CN114762499A - 一种冻存液、冻存液的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冻存液、冻存液的制备方法与应用。所述冻存液包括以下组分，人血白蛋白溶液、DMSO、混合葡萄糖注射液、无血清基础培养基。发明中的冻存液一方面能够细胞中多余的血液成分凝集，防止细胞结团，达到细胞保存时间的目的，另一方面可以使得是复苏后的细胞的结团率较低，具有较高的安全性。

Description

一种冻存液、冻存液的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冻存液、冻存液的制备方法与应用。

背景技术

间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，被广泛使用到临床中和科学研究中，扩增后的干细胞有时需要被冻存起来，其目的是在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命，以备用于科研及临床随时复苏使用。目前在间充质干细胞的冻存中需要加入冻存保护液。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂一般是小分子物质，比如说甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、甲酰胺等，主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水，渗透性冷冻保护剂使用得比较多的是甲基亚砜(DMSO)，但是二甲基亚砜(DMSO)具有毒性，当其量过多时会损伤细胞且复苏过程中容易导致干细胞氧化损伤与分化潜能降低。非渗透性冷冻保护剂主要是一些大分子物质，比如说海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、羟乙基淀粉(HES)和聚乙烯吡咯烷酮等，其对冻存时冷冻速率的要求很高，使用大分子物质，会使得细胞团率太高为病人带来极大风险。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种冻存液，所述冻存液包括以下组分，人血白蛋白溶液、DMSO、混合葡萄糖注射液、无血清基础培养基。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液20-30份、DMSO4-8份、混合葡萄糖注射液25-40份、无血清基础培养基30-50份。

作为本发明一种优选的技术方案，所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和/或葡萄糖氯化钠注射液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为(2-4)：1。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮。

作为本发明一种优选的技术方案，所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.5％-1％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf。

作为本发明一种优选的技术方案，所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮A的重量比为(1.5-2)：1。

本发明的第二个方面提供了种冻存液的制备方法，所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

本发明第三个方面提供了一种冻存液的应用，所述冻存液用于冻存人脐带间充质干细胞。

有益效果：

1.二甲基亚砜的浓度过高会引起蛋白变性，本发明中减少了二甲基亚砜的使用量，降低了二甲基亚砜对细胞的负面影响，使得冻存液具有良好的安全性和稳定性；

2.本发明提供的冻存液能够降低细胞内的晶体形成，减少对细胞的损害，提高了冻存细胞复苏后的存活率，细胞活率能够达到FDA要求；

3.本发明中的冻存液一方面能够细胞中多余的血液成分凝集，防止细胞结团，达到细胞保存时间的目的，另一方面可以使得是复苏后的细胞的结团率较低，具有较高的安全性。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种冻存液，所述冻存液包括以下组分，人血白蛋白溶液、DMSO、混合葡萄糖注射液、无血清基础培养基。

在一种实施方式中，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液20-30份、DMSO4-8份、混合葡萄糖注射液25-40份、无血清基础培养基30-50份。

在一种优选的实施方式中，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液24-28份、DMSO5-7份、混合葡萄糖注射液30-35份、无血清基础培养基40-45份。

在一种优选的实施方式中，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液25份、DMSO6份、混合葡萄糖注射液32份、无血清基础培养基42份。

在一种实施方式中，所述人血白蛋白溶液指的的体积浓度为20％。

在一种实施方式中，所述人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。

在一种实施方式中，所述无血清基础培养基为MSC

XF Basal Medium，其无血清、不含异源动物成分、不含抗生素，为BI品牌。

在一种实施方式中，所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和/或葡萄糖氯化钠注射液；进一步优选的，所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液。

在一种实施方式中，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为(2-4)：1；进一步优选的，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为3：1。

右旋糖酐40葡萄糖注射液是一种无色、稍带粘性的澄明液体，有时显轻微的乳光，为右旋糖酐40与5％葡萄糖的灭菌水溶液，其平均分子量为40000。

在一种实施方式中，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液采购于湖北科伦药业有限公司。

在一种实施方式中，所述葡萄糖氯化钠注射液采购于四川科伦药业股份有限公司。

葡萄糖氯化钠注射液为复方制剂，其组份为：每100mL中含8g葡萄糖、0.18g氯化钠；辅料:稀盐酸、注射用水。

在一种实施方式中，所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮。

在一种实施方式中，所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.5％-1％；进一步优选的，所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.7％。

在一种实施方式中，所述甘草查尔酮为甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、甘草查尔酮C中的至少一种。

在一种优选的实施方式中，所述甘草查尔酮为甘草查尔酮A。

在一种实施方式中，所述甘草查尔酮A采购于成都曼思特生物科技有限公司。

为了提高冻存细胞复苏后的存活率，在本发明的条件下可以使用右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液可以为冻存细胞提供营养，使得复苏后的细胞具有良好的增值能力，右旋糖酐40葡萄糖注射液可以提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，减少冻存过程中的冰晶形成造成的细胞损伤，申请人意外发现，在冻存液中加入适量的甘草查尔酮，尤其是甘草查尔酮A可以更进一步增加冻存后细胞复苏后的存活率，可能是因为甘草查尔酮能够与葡萄糖氯化钠注射液中的Na⁺离子相互协同作用具有一定的抑制氧化应激的作用，从而更进一步增加了冻存细胞复苏后的存活率。

在一种方式中，所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf。

在一种实施方式中，所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮的重量比为(1.5-2)：1；进一步优选的，所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮A的重量比为1.8：1。

在一种实施方式中，所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf采购于成都曼思特生物科技有限公司。

右旋糖酐40葡萄糖注射液的对聚集作用比较强，甘草查尔酮的加入使得冻存液体系的聚集作用更强，增加了冻存细胞复苏后的结团率，这使得细胞在使用时的安全风险较大，申请人意外发现，在冻存液中加入一定量的20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与可以减小冻存细胞复苏后的结团率。可能是因为在DMSO的作用下20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮能够很好的相容，并且20-葡糖糖基-人参皂甘Rf中的人参皂甘Rf基团能够减少右旋糖酐40葡萄糖注射液与甘草查尔酮造成的聚集现象。

本发明的第二个方面提供了种冻存液的制备方法，所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

本发明第三个方面提供了一种冻存液的应用，所述冻存液用于冻存人脐带间充质干细胞。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

实施例1

本发明的实施例1提供了一种冻存液，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液24份、DMSO5份、混合葡萄糖注射液30份、无血清基础培养基40份；

所述人血白蛋白溶液指的体积浓度为20％；

所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为2：1；

所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮；所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.5％％；所述甘草查尔酮为甘草查尔酮A；

所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮的重量比为1.5：1；

所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

所述人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司；所述无血清基础培养基为MSC

XF Basal Medium，为BI品牌；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液采购于湖北科伦药业有限公司；所述葡萄糖氯化钠注射液采购于四川科伦药业股份有限公司；所述甘草查尔酮A采购于成都曼思特生物科技有限公司；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf采购于成都曼思特生物科技有限公司。

实施例2

本发明的实施例2提供了一种冻存液，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液28份、DMSO7份、混合葡萄糖注射液5份、无血清基础培养基45份；

所述人血白蛋白溶液指的体积浓度为20％；

所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为4：1；

所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮；所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的1％；所述甘草查尔酮为甘草查尔酮A；

所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮的重量比为1.5：1；

所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

所述人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司；所述无血清基础培养基为MSC

XF Basal Medium，为BI品牌；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液采购于湖北科伦药业有限公司；所述葡萄糖氯化钠注射液采购于四川科伦药业股份有限公司；所述甘草查尔酮A采购于成都曼思特生物科技有限公司；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf采购于成都曼思特生物科技有限公司。

实施例3

本发明的实施例3提供了一种冻存液，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液25份、DMSO6份、混合葡萄糖注射液32份、无血清基础培养基42份；

所述人血白蛋白溶液指的体积浓度为20％；

所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为3：1；

所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮；所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.7％；所述甘草查尔酮为甘草查尔酮A；

所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮的重量比为1.8：1；

所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

所述人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司；所述无血清基础培养基为MSC

XF Basal Medium，为BI品牌；所述右旋糖酐40葡萄糖注射液采购于湖北科伦药业有限公司；所述葡萄糖氯化钠注射液采购于四川科伦药业股份有限公司；所述甘草查尔酮A采购于成都曼思特生物科技有限公司；所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf采购于成都曼思特生物科技有限公司。

实施例4

本发明的实施例4提供了一种冻存液，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，无甘草查尔酮。

实施例5

本发明的实施例5提供了一种冻存液，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的2％。

实施例6

本发明的实施例6提供了一种冻存液，其具体实施方式同实施例3，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为6：1。

实施例7

本发明的实施例7提供了一种冻存液，其具体实施方式同实施例3，无20-葡糖糖基-人参皂甘Rf。

实施例8

本发明的实施例8提供了一种冻存液，其具体实施方式同实施例3，20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮A的重量比为1：1。

性能测试

将实施例1-8中的冻存液下述方法进行细胞冻存和复苏实验。

细胞冻存过程：将P3代人脐带间充质干细胞用0.2％胰蛋白酶消化4min，加入培养液(BI基础培养基与Elite血清替代物组成，其体积比为为95:5)15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入冻存液2ml混匀，置于无菌冻存管内。将冻存管放入降温程序仪中进行降温程序。降温程序为：4℃等待30min，1℃/min降温至-7℃、20℃/min降温至-40℃、15℃/min升温至-18℃、1℃/min降温至-50℃、10℃/min升温至-80℃，在-80℃保持20min后将冻存液转入液氮中保存6个月。

细胞复苏：取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡置细胞悬浮完全融化，然后用用5倍培养液稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，重复3次实验，计算细胞存活率，取平均值。

测试结果如表1所示：

表1

	结团率(％)	细胞存活率(％)
			实施例1	8.46	98.25
实施例2	8.92	98.37
			实施例3	8.19	98.41
实施例4	9.26	80.7
			实施例5	10.21	85.62
实施例6	10.35	82.66
			实施例7	14.89	94.47
实施例8	12.6	93.49

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种冻存液，其特征在于，所述冻存液包括以下组分，人血白蛋白溶液、DMSO、混合葡萄糖注射液、无血清基础培养基。

2.根据权利要求1所述的一种冻存液，其特征在于，所述冻存液包括以下组分，按体积份计，人血白蛋白溶液20-30份、DMSO4-8份、混合葡萄糖注射液25-40份、无血清基础培养基30-50份。

3.根据权利要求1或2所述的一种冻存液，其特征在于，所述混合葡萄糖注射液为右旋糖酐40葡萄糖注射液和/或葡萄糖氯化钠注射液。

4.根据权利要求3所述的一种冻存液，其特征在于，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液的体积比为(2-4)：1。

5.根据权利要求1或2所述的一种冻存液，其特征在于，所述冻存液的组分还包括甘草查尔酮。

6.根据权利要求5所述的一种冻存液，其特征在于，所述甘草查尔酮的重量为冻存液重量的0.5％-1％。

7.根据权利要求5所述的一种冻存液，其特征在于，所述冻存液的组分还包括20-葡糖糖基-人参皂甘Rf。

8.根据权利要求7所述的一种冻存液，其特征在于，所述20-葡糖糖基-人参皂甘Rf与甘草查尔酮A的重量比为(1.5-2)：1。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述的一种冻存液制备方法，其特征在于，所述冻存液的制备方法为：在避光的条件，称取冻存液的组分；除了人血白蛋白，将冻存液的其他组分混合搅拌均匀，然后滴加人血白蛋白，滴加完毕后，将混合液过滤制得冻存液。

10.一种根据权利要求1-8任一项所述的一种冻存液的应用，其特征在于，所述冻存液用于冻存人脐带间充质干细胞。