um ensaio que avalia a atividade metabólica que é descrita abaixo.

[0087] Método de Vitrificação: Tecidos foram gradualmente infiltrados com VS55 consistindo de DMSO 3,10 M, formamida 3.10 M, e propileno glicol 2,21 M em solução de Euro-Collins a 4°C utilizando métodos anteriormente descritos para a vitrificação do vaso sanguíneo, uma diluição de VS55 a VS49 ou DP6 consistindo de DMSO 3 M, propileno glicol 3 M. Soluções de vitrificação diluídas pré-esfriadas (4°C) são adicionadas em cinco etapas sequenciais de 15 min de concentração crescente em gelo. A última concentração de crioprotetor com mNPs foi adicionada em uma sexta etapa de adição final em solução de vitrificação de intensidade total pré-esfriada a -10°C ou 4°C e mantida em um banho a -10°C durante 15 minutos ou a 4°C sobre gelo em tubos de plástico. As amostras foram então esfriadas em duas etapas, no primeiro esfriamento rápido para -100°C mediante a colocação em um banho de 2-metilbutano pré-esfriado para -135°C e depois através da transferência para armazenagem de nitrogênio em fase vapor para esfriamento mais lento para abaixo de -135°C. Finalmente, as amostras foram armazenadas abaixo de -130°C em nitrogênio em fase vapor durante pelo menos 24 horas antes do teste.

[0088] Aquecimento: O aquecimento foi executado pelo aquecimento por convecção ou nanoaquecimento. O aquecimento por convecção é um processo de dois estágios incluindo aquecimento lento para -100°C e depois tão rápido quanto possível aquecimento até a

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40/47 fusão. A taxa de aquecimento lenta é criada tomando-se a amostra na parte superior do congelador a -135°C e a taxa de aquecimento de controle é gerada pela colocação do recipiente plástico na mistura de DMSO/H2O 30% em temperatura ambiente. Após 0 reaquecimento, a solução de vitrificação foi removida de uma maneira escalonada sobre gelo para manter os tecidos frios e minimizam a citotoxicidade devido à presença de crioprotetores residuais.

[0089] Avaliação da Viabilidade: Atividade Metabólica - Um ensaio alamarBIue™ será utilizado para avaliar a atividade metabólica das amostras de tecido de controle e tratado. Os tecidos foram incubados em 2 ml de meio de cultura DMEM+10%FBS durante uma hora para equilibrar seguido pela adição de AlamarBIue 20% sob condições de cultura celular padrão durante 3 horas. AlamarBIue é um indicador fluorométrico não tóxico com base na detecção da atividade metabólica. A fluorescência foi medida em um comprimento de onda de excitação de 544 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm. Esta avaliação foi executada após 0 reaquecimento (dia 0) para demonstrar a viabilidade celular. Os tecidos de controle e experimentais foram secados no final de cada experimento, pesado e os resultados expressos como unidades de fluorescência relativa (RFU)/mg de peso seco de tecido.

[0090] Os resultados destes experimentos indicam que 0,6 M de trealose ou sacarose impede a formação de gelo visível nas formulações tanto de DP6 quanto de VS49 e aumenta a viabilidade pósvitrificação nestas soluções (DP6, VS49 e VS55) com a viabilidade da cúspide demonstrando aumentos de 2 a 3 vezes. Notavelmente, as formulações de VS49 ou DP6 não são eficazes no controle da formação de gelo que utiliza aquecimento por convecção convencional, descrita na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2016/0015025. No entanto, nenhuma formação de gelo foi observada na presença de tre

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41/47 alose ου sacarose durante o esfriamento e reaquecimento nestes experimentos com nano aquecimento.

2^o conjunto de Experimentos [0091] Uma outra série de experimentos foi conduzida com uma formulação de 0,5 M de sacarose DP6 com vasos sanguíneos utilizando um dispositivo chamado de criomacroscópio (utilizado para visualizar eventos durante a crioconservação). Os resultados são mostrados na Figura 2 (respostas contráteis de artérias carótidas de coelho recém-obtidas e vitrificadas, curvas de resposta de dose de Norepinefrina (parte superior) e Fenilefrina (parte inferior).

[0092] O estudo acima foi executado em amostras de 4 ml utilizando aquecimento por convecção sem nano aquecimento. A preparação, a vitrificação e o reaquecimento foram executados conforme indicado anteriormente. Os vasos sanguíneos foram cortados em anéis de 2 mm para teste. As amostras de artéria conservadas com DP6 suplementado com sacarose 0,5 M produziram mais de 90% de viabilidade por alamarBIue utilizando métodos descritos acima no primeiro conjunto de experimentos (dados não mostrados). As amostras também foram verificadas com relação à função do músculo liso e excelentes respostas aos dois fármacos contráteis foram observadas, como visto na Figura 2.

Métodos [0093] Fisiologia do vaso sanguíneo: Anéis de dois mm de vasos sanguíneos crioconservados recém-obtidos e livres de gelo foram preparados para estudos de fisiologia vascular para documentar a função dos anéis da artéria femural de coelho em um sistema de banho de órgão de Radnotl que utiliza um painel de fármacos constritivo. As tensões contráteis isométricas foram medidas após a adição de concentrações crescentes de cada fármaco utilizando métodos anteriormente empregados. Os resultados de fisiologia foram expressos como gra

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42/47 mas de tensão/mg de peso seco de tecido.

3^o conjunto de Experimentos [0094] A crioconservação da artéria femoral de porco foi executada em sacarose VS55 ± 0,6 M em volumes de material celular de 4 e 10 ml. A conservação significativa foi demonstrada em todas as formulações em 4 ml, enquanto que em 10 ml o VS55 sem sacarose demonstrou baixa viabilidade. Em contraste, as formulações suplementadas com sacarose demonstraram conservação de viabilidade pelos ensaios tanto de alamarBIue (Figura 3; comparação da artéria femoral suína de amostras de 4 e 10 ml de VS55 ± 0,6 M sacarose, onde os anéis de tecido foram avaliados utilizando o ensaio metabólico alamarBIue) quanto de fisiologia (Figura 4; relaxamento do músculo liso suíno induzido por nitroprussiato de sódio após a pré-contração, onde VS55 isoladamente funciona bem para uma amostra de 4 ml, mas falha na amostra de 10 ml, e a suplementação de sacarose conserva a funcionalidade (relaxamento) na amostra de 10 ml de volume) empregado. Estes resultados demonstram que a suplementação de dissacarídeo resulta na sobrevivência do tecido em grandes volumes (por exemplo, 10 ml de volume) em que a solução de VS55 não suplementada (isto é, nenhum dissacarídeo adicionado) falha (devido à formação de gelo com perda de viabilidade do tecido). Resultados similares foram obtidos para dois fármacos contrateis.

[0095] Os métodos utilizados nesta invenção foram os mesmos como nos exemplos anteriores que utilizam aquecimento por convecção.

4^o conjunto de Experimentos [0096] Amostras da aorta torácica de coelho foram vitrificadas em volumes de 30 ml de VS55 com ou sem 0,6 M de sacarose com ou sem nanopartículas para comparação de aquecimento por convecção versus nano. Os resultados são apresentados na Figura 5 (resultados

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43/47 de aorta torácica de coelho de 30 ml que demonstram resultados melhorados com suplementação de sacarose utilizando aquecimento por convecção (barra mediana) ou nano (barra à direita)).

[0097] Os métodos eram como descritos para os exemplos anteriores com relação à adição de crioprotetores e esfriamento. No entanto, neste experimento, comparamos o aquecimento por convecção e o nano aquecimento. O nano aquecimento foi executado após pelo menos 24 h a -130°C. As amostras foram vitrificadas com 7,69 mg/ml de nanopartículas de Fe (EMG-308, Ferrotec) e as amostras foram inseridas na bobina de um aquecedor indutivo para reaquecimento. Mais especificamente, empregamos um fornecimento de energia por indução de estado de 6,0 kW terminal, 150 a 400 kHz, EASYHEAT 5060LI com uma cabeça de trabalho remota e bobina helicoidal de múltiplas voltas personalizada com 6 a 7 voltas para criar um campo magnético de 35 kA/m no centro. Bons resultados (logo abaixo de 50% de viabilidade) foram obtidos com aquecimento por convecção ou nano aquecimento (conduzidos como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2016/0015025) contanto que a sacarose esteja presente na solução de vitrificação. VS55 sem sacarose desempenhou pouco devido à formação de gelo que foi observada no processo de reaquecimento.

5^o conjunto de Experimentos [0098] Nesta série de experimentos (cujos resultados são ilustrados na Figura 6A e Figura 6B), a viabilidade dos tecidos da válvula cardíaca em que as válvulas cardíacas intactas foram conservadas em volumes de crioprotetor de 30 ml e reaquecidas por métodos de convecção ou nano aquecimento são comparadas.

[0099] Três amostras de tecido foram tiradas de cada cúspide e artéria pulmonar associada e músculo cardíaco para um total de 9 amostras de cada tipo de tecido de cada válvula. Os procedimentos de

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44/47 vitrificação e reaquecimento livres de gelo foram executados conforme descrito anteriormente, exceto que foi empregada uma adição escalonada de DP6 com sacarose ou trealose na última etapa. Em alguns casos, a etapa de DP6+ açúcar foi seguida por imersão em VS55+açúcar a -10 °C seguido por vitrificação imediata. Deve ser observado que neste experimento, como também observado na Figura 1, DP6 isoladamente resulta em boa viabilidade celular do músculo cardíaco a despeito do congelamento que ocorre com DP6, no entanto, neste experimento, dois grupos de crioconservação alcançaram valores de controle (Figura 6B, parte inferior) após a adição de sacarose. [00100] Com relação aos dados mostrados na Figura 6A e Figura 6B, válvulas cardíacas suínas individuais foram carregadas com DP6 e depois crioconservadas em DP6 isoladamente, DP6 com 0,6 M de trealose, 0,6 M de sacarose ou uma mistura de 0,3M de sacarose e 0,2 M de trealose, ou transferido no último momento de DP6 com açúcar para VS55 com o mesmo açúcar. O volume total de tecido e solução foi de pelo menos 30 ml. Os resultados integrados são para a cúspide, depois para o conduto e finalmente para o músculo cardíaco. Os resultados na Figura 6A são para aquecimento por convecção e os resultados na Figura 6B são após o nano aquecimento (n = 9). Os resultados são expressos como a média ± 1 erro padrão em percentual de tecidos da válvula cardíaca de controle não tratados.

[00101] Estes resultados demonstram que DP6 (3,0 M de dimetilsulfóxido acrescido de 3,0 M em EuroCollins Solution) com 0,6 M de sacarose resulta em excelente conservação de todos os três componentes de tecido nas válvulas cardíacas, particularmente após o nano aquecimento. Vários outros grupos de tratamento incluindo carga com DP6 e depois transferência para VS55 com sacarose ou trealose também melhoraram a viabilidade após o aquecimento por convecção ou o nano aquecimento. Houve uma tendência com relação aos grupos

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45/47 de tratamento com sacarose sendo melhor do que com trealose. [00102] Os resultados acima (Figure 1 a 6) combinam para demonstrar que o uso de açúcares, tais como dissacarídeos, por exemplo, sacarose e trealose, com VS55 e formulações de crioprotetor mais diluídas (DP6, Figura 6) resultam em benefícios inesperados melhorados de vitrificação livre de gelo. Estes açúcares ajudam tanto durante a convecção quanto durante o aquecimento rápido com aquecimento indutivo de nanopartículas magnéticas, mas parece que as formulações com alto teor de sacarose e trealose não necessitam de aquecimento rápido.

[00103] O uso de açúcares, tais como dissacarídeos, por exemplo, sacarose e trealose, permite a conservação de amostras de grande volume e aquecimento lento com menos risco de formação de gelo e maior viabilidade pós-reaquecimento.

[00104] O armazenamento de VS55 com uma faixa de concentrações de trealose e sacarose demonstra a liberdade da formação de gelo a -80°C durante 1 semana. Neste experimento, amostras de 30 ml de VS55 com concentrações crescentes de açúcares foram colocadas em tubos de plástico de 50 ml e armazenadas num congelador de armazenamento mecânico a -80^cC durante 7 dias. Os tubos foram verificados diariamente com relação à formação de gelo. Os tubos demonstraram gelo em uma maneira dependente da concentração de açúcar com as concentrações mais elevadas (tais como em uma faixa de 0,5 a 0,6 M) não mostrando a formação de gelo após 8 dias. Após um dia, 0,4 a 0,6 M de trealose e 0,5 a 0,6 M de sacarose estava livres de gelo, enquanto que após 7 dias, grupos de 0,5 a 0,6 M de trealose e 0,6 M de sacarose estavam livres de gelo. As concentrações mais baixas destes açúcares podem ainda ser utilizadas para a vitrificação livre de gelo, mas um esfriamento e aquecimento mais rápidos serão necessários porque o risco de formação de gelo será maior e nano

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46/47 aquecimento em vez de aquecimento por convecção pode ser necessário.

[00105] O VS55 suplementado com 0 a 0,4 M de sacarose ou 0 a 0,6 M de trealose demonstrou formação de gelo (branco). Concentrações mais elevadas eram transparentes sem gelo. Após uma semana a ~80°C, as concentrações mais elevadas de açúcares ainda eram livres de gelo.

[00106] A incorporação de açúcares, tais como dissacarídeos, por exemplo, sacarose e trealose, em tais formulações de vitrificação livres de gelo, permite taxas de esfriamento e aquecimento relativamente lentas (tais como da ordem de horas ou dias) a serem utilizadas sem formação de gelo e perda da viabilidade celular/tecidual. Adicionalmente, os métodos tanto de aquecimento por convecção quanto de nano aquecimento podem ser utilizados nos métodos da presente invenção com as formulações aqui descritas. Métodos de aquecimento rápidos, tais como métodos de nano aquecimento, podem ainda ser desejados porque nas taxas de aquecimento rápidas existe menos oportunidade com relação à citotoxicidade induzida por exposição crioprotetora. Estas observações também sugerem que outras formulações crioprotetoras com açucares possam ser desenvolvidas pelo fato de que possuem ainda menos risco de citotoxicidade de crioprotetor.

[00107] Todas as referências de literatura e patente citadas por toda a presente invenção são incorporadas por referência nas suas totalidades. Embora a descrição precedente tenha sido aqui descrita com referência aos meios, materiais e modalidades particulares, ela não se destina a ser limitada pelas particularidades aqui divulgadas; em vez disso, ela se estende para todas as estruturas, métodos e usos funcionalmente equivalentes, tais como são dentro do escopo das reivindicações anexas. Além disso, embora apenas algumas modalidades de exemplo tenham sido descritas com detalhes acima, aqueles versados

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47/47 na técnica irão facilmente observar que muitas modificações são possíveis nas modalidades exemplares sem se afastar materialmente da descrição de ICE-FREE PRESERVATION OF LARGE VOLUME TISSUE SAMPLES FOR VIABLE, FUNCTIONAL TISSUE BANKING. Consequentemente, todas essas modificações destinam-se a serem incluídas dentro do escopo desta invenção, conforme definido nas seguintes reivindicações. Nas reivindicações, as cláusulas de meios acrescidos de função se destinam a cobrir as estruturas aqui descritas como executando a função citada e não apenas equivalentes estruturais, mas também estruturas equivalentes. Assim, embora um prego e um parafuso possam não ser equivalentes estruturais, pelo fato de que um prego emprega uma superfície cilíndrica para fixar partes de madeira entre si, enquanto que um parafuso emprega uma superfície helicoidal, no ambiente de fixação de peças de madeira, um prego e um parafuso podem ser estruturas equivalentes. É a intenção expressa do requerente não invocar 35 U.S.C. §112(f) para quaisquer limitações de qualquer uma das reivindicações nesta invenção, exceto para aquelas em que a reivindicação expressamente utiliza as palavras ‘meios para’ juntamente com uma função associada.

Claims

1. Método para a conservação de material celular de grande volume vivo, caracterizado pelo fato de que compreende:

expor o material celular a uma formulação crioprotetora contendo pelo menos um açúcar, submeter o material celular a um protocolo de conservação no qual o dano induzido por gelo ao material celular não ocorre, e obter um material celular crioconservado; em que o material celular possui um volume maior do que 4 ml, e uma viabilidade celular (%) do material celular após a conclusão do protocolo de conservação é de pelo menos 60%.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peto fato de que o material celular possui um volume maior do que 10 ml.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peto fato de que o material celular é livre de gelo durante pelo menos 7 dias após submeter o material celular ao protocolo de conservação.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peto fato de que o protocolo de conservação inclui uma estratégia de vitrificação que limita o crescimento de gelo durante o esfriamento e o aquecimento de tal modo que o dano induzido por gelo não ocorre durante o protocolo de conservação.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar é selecionado do grupo que consiste em treatose e sacarose.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que submeter o material celular a um protocolo de conservação compreende:

a adição de crioprotetor de maneira gradativa à formulação crioprotetora para obter uma formulação crioprotetora final com uma

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2/3 concentração de crioprotetor e/ou pelo menos uma concentração de açúcar eficaz para evitar danos induzidos por gelo ao material celular.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material celular é incubado em uma formulação crioprotetora, a formulação crioprotetora contendo de 0,1 a 1 M do pelo menos um açúcar.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o protocolo de conservação ainda compreende o esfriamento do material celular em uma formulação crioprotetora contendo pelo menos um açúcar, um crioprotetor adicional é adicionado à formulação crioprotetora antes ou durante o esfriamento, o crioprotetor adicional sendo diferente do açúcar, e a formulação crioprotetora contém o crioprotetor adicional em uma concentração de 0,1 a 13,0 M.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor adicional é selecionado do grupo que consiste em acetamida, agarose, alginate, alanina, albumina, acetato de amônio, proteínas anticongelantes, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodióis, ciclo-hexanodionas, ciclohexanotrióis, dextranos, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico de etileno glicol, formamida, glicose, glicerol, glicerofosfato, monoacetato de glicerila, glicina, glicoproteínas, amido de hidroxietila, inibidores da recristalização de gelo, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metóxi propanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil uréias, metil glicose, metil glicerol, fenol, polióis pluronic, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, N-óxido de piridina, rafinose, ribose, se

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3/3 rina, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrite de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, uréia, valina e xilose.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material celular é selecionado do grupo que consiste em órgãos humanos e tecidos humanos.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio não contém DMSO, formamida e/ou propileno glicol.

12. Método para o armazenamento do material celular de grande volume vivo no qual a viabilidade celular não é desejada, caracterizado pelo fato de que compreende:

expor o material celular a uma formulação/solução/meio crioprotetor contendo pelo menos um açúcar, submeter o material celular a um protocolo de conservação, o qual compreende o armazenamento do material celular em temperaturas que variam da temperatura do nitrogênio líquido até temperaturas fisiológicas abaixo da faixa de temperatura de desnaturação do colágeno, e obter um material celular crioconservado.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o material celular é obtido a partir de um mamífero e é selecionado do grupo que consiste em válvulas cardíacas, pele, tendões e enxertos de nervos periféricos.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o material celular é armazenado em temperaturas que variam de cerca de 190°C a cerca de 60°C.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a viabilidade celular (%) do material celular crioconservado recuperado é de 0%.